JPH07501529A

JPH07501529A - 陸蛭からの新規トロンビン阻害性蛋白質

Info

Publication number: JPH07501529A
Application number: JP5509766A
Authority: JP
Inventors: シュトルーベ，　カール−ヘルマン; ビアロヤン，　ジークフリート; クレーガー，　ブルクハルト; フリードリッヒ，　トーマス
Original assignee: ビーエーエスエフ　アクチエンゲゼルシャフト
Priority date: 1991-11-26
Filing date: 1992-11-19
Publication date: 1995-02-16
Anticipated expiration: 2017-06-10
Also published as: DK0616642T3; US5455181A; ES2097368T3; EP0616642B1; MX9206732A; DE4209110A1; JP3290661B2; WO1993011239A1; CA2121601A1; DE59208025D1; EP0616642A1; ATE148744T1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】陸蛭からの新規トロンビン阻害性蛋白質本発明は、陸蛭（Ｌａｎｄｅｇｅｌ）へマディブサ・シルベストリス（Ｈａｅｍａｄｉｐｓａ　５ｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）からの新規トロンビン阻害性蛋白質ならびにその取得法に関する。

トロンビン阻害剤は、例えば血栓症又は動脈再閉塞の予防又は処置のために使用される、重要な治療用物質である。

欧州特許（Ｅ　Ｐ）第１４２８６０号明細書には、医療用蛭（Ｈｉｒｕｄｏ　ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ）からのトロンビン阻害剤、ヒルジンがその主要構造と共に記載されている。

更に、遺伝子技術によるヒルジンの製造が、欧州特許（Ｅ　Ｐ）第１６８３４２号明細書から公知である。

ところで、今般、陸蛭ヘマディブサ・シルベストリスから新規のトロンビン阻害性蛋白質が単離された。

この新規蛋白質は、次の物理化学的特性を有する。

分子篩クロマトグラフィにより、これには、１１２００±１０００ダルトンの分子量が関係付けられる。５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルでは、５０００±１０００ダルトンの分子量が測定される。

この蛋白質は、特異的に、トロンビン−親和性カラムに結合する。これは、インビトロ酵素試験で、トロンビンの生物学的活性を抑制する。

次のＮ−末端アミノ酸配列が、この蛋白質から測定された（ＳＥＱ−ＩＤ　ＮＯ：３）：（ここでＡはＡｓｐ又はＰｈｅであり、ＢはＧｌｕ又はＴｒｐであり、ＣはＬｙｓ、Ａｓｎ又はＡｓｐであり、ＤはＰｒｏ又はＬｅｕである）。

この新規蛋白質は、ヘマディプサ属の陸蛭から単離することができる。このために、蛭をｐＨ６〜９有利に、ｐＨ７〜８で緩衝液中に入れ、ホモゲナイザー有利に、ミキサー中で、ホモゲナイズするのが有利である。引続き不溶分を有利に遠心分離により分離除去する。

こうして得られた溶液から、蛋白質を更にクロマトグラフィ法で、有利にイオン交換クロマトグラフィ及び／又はアフィニティクロマトグラフィにより精製することができる。特に、トロンビンーアフィニティクロマトグラフィによる精製工程が有利である。

トロンビン−カラムでのアフィニティクロマトグラフィの後に、逆相ＨＰＬＣにより、トロンビン阻害活性を有する種々異なるイソ蛋白質を分離して取得することができる（第１図参照）。

この蛋白質の精製は、トロンビン−活性試験を経て行なうことができる。このために、色原性基質例えばクロモチーム（Ｃｈｒｏ閣Ｏ２ｙ■）ＴＨがトロンビン１こより変換される光学的試験を使用するのが有利である。新規蛋白質を含有するフラクションは、この光学的試験でのそのトロンビンへの添加時に阻害作用が認めることができる。

本発明の蛋白質の製造のためには、遺伝子技術的方法が特に好適である。

このために、自体公知の方法で、蛭からのｃ　ＤＮＡ−遺伝子バンクを設定する。この遺伝子バンクから、本発明による蛋白質をコードする遺伝子を単離することができ、ここでは、例えば、前記Ｎ−末端アミノ酸配列から遺伝子コードに応じた逆翻訳により得られる配列を有するＤＮＡ−プローブを製造する。このＤＮＡ−プローブとのバイブリド形成により、相応する遺伝子を見つけ、かつ単離することができる、。

しかしながら、この相応する遺伝子の製造のために、ポリメラーゼ−鎖−反応（ＰＣＲ）−技術を使用することもできる。例えば、前記Ｎ−末端アミノ酸配列から逆翻訳により得られた配列を有するプライマーを用いて、かつｃＤＮＡ遺伝子フラグメントの３′−末端に対して相補的な配列を有する第２のプライマーを用いて、有利には、配列ポリ（ｄＴ）と共に、本発明による蛋白質に関するｃＤＮＡ−遺伝子フラグメントをＰＣＲ技術で製造することができる。相応する遺伝子は、蛭の表現遺伝子バンクを設定し、これを本発明の蛋白質と反応する抗体で捜査する方法で単離することもできる。

この本発明による蛋白質をコード化するｃＤＮＡは、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　２２で表わされる。

他の好適なりＮＡ−配列は、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ０２２に挙げられているもの以外のヌクレオチド配列を有するが、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　２２遺伝子コードの退化の結果ポリペプチド鎖又はその一部分をコード化するものである。更に、トロンビン阻害作用を有する蛋白質をコード化し、標準的条件下で、ＳＥＱ　ＩＤＮｏ　２２で表わされるヌクレオチド配列又は５ＥＱＩＤ　Ｎ０２２で表わされる蛋白質をコード化するヌクレオチド配列とバイブリド形成するようなりＮＡ−配列が好適である。ＤＮＡ−バイブリド形成のための実験条件は、遺伝子技術の教科書、例えばＭａｎｉａｔｉｓ等の＋Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ”　、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　１９９０に記載されている。

標準条件とは、例えば、０．１〜１ｘＳＳＣ（ＩＸＳＳＣ：０．１５Ｍ　ＮａＣ１，１５ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ７，２）の濃度を有する水性緩衝液中での４２〜５８°Ｃの温度と解すべきである。

相応するこの遺伝子が単離された後、これは、遺伝子技術により、表現ベクターを用いて自体公知の方法で、生物中に、例えば細菌、酵母又は高級真核細胞中に表現させることができる。

本発明の蛋白質を融合蛋白質の形で合成する原核性表現系を使用するのが有利である。このような表現系の例は、市場で入手されるプロツユジョン［Ｆ］−システム（Ｐｒｏｆｕｓｉｏｎ−３ｙｓｔｅｍ　；　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）であり、これは、所望の蛋白質を、マルトース−結合蛋白質との融合蛋白質として、誘導可能なｔａｃ−プロモーターのコントロール下に合成する。

