JP4245804B2 - 新規溶血活性蛋白質および該蛋白質をコードする遺伝子 - Google Patents
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Description
本発明は、溶血活性を有する蛋白質およびそれをコードする遺伝子に関する。さらに詳細には、本発明は、溶血活性を有する新規蛋白質、その製造方法およびその使用に関する。
背景技術
海水浴中におけるクラゲによる刺傷被害は、世界各地で発生しており、我が国でも毎年夏場の海水浴シーズンにアンドンクラゲ(Carybdea rastonii)やカツオノエボシ(Physalia physalis)による刺傷被害が頻発している。刺傷による症状はクラゲの種類や、患者の個人差により程度が異なるが、その第一は、刺傷部位の疼痛、発赤、丘疹、小水泡などの皮膚症状である。重症例では、出血斑、壊死を起こし頭痛、発熱、吐気、呼吸困難、脈拍の変動などの全身症状を伴い死亡することもある。このような被害の多さにもかかわらず、その毒成分を明らかにするとともに、毒成分の薬理学的性質を解明し、クラゲによる刺傷時の治療用薬剤などの開発につなげようとすることはあまり行われていない。
アンドンクラゲの毒成分については、佐藤らによって研究が行われており、アンドンクラゲの触手の凍結乾燥物から調製した粗抽出液中には、溶血、血小板凝集、肥満細胞脱顆粒、血管平滑筋収縮、皮膚壊死、心臓毒性および致死などの活性を示す成分が存在することを明らかにし、その毒成分の血小板凝集作用および血管平滑筋収縮作用について検討がなされている(佐藤昭彦:アンドンクラゲの毒成分の研究、お茶の水医学雑誌,33巻,2号,131−151頁,昭和60年6月)。
一方、クラゲ毒の成分としては、その刺胞毒が酸、アルカリ処理、加熱処理、有機溶媒処理、プロテアーゼ処理などで失活し、透析されない高分子物質であることから、その主体は蛋白質であると考えられていた。
そして、これまでクラゲ由来の蛋白毒の精製も試みられてきたが、クラゲ毒自体は非常に失活しやすいことから、これまではこれらの活性成分について、例えば、その溶血活性を保持したままで単離、精製することは行われておらず、その物理的、化学的な性質も明らかにされていなかった。
クラゲ毒成分の詳細を解明することは、その蛋白質が有する多種多様な生理活性、なかでも特異的溶血活性、血小板凝集作用を応用した医薬品等の開発のために、極めて重要な事項である。したがって、溶血活性を有する蛋白質の構造−活性相関、種特異性等の研究のために、できるだけ多くの溶血活性を有する蛋白質またはペプチドを、その生理活性を保持したまま単離し、これらの発生学上または構造上の類似点を究明する手段を与えるとともに、クラゲによる刺傷被害の治療に使用することができる医薬品等の開発へのアプローチを与えることが、本発明が解決しようとする課題である。
発明の開示
本発明者らは、アンドンクラゲの刺胞からその溶血活性を指標に、溶血活性を有する蛋白質を、活性を保持したまま単離すべく鋭意研究を行い、活性を保持したままの蛋白質を単離、精製する方法を見出すとともに、その部分化学構造が次のアミノ酸配列式(1)〜(3):
アミノ酸配列式(1):
Gly−Glu−Ile−Gln−Thr−Lys−Pro−Asp−Arg−Val−Gly−Gln−Ala−Thr
アミノ酸配列式(2):
Gly−Asn−Ala−Glu−His−Val−Ala−Ser−Ala−Val−Glu−Asn−Ala−Asn−Arg−Val−Asn−Lys
アミノ酸配列式(3):
Met−Ser−Asp−Gly−Phe−Tyr−Thr−Met−Glu−Asn−Ser−Asp−Arg−Arg−Lys
(上記の各式中、アミノ酸残基はIUPACおよびIUBの定める3文字表記により表記する)
であり、分子量が約50,000Da(SDSゲル電気泳動法による)である蛋白質であることを明らかにした。そしてさらに、これらの部分化学構造をもとにプライマーを作成し、アンドンクラゲの触手より調製したtotal RNAに対してRT−PCRを行い、約1000塩基対の遺伝子配列を解明し、続いて5’RACE法、3’RACE法を用いて5’末端および3’末端側の遺伝子配列を解明することにより、アンドンクラゲの溶血活性蛋白質の全一次アミノ酸配列および該溶血活性蛋白をコードする遺伝子配列を決定して、本発明を完成した。
