DE4234921A1 - Neues, die Gerinnungszeit des Blutes verlängerndes Protein aus dem Landblutegel Haemadipsa sylestris - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues, die Gerinnungszeit des Blutes verlängerndes Protein aus dem Landblutegel Haemadipsa sylvestris sowie Verfahren zu dessen Herstellung.

Gerinnungshemmstoffe sind wichtige therapeutische Substanzen, die beispielsweise zur Prophylaxe oder Behandlung von Thrombosen oder arteriellen Reokklusionen verwendet werden. Die Hemmung der Gerinnung kann über verschiedene Mechanismen erfolgen. So gibt es Stoffe, die Thrombin hemmen; beispielsweise Hirudin, oder Stoffe, die den Faktor Xa hemmen, beispielsweise TAP (Waxman et al., Science 248, 593-596, 1990) oder Antistasin (Tuszynski et al., J. Biol. Chem., 262, 9718-9723, 1989).

Es wurde nun ein neues gerinnungshemmendes Protein aus dem Land­ blutegel Haemadipsa sylvestris isoliert.

Das neue Protein (PT-Faktor) besitzt folgende physikochemischen Eigenschaften.

Im Tris/Tricine-SDS Polyacrylamidgel zeigt das Protein zwei Banden, denen eine Molekularmasse von 8200 ± 2000 Da und 18600 ± 2000 Da zugeordnet wird (Abb. 2).

Das Protein zeigt im APTT-Test (Beispiel 8a) und im PT-Test (Beispiel 8b) jeweils signifikante Verlängerungen der Plasma­ gerinnungszeit. Weiterhin zeigt es in einem Faktor Xa-Inhibi­ tionstest (Beispiel 8d) eine spezifische Faktor Xa-Hemmung. In einem analogen Faktor VII-Hemmtest (Abb. 3b) wird ebenfalls eine Hemmwirkung festgestellt; allerdings kann diese auch indirekt über die Hemmung von Faktor Xa zustandekommen.

Folgende N-terminale Aminosäuresequenz wurde von den Proteinen bestimmt:
A-Val-Lys-Phe-Cys-Gly-His-Pro-Leu-Ser-Leu-Pro-Thr-Ala-Leu-Cys- Ala, worin A eine nicht eindeutig zu bestimmende Aminosäure darstellt.

Die neuen Proteine lassen sich aus Landblutegeln der Gattung Haemadipsa isolieren. Hierzu werden die Egel zweckmäßigerweise in einem Puffer bei pH 6 bis 9, vorzugsweise pH 7 bis 8 aufgenommen und mit einem Homogenisator, vorzugsweise einem Mixer, homogeni­ siert. Anschließend werden die unlöslichen Bestandteile abge­ trennt, bevorzugt abzentrifugiert.

Aus der so erhaltenen Lösung können die Proteine weiter durch chromatographische Methoden, bevorzugt Ionenaustauschchromato­ graphie und/oder reversed phase HPLC, gereinigt werden.

Die Reinigung der Proteine kann über die in Beispiel 8 beschrie­ benen Aktivitätstests verfolgt werden.

Besonders geeignet zur Herstellung der erfindungsgemäßen Proteine sind gentechnische Verfahren.

Hierzu wird in an sich bekannter Weise eine cDNA-Genbank aus dem Egel angelegt. Aus dieser Genbank kann das für das erfindungs­ gemäße Protein codierende Gen isoliert werden, indem man bei­ spielsweise eine DNA-Probe herstellt, deren Sequenz von der oben beschriebenen N-terminalen Aminosäuresequenz durch Rücküber­ setzung gemäß dem genetischen Code erhalten wird. Durch Hybridi­ sierung mit dieser DNA-Probe läßt sich das entsprechende Gen auf­ finden und isolieren.