この融合蛋白質から、所望の蛋白質を、ファクターＸａを用いる分解により遊離させることができる。

この組換え宿主系から、蛋白質は、前記の物理化学的特性に基づき、単離することができる。

公知アミノ酸部分配列での新規蛋白質の遺伝子技術的製造のための一般的処置法は、遺伝子技術の教科書に、例えばＥ、　Ｌ、Ｗｉｎｎａｃｋｅｒの“Ｇｅｎｅ　ｕｎｄ　Ｋｌｏｎｅ”　。

Ｖｅｒｌａｇ　Ｃｈｅｍｉｅ、　Ｖｅｉｎｈｅｉｍ、１９８４に記載されている。個々の方法に関する実験条件、例えば、遺伝子バンクの設定、バイブリド形成、遺伝子の表現は、Ｔ。

Ｍａｎｉａｔｉｓの　’！Ｊｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ”、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９９０に記載されている。

ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　２２に記載のｃＤＮＡ−配列は、それでコード化された蛋白質の公知方法を用いる突然変異生成の可能性を提供する。これによって、個個のアミノ酸がＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ２２に記載の蛋白質配列で交換されている蛋白質を製造することができる。特に好適な蛋白質は、ポリペプチド末端の変更により、殊に、末端の短縮により得られるものである。特に好適な蛋白質は、Ｃ−末端の所で有利に１〜１２個のアミノ酸の短縮により得られる。このように短縮された突然変異体は、同様にトロンビン阻害作用を有する。

本発明による蛋白質は、その薬剤学的に認容しうる塩の形で使用するのが有利である。

新規蛋白質は、血液凝固抑制特性を有する。これらは、例えば、血栓症又は動脈再閉塞の予防のため、血栓症の処置のため、血液の保存のため又は体外循環の場合に使用することができる。この新規蛋白質は、有効なトロンビン阻害剤である。これは、単独でも、公知の凝固阻害因子と一緒にして”も医薬品として使用することができる。凝固阻害因子としては、トロンビン阻害剤例えばヒルジン、因子Ｘａ−阻害剤、例えばＴＡ　Ｐ　（Ｗａｘｍａｎ等の５ｃｉｅｃｎｅ　２４８　、　１９９０　、　５９３−５９６頁）又は血小板−凝集抑制剤例えばクリストリン（Ｋｒ１ｓｔｒｉｎ）　（Ｄｅｎｎｉｓ等のＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄＳｃｉ、ＵＳＡ　８７．１９８９．２４７１〜２４７５頁）を使用するのが有利である。

本発明を次の実施例で更に説明する。

例１陸蛭からのトロンビン阻害性蛋白質の精製ａ）　蛭ホモノネートの取得生きている陸蛭（Ｈａｅｍａｄｉｐｓａ　５ｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）　１５０９を２０ｍＭ燐酸ナトリウム（ｐＨ７，４）４００ｍｌ中で、ミキサーを用い、４℃ で１０分間均質化した。

このホモジネートを、２０００　Ｕ　／　ｓｉｎ　（ＳｏｒｖａｌｌＲＣ−５８、Ｒｏｔｏｒ　Ｇ　Ｓ　−３）で１５分間、次いで沈殿物の除去の後に、８０００　Ｕ／ｗ＋ｉｎで３０分間遠心した。沈殿を捨て、上澄みを５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）−アミノ−メタン／ＨＣｌ−緩衝液（ｐＨ８，５）、（）リス／ＨＣｌ−緩衝液）で、約６０ｍ１の量まで稀釈した。

この蛋白質溶液は５８０　ｍ　ｌの量で、その蛋白質濃度は４　、４９　ｍ　ｇ　／　ｍ　１であり、トロンビン阻害活性は２２　、２　Ｕ　／　ｍ　ｌであった。

ｂ）　イオン交換クロマトグラフィによる陸蛭−ホモジネートの分離陸蛭から得られた蛋白質溶液を５０　ｍ　Ｍ　トリス／ＨＣｌ−緩衝１＆（ｐＨ８，５）で平衡化されたＱ−セファ０−ス■−カラム（５０−７０ｍ　ｌ　、直径２５ｃｍ）上に施与した。結合していない物質を平衡化緩衝液で洗浄除去した後、結合した蛋白質を２０ｍＭトリス／ＨＣＩ　（ｐＨ８，５）中の０−ＩＭ　ＮａＣｌ勾配液で溶離させた。約７　ｍ　ｌのフラクションを捕集し、蛋白質含有率及びトロンビン阻害活性を検査した（第１表）。トロンビン阻害活性を有するフラクションを集めた。

第１表：Ｑ−セファロース［Ｆ］−カラムでの分離Ｃ）　アフィニティクロマトグラフィによるトロンビン阻害活性を有する蛋白質の単離Ｑ−セファロース■−カラムの有用フラクションを、１：２で、２０ｍＭ燐酸塩緩衝液（ｐＨ７，５）で稀釈し、トロンビンセファロース（製造は例３に記載）上に施与した。結合しなかった蛋白質の除去の後に、カラムをまず、１０カラム量の２０ｍＭ燐酸塩緩衝液、５００ｍＭ　ＮａＣＩ　（ｐＨ７，５）で洗浄した。これにより、場合によってなお非特異的に吸着された蛋白質が除去された。引続き、特異的に結合したトロンビン阻害剤を、１００ｍＭグリシン／ＨＣＩ（ｐＨ２，８）を用いて、溶離させた。溶離液中に含有したトロンビン阻害活性を測定し、有用フラクションを集めた（第２表）、３０００Ｄ膜（Ｆｉｌｔｒｏｎ　Ｏｍｅｇａ＾１ｐｈａ　Ｃａｔ、　Ｎｏ、　ＡＭ　ＯＯ３０６２）を用いる濃縮の後に、濃縮物を、真空蒸発器中で蒸発乾個させた。

第２表ニトロンビン−セファロースでの分離ｄ）　逆相ＨＰＬＣによるトロンビン阻害剤の精製トロンビンセファロース−クロマトグラフィの有用フラクション（Ｐ３）をＨ２Ｏ中の０．１重量％トリフルオロ酢酸（Ｔ　Ｆ　Ａ）中に溶かし、逆相ＨＰＬＣカラム（Ｂｉｏｒａｄ　ｒｐ　３０４　＠　）上に装入した。カラムを水中の０．１重量％ＴＦＡで５分洗浄した後に、水中の０１重量％ＴＦＡ／アセトニトリル中の０．１重量％ＴＦＡの直線状勾配液を用いて１％／ｗｉｎで分離させた（第１図）。ＨＰＬＣ−カラムから溶離する蛋白質を、２１０ｎｍでのＵＶ検査により測定し、分別させた。個々のフラクション中に含有するトロンビン阻害活性を、溶剤の除去及び水（０，２ｍｊり中への再懸濁の後に測定した（第３表）。

第３表：逆相ＨＰＬＣによる分離トロンビン阻害活性を有するフラクションのアミノ末端配列をペプチドンーケネーター（Ｐｅｐｔｉｄｓｅｑｕｅｎａｔｏｒｓ　；＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、　ＭＯｄｅｌｌ　４７７　Ａ）を用いて測定した。第４表に、第３表の主フラクションＥ。