したがって、本発明の一つの態様としては、上記した生理活性および物理的、化学的性質を特性として有し、配列番号5で表わされるアミノ酸配列、またはその一部が欠失もしくは置換したアミノ酸配列、あるいは該アミノ酸配列またはその一部が欠失もしくは置換したアミノ酸配列に1個から複数個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列を有する特異的蛋白質を提供し、また別の態様としてかかる蛋白質の製造方法を提供する。さらに別の態様としては、かかる蛋白質をコードする遺伝子、およびこの遺伝子を用いた特異的蛋白質の製造方法、ならびにこの遺伝子を利用した医薬または農薬を提供する。本発明はさらにまた、これらの特性を利用した医薬組成物、特に血小板凝集作用等を有する医薬組成物、または農薬を提供する。また、本溶血活性蛋白質を用いれば、公知の方法(細胞工学別冊「抗ペプチド抗体実験プロトコール」:秀潤社)により、特異的抗体を得ることもでき、当該抗体を利用した医薬組成物も提供する。
発明を実施するための最良の形態
本発明が提供する特異的生理活性を有する蛋白質は、具体的には次のようにして単離、精製することができる。例えば、アンドンクラゲの刺胞をリン酸緩衝液中で超音波処理した後、遠心分離して上清を集め粗抽出物を得る。この粗抽出物をTSK−GEL(東ソー社製)を用いたイオン交換高速液体クロマトグラフィーおよびSuperdex−75(Pharmacia社製)によるゲル濾過高速液体クロマトグラフィーに付して目的とする蛋白質を分離、精製することができる。
かくして得られた本発明が提供する蛋白質の構造は、酵素を用いた選択的分解によるアミノ酸配列の解析手法、およびPCR法などを用いた遺伝子配列の解析手法を組み合わせることによって決定することができる。例えば、上記によって分離、精製した蛋白質をリジルエンドペプチダーゼで処理し、高速液体クロマトグラフィーによりその断片を分取後、アミノ酸シークエンサーなどを用いて分析することによってアミノ酸配列を決定することができる。次に、明らかになったアミノ酸配列をもとにプライマーを作成し、これを用いたRT−PCR法などにより、遺伝子配列を決定することができる。最後に遺伝子配列をもとにアミノ酸配列を決定すれば、蛋白質の全一次アミノ酸配列を決定することができる。
かかる分析によって、本発明が提供する蛋白質は、その分子量が約50,000Da(SDSゲル電気泳動法による)であり、その部分アミノ酸配列が上記したアミノ酸配列式(1)〜(3)を有するものであることが確認された。
この部分アミノ酸配列についてホモロジー検索を行った結果、今まで報告されている蛋白質と極めて相同性が低いものであった。したがって、本発明が提供する溶血活性を有する蛋白質は、既知の蛋白質には似ていない全く新しい蛋白質であることが示唆された。
次に、この部分アミノ酸配列をもとにプライマーを作成し、アンドンクラゲの触手より調製したtotal RNAに対してRT−PCRを行い、約1000塩基対の遺伝子配列を解明し、続いて、5’RACE法、3’RACE法を用いて5’末端および3’末端側の遺伝子配列を解明することにより、アンドンクラゲの溶血活性蛋白質は、配列番号5で示される全一次アミノ酸配列を有するものであること、および該溶血活性蛋白質をコードする遺伝子は配列番号4に示される塩基配列を有するものであることを明らかにした。
さらに、この全一次アミノ酸配列についてもホモロジー検索を行った結果、これまでに報告されている蛋白質との相同性は低いものであった。
本発明の特異的蛋白質の分離・精製による製法は、特にその溶血活性を保持したままの状態で行われることを特徴とする。かかる溶血活性を保持したままの分離・精製は、具体的には、上記したリン酸緩衝液による超音波処理、あるいは各種高速液体クロマトグラフィー等の処理を行うに際して、0.1M以上、好ましくは0.3M以上、より好ましくは0.5M以上のNaCl含有の10mMリン酸緩衝液(pH6.0)中で、10℃以下、好ましくは5℃以下で行うことによって達成される。
したがって、本発明のアンドンクラゲの刺胞からの蛋白質の抽出・精製による製造方法においては、その生理活性を保持したままの製造方法を提供するものでもある。