Für die Herstellung des entsprechenden Gens kann aber auch die Polymerase-Chain-Reaction (PCR)-Technik eingesetzt werden. Beispielsweise läßt sich mit Hilfe eines Primers, dessen Sequenz durch Rückübersetzung aus der oben beschriebenen N-terminalen Aminosäuresequenz erhalten wurde, und eines zweiten Primers, dessen Sequenz komplementär zum 3′-Ende des cDNA-Genfragments ist, bevorzugt mit der Sequenz Poly(dT), das cDNA-Genfragment für das erfindungsgemäße Protein durch PCR-Technik herstellen. Das entsprechende Gen läßt sich auch isolieren, indem man eine Expressionsgenbank von Egeln anlegt und diese mit einem Anti­ körper, der gegen das erfindungsgemäße Protein gerichtet ist, absucht.

Weitere geeignete DNA-Sequenzen sind solche, die zwar eine andere Nukleotidsequenz besitzen, die aber infolge der Degeneration des genetischen Codes für die erfindungsgemäße Polypeptidkette oder Teile davon codieren. Weiterhin sind solche DNA-Sequenzen geeig­ net, die für gerinnungshemmende Proteine codieren, und die unter Standardbedingungen mit den obengenannten Nukleotidsequenzen hybridisieren. Die experimentellen Bedingungen für DNA-Hybridi­ sierung sind in Lehrbüchern der Gentechnik, beispielsweise in J. Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrieben.

Unter Standardbedingungen sind beispielsweise Temperaturen zwischen 42 und 58°C in einer wäßrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 und 1×SSC (1×SSC: 0,15M NaCl, 15 mM Natriumcitrat pH 7,2) zu verstehen.

Nachdem das entsprechende Gen isoliert worden ist, kann es durch gentechnische Verfahren in Organismen, z. B. in Bakterien, Hefen oder höheren eukaryontischen Zellen, mit Hilfe eines Expressions­ vektors in an sich bekannter Weise exprimiert werden.

Aus diesen rekombinanten Wirtssystemen läßt sich das Protein aufgrund der oben beschriebenen physikochemischen Eigenschaften isolieren.

Die generelle Vorgehensweise zur gentechnischen Herstellung eines neuen Proteins bei bekannter Aminosäurepartialsequenz ist in Lehrbüchern der Gentechnologie, beispielsweise E.L. Winnacker, Gene und Klone, Verlag Chemie, Weinheim, 1984, beschrieben. Die experimentellen Bedingungen für die einzelnen Verfahren, wie beispielsweise Anlegen einer Genbank, Hybridisierung, Expression eines Gens, sind bei J. Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrieben.

Das erfindungsgemäße Protein wird bevorzugt in Form seiner pharmazeutisch annehmbaren Salze verwendet.

Das neue Protein besitzt blutgerinnungshemmende Eigenschaften. Es kann beispielsweise zur Prophylaxe von Thrombosen oder arteriel­ len Reokklusionen, zur Behandlung von Thrombosen, zur Konser­ vierung von Blut oder bei der extrakorporalen Zirkulation verwen­ det werden.

Das neue Protein ist ein wirksamer Gerinnungshemmer. Es kann allein oder auch zusammen mit bekannten gerinnungshemmenden Faktoren, beispielsweise Thrombininhibitoren wie Hirudin, als Arzneimittel verwendet werden.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter ver­ anschaulicht.

Beispiel 1 Reinigung des PT-Faktors aus Landegeln Gewinnung von Egelhomogenaten

150 g lebende Landegel (Haemadipsa sylvestris) wurden in 400 ml 20 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,4) mit einem Mixer bei 4°C 10 Minuten homogenisiert. Das Homogenat wurde 15 Minuten bei 2000 U/min (Sorvall RC-5B, Rotor GS-3) und dann, nach Entfernen des Niederschlags 30 Minuten bei 8000 U/min zentrifugiert. Der Niederschlag wurde verworfen und der Überstand mit 50 mM Tris(hydroxymethyl)-amino-methan/HCL-Puffer pH 8,5 (Tris/HCI-Puf­ fer) auf ein Volumen von etwa 600 ml verdünnt.

Die Proteinlösung hatte ein Volumen von 580 ml, die Protein­ konzentration betrug 4,49 mg/ml und die thrombininhibierende Aktivität betrug 22,2 U/ml.

Die Gerinnungszeit (APTT, siehe Beispiel 8) des Blutes wurde in einer 1 : 10 Verdünnung um ca. 200 sec verlängert und die partielle Thromboplastinzeit (PT) wurde in einer Verdünnung von 1 : 10 um ca. 60 sec verlängert.