Ｆ、Ｇ及びＪのアミノ末端配列を示す第４表：　ＨＰＬＣ−フラクションのアミノ酸配列括弧内に記載のアミノ酸は、明白に同定されていない。Ｘは同定できなかったアミノ酸を表わす。

単離されたトロンビン阻害性蛋白質のペプチド−地図化他のアミノ酸部分配列の決定のために、トロンビン阻害活性を有するフラクションを、還元及びピリジルーエチリル化（Ｈｕａｎｇ等のＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９８９　。

Ｖｏｌ、２８．６６１　６６６）の後に、トリプシンーブロテアーゼによる分解に供した。この場合に、蛋白質／プロテアーゼ−比は２０〜４０対１であった。

製造者の指示により、３７℃で４時間プロテアーゼインキュベーションを実施した。得られたペプチドフラグメントを、Ｃ−４−カラム（ｒｐ３０４０　Ｂｉｏ　Ｒａｄ）を用いる逆相ＨＰＬＣにより分離した。このために、カラムを、Ｈ２Ｏ中の０．５重量％ＴＦＡで５分間洗浄した後、１２０分で６０％までのＨ２Ｏ中の０．５重量％ＴＦＡ勾配、アセトニトリル中の０．１重量％ＴＦＡを使用した。２１０ｎｍで検出されたペプチドを別別に捕集し、溶剤の溜去の後に気相シーケンサ−（Ｇａ５ｐｈａｓｅｎｓｅｑｕｅｎｚｅｒ　：＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｍｏｄｅ１４７７Ａ）中で分析した。

第２図は、フラクションＦ（第１図）の消化から得られるトリブチイックペプチドの分離を示す。第５表に、立証されたアミノ酸配列をまとめる。

第５表ニトリプシン分解によるフラクションＦのアミノ酸配列Ｘは天然アミノ酸を表わす。括弧内には、明白に同定することのできなかったアミノ酸が存在する。（Ｄ／Ｆ）は、この位置では、アミノ酸ＡｓｐもＰｈｅも検出されたことを意味する。

例２阻害剤によるトロンビンの抑制の測定トロンビニ／　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を燐酸塩緩衝された塩溶液（ＰＢＳ）（ＮａＣＩ　Ｏ，８９／Ｉ　。

ＨＣＩ　０．２ｑ／ｌ、燐酸ナトリウム　０．１４４９／ｌ、燐酸カリウム　０．２９／ｌ　、Ｉ）Ｈ７，５）中に最終濃度（２５ｍ　Ｕ　／　ｍ　ｌ　）で溶かした。

クロモライム（Ｃｈｒｏｍｏｚｙｍ）　Ｔ　Ｈ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を、Ｈ２Ｏ２０ｍ１１面中に溶かした。

トロンビン溶液５０μｌ及びクロモライム１００μｌ並びに試料又は緩衝液２５ μｌをマイクロ滴定プレートのウェル中に入れた。その後直ちに、０分及び３０分後に、３７℃で４０５１ｍの吸収を測定した。

試料の強力な固有色で、他の対照をトロンビン不含で前記のように処理した。

トロンビンの活性により、色原性着色基質から４０５ｎｍで吸収性の色素が放出される。トロンビン阻害剤によるトロンビンの抑制は、４０５ｒｖでの低められた吸収により認識でき、検量曲線を用いて定量化した。

例３リガントとしてのトロンビンを有するアフィニティカラムの製造ａ）　カンプリンク。

ＣＮＢ　ｒ活性化セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　６　、６９をヌソツ二上テ１　ｍ　ＭＨＣ１２００ｍ　ｌで洗浄した。ゲルを１００ｍＭ　ＮａＨＣＯａ　、５００ｍＭＮａＣ１ｐＨ８，３中に入れ、直ちに、１００ｍＭＮａＨＣＯ３，５００ｍＭ　ＮａＣ１ｐＨ８，３中のトロンビン（Ｓｉｇｍａ）　１００００単位（Ｕｎｉｔｓ）と混合した。

この溶液を４℃で２４時間注意深く振動させた。

ｂ）　ブロッキングニゲル物質を、沈殿の後に１００　ｍＭ　ＮａＨＣＯ８，５００ｍＭ　ＮａＣ１、ｐＨ８，３で洗浄シタ。次イで、セフ　７０−　スを１００ｍＭ　ＮａＨＣＯ３，５０ＱｍＭ　ＮａＣ１、ＩＭ　エタノールアミンｐＨ８，３と共に２時間インキュベートした。

Ｃ）　予備調製：結合してないトロンビンを除去するために、ゲル物質を使用前にもう一度、刀ラム中で、２０倍カラム量のＰＢＳ　（ｐＨ７，４）で洗浄した。

例４分子篩クロマトグラフィによる分子量の測定トロンビンセファ０−スークロマトグラフイの有用フラクションを、精製トロンビン阻害剤の見かけの分子量の測定のために、分子篩カラム（セファ０−ス１２、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上で分離した。次のクロマトグラフィーパラメータを用いた。溶離速度Ｑ、２５　ｍ　ｌ　／ｍｉｎ、検出２８０ｎｍ：フラクションの大きさ０．２５ｍ１、緩衝液　２０ｍＭ燐酸塩緩衝食塩溶液（２０ｍＭ燐酸ナトリウム、０１５Ｍ　塩化ナトリウム、ｐＨ７゜４）。

得られたクロマトグラムを第３図に示す。フラク／コンのトロンビン阻害活性を前記のように測定し、クロマトグラムに記入した。カラムを標準蛋白質で検量することにより、阻害剤の分子量を測定すると、１１２００±１０００ダルトンであった。

例５トリス／トリシン−３ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量の測定（文献：＾ｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１６６　、　３６８−　３　７　９　（１９８７）　、Ｔｒｉｃｉｎｅ−３ｏｄｉｕｍ　Ｄｏｄｅｃｙｌ　Ｓｕｌｆａｔｅ−Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　Ｇｅｌ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅＳｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒａｎｇｅ　ｆｒｏｍ　ｌ　−１０００ｋＤａ、　Ｓｃｈｒａｅｇｅｒ　Ｈ，ａｎｄ　ｖｏｎ　Ｉｓｇｏｗ、Ｇ、　）精製された阻害剤の更なる特徴付けのために、５μ９に相当する少量を、１６％トリス／トリシンゲル（Ｂａｉ　Ｇｍｂｌ（、Ｂｅｎｓｈｅｉｍ）上で分離した。第４図は、このゲルのクマシー・ブリリアント・ブルーによる着色後の結果を示している。ここでは、マーカー蛋白質（第１列及び４列）及び組換えヒルジン（第３列）が標準として機能している。新規阻害剤（第３列）の分子量は５０００±１０００ダルトンで測定された。