さらに、本発明の特異的蛋白質は遺伝子組換え法によっても製造することができる。遺伝子組換え法によって製造を行う場合は、常法に従って、例えば配列番号4で示される遺伝子を組み込んだベクターを作成し、当該ベクターによって宿主の形質転換を行った後、該宿主を培養または成育させ、該宿主から目的の溶血活性を有する蛋白質を単離、精製して採取すれば良い。
本発明が提供する蛋白質は、溶血活性を有する蛋白質であり、例えば血小板凝集作用等を有する医薬品としてばかりでなく、溶血に関する研究用の試薬として利用できる。さらにはクラゲによる刺傷時の治療用薬剤など医薬品開発や、溶血活性を利用した殺虫剤等の農薬開発への新たなアプローチを与える。
実施例
以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例1
1)アンドンクラゲ刺胞の抽出
神奈川県三浦海岸で採取し、マイナス80℃で凍結保存されていたアンドンクラゲの刺胞200mgを、10mMリン酸緩衝液(pH6.0)8ml中に入れ、超音波(井内社製 ultrasonic cleaner VS150)中で15分間処理した後、遠心分離(3,000rpm、20分間)し、その上清を集めた。この操作を計3回行った。さらに、1M NaCl含有10mMリン酸緩衝液(pH6.0)8mlにより同様の抽出操作をさらに3回繰り返し、そのすべての上清を集めた。この抽出操作後、直ちに次の精製段階であるイオン交換HPLC(高速液体クロマトグラフィー)を行った。
2)イオン交換HPLC(カラム:TSK−GEL CM650S,カラムサイズ:20×220mm)による精製
標記カラムを、0.3M NaCl含有10mMリン酸緩衝液(pH6.0)にて平衡化した。平衡化後、次いで、上記1)の操作により抽出して得た上清を合わせて、10mMリン酸緩衝液(pH6.0)で4倍に希釈した後、上記カラムに、流速3ml/分にて供した。サンプルアプライ後、10mMリン酸緩衝液(pH6.0)100mlで洗浄した。洗浄後、60分間で0Mから0.7MのNaCl濃度によるグラジエント(10mMリン酸緩衝液:pH6.0)にて溶出を行った。グラジエント開始後、45分から65分の間に多くの溶血活性フラクションが溶出した。なお、溶血活性はヒツジ血球に対する溶血作用で調べた(後記実施例2を参照)。
3)イオン交換HPLC(カラム:TSK−GEL CM5PW,カラムサイズ:7.5×75mm)による精製
標記カラムを、0.3M NaCl含有10mMリン酸緩衝液(pH6.0)でよく平衡化した。上記2)の精製操作により得られた溶血活性画分を、10mMリン酸緩衝液(pH6.0)で4倍に希釈後、上記カラムに、流速2ml/分にて供した。サンプルアプライ後、10mMリン酸緩衝液(pH6.0)30mlで洗浄した。洗浄後、60分間で0Mから0.8MのNaCl濃度によるグラジエント(10mMリン酸緩衝液:pH6.0)にて溶出を行った。グラジエント開始後、25分から35分の間に多くの溶血活性フラクションが溶出した。分取した溶血活性を有する各フラクションをSDS−PAGEに供し、活性成分の分離具合を確認し、よく分離している部分を集めて次のステップにまわし、分離していない部分については、分離するまで再クロマトグラフィーを繰り返した。
4)イオン交換HPLC(カラム:TSK−GEL CM5PW,カラムサイズ:7.5×75mm)による溶血活性成分の濃縮
カラムは、0.3M NaCl含有10mMリン酸緩衝液(pH6.0)でよく平衡化した。上記3)の精製操作で得られた溶血活性画分を、10mMリン酸緩衝液(pH6.0)で4倍に希釈後、上記カラムに、流速2ml/分にて供した。サンプルアプライ後、10mMリン酸緩衝液(pH6.0)30mlで洗浄した。洗浄後、0.8M NaCl含有10mMリン酸緩衝液(pH6.0)を流し、カラムに吸着したサンプルを溶出させた。溶媒を交換後5分前後に溶血活性成分が濃縮されて一気に溶出するので、その部分を分取した。
5)ゲル濾過HPLC(カラム:Superdex−75,カラムサイズ:16×600mm)による精製
イオン交換HPLCによって濃縮されたサンプルを、0.8M NaCl含有10mMリン酸緩衝液(PH6.0)で平衡化した上記カラムに0.5−1.0mlずつ供し、流速1ml/分で溶出させた。サンプルを注入後、50分から60分の溶出フラクションに強い溶血活性が見出された。SDS−PAGEで分離状況を確認後、活性画分を集め、ここで溶血毒である、本発明の蛋白質が単離された(約1マイクログラム)。
