JPS61122299A - 抗菌性ポリペプチド、その製造法およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＣＩ）　　発明の背景 よびその用途に関する。

従来の技術 昆虫などの無を椎動物では、ワクチン接種により、体液
中に抗菌活性物質が出現することが幾つか報告されてい
る。１）・２）・５）・４）　この物質は、抗体産生能
を持たない動物の生体防御にとって主要な役割を担って
いる゛と考えられるが、一般にその誘導機構や、物質の
性状、抗菌作用のメカニズム等については、まだ十分に
明らかにされていない。

ところで、センチニクバエ（Ｓａ、ｒａｏｐｈａｇａ　
ｐｅｒｅ−ｇｒｉｎａ　）幼虫では、体表に傷害を与え
ることによって、体液中に、大腸菌や枯草菌に対し、顕
著な抗菌活性を持つ蛋白が出現することが、本発明者ら
によりて既に明らかにされている。′）これは。

体表傷害時に、細菌感染を防ぐ為に誘導される、一種の
生体防御物質であると考えられる。この昆虫では、同じ
く体表傷害時に、食細胞の活性化能を持つ、細胞凝集性
蛋白も出現することから、６）・７）これらの蛋白が相
互に関連しあって、センチニクバエの生体防御機構を溝
成しているものと思われる。一方、近年高等哺乳動物で
も、精液９）中や血清１０）中に、抗菌力が強くて幅広
℃・スペクトルを持つ抗菌性蛋白の存在が明らかとなり
、一般に動物体液中の抗菌性蛋白が重要視されている。

センチニクバエの抗菌性蛋白については、さらに本発明
者らは、３種類あることを報告し、１１）そしてこれら
のうちの−成分について電気泳動的に単一でかつ抗菌比
活性がｉ、ｏ、ｏｏｏ倍以上、特にほぼ３０，０００倍
に上昇した蛋白Ｋまで精製することに成功し、その理化
学的性質の一部を明らかにした（特開昭ｊ？−１３７３
０号公報）。

発明が解決しようとする問題点 しかしながら、最近、この成分についてもいまだ単一蛋
白でなく、複数の成分から成ることが判明した。したが
って、例えば医学、薬学的見地からみてもこの成分の利
用については不十分であり、複数成分の完全な特定化が
望まれていた。

（ＩＤ　　発明の概要 要旨 本発明は、双翅目または膜翅目に属する昆虫、とりわけ
センチニクバエ幼虫、の体表傷害時に誘導される抗菌性
蛋白の一成分からさらに精製操作を加え、複数の単一蛋
白を単離特定することに成功したことに基づくものであ
る。

したがつて、本発明による抗菌性ポリペプチドは下記の
アミノ酸配列式で示されるものである。

Ｈ−Ｇｌｙ　−Ｔｒｐ　−Ｌｅｕ　−Ｘｌ　−Ｌｙｓ　
−１１ｅ　−Ｇｌｙ　−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ　−１１ｅ−Ｇ
ｌｕ−Ａｒｇ−Ｖａｌ　−Ｇｌｙ−Ｇｉｎ−Ｈｉｓ　−
Ｔｈｒ　−Ａｒｇ　−Ａａｐ　−Ａｌａ　−Ｔｈｒ　−
Ｉ　ｌａ　−Ｇｉｎ　−Ｘ２−　Ｘ３−　Ｇｌｙ　−Ｘ
ｌｌ−Ａｌａ　−Ｇｉｎ　−Ｇｌｎ　−Ａｌａ　−Ａｌ
ａ　−Ａｓｎ　−Ｖａｌ　−Ａｌａ　−Ａｌａ　−Ｔｂ
ｒ　−Ａｌａ　−Ａｒｇ　−ＯＨ（式中Ｘ１はＬｙｓま
たはＡｒｇ　、　Ｘ２はＧｌｙまたはＶａｌ。

Ｘ５はＬｅｕまたはＩｌｅ　、　Ｘ４はＩＩｓまたはＶ
ａｌをあられす。） また、本発明による抗菌性ポリペプチドの製造法は、双
翅目または膜翅目に属する昆虫の幼虫の体表に傷害を与
え、その後得られる体液より体液・］　　　　　細胞お
よび脂肪体を除去したものから上記のアミノ酸配列式で
示されるポリペプチドを取得すること、を特徴とするも
のである。

さらにまた１本発明による可食性抗菌剤は、上記のアミ
ノ酸配列式で示されるポリペプチドを有効成分とするも
のである。

発明の効果 本発明による抗菌性ポリペプチドはそれ自体抗菌性を有
し、しかも毒性は殆んどない。したが−てこの性質を利
用できる種々の用途が考えられるが、特にこれらの物質
を有効成分とする医薬品製剤としての応用、あるいは食
品添加物としての利用が期待できる。