例６トロンビン阻害性蛋白質をコード化するＤＮＡ−配列の製造ａ）　ＲＮＡの単離及びｃＤＮＡ−バンクの製造へマディブサ・ンルベストリス種の動物全個体からの全−ＲＮＡを、グアニジウムチオシアネート中での溶解により取得した。この際、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ社のＲＮＡ単離キット（カタログＮｏ。

２００３４５）による材料を用い、かつ指針に従って操作した。

ポリアデニル化されたメツセンジャーＲＮＡを、前記全〜ＲＮＡから、オリゴ（ｄＴ）−アフィニティ分離により選択した。この方法は、Ｐｒｏｍｅｇａ、　Ｍａｄｉｓｏｎ。

Ｗｌ、ＵＳＡ社のｒＰｏｌｙ　ＡＴ　ｔｒａｃｔ　ｍ　ＲＮ　Ａ　ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　５ｙｓｔｅＪによる材料を用い、指針に従って実施した。

ポリアデニル化されたメンセンジャーＲＮＡから、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ　、’　Ｕ　Ｓ　Ａ社のｒＺＡＰ−ｃＤＮＡ合成キット」　（カタログＮｏ、２３７６１１）の材料を用い、指針に従って、ラムダファージ中にバッキングした。

ｂ）　ＰＣＲに関するオリゴヌクレオチドプローブの製造ポリメラーゼ連鎖反応を用いるｃ　ＤＮＡ−フラグメントのクローン化（Ｐ　ＣＲ、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版（１９８９）、　Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　１　等、、　Ｃ３ＨＰｒｅｓｓ１４．１頁以降参照）のために、例１に記載の蛋白質配列のペプチドから出発した。

遺伝子コードを基礎として、ペプチド配列：Ｎｌｌ２−Ｇｌｙ　Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　（位置４−１１）　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　・　１１）から、このコード化されたＤＮＡ−鎖の核酸配列５　’　 −ＧＧＡ　ＡＴＧ　ＧＧＮ　ＡＡＲＧＴＮ　ＣＣＮ　ＴＧＹ　ＣＣ−３’（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２）を、かつ、ペプチド配列・Ｎｌ２−Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｃｙｓ　（位置１９−２６）（ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１３）から、核酸配列。

５　’　−ＴＧＹ　ＧＡＹ　ＴＧＹ　ＧＧＮ　ＧＡＩ？　ＡＡＲＡＴＨＴＧ−３ ’（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４）を引き出すことができる。遺伝子コードの公知の変性の故に、多くの位置で、いくつかのヌクレオチド（Ｎ：Ａ、ｃ、ｃ、Ｔ、Ｙ：Ｃ，Ｔ’；Ｒ：Ａ、Ｇ；Ｈ：Ａ、Ｃ，Ｔ）が使用可能である。従って、ＳＥＱ　ＩＤＮ０１２に関して、２５６倍の、かっｓＥＱ　ＩＤＮｏ・１４に関して、３８４倍の混合コンプレキノティ（Ｇｅｍｉｓｃｈｋｏｍｐｌｅｘｉｔａｅｔ）が生じる。前記配列は、オリゴヌクレオチドとして合成された。

付加的に次のオリゴヌクレオチドが３′プライマーとして合成されたＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５：５’　−ＣＧＡＧＧＧＧＧＡＴＧＧＴＣＧＡＣＧＧＡＡＧＣＧＡＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’：並びにＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６５　’　−ＣＧＡＧＧＧＧＧＡＴＧＧＴＣＧＡＣＧＧ−３’　、並びにＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７５’　−ＧＡＴＧＧＴＣＧＡＣＧＧ＾＾ＧＣＧＡＣＣ−３’この合成は、＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ　Ｔｙｐ　３６０　Ａ　ＤＮＡ−シンセサイザー（５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いて実施した。オリゴヌクレオチドは、保護基の除去の後に、アクリルアミド／尿素−ゲル上でのゲル電気泳動により精製した。

ｃ）　ＰＣＲに関するＤＮＡ−テンプレートの製造ａ）に記載のＲＮＡ−調製の全−ＲＮＡ５μｇ又はポリ（Ａ）′″−ＲＮＡ　１μ９を、オリゴヌクレオチドＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・１５５’　−ＣＧＡＧＧＧＧＧＡＴＧＧＴＣＧＡＣＧＧＡＡＧＣＧＡＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’ １５μ９及び酵素逆トランスクリブターゼを用いて、１重鎖ｃＤＮＡ　（ｌｏ　ｃＤＮＡ）に翻訳した。この場合に、Ｇｉｂｃｏ　Ｂ　ＲＬ　、　Ｅｇ’ｇｅｎｓｔｅｉｎ社（ドイツ）のスーパースクリプト・プレアンプリフィケーンコン・システム（Ｓｕｐｅｒ　５ｃｒｉｐｔ　ＰｒｅａＩＩＩｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ）　（カタログＮｏ、８０８９３Ａ）に依る材料を用い、指針に従って操作した。反応の終了後に、合成生成物を、ＢＩＯ１０１，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ社の「ゲネクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）　ＩＩキット」を用いて、小分子及び過剰のオリゴヌクレオチドから精製した。

ｄ）　ＰＣＲｓ及び部分−ｃ　ＤＮＡ−配列のクローニングポリメラーゼ一連鎖反応を公知のプロトコルに従って実施した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版（１９８９）　、　Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、等、　Ｃ３Ｈ−Ｐｒｅｓｓ、１４．１頁以降参照）。このために、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅ１ｍｅｒ社のｒＤＮＡサーマル・サイクラ−（ＴｈｅｒＩＩａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ）　Ｊを使用した。この際、フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎｎ）　、　Ｍ、　Ａ、等の「フ工／Ｌ／　’／　ヤハテルテン・ブライ７−（ｖｅｒｓｃｈａｃｈｔｅｌｔｅｎｐｒｉｍｅｒ）　Ｊの原理（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ（１９８８）、８５．８９９８−９００２）を用い、フリップ（Ｆｒ１ｔｚ）等の（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、（１９９１）、１９．３７４７）により変更して用いた。

個々には、Ｃ）からの１°ｃＤＮＡを、オリゴヌクレオチドＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：’１２及びＳＥＱ　ＩＤＮ０：１６各々２０ピコモルを用いて増幅させた。この場合の条件は、３５サイクルに関して９５℃で１分；５５℃で２分；７２°Ｃで３分であった。

ＰＣＲ−生成物を、１．２％低融点−アガロース／ＴＢＥ−ゲル上で電気泳動により分離した（ＴＢＥ・１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１００ｍＭホウ酸、２ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８，０）。

このゲルから、油状物（Ｓｃｈｍｉｅｒ）の全長に渡り、約１０個のゲル板（Ｇｅ１５Ｃｈｅｉｂｃｈｅｎ）を切り出し、これらを別々のフラクノコンとして、上昇性分子量のＤＮＡ−フラグメンと共に融解させた。