実施例2:溶血活性の測定
上記の実施例1における各精製段階での溶血活性の測定、ならびに最終的に得られた本発明の蛋白質の溶血活性の測定は、以下のようにして行った。
1)方法
溶血活性は、ヒツジ赤血球に対する溶血により測定した。すなわち、0.8%のヒツジ赤血球を含むPBS(+)緩衝液を96穴のマイクロウェルプレート(丸底タイプ)に200μl溶液ずつ入れ、そこに、上記実施例1の各精製段階で得られた両分を、10mMリン酸緩衝液(pH6.0)に溶解させた溶液10μlを加え、室温下に3時間放置し、各プレートのヒツジ赤血球の溶血状態を観察した。なお、溶血活性を保持しているか否かは、各精製段階で得られた画分について、完全溶血を示すか、示さないかで判断を行った。
2)結果
2−1)上記実施例1の各精製段階で得られた両分は、ヒツジ赤血球に対し、完全溶血を示し、その溶血活性が保持されていることが判明した。
2−2)また、上記実施例1の5)の精製操作で最終的に得られた溶血活性を有する本発明の蛋白質については、その100ng/ml (約2nM)以下の濃度で、ヒツジ赤血球に対して完全溶血を引き起こした。
実施例3:蛋白質の分子量の決定と部分構造の決定
3−1)分子量の決定
実施例1の5)の精製操作で得られた溶血活性を有する本発明の蛋白質を、常法に従ってSDSゲル電気泳動(SDS−PAGE)させたときに現れるシングルバンドと、蛋白質分子量マーカー(Pharmacia社製)との比較により、本発明の蛋白質は、その分子量が約50,000Daの蛋白質であることが確認された。
3−2)リジルエンドペプチダーゼによる分解
上記実施例1の5)の精製操作で得られた溶血活性を有する本発明の蛋白質10μgに、Achromobacter Protease I(Achromobacter lyticus M497−1株由来:宝酒造社製)3pMを加え、10mMのトリス−塩酸緩衝液(pH9.0)中で30℃にて20時間インキュベートして、蛋白質の分解を行った。この酵素消化された蛋白質を高速液体クロマトグラフィー(カラム:Bakerbond wide pore ODS)に付し、60分間で10%から62%のアセトニトリル濃度によるグラジエント(0.1%トリフロロ酢酸含有水)にて、流速0.7ml/分で分離した。その結果、保持時間19,23および27分に各々溶出した3種類のペプチドフラグメントを得た。
3−3)各フラグメントのアミノ酸シークエンサーによる構造決定
以上のようにして得られた3種のペプチドフラグメントについて、Shimadzu PSQ−1 protein sequencer(島津製作所社製)を使用して、常法に従ってそのアミノ酸配列を決定した。
その結果、3種のフラグメントは、以下のアミノ酸配列式(1)〜(3)を有しているものであることが判明した。
アミノ酸配列式(1):
Gly−Glu−Ile−Gln−Thr−Lys−Pro−Asp−Arg−Val−Gly−Gln−Ala−Thr
アミノ酸配列式(2):
Gly−Asn−Ala−Glu−His−Val−Ala−Ser−Ala−Val−Glu−Asn−Ala−Asn−Arg−Val−Asn−Lys
アミノ酸配列式(3):
Met−Ser−Asp−Gly−Phe−Tyr−Thr−Met−Glu−Asn−Ser−Asp−Arg−Arg−Lys
(上記の各式中、アミノ酸残基はIUPACおよびIUBの定める3文字表記により表記する)
上記によりアミノ酸配列が決定された各フラグメントについて、ホモロジー検索を行った結果、これらのフラグメントはこれまでに報告されている蛋白質と極めて相同性が低く、したがって、アンドンクラゲの刺胞よりその溶血活性を保持したまま分取した本発明の特異的な蛋白質は、全く新しい蛋白質であることが示唆された。
実施例4:蛋白質の全アミノ酸構造およびそれをコードする遺伝子の決定
4−1)アンドンクラゲtotal RNAの調製