とりわけセンチニクバエ幼虫より取得したポリペプチド
は、熱安定性であり、熱による加工工程を含む用途には
特に期待できるものである。

本発明で対象とする昆虫は、双翅目または膜翅目に属す
る昆虫である。具体的には、ノ・工、力、ハチ、アブな
どがある。これらのうちでは、ニクバエ科のハエ、特に
センチニクバエ、カ好マしい。

対象昆虫は、幼虫でなければならない。ここで「幼虫」
とは、昆虫の完全変態の過程において。

化後、桶化前のものをいう。本発明で適当なものは、王
台に同調しである幼虫、特にセンチニクバエ幼虫、であ
る。

抗菌性ポリペプチドを誘導すべく昆虫体表に傷害を与え
る操作は、結果的に感染の危険を増大させる任意の方法
が可能である。「体表」といっても体表のみを意味する
ものではなく、注射針の貫通のように体内にも傷害を与
える操作をも包含することはい５までもない。傷害を与
えるべき体表は、昆虫の体のどこであってもよいが、通
常は頭部を除く部分である。

傷害を与えて０〜５日後、望ましくは約２日後、体液を
しぼり出し、遠心分離により体液細胞を除き、さらに得
られた上清から脂肪体および不要な蛋白を更に除くため
湯浴中で加熱−、（たとえば１００℃、５分）後、遠心
上清を取り、出発材料とする。

コ、抗菌性ポリペプチドの精製・分離 一般の高分子蛋白類の分画と精製に常用されるさまざま
な方法が適用できる。しかしながら活性成分をすべて含
んだままで精製を進め、夾雑物質が少なくなったところ
で各々の成分（そのうちの−が本発明で対象とするもの
である）を分離する方法が望ましい。本発明において、
特にセンチニクバエ幼虫を用いる場合、イオン交換樹脂
処理および熱処理の二つの精製手段により活性成分をす
べて含んだままで精製を進め、限外ｒ過にて濃縮し、次
にゲルｒ過およびイオン交換樹脂処理によって各成分を
分離する方法が好適である。また、この種の抗菌性物質
はトリプシン処理によって失活することから蛋白性物質
であることは明らかであるところ、上記精製にあたうて
は蛋白あたりの比活性が上昇することを指標にし、上記
分離にあたっては各々の活性成分全体としての比活性が
下がらないことを指標とするのが好ましい。

、各成分分離後、その−成分をさらに本発明の単一な物
質にまで精製する場合、上記同様さまざまな方法が考え
られ１例えばイオン交換樹脂処理、吸着クロマトグラフ
ィー、電気泳動などを適宜用いて目的を達することが可
能であるが、この時、本発明の実施例のように、二つの
原理の異なる電気泳動システムで単一バンドを形成する
こと、及びその各々のバンドに活性が対応すること、の
二つの条件を満たすことを指標にして操作を進めると好
適である。

また、本発明の抗菌性蛋白は耐熱性が良好であるので、
粗標品を加熱することによりて純化して比活性を高める
ことができる。すなわち、粗標品をｔｏ　−ｔ２０℃、
好ましくは１００℃前後、でｉｏ　−ｔ。

分間程度の熱処理に付すと好都合である。

３、抗菌性ポリペプチド 本発明による抗菌性ポリペプチドは１体表傷害という刺
激によって幼虫体液中に銹導されるものである。このこ
とは、幼虫体液を例えば電気泳動にかけ、さらに大腸菌
等を吹きつけて放置し、菌のコロニー形成の阻止された
バンドが出現するか否かを、体表傷害を与えた体液と正
常体液とを比′）　　　　　較することによつて確認で
きる。

また前述のよ５に、このバンドの物質が例えばトリプシ
ン処理によって失活することＫより、蛋白性物質である
ことも確認できる。

本発明による抗菌性ポリペプチドは、前記のアミノ酸配
列式で示されるものである。

アミノ酸配列式は、プロテインシークエンサー（アプラ
イドバイオシステムズ社製）によつて決定したものであ
る。

また、この抗菌性ポリペプチドは含水メタノールに可溶
である。

また、この抗菌性ポリペプチドは、凍結乾燥を行なうと
白色粉末として得られる。

先用途 本発明による抗菌性ポリペプチドは、その抗菌性を生か
して抗菌剤として有用である。すなわち。

それ自身として、あるいは適当な液体、固体または気体
の担体ないし希釈剤と組合せた形態で、あるいは他の薬
剤と組合せた形態で、抗菌剤として使用することができ
る。前記公報かられかるように、本発明抗菌性ポリペプ
チドは、抗菌スペクトルが広く、グラム陰性菌および陽
性菌のいずれに対しても有効な抗菌作用を示すことが明
らかである。