Alternativ kann das neue Protein aus Homogenaten von Egelköpfen aufgereinigt werden. Die Egel wurden dazu zunächst dekapitiert und die so gewonnenen Kopfpräparate in analoger Weise homo­ genisiert. Die Aufreinigung aus Egelköpfen hat den Vorteil, daß das Homogenat bei etwa gleicher Aktivitätsmenge eine geringere Proteinmenge enthält. Das neue Protein ist also hier bereits in einer höheren Reinheit vorhanden. Weiterhin wurde im Kopf­ homogenat eine deutlich verringerte proteolytische Aktivität bestimmt. Nachteil der Isolierung aus Egelköpfen ist die limitierte Substanzmenge.

Beispiel 2 Auftrennung von Landegel-Homogenaten durch Ionenaustausch- Chromatographie

Die aus den Egelhomogenaten erhaltene Proteinlösung wurde auf eine mit 50 mM Tris/HCI-Puffer pH 8,5 äquilibrierte Q-Sepharose®-Säule (50-100 ml, 2,5 cm Durchmesser) appliziert. Nach dem Wegwaschen nicht gebundenen Materials mit dem Äquili­ brierungspuffer wurden die gebundenen Proteine mit einem Gradienten von 0-1 M NaCl in 20 mM Tris/HCl pH 8,5 eluiert. Es wurden Fraktionen von ca. 7 ml aufgefangen und auf Proteingehalt, thrombininhibitorische Aktivität, APTT- und PT-verlängernde Aktivität untersucht. Fraktionen, in denen keine oder geringe Antithrombin-Aktivität, dafür aber hohe APTT- und PT-verlängernde Aktivität gemessen wurde, wurden vereinigt (Abb. 1).

Das neue Protein eluiert bei einer Salzkonzentration von 300 bis 500 mM NaCl von der Säule.

Beispiel 3 Reinigung des PT-Faktors durch Ionenaustauschchromatographie an S-Sepharose FF

Die Wertfraktion der Q-Sepharose-Chromatographie wurde mit Hilfe einer 3000 D Membran- (Filtron Omega Alpha Cat. No. AM003062) kon­ zentriert und auf 20 mM Bernsteinsäure-Puffer pH 4,0 umgepuffert oder aber einfach mit dem Bernsteinsäurepuffer pH 4,0 verdünnt und der pH-Wert, falls erforderlich, nachgestellt. Diese Fraktion wurde auf eine, mit 20 mM Bernsteinsäure äquilibrierte S-Sepharose FF-Säule (Durchmesser 1,5-2,5 cm, Volumen 10-30 ml) mit einem Fluß von 40-80 ml/h aufgetragen. Nach dem Wegwaschen nicht gebundenen Materials mit Äquilibrierungspuffer wurden die gebundenen Proteine mit Hilfe eines linearen Gradienten von 0 bis 1 M NaCl in 20 mM Bernsteinsäure pH 4,0 von der Säule eluiert. Die Elution wurde bei 280 nm im UV verfolgt und Fraktionen von 3-7 ml Volumen aufgefangen. Die erhaltenen Frak­ tionen wurden auf PT-verlängernde Aktivität untersucht und die entsprechend aktiven Fraktionen wurden vereinigt. Der neue Faktor eluierte unter diesen Bedingungen zwischen 400 und 700 mM NaCl von der Säule. Zur Vorbereitung der weiteren Reinigung des PT-Faktors wurde die Wertfraktion zunächst über eine 3000 D Membran (Filtron Omega Alpha Cat. No. AM003062) konzentriert und schließlich in einem Vakuum-Konzentrator bis zur Trockne ein­ geengt.