次いで、これらフラクノコンの少量分を、別々に、オリゴヌクレオチドＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４及びＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７各々２０ピコモルと共に、第２のＰＣＲで使用した。この場合に、アガロース分は、決してＰＣＲ−バッチの１／１ｏ量を越えない。反応条件：３５サイクルに関して９５℃で１分；５０”Ｃで２分；７２℃で３分。

これらフラクションの増幅生成物のゲル電気泳動による分離は、明らかに、第１のＰＣＨの第２ＰＣＨの後の限定されたバンドまでの複雑な生成スペクトルの減少を認識させることができた。

このように選択されたＰＣＲ−生成物を、標準法で溶離させた。ベクターｐＢ１ｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳのＥｃｏＲＶ−切断位置でのサブクローニング及びこのプラスミドのＥ、コリーＤＨ５α中での増殖の後に、クローン（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１８）の配列分析は、３９アミノ酸の開放読取りラスタ（ｏｆｆｅｎｅ　Ｌｅｓｅｒａｓｔｅｒ）　（Ｓ　Ｅ　ＱＩＤ　ＮＯ：１９）を示し、これは、先に記載の蛋白質配列と一致した。

ｅ）　集められたコード化された領域のＰＣＲ及びクローニング全−ｃＤＮＡ−配列を導出するために、もう１つのＰＣＲ増幅を実施した。この反応のためのプライマーとしてオリゴヌクレオチド：５’　−ＧＧＧＧＧＧＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＧＴＴＡＣＡＧＡＴＡＡＴＴＡＴＴＧＣＣ＾ＡＡＧＣ−３’　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋２０）、並びに５’　− ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣ−３’　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　・　２１）を合成した。

この場合に、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋１８中に記載の配列からＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・２０が導出でき、これは、１５８〜１８０の位置の対ストランド（Ｇｅｇｅｎｓｔｒａｎｇｅ）の配列に一致する。付加的にＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０の５′ 末端の１８ヌクレオチドは、５ａｉｌもしくはＢａｍＨＩ切断位置を再構成するはずである。

オリゴヌクレオチドＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２１は、市場の「逆（ｒｅｖｅｒｓｅ）ブライｖ−Ｊ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ　、Ｕ　Ｓ　Ａ　）の配列に一致し、ＵｎｉＺＡＰＸＲランダムファージの配列か“ら導出される。

これら双方のオリゴヌクレオチド及びａ）に記載のテンプレート（ｔｅｍｐｌａｔｅ）としての全一ファージエンリゼートの少量分を用いるＰＣＲは、前記トロンビン阻害剤の完全コード化領域を有するｃＤＮＡ−配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２）を単離した。

個々には、この目的のために、ヘマディブサｃＤＮＡ　、＜ンクの高力価のファーンリゼート（１０９〜１０１０ｐｆｕ／ｍ１り１０１１１を１０分間煮沸し、オリゴヌクレオチドＳＥＱ　ｒＤ　Ｎｏ６２０及び５ＥＱＩＤ　ＮＯ：２１各々２０ピコモルを用いるＰＣＲ反応で増幅させた。この際の条件は、３５サイクルに関して９５°Ｃで１分、５５℃で２分、７２°Ｃで３分、全量１００μｌであった。

ゲル電気泳動分析されたＰＣＲ−生成物を、標準法で溶離させた。ベクターｐＢ１ｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳのＥ　ｃｏＲＶ　−切断位置でのサブクローニング及びこのプラスミドのＥ、コリーＤＨ５α内での増殖の後に、クローン（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２）の配列分析は、７７アミノ酸（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２３）の開放読取りラスタを示し、これは、先に述べた蛋白質配列と一致した。

ｆ）　トロンビン阻害剤の異種表現組換えトロンビン阻害剤の製造のために、まず、アミノ酸配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２３の位置１〜５７をＥ、コリーに典型的なコドン選択の考慮の下に、ヌクレオチド配列内に逆翻訳した。この際に、次のコドン選択を用いた；２水路ヌクレオチド配列を公知方法での化学的オリゴヌクレオチド合成及び酵素的リゲーノコンにより製造した。このオリゴヌクレオチド配列は、Ｘ　ｍｎ　Ｉ −及びＢａωＨ１−競合性末端を有し、Ｅ　コリー表現ベクターｐ　Ｍ　Ａ　Ｌ　−ｐ　２　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）中でクローン化された。

組換えプラスミドを用いて、Ｅ、コリーＤＨ５α細胞を形質転換させた。トロンビン阻害剤は、マルト−スー結合位置を有する融合蛋白質として製造され、ベクター製造者の指示に従って単離及び精製された。

ペリプラスマ表現されたトロンビン阻害剤の濃度は、培地１１当り１２５０単位であった。

第１図〜第４図の記号説明第１図：　ＢｉｏＲａｄ　ｒｐ　３０４　＠カラムでの逆相ＨＰＬＣによるトロンビンセファ０−スの有用フラクション（Ｐ３）の分離。試料を水中の０．１重量％トリフルオロ酢酸中に溶かし、水中の０．１重量％トリフルオロ酢酸での５分間洗浄の後に、水中の０．１重量％ＴＦＡ／アセトニトリル中の０．１重量％ＴＦＡの線状勾配液を用い、１％／ｌ１ｉｎで分離した。トロンビン阻害活性を有するフラクション’（Ａ−Ｊ）を別々に集めた。

第２図・逆相ＨＰＬＣによる有用フラクションＦ（第１図）の典型的フラグメントの分離。切断により得られたペプチドフラグメントを、水中の０．１重量％ＴＦＡでのカラムの５分間洗浄の後に、１２０分間に６０％までの０．１％ＴＦＡ／アセトニトリルの線状勾配液を用いて分離した。２１０ｎｍでの検出を行ない、得られたフラクション（１−６）を溶剤の溜去の後に、気相シーケンサ−（Ｇａ５ｐｈａｓｅｎｓｅｑｕｎｚｅｒ）中で分析した。

第３図二分子篩−カラム（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ　１２　、　Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によるトロンビン阻害剤の見かけの分子量の測定。装入物ニトロンビン−セファロースの有用フラクション：流速：　０．５　ｍ　ｌ　／ａ＋ｉｎ；緩衝液：２０ｍＭ　燐酸ナトリウム、０．１５Ｍ　塩化ナトリウム（ｐＨ７，４）；フラクションの量：２５０μｌ；検出＝２８ＯｎＩ１１０トロンビン阻害活性を有するフラクションは、クロマトグラム（１−−−−−１）で示されている。

第４図ニドリス／トリシン−３ＤＳ−傾斜トレホレースによるトロンビン阻害剤の見かけの分子量の測定。５μ９に相当する少量分を、１６％トリス／トリシン −ゲル（Ｂａｔ−Ｇｍｂ）Ｉ、　Ｂｅｎｓｈｅｉｍ）上で分離させ、クマンー・ブリリアント・ブルーを用いる着色により可視化した（第３列）。分子量を市販の分子量マーカー（第１及び４列）を用いて５０’ＯＯ±１０００ダルトンまで測定した。同様に組換えヒルジンも掲載した（第２列）。