したがって１本発明抗菌性ポリペプチドは、たとえば、
細菌性疾患に対する薬剤として使用することができる。

その場合は、投与の剤型およびその投与量については、
患者および疾患の種類、症状等を勘案して、本発明によ
る抗菌効果が認められる限り任意の選択が可能である。

このような薬剤は血清中で活性が失なわれないことが大
切であるが、やはり前記公報から明らかなよ５に１本発
明抗菌性ポリペプチドは血清存在下で抗菌活性が認めら
れる点に価値がある。

本発明抗菌性ポリペプチドは蛋白質そのものであるとこ
ろ、その毒性は少なくとも結果的に経口にて摂取される
ときには、はとんどないと考えられる。従うて、この抗
菌性ポリペプチドは、ヒトおよび動物用の薬剤および食
品ないし飼料添加物として利用することができる。たと
えば、本発明による抗菌性ポリペプチドは食品添加物と
しての抗菌剤、換言すれば可食性抗菌剤、として有用で
ある。

！、実験例 本発明の抗菌性ポリペプチドを取得するためＫは例えば
前記公報の５実験例でいういわゆる第三成分を用いれば
よい。すなわち、この第三成分を単離・精製する工程の
具体例は前記公報に開示したものと同様であり、その手
順に従がえばよい。

（１３抗菌性ポリペプチドの取得 精製された第三成分（以下サルコトキシンＩ（ｔｒａｒ
ｃｏｔｏｘｉｎ　Ｉ　）と称する）をＨＰＬＣ逆相りＱ
？トゲラフイー（シンクロ−くツクＲＦＰ−Ｃ／ｆカラ
ム（ギルソン社））を用いて分画し、サルコトキシンＩ
Ａ、ＩＢおよびＩＣの３つのピークを得た（第１図）。

ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。

すなわち、第１図から明らかなよ５＃ｃ、Ｂ液が３０〜
３Ｊ憾の間で、サルコトキシンＩＡ、ＩＢおよびＩＣが
分離された。

得られたサルコトキシンＩＡ、ＩＢおよびＩＣのアミノ
酸配列は気相プロテインシークエンサー（アプライド　
バイオシステムズ≠７ＯＡプロテインシークエンサー）
によって次の通りであることがわかつた◎ ｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　！ＩＡ
　Ｈ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＩＩ
ｓ−Ｇｌｙ　−ＩＢ　　　　　　　　　　−Ｌｙｓ− ＩＣ−Ａｒｇ− １０／ｊ’ Ｌｙｓ　−Ｌｙｓ　−Ｉ　ｌ＠−Ｇｌｕ　−Ａｒｇ　−
Ｖａｌ　−Ｇｌｙ　−Ｇｌｎ−）Ｉｉｓ　−Ｔｈｒ　−
Ａｒｇ　−Ａｓｐ　−Ａｌａ　−Ｔｈｒ　−１１ａ　−
Ｇｉｎ　−Ｇｌｙ　−Ｌａｕ　−Ｇｌｙ　−Ｉ　ｌｅ　
−Ａｌａ　−Ｇｉｎ　−Ｇｉｎ−Ｖａｌ−１１ｅ−−Ｖ
ａｌ− −Ｖａｌ−Ｌｅｕ−−１１ｅ− “′１３Ｓ −Ａｌａ　−Ａｌａ　−Ａａｎ　−Ｖａｌ　−Ａｌａ　
−Ａｌａ　−Ｔｈｒ　−Ａｌａ　−Ａｒｇ　−０Ｈ （２）　　抗菌性ポリペプチドの性質 上記操作で得られたサルコトキシンＩＡ、ＩＢおよびＩ
Ｃは前記公報の第三成分（サルコトキシンエ）と同様の
抗菌スペクトルをもつ。

参考文献 （１１ネーチャー、２２コ、６りｓ　　（ｉり６り）（
２）ジャーナル、オフ、インバーｆプレート、ハソロジ
ー、３コ、　／７／　（／り７１’Ｊ（３）　　ジャー
ナル、オフ、インセクト、フイジオロジー、ｌ弘、　１
０２１　　（／りｔｒ）（４）ユーロピアン、ジャーナ
ル、オフ、バイオケミストリー、ｔｏｂ、７（／り１０
） （５）　ジャーナル、オフ、インセクト、フイジオロジ
ー、コ、　ｒｔ４タ　（ｌり７７） （６）ザ、ジャーナル、オフ、バイオロジカル、ケミス
トリー、コｊｊ、Ｊりｌり（ｌり１０）（７１ザ、ジャ
ーナル、オフ、バイオロジカル、ケミストリー、２！Ａ
　、　７０１ｒ７　（／Ｆｌｒ／　）（９）　ネーチャ
ー、２７り、７２！・ｙ２ｒ＜Ｉり７ヂ）α１　バイオ
ケミストリー、　２０．！９７３　（／りｒ／）αυ　
日本薬学会第１０１回年会（ｌりｒｔ）