アンドンクラゲの触手(湿重量約0.5g)を液体窒素中で粉砕し、5mlのTRIzol(登録商標)試薬(GIBCO BRL社製)中でホモジナイズした。1mlのクロロホルムを加えて撹拌後、冷却遠心機(佐久間製作所社製)で遠心分離(13,000rpm、15分間、4℃)した。上層の水層を分取して2.5mlのイソプロパノールを加え、室温で10分静置した。冷却遠心機で遠心分離(13,000rpm、10分間、4℃)した後、上清を除いて5mlの75%エタノールを加え、再度遠心分離(10,000rpm、5分間、4℃)した。上清を除いて約10分間風乾し、100μlのRNase−free水を加え、60℃で10分間インキュベートしてRNAを溶解した。以上の方法で約0.5mgのtotal RNAが得られた。
4−2)部分cDNAのクローニング
アミノ酸配列式(1)、アミノ酸配列式(2)、アミノ酸配列式(3)を基に、以下の縮重プライマーを設計し、常法により合成した。
7−F;GAR ATH CAR ACI AAR CCI G
7−R;CIG GYT TIG TYT GDA TYT C
12−F;GCI GTI GAR AAY GCI AAY MG
12−R;CKR TTI GCR TTY TCI ACI GC
14−1−F;GAY GGI TTY TAY ACI ATG G
14−1−R;CCA TIG TRT ARA AIC CRT C
14−2−F;GAY GGI TTY TAY ACI ATG GAR AA
14−2−R;TTY TCC ATI GTR TAR AAI CCR TC
(上記の各式中の英文字は、「ヌクレオチド略語表」による(細胞工学別冊「バイオ実験イラストレイテッド」:秀潤社))
次に、SUPERSCRIPT(登録商標)Preamplification System for 1st−Strand cDNA Synthesisを用いて、以下の手順で1本鎖cDNA(1st−strand cDNA)を合成した。すなわち、1μgのtotal RNA、oligo(dT)12−18、DEPC−処理水を混合し、70℃で10分間処理した後、さらにPCR buffer、25mM MgCl2、10mM dNTP mix、0.1M DTTを加えて42℃で5分間プレインキュベートした。そこに、SuperScript II RT(200units/μl)を加えて、さらに42℃で50分間インキュベートし、70℃で15分間処理した。そこに、RNase Hを加えて37℃で20分間インキュベートし、1st−strand cDNAを得た。
続いて、GeneAmp PCR System 2400 thermal cycler(Perkin−Elmer社製)を用い、以下の条件でPCRを行った。即ち、1st−strand cDNA、PCR buffer、dNTP mix、primer1、primer2(ここで、primer1、primer2とは、上記8種類の任意のプライマーである)、TaKaRa Ex Taq(登録商標−宝酒造社製)、水を混合し、94℃5分間の後、94℃30秒間、45℃30秒間、72℃2分間で3サイクル、さらに、94℃30秒間、55℃30秒間、72℃2分間で27サイクルの後、72℃で5分間反応させた。
反応液を0.8%アガロースゲルで電気泳動した結果、7−Fと12−R、7−Fと14−1−R、7−Fと14−2−R、12−Fと14−1−R、12−Fと14−2一Rの組み合わせで、PCR産物の増幅がみられた。各PCR産物のサイズは、順に約600bp、1000bp、1000bp、400bp、400bpであった。
4−3)部分cDNAの塩基配列の決定
各PCR産物を、TAクローニングベクターpCR2.1(Invitrogene社製)に挿入し、組換え体を大腸菌JM109に形質転換してLB(50μg/μlアンピシリンを含む)寒天培地上で培養した。得られたコロニーを鋳型に、M13ユニバーサルプライマーを用いて以下の条件でcolony PCRを行った。大腸菌の菌体、PCR buffer、dNTP mix、M13 FW primer、M13 RV primer、TaKaRa Ex Taq(登録商標−宝酒造社製)、水を混合し、90℃10分間の後、94℃30秒間、55℃30秒間、72℃2分間で30サイクル、72℃でさらに5分間反応させた。反応液を0.8%アガロースゲルで電気泳動後、目的のcolony PCR産物をMicroSpin(登録商標)S−400(Amersham Pharmacia社製)を用いたスピンカラムで精製し、ABI PRISM 310 Genetic Analyzer(Applied Biosystems社製)を用いてシークエンシングを行った。