配列リスト（１）一般的情報：（１）出願人：（＾）名称・ＢＡＳＦアクチェンゲゼルシャフト（Ｂ）通り　カールーポソシューンユトラーセ３（Ｃ）市、ルードウインヒスハーフエン（Ｅ）国　ドイツ連邦共和国（Ｆ）郵便コード（ＺＩＰ）：Ｄ−６７０５６（Ｇ）電話：　０６２１／６０４８５２６（＋１）テレファ・ソクスニ０６２１／６０４３１２（Ｉ）テレックス・１７６２１７５１７０（ｉ）発明の名称：陸蛭からの新規トロンビン阻害性蛋白質（ｉ）配列の数：２３（Ｗ）コンピューター読み取り可能形：（＾）媒体型、フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ　ｐｃコンパチブル（Ｃ）オペレーティング　システム・ＰＣ−Ｄ。

Ｓ／ＭＳ−ＤＯ３（Ｄ）ソフトウェア　パテント　イン　リリース＃１０．バージョン＃１．２５　（ＥＰＯ）（マ）通用出願データ。

出願番号・（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１に関する情報（ｉ）配列特徴：（＾）長さ、５７アミノ酸（Ｂ）型、アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（云）配列の種類　蛋白質（ｉ）ハイポセティカル＝ＮＯ（ｌｌ）アンチセンス＝ＮＯ（りフラグメント型　Ｎ−末端フラグメント（η）起源：（Ｂ）株名：　Ｂｌａｎｃｈａｒｄ（Ｄ）分化の程度：成熟体（Ｆ）組織の種類：動物全個体（ｉ＋）配列の特徴：（＾）名称／記号：蛋白質（Ｂ）存在位置・１．　５７（蕩）配列：ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・１゜Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　ＧｌｕＧｌｕ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　ｌｉｅ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２１こ関する情報：（１）配列特徴：（Ｄ）トポロジー、直鎖状（ｉ）配列の種類　ペプチド（ｉ）ハイポセティカル：Ｎ。

（−）アンチセンス＝Ｎ。

（マ）フラグメント型：Ｎ−末端フラグメント（Ｉｉ）起源：（＾）生物名：へマディブサ・シルベストリス（Ｂ）株名：　Ｂｌａｎｃｈａｒｄ（Ｄ）分化の程度：成熟体（Ｆ）組織の種類：動物全個体（ｒｌ）配列の特徴：（Ａ）名称／記号：ペプチド（Ｂ）存在位置＋１．．４５（ｒ）配列：ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・２：（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３に関する情報・（ｉ）配列特徴・（＾）長さ＝４４アミノ酸（Ｂ）型、アミノ酸（Ｄ）トポロジー　直鎖状（６）配列の種類、ペプチド（ｉ）ハイポセティカル・Ｎ。

（ｊ）アンチセンス　Ｎ。

（マ）フラグメント型二Ｎ−末端フラグメント（Ｉｉ）起源：（＾）生物名：へマディプサ・シルベストリス（Ｂ）株名：　Ｂｌａｎｃｈａｒｄ（Ｃ）分化の程度：成熟体（Ｆ）組織の種類：動物全個体（■）配列の特徴：（＾）名称／記号：ペプチド（Ｂ）存在位置・１．．４４（ｌＸ）配列の特徴：（＾）名称／記号：　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ（Ｂ）存在位置：１２（Ｄ）他の情報：　／　１ａｂｅｌｊ　ａ＋ｏｂｉｑｕｉｔｙ／　ｎｏｔｅ＝　 ”　ＸａａはＰｒｏ又はＬｅｕ”（１＋）配列の特徴・（Ａ）名称／記号　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ（Ｂ）存在位置：２３（Ｄ）他の情報：　／　１ａｂｅｌ＝＝　ａｍｂｉｑｕｉｔｙ／　ｎｏｔｅ＝　 ”　ＸａａはＧｌｕ又はＴｒｐ”（［）配列の特徴・（＾）名称／記号−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ（Ｂ）存在位置＝２４（Ｄ）他の情報：　／　１ａｂｅｌ＝　ａｍｂｉｑｕｉｔｙ／　ｎｏｔｅ＝　” 　ＸａａはＬｙｓ、＾ｓｎ又はＡｓｐ” （Ｘｌ）配列：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３：Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｘａａ　Ｘａａ工ｌｅ　Ｃｙｓ　Ｌａｕ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　ＣｙｓＡｓｎ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　５ｅｒ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：４に関する情報・（１）配列特徴（＾）長さ・２５アミノ酸（Ｂ）型、アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（６）配列の種類、ペプチド（ｉ）ハイポセティカル：　Ｎｏ’ （１）アンチセンス、Ｎ。

（マ）フラグメント型−Ｎ−末端フラグメント（−）起源（＾）生物名　へマディプサ・シルベストリス（Ｂ）株名：　Ｂｌａｎｃｈａｒｄ（ｉ＋）配列の特徴（Ａ）名称／記号、ペプチド（Ｂ）存在位置　１．２５（■）配列の特徴（Ａ）名称／記号−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ（Ｂ）存在位置　２２（Ｄ）他の情報：　／　１ａｂｅｌ＝　ｕｎｖｅｒｉｆｉｅｄ／ｎｏｔｅ＝“位置は証明されず” （ｊ＋）配列の特徴：（Ａ）名称／記号：　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ（Ｂ）存在位置：２４（Ｄ）他の情報：　／　１ａｂｅｌ＝　ｕｎｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ／ｎｏｔｅ＝ “位置は同定されず“ （辻）配列の特徴：（Ａ）名称／記号：　Ｌｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ（Ｂ）存在位置：２５（Ｄ）他の情報：　／　１ａｂｅｌ＝　ｕｎｖｅｒｉｆｉｅｄ／ｎｏｔｅ＝“位置は証明されず” （Ｘｌ）配列：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４：Ｘ１ｅ　Ｍｑ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｍｅｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｆ’ｒｏ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｙｌ　５　１０　１５Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｘａａ工１ｅ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５１：関ｔ６情報：（：）配列特徴：（＾）長さ＝４３アミノ酸（Ｂ）型・アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（６）配列の種類　ペプチド（ｉ）ハイポセティカル：Ｎ。

Ｄ）アンチセンス＝Ｎ。

（マ）フラグメント型二Ｎ−末端フラグメント（町）起源：（＾）生物名：ヘマデイプサ・シルベスト１Ｊス（Ｂ）株名：　Ｂｌａｎｃｈａｒｄ（−）配列の特徴：（＾）名称／記号：ペプチド（Ｂ）存在位置：１．．４３（１＋）配列の特徴：（Ａ）名称／記号：　１ｉｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ（Ｂ）存在位置：１．．４３（Ｄ）他の情報：　／　１ａｂｅｌ＝　ｕｎｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ／ｎｏｔｅ＝ “Ｘａａ位置は同定されず” （ａ）配列の特徴：（＾）名称／記号：　ＭｏｄｉｆｉＭ−ｓｉｔｅ（Ｂ）存在位置：３９．．４０（Ｄ）他の情報：　／　１ａｂｅｌ＝　ｕｎｖｅｒｉｆｉｅｄ／ｎｏｔｅ＝“位置は立証されず” （１）配列：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６１．関する１冑報。