Beispiel 4 Reinigung der PT-verlängernden Aktivität durch reversed phase (r) HPLC

Die Wertfraktion der S-Sepharose-Chromatographie wurde in dem kleinstmöglichen Volumen 0,1gew.-%iger Trifluoressigsäure ge­ löst und auf einer reversed phase (r)HPLC Säule (BioRad rp304) nach 5minütigem Spülen mit 0,1gew.-%iger Trifluoressigsäure mit Hilfe eines linearen Gradienten (0,1gew.-%ige TFA in Wasser/ 0,1gew.-%ige TFA in Acetonitril in 65 min auf 0,1gew.-%ige TFA in 50% Acetonitril) aufgetrennt. Die von der HPLC-Säule eluierenden Proteine wurden durch UV-Detektion bei 210 nm erfaßt und mit der Hand fraktioniert. Die in den einzelnen Fraktionen enthaltene PT-verlängernde Aktivität wurde nach Entfernen des Lösungsmittels und Resuspendierung in Wasser bestimmt. Der PT-Faktor eluierte unter diesen Bedingungen zwischen 20 und 28% Acetonitril von der Säule.

Beispiel 5 Aminoterminale Sequenz des PT-Faktors

Die aminoterminale Sequenz des PT-Faktors wurde mit Hilfe eines Peptidsequenators (Applied Biosystems, Modell 477A) bestimmt. In den Eluaten der rp304-(r)HPLC-Säule wurde die folgende Amino­ säure-Sequenz 1 bestimmt:
NH₂-XVKFVGHPLSLPTALXA . . . , wobei X eine nicht eindeutig zu bestimmende Aminosäure darstellt. Nach Reduktion und Umsetzung mit Vinylpyridin (Huang et al., Biochemistry 1989, Vol. 28, 661-666) konnte von dieser Fraktion die Sequenz 2 bestimmt werden:
NH₂-XVKFCGHPLSLPTALCA . . . , wobei X eine nicht eindeutig zu identi­ fizierende Aminosäure, möglicherweise ein Asparaginsäurerest, darstellt. Das in Position 5 der Sequenz 1 identifizierte Valin ist dabei, ebenso wie die in Position 16 der Sequenz 1 nicht näher zu bestimmende Aminosäure, eindeutig als pyridylethyliertes Cystein identifiziert worden.

Beispiel 6 Peptide-Mapping des isolierten PT-verlängernden Proteins

Zur Bestimmung weiterer Aminosäureteilsequenzen wurden die PT-verlängernden Fraktionen aus Beispiel 4 einer Reduktion und Pyridyl-Ethylierung (Huang et al., Biochemistry, 1989, Vol. 28, 661-666) unterworfen. Der Reaktionsansatz wurde anschließend an einer C-18 (r)HPLC-Säule (Nucleosil; Macherey und Nagel) rechromatographiert. Nach Entfernen des Lösungsmittels wurde der reduzierte und vinylpyridylierte PT-Faktor einer Spaltung durch die Protease Trypsin (Boehringer Sequence Grade) unterworfen. Das Protein/Protease-Verhältnis betrug dabei 20-40 zu 1.

Die Protease-Inkubation wurde 16 Stunden bei Raumtemperatur nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Die erhaltenen Peptid­ fragmente wurden durch (r)HPLC an einer C-18-Säule aufgetrennt. Dazu wurde, nachdem die Säule 5 min mit 0,1gew.-%iger TFA in Wasser gespült worden war, ein linearer Gradient von 0,1gew.-%iger TFA in Wasser in 120 min auf 60% 0,1gew.-%iger TFA in Acetonitril bei einem Fluß von 0,3 ml/min verwendet. Die bei 210 nm detektierten Peptide wurden getrennt aufgefangen und nach Abdampfen des Lösungsmittels im Gasphasensequenzer (Applied Biosystems Modell 477A) analysiert.

In der Tabelle sind die nachgewiesenen Sequenzen der einzelnen Fraktionen aufgeführt:

Fraktion
aminoterminale Sequenz
1
FCGHPL . .
2	SLPTAL(I) . .
3	SLPTALCA . .

Beispiel 7 Bestimmung der Molekularmasse durch Tris/Tricine-SDS-Polyacryl­ amid Gel Elektrophorese

Die Elektrophorese wurde, wie von Schägger und Jagow (Analytical Biochemistry, 166, 368-379 (1987)) beschrieben, durchgeführt. Ein Aliquot (20 µg) wurde auf einem 16%igen Tris/Tricine Gel (BAI GmbH, Bensheim) aufgetrennt. Abb. 3 zeigt das Ergebnis nach Färben des Gels mit Coomassie Brillant Blau (A) bzw. Silber (B). Das neue Protein (A: Spur 2; B: Spur 2) zeigt zwei Banden mit Molekularmassen von 8200 ± 1000 und 18 600 ± 2000 Da.