得られた配列を、遺伝子解析ソフトGENETYX−MAC(ソフトウエア開発社製)を用いて解析した結果、約1000bpの部分cDNA配列が解明でき、アミノ酸配列式(1)、アミノ酸配列式(2)およびアミノ酸配列式(3)の各部分構造は、蛋白質のN末端側からこの順番で位置していることが明らかになった。
4−4)全長cDNAの塩基配列決定
部分cDNAの塩基配列から、以下のプライマーを合成した。
5’−RACE−4R;GCT CTA TCA ATA ACG GCA GC
5’−RACE−5R;TGT CTT TGG ATG GCC TCA TC
5’−RACE−6R;GAT ACT TAG GTC GCT ATC CG
3’−RACE−1F;GTT CAG AGG CTG TTC TAA CG
3’−RACE−2F;ATG TCT GAC GGC TTC TAC AC
次に、5’/3’RACE Kit(Boehringer Mannheim社製)を用いて、以下の手順で5’RACEおよび3’RACEを行った。
(a)5’RACE
1μgのtotal RNA、cDNA synthesis buffer、dNTP mix、5’−RACE−6R、AMV reverse transcriptase、DEPC−処理水を混合し、55℃で60分間インキュベートの後、65℃で10分間処理して1st−strand cDNAを合成した。
次いで、1st−strand cDNAをスピンカラムで精製した後、reaction buffer、2mM dATPを加えて94℃で3分間処理した。そこに、terminal transferase(10 units/μl)を加え、37℃で20分間インキュベート後、1st−strand cDNA、PCR buffer、dNTP mix、5’−RACE−5R、oligo(dT)−anchor primer、水を混合し、94℃5分間の後、94℃30秒間、55℃30秒間、72℃1分間で30サイクル、72℃でさらに5分間反応させた。続いて、1st−PCR産物を鋳型にし、5’−RACE−4RとPCR anchor primerの組み合わせで、1st−PCRと同条件でnested−PCRを行った。
1st−PCR産物、nested−PCR産物を1.5%アガロースゲルで電気泳動したところ、約500bpのバンドが確認できた。このnested−PCR産物をTAクローニングベクターに挿入し、上記の4−3)に記載するcDNAの塩基配列の決定に従って、シークエンシングを行い、配列を解析した。
(b)3’RACE
1μgのtotal RNA、cDNA synthesis buffer、dNTP mix、oligo(dT)−anchor primer、AMV reverse transcriptase、DEPC−処理水を混合し、55℃で60分間インキュベート後、65℃で10分間処理して1st−strand cDNAを合成した。
続いて以下の条件で1st−PCRを行った。1st−strand cDNA、PCR buffer、dNTP mix、3’−RACE−1F、PCR anchor primer、TaKaRa Ex Taq(登録商標−宝酒造社製)、水を混合し、94℃5分間の後、94℃30秒間、55℃30秒間、72℃2分間で30サイクル、72℃でさらに5分間反応させた。続いて、1st−PCR産物を鋳型にし、3’−RACE−2FとPCR anchor primerの組み合わせで、1st−PCRと同条件でnested−PCRを行った。
1st−PCR産物、nested−PCR産物を1.5%アガロースゲルで電気泳動したところ、約600bpのバンドが確認できた。このnested−PCR産物をTAクローニングベクターに挿入し、上記の4−3)に記載するcDNAの塩基配列の決定に従って、シークエンシングを行い、配列を解析した。
以上の結果から、アンドンクラゲの新規溶血活性蛋白質をコードするcDNAのサイズ(1610bp)と配列、アミノ酸の数(450aa)と配列が明らかになり、アンドンクラゲの溶血活性蛋白質は、配列番号5で示されるアミノ酸配列を有し、溶血活性蛋白質をコードする遺伝子は配列番号4で示される塩基配列を有するものであった。