（１）配列特徴：（＾）長さ、２５アミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（五）配列の種類・ペプチド（ｉ）ハイボセティカル：ＮＯ（鯉）アンチセンス二ＮＯ（マ）フラグメント型：Ｎ−末端フラグメント（１）起源：（＾）生物名：ヘマディブサ・シルベストリス（Ｂ）株名：　Ｂｌａｎｃｈａｒｄ（α）配列の特徴：（＾）名称／記号：ペプチド（Ｂ）存在位置：１．．２５（［）配列の特徴・（Ａ）名称／記号：　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ（Ｂ）存在位置：１．．２５（Ｄ）他の情報：　／　１ａｂｅｌ＝　ｕｎｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ／　ｎｏｔｅ＝　”　Ｘａａ　：位置は同定されず” （ｉ＋）配列の特徴：（Ａ）名称／記号：　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ（Ｂ）存在位置：１８．．２２（Ｄ）他の情報：　／　１ａｂｅｌ＝　ｕｎｖｅｒｉｆｉｅｄ／ｎｏｔｅ＝“位置は証明されず” （ｍ）配列の特徴：（Ａ）名称／記号　１１ｏｄｉ　ｆｉｅｄ−ｓｉ　ｔｅ（Ｂ）存在位置　２５（Ｄ）他の情報二／　１ａｂｅｌ＝　ｕｎｖｅｒｉｆｉｅｄ／ｎｏｔｅ＝“位置は証明されず” （ｆｉ）配列：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６：（２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・７に閤する情報。

（１）配列特徴：（＾）長さ、１７アミノ酸（Ｂ）型　アミノ酸（Ｄ）トポロン−直鎖状（ｊ）配列の種類　ペプチド　゛（ｉ）ハイボセティカル　ＮＯ（評）アンチセンス・Ｎ。

（マ）フラグメント型　Ｎ−末端フラグメント（１）起源（＾）生物名、ヘマデイブサ・シルベストリス（Ｂ）株名−Ｂｌａｎｃｈａｒｄ（ＩＩ）配列の特徴（Ａ）名称／記号　ペプチド（Ｂ）存在位置　１　１７（ＩＩ）配列の特徴（＾）名称／記号：　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ（Ｂ）存在位置　２（Ｄ）他の情報：　／　１ａｂｅｌ＝　ｕｎｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ／ｎｏｔｅ＝ “位置は同定されず” （ｉ＋）配列の特徴。

（＾）名称／記号：　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ（Ｂ）存在位置＋１６．．１７（Ｄ）他の情報：　／　１ａｂｅｌ＝　ｕｎｖｅｒｉｆｉｅｄ／ｎｏｔｅ＝”位置は証明されず” （１）配列・ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・７：１１ｅＸａａＰｈｅＧｌｙｌイｅ亡ＧｌｙＬｙｓＶａｌＰｒｏＣｙｓＬｅｕＡｓｐＧｌｙＧｌｕＶａＬＧＬｙｙｒ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８に関する情報：（ｉ）配列特徴（Ａ）長さ＝１５アミノ酸（Ｂ）型　アミノ酸（Ｄ）トポロジー　長鎖状（ｊ）配列の種類　ペプチド（ｉ）ハイポセティカル　Ｎ。

（ｉ、）アンチセンス　ＮＯ（マ）フラグメント型・中間部フラグメント（η）起源。

（＾）生物名　へマディプサ・シルベストリス（Ｂ）株名　Ｂｌａｎｃｈａｒｄ（１）配列の特徴（Ａ）名称／記号　ペプチド（Ｂ）存在位ｆｉ：１．．１５（！Ｉ）配列：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８：（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９に関する情報：（１）配列特徴。

（＾）長さ＝２０アミノ酸（Ｂ）型　アミノ酸（Ｄ）トポロジー、直鎖状（ｉ）配列の種類、ペプチド（ｉ）ハイポセティカル：Ｎ０（ｋ）アンチセンス、ＮＯ（マ）フラグメント型：中間部フラグメント（η）起源（＾）生物名・ヘマディプサ・シルベストリス（Ｂ）株名：　Ｂｌａｎｃｈａｒｄ（σ）配列の特徴（＾）名称／記号　ペプチド（Ｂ）存在位置：１．．２０（ｉ）配列の特徴。

（＾）名称／記号：　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ（Ｂ）存在位置　５（Ｄ）他の情報　／　１ａｂｅｌ＝　ａｍｂｉｑｕｉｔｙ／ｎｏｔｅ＝“位置５はＰｈｅとしても同定された“ （辻）配列の特徴・（＾）名称／記号：　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ（Ｂ）存在位置　１７（Ｄ）他の情報：　／　１ａｂｅｌ　＝　ａｍｂｉｑｕｉｔｙ／ｎｏｔｅ＝“位置１７はＡｓｐとしでも同定された” （＋り配列の特徴：（＾）名称／記号：　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ（Ｂ）存在位置、１６（Ｄ）他の情報：　／　１ａｂｅｌ＝　ｕｎｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ／ｎｏｔｅ＝ “位置は同定されず” （−）配列：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９：ｖａｌ　Ｐｒｏ　ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｖａｉ　ＧＬｙ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｘａａｌ　５　１０　１５Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０に関する情報：（ｉ）配列特徴：（＾）長さ：２２アミノ酸（Ｂ）型、アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（１１）配列の種類：ペプチド（ｉ）ハイポセティカル、Ｎ０Ｏ）アンチセンス　Ｎｏ（１）フラグメント型、中間部フラグメント（η）起源（＾）生物名・ヘマディプサ・シルベストリス（Ｂ）株名：　Ｂｌａｎｃｈａｒｄ（ｆｆ）配列の特徴（＾）名称／記号：ペプチド（Ｂ）存在位置・１．　２２（α）配列の特徴：（＾）名称／記号：　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ（Ｂ）存在位置、２１（Ｄ）他の情報：　／　１ａｂｅｌ＝　ｕｎｖｅｒｉｆｉｅｄ／ｎｏｔｅ＝“位置は証明されず” （ｉ＋）配列の特徴・（＾）名称／記号　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ（Ｂ）存在位置：２２　゛（Ｄ）他の情報：　／　１ａｂｅｌ＝　ｕｎｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ／ｎｏｔｅ＝ “位置は同定されず” （＋ｉ）配列　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０：Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｘａａ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１に関する情報（１）配列特徴（Ａ）長さ　８アミノ酸（Ｂ）型・アミノ酸（Ｄ）トポロジー　直鎖状（ｊ）配列の種類　ペプチド（ｉ）ハイポセティカル：ＮＯ（實）アンチセンス二ＮＯ（マ）フラグメント型・中間部フラグメント（＋ｉ）起源：（＾）生物名：ヘマディブサ・シルベストリス（Ｂ）株名：　Ｂｌａｎｃｈａｒｄ（Ｄ）分化の程度、成熟体（Ｆ）組織の種類：動物全個体（Ｘｌ）配列：ＳＥＱ　ｒＤ　ＮＯ：１１：Ｇｌｙ　Ｈｅｉ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｐｒ。