Beispiel 8 Angriffspunkt des neuen Proteins in der Gerinnungskaskade

Der neue Faktor wurde in verschiedenen Assaysystemen getestet, um festzustellen, wie und welche Faktoren in der Koagulationskaskade durch ihn inhibiert werden.

• a) APTT (= aktivierte partielle Thromboplastinzeit) zum Nachweis einer antikoagulatorischen Aktivität in der intrinsischen Gerinnungskaskade.
  Zu testende Proben wurden in 50 µl humanem Plasma (z. B. Preciclot®, Boehringer/Ma, Nr. 654 370) verdünnt. Dazu wurden 50 µl PTT_a-Reagenz (Boehringer/Mannheim, Nr. 886 050) pipettiert und 5 min bei 37°C inkubiert. Durch Zugabe von 50 µl 25 mM CaCl₂ wurde die Gerinnungskaskade gestartet. Gemessen wurde die Zeit bis zum Auftreten von Plasma­ gerinnseln.
• b) PT (= Prothrombinzeit, Quick-Test) zum Nachweis einer anti­ koagulatorischen Wirkung auf die extrinsische Gerinnungs­ kaskade.
  Proben wurden in 100 µl humanem Plasma (z. B. Preciclot®, Boehringer/Mannheim, Nr. 654 370) verdünnt. Dazu wurden 100 µl Thromboplastin (1 : 1 mit NaCl 0,9% verdünnt) pipet­ tiert. Mit 50 µl 25 mM CaCl₂ wurde die Gerinnungskaskade ge­ startet. Gemessen wurde die Zeit bis zum Auftreten von Plas­ magerinnseln. Die Proben zeigten eine signifikante Verlänge­ rung der Plasmagerinnungszeit (extrinsisch).
  Alternativ kann die Bildung einzelner Faktoren der extrinsischen Gerinnung, z. B. Faktor VIII oder Faktor X, durch Messung des Umsatzes chromogener Substrate erfolgen. Dazu wurden die Proben wie oben beschrieben, verdünnt mit der Abwandlung, daß das entsprechende chromogene Substrat (25 µl) zupipettiert wurde.
  Anschließend wurde zu verschiedenen Zeitpunkten die Extink­ tion bei 405 nm bestimmt. Aus der Differenz zweier Experi­ mente mit und ohne Inhibitor kann das Ausmaß der Hemmung be­ stimmt sowie der Angriffspunkt des Inhibitors in der Gerin­ nungskaskade identifiziert werden. Als chromogene Substrate wurden S 2222 (für Faktor Xa) und CH₃SO₂-D-CHA-But-Arg- pNA·AcOH (Pentapharm, Schweiz) (für Faktor VIIa) eingesetzt. Wie aus Abb. 3 ersichtlich ist, hemmt das neue Protein sehr effektiv sowohl den Faktor Xa als auch die Bildung von Faktor VIIa.
• c) Bestimmung der Hemmung von Thrombin
  Thrombin (Boehringer/Mannheim) wurde zu einer Endkonzentra­ tion von (25 mU/ml) in Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) (0,8 g/l NaCl; 0,2 g/l HCl; 0,144 g/l Natriumphosphat; 0,2 g/l Kaliumphosphat, pH 7,5) gelöst.
  Chromozym TH (Boehringer/Mannheim) wurde in 20 ml H₂O/Flasche gelöst.
  50 µl Chromozym sowie 25 µl Probe oder Puffer wurden in die Näpfe einer Mikrotiterplatte gegeben. Sofort danach wurde zur Zeit 0 und nach 30 min bei 37°C die Absorption bei 405 nm ge­ messen.
  Bei starker Eigenfarbe der Probe wurde eine weitere Kontrolle ohne Thrombin wie oben behandelt.
  Durch die Aktivität des Thrombins wird aus dem chromogenen Substrat ein bei 405 nm absorbierender Farbstoff freigesetzt. Die Hemmung des Thrombins durch einen Thrombinhibitor ist an einer geringeren Absorptionszunahme bei 405 nm erkennbar und wurde mit Hilfe einer Eichkurve quantifiziert.
• d) FXa-Inhibitionstest Proben (verdünnt in PBS) wurden mit Faktor Xa (FXa) und einem spezifischen chromogenen Substrat für FXa 60 min bei Raum­ temperatur inkubiert: 25 µl Probe
  50 µl FXa (Boehringer/Mannheim, Nr. 602 388, 0,025 U/ml)
  100 µl S-2222-Farbsubstrat (Kabi-Vitrum, 16,9 ml H₂O/vial).Nach 5 min wurde die optische Dichte bei 405 nm erstmals gemessen. Nach 60 min wurde die Reaktion mit 50 µl Eisessig gestoppt und die optische Dichte bei 405 nm erneut gemessen.
  Als Kontrollen dienen Ansätze ohne FXa sowie Proben ohne Inhibitor. Für die Auswertung wurde ein Δ OD_405,40 nach folgender Formel errechnet:Δ OD = [OD_60min-OD_5min]_+FXa-[OD_60min-OD_5min]_-5FXa(Differenz der Extinktionsänderung mit und ohne FXa).
  Aus entsprechenden Ansätzen mit und ohne Inhibitor ergibt sich der Grad der Inhibition von FXa (in %) durch