【図面の簡単な説明】 第１図はサルコトキシンエの高速液体クロマトグラフィ
ーによる溶出パターンを示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記のアミノ酸配列式で示される抗菌性ポリペプチ
   ド。 【アミノ酸配列があります】 （式中Ｘ＿１はＬｙｓまたはＡｒｇ、Ｘ＿２はＧｌｙま
   たはＶａｌ、Ｘ＿３はＬｅｕまたはＩｌｅ、Ｘ＿４はＩ
   ｌｅまたはＶａｌをあらわす。） ２、Ｘ＿１、Ｘ＿２、Ｘ＿３、Ｘ＿４がそれぞれＬｙｓ
   、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅである特許請求の範囲第１項
   記載のポリペプチド。 ３、Ｘ＿１、Ｘ＿２、Ｘ＿３、Ｘ＿４がそれぞれＬｙｓ
   、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｖａｌである特許請求の範囲第１項
   記載のポリペプチド。 ４、Ｘ＿１、Ｘ＿２、Ｘ＿３、Ｘ＿４がそれぞれＡｒｇ
   、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅである特許請求の範囲第１項
   記載のポリペプチド。 ５、双翅目または膜翅目に属する昆虫の幼虫の体表に傷
   害を与え、その後得られる体液より体液細胞および脂肪
   体を除去したものから下記のアミノ酸配列式で示される
   ポリペプチドを取得することを特徴とする、抗菌性ポリ
   ペプチドの製造法。 Ｈ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘ＿１−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ
   −Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−
   Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａ
   ｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｘ＿２−Ｘ＿
   ３−Ｇｌｙ−Ｘ＿４−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ａｌａ
   −Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−
   Ａｌａ−Ａｒｇ−ＯＨ（式中Ｘ＿１はＬｙｓまたはＡｒ
   ｇ、Ｘ＿２はＧｌｙまたはＶａｌ、Ｘ＿３はＬｅｕまた
   はＩｌｅ、Ｘ＿４はＩｌｅまたはＶａｌをあらわす。） ６、Ｘ＿１、Ｘ＿２、Ｘ＿３、Ｘ＿４がそれぞれＬｙｓ
   、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅである特許請求の範囲第５項
   記載の製造法。 ７、Ｘ＿１、Ｘ＿２、Ｘ＿３、Ｘ＿４がそれぞれＬｙｓ
   、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｖａｌである特許請求の範囲第５項
   記載の製造法。 ８、Ｘ＿１、Ｘ＿２、Ｘ＿３、Ｘ＿４がそれぞれＡｒｇ
   、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅである特許請求の範囲第５項
   記載の製造法。 ９、双翅目または膜翅目に属する昆虫がセンチニクバエ
   （Ｓａｒｃｏｐｈａｇａ　ｐｅｒｅｇｒｉｎａ）である
   、特許請求の範囲第５〜８に項記載の製造法。 １０、幼虫が三令幼虫である、特許請求の範囲第５〜９
   項記載の製造法。 １１、幼虫の体液が体表傷害後０〜５日経過後のもので
   ある、特許請求の範囲第５〜１０項記載の製造法。 １２、目的ポリペプチドの取得工程において、材料を８
   ０〜１２０℃の熱処理に付す操作を含む、特許請求の範
   囲第５〜１１項記載の製造法。 １３、下記のアミノ酸配列式で示されるポリペプチドを
   有効成分とする可食性抗菌剤。 Ｈ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘ＿１−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ
   −Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−
   Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａ
   ｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｘ＿２−Ｘ＿
   ３−Ｇｌｙ−Ｘ＿４−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ａｌａ
   −Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−
   Ａｌａ−Ａｒｇ−ＯＨ（式中Ｘ＿１はＬｙｓまたはＡｒ
   ｇ、Ｘ＿２はＧｌｙまたはＶａｌ、Ｘ＿３はＬｅｕまた
   はＩｌｅ、Ｘ＿４はＩｌｅまたはＶａｌをあらわす。） １４、Ｘ＿１、Ｘ＿２、Ｘ＿３、Ｘ＿４がそれぞれＬｙ
   ｓ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅである特許請求の範囲第１
   ３項記載の可食性抗菌剤。 １５、Ｘ＿１、Ｘ＿２、Ｘ＿３、Ｘ＿４がそれぞれＬｙ
   ｓ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｖａｌである特許請求の範囲第１
   ３項記載の可食性抗菌剤。 １６、Ｘ＿ｌ、Ｘ＿２、Ｘ＿３、Ｘ＿４がそれぞれＡｒ
   ｇ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅである特許請求の範囲第１
   ３項記載の可食性抗菌剤。