アミノ酸配列式(1)(配列番号1)が、配列番号5のアミノ酸番号56から69に、アミノ酸配列式(2)(配列番号2)が、配列番号5のアミノ酸番号250から267に、アミノ酸配列式(3)(配列番号3)が、配列番号5のアミノ酸番号363から377に対応していた。さらに、配列番号4のヌクレオチド番号1600以降にポリA配列が存在した。
以上のようにして得られた本発明の新規な蛋白質は、上記した実施例に記載のように、その生理活性および物理的、化学的特性として;
(a)溶血活性を有するものであり、
(b)分子量が約50,000Da(SDSゲル電気泳動法による)を有し、
(c)その部分アミノ酸配列として、上記したアミノ酸配列式(1)〜(3)を有し、
(d)その全アミノ酸配列として、配列番号5で表わされるアミノ酸配列を有する特異的な蛋白質である。
産業上の利用可能性
本発明が提供するアンドンクラゲの刺胞由来の溶血活性を有する蛋白質は、その部分アミノ酸配列および全一次アミノ酸配列からホモロジー検索を行った結果から、既知の蛋白質には似ていない新しい蛋白質であり、例えば溶血のメカニズム等を解明するための生化学試薬として有用である。
また、分子レベルでの構造活性相関の研究や、当該蛋白質またはその部分ペプチドに対する抗体の研究などにより、例えばクラゲによる刺傷時の治療用薬剤など医薬品開発への新たなアプローチを与えるものであり、さらに血小板凝集作用等を有する医薬品や、溶血活性を利用した農薬として有用なものでもある。
【配列表】
Claims (12)
- 次の特性:
(1)溶血活性を有し;
(2)分子量が約50,000Da(SDSゲル電気泳動法による)であり;
(3)アミノ酸配列として、配列番号5に示すアミノ酸配列を有する;
を有する蛋白質。 - アンドンクラゲ(Carybdea rastonii)の刺胞より得られる、請求項1に記載の蛋白質。
- 請求項1に記載の溶血活性蛋白質と同一のアミノ酸配列、あるいはそのアミノ酸配列に対して1個または複数個のアミノ酸の付加、欠失、および/または他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有し、遺伝子組換え技術によって造成された形質転換細胞の培養物から得られる溶血活性を有する蛋白質。
- 配列番号5に示すアミノ酸配列、あるいはそのアミノ酸配列に対して1個または複数個のアミノ酸の付加、欠失、および/または他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有し、かつ溶血活性を有する蛋白質。
- アンドンクラゲ(Carybdea rastonii)の刺胞をリン酸緩衝液中で超音波処理し、遠心分離したその上清を、0M〜0.8MのNaCl濃度によるグラジエントによって溶出するイオン交換高速液体クロマトグラフィー、および0.8MのNaCl濃度によって溶出するゲル濾過高速液体クロマトグラフィーにより抽出・精製して採取することからなる請求項1、2または4に記載の蛋白質の製造方法。
- 刺胞の超音波処理が、0.1M以上のNaCl含有10mMリン酸緩衝液(pH6.0)中リン酸緩衝液中10℃以下で行う超音波処理であり、イオン交換高速液体クロマトグラフィー処理が、0M〜0.8MのNaCl濃度によるグラジエント(10mMリン酸緩衝液:pH6.0)によって10℃以下で溶出するイオン交換高速液体クロマトグラフィーであり、ゲル濾過高速液体クロマトグラフィー処理が、0.8MのNaCl含有10mMリン酸緩衝液(pH6.0)中で、10℃以下で行うことを特徴とする、請求項5に記載の蛋白質の製造方法。
- 請求項1ないし4のいずれか1項に記載の溶血活性を有する蛋白質のアミノ酸配列をコードする遺伝子。
- 請求項7に記載の遺伝子を含んでなるベクター。
- 請求項8に記載のベクターにより形質転換された宿主(但し、ヒトの宿主は除く)。
- 請求項9に記載の宿主を培養し、または生育させ、そして該宿主から溶血活性を有する蛋白質を採取することを特徴とする、蛋白質の製造方法。
- 請求項1ないし4のいずれか1項に記載の蛋白質またはそれらの部分ペプチドを抗原とする抗体。
- 請求項1ないし4のいずれか1項に記載の蛋白質を有効成分とする農薬。
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