（２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・１２に関する情報二（１）配列特徴（Ａ）長さ　２３塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数、−末鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（６）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉ）ハイポセティカル：Ｙｅｓ（ｊ）アンチセンス・ＮＯ（！Ｉ）起源− （Ａ）生物名　へマディブサ・シルベストリス（Ｂ）株名：　Ｂｌａｎｃｈａｒｄ（ｎ）配列　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２：ＧＧＡＡＴＧＧＧＮＡ　ＡＲＧＴＮＣＣＮＴＧ　ＹＣＣ２３（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３に関する情報＝（＋）配列特徴：（Ａ）長さ：８アミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（Ｄ配列の種類：ペプチド（ｉ）ハイポセティカル：Ｎ。

０）アンチセンス＝Ｎ。

（１）フラグメント型・中間部フラグメント（＋ｉ）起源：（＾）生物名：ヘマディブサ・シルベストリス（Ｂ）株名：　Ｂｌａｎｃｈａｒｄ（Ｄ）分化の程度：成熟体。

（Ｆ）組織の種類・動物全個体（−）配列：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３：（２）ＳＥＱ　ｒＤ　ＮＯ：１４に関する情報＝（１）配列特徴・（＾）長さ：２３塩基対（Ｂ）型・核酸（Ｃ）鎖の数ニー末鎖（Ｄ）トポロジー　直鎖状（ｉ）配列の種類　［）　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏａ＋１ｃ）（ｉ）ハイポセティカル：Ｙｅｓ（鯉）アンチセンス二Ｎ。

（１）起源：（＾）生物名：へマディプサ・シルベストリス（Ｂ）株名：　Ｂｌａｎｃｈａｒｄ（１）配列：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４：ＴＧＹＧＡＹＴＧＹＧ　ＧＮＧＡＲ＾＾ＲＡＴ　ＨＴＧ　２３（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５に関する情報：（１）配列特徴：（Ａ）長さ：４５塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー末鎖（Ｄ）トポロンー：直鎖状（ｊ）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏ＋ｅｉｃ）（ｉ）ハイポセティカル：ＹｅｓＯ）アンチセンス二ＮＯ（！ｌ）配列：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５：ＣＧＡＧにＧＧＧＡＴ　ＧＧＴＣＧＡＣＧＧＡ　ＡＧＣＧＡＣＣＴＴＴ　ＴＴＴＴπｒｒｒｒ　ＴＴＴｒｒ　４ｓ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６に関する情報：（１）配列特徴：（＾）長さ；１９塩基対（Ｂ）型・核酸（Ｃ）鎖の数ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（５）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎮状（ｉ）配列の種類、蛋白質（））配列：ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１９Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　ＰｈｅＧｌｕ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　ＧＬｕ　Ｌｙｓ〕５（２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・２０に関する情報：（１）配列特徴。

（＾）長さ：４２塩基対（Ｂ）型・核酸（Ｃ）鎖の数・−末鎖（Ｄ）トポロジー・直鎖状（ｉ）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉ）ハイポセテイカル　Ｎ。

Ｏ）アンチセンス　Ｎ。

（１）起源：（Ａ）生物名、ヘマデイブサ・シルベスト１Ｊス（Ｂ）法名：　Ｂｌａｎｃｈａｒｄ（ｒ）配列　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０ＧＧＧＧＧＧＧＴＣＧ　ＡＣＧＧＡＴＣＣＧＴ　ＴＡＣＡＧＡＴＡＡＴ　ＴＡＴＴＧＣＣＡＡＡ　ＧＣ４２（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２１に関する情報（＋）配列特徴。

（Ａ）長さ、１８塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（社）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｓ＋１ｃ）（ｉ）ハイポセテイカル　Ｎｏ（１）アンチセンス二Ｎ０（−）配列：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２１：ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧ　ＣＴＡＴＧＡＣＣ１８（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２に関する情報＝（＋）配列特徴：（Ａ）長さ＝３５３塩基対“ （Ｂ）型、核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖：（Ｄ）トポコノ−。直鎖状（五）配列の種類：ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡ（ｉ）ハイポセテイカル・Ｎｏ（−）アンチセンス＝ＮＯ（ｗ）起源：（＾）生物名；へマデイプサ・シルベストリス（Ｂ）法名：　Ｂｌａｎｃｂａｒｄ（Ｄ）分化の程度　成熟体（Ｆ）組織の種類・動物全個体（媚）直接の起源：ＦＩＧ、１時間（ｍｉｎ、）ＦＩＧ、２２０　７ＬＯ６０１３０１００１２０時間（ｍｉｎ、）ＦＩＧ、３ＦｒＣ，、’１フロントページの続き（５１）Ｉｎｔ、Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｐ　２１１０２　Ａ　９２８２−４Ｂ／／（Ｃ１２Ｐ　２１１０２　ＡＣ１２Ｒ１：１９）（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、　ＣＡ、ＪＰ、　ＵＳＩ（７２）発明者　クレーガー、　プルクハルトドイツ連邦共和国　Ｄ　−６７０３リムブルガーホーフ　ドナースベルクシュトラーセ（７２）発明者　フリードリッヒ、トーマスドイツ連邦共和国　Ｄ−６１００ダルムシュタット　ザールバウシュトラーセ　２２−２４

Claims

【特許請求の範囲】

１．ヘマディプサ塵の陸棲からの、アミノ酸配列【配列があります】（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）又はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１のＣ末端の１〜１２アミノ酸の短縮により得られるアミノ酸配列を有する、トロンビン阻害作用限有する蛋白質。
２．配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２を有する請求項１に記載の蛋白質。
３．トロンビン阻害作用を有すろ蛋白質をコードし、次の群：ａ）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ０２２に記載の構造のＤＮＡ−配列ｂ）請求項１又は２に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ−配列、及びｃ）標準的条件下でＤＮＡ−配列ａ）又はｂ）とのハイブリド化により形成されるＤＮＡ−配列から選択された、ＤＮＡ−配列。
４．請求項３に記載のＤＮＡ−配列を有する表現ベクター。
５．請求項３に記載のＤＮＡ−配列によりコードされる蛋白質を、病気の治療に使用すること。
６．請求項３に記載のＤＮＡ−配列によりコードされる蛋白質１種以上及びもう１秘の凝固阻害因子を含有する医薬品。
７．もう１種の凝固阻害因子としてヒルジンが使用される、請求項６に記載の医薬品。