Legende zu den Abbildungen

Abb. 1: Chromatographie von Egelhomogenaten auf einer Q-Sepha­ rose-Säule. Nach dem Auftrag wurde nicht gebundenes Material durch Spülen mit dem Äqulibrierungspuffer (50 mM Tris·HCl, pH = 8,5) entfernt. Das gebundene Protein wurde durch Anlegen eines Salzgradienten von 0-1 M NaCl eluiert. Einzelne Fraktionen wurden auf Thrombin- Inhibiton, Verlängerung von APTT und PT, untersucht. Fraktionen, bei denen APTT und PT verlängert waren, die jedoch keine oder nur geringe Thrombininhibition zeigten, wurden vereinigt.

Abb. 2: Tris/Tricine - SDS Polyacrylamid Gel Elektrophorese
Die Molmasse der Wertfraktion der (r)HPLC-Trennung wurde auf einem 16%igen Tris/Tricine Gel bestimmt. (A): Fär­ bung mit Coomassie-Brillant Blau; (B): Silberfärbung.

Spuren 1, 3:
Molmasseneichsubstanz,
intaktes Myoglobin 17,2 kDa,
Bromcyanpeptid Myoglobin I+III 14,6 kDa,
Bromcyanpeptid Myoglobin I 8,2 kDa,
Bromcyanpeptid Myoglobin II 6,4 kDa,
Bromcyanpeptid Myoglobin 2,6 kDa,
Myoglobin 1-14
Spuren 2, 4:
gereinigter PT-Faktor (20 µg)
nach (r)HPLC-Trennung

Abb. 3: Messung des Einflusses von PT-Faktor auf die extrinsische Gerinnung.

• a) Messung des S 2222-Umsatzes (Faktor Xa)
• b) Messung des CH₃SO₂-D-CHA-But-Arg-pNA·AcOH-Umsatzes (Faktor VIIa)

Claims (5)

1. Protein aus Landblutegeln der Gattung Haemadipsa mit der N-terminalen Aminosäuresequenz:
A-Val-Lys- Phe-Cys-Gly-Hi s- Pro-Leu-Ser-Leu-Pro-Thr-Ala-Leu- Cys-Ala, worin A eine nicht eindeutig zu bestimmende Amino­ saure darstellt.

2. DNA-Sequenz codierend für ein Protein gemäß Anspruch 1.

3. DNA-Sequenz, die für ein gerinnungshemmendes Protein codiert und unter Standardbedingungen mit der DNA-Sequenz gemäß Anspruch 2 hybridisiert.

4. Verwendung eines Proteins gemäß Anspruch 1 zur Bekämpfung von Krankheiten.

5. Arzneimittel enthaltend ein Protein gemäß Anspruch 1 und eine weitere gerinnungsinhibierende Substanz.