DE60010344T2

DE60010344T2 - Diketopiperazinderivate als thrombininhibitoren

Info

Publication number: DE60010344T2
Application number: DE60010344T
Authority: DE
Inventors: Yudu Cheng; Jeffrey Manwell
Original assignee: BEST EXPRESS WORLDWIDE Ltd TRU; Best Express Worldwide Ltd TrustNet Chambers
Current assignee: BEST EXPRESS WORLDWIDE Ltd TRU; Best Express Worldwide Ltd TrustNet Chambers
Priority date: 1999-11-30
Filing date: 2000-11-29
Publication date: 2005-02-17
Anticipated expiration: 2020-11-30
Also published as: CN1402725A; DE60010344D1; CA2392936A1; ATE265453T1; CN1174982C; EP1261608A1; AU1847401A; WO2001040224A1; EP1261608B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
(a) Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen zur Inhibierung der Blutgerinnung und insbesondere Diketopiperazin-Derivate, pharmazeutisch verträgliche Salze und Zusammensetzungen davon, um spezifisch Thrombin zu inhibieren.
(b) Beschreibung des Stands der Technik
Thrombotische Störungen sind durch die Bildung eines Thrombus, der den vaskulären Blutfluss behindert, charakterisiert, was zu einer arteriellen oder venösen Thrombose oder Thromboembolie führt. Thrombi bestehen aus Fibrin, Blutplättchen, weißen Blutzellen (WBCs) und roten Blutzellen (RBCs). Die Thrombusbildung involviert mehrere genetische und Umweltfaktoren. Genetisch beeinträchtigte Antigerinnungsmechanismen schließen Faktor V-Resistenz gegenüber aktiviertem Protein C, Hyperhomocysteinämie, Protein-C-Defizienz, Protein-S-Defizienz, Antithrombin-Defizienz und fehlerhafte Fibrinolyse ein, während thrombotische Stimuli einen chirurgischen Eingriff, Schwangerschaft, die Verwendung oraler Kontrazeptiva und Antiphospholipid-Antikörper einschließen. Chronische und akute thrombotische Komplikationen, einschließlich venöser und arterieller Thrombose, atrialer Fibrillation, Schlaganfall, myokardialem Infarkt und Lungenembolie, sind die führende Todesursache weltweit.
Die antithrombotische Therapie involviert die thrombolytische Arzneistoff-Therapie, um Thrombi zu entfernen, und die Verwendung von Antiblutplättchen-Arzneistoffen und Antikoagulanzien, um die Gerinnung zu inhibieren. Die anschließende Therapie variiert in Abhängigkeit von dem involvierten venösen oder arteriellen Zirkulationssystem und der Größe und Lokalisation der Gefäße.
Die Antikoagulanz-Arzneistoffe, die derzeit verwendet werden, zeigen mehrere Nachteile (Exp. Opin. Inves. Drugs 1997, 6: 1591–1622; Current Pharmaceutical Design 1995, 1: 441–468; Circulation 1994, 90: 1522–1536).
Zum Beispiel ist Heparin das erste Mittel, das parenteral in Situationen zu verabreichen ist, die eine akute Antigerinnung erfordern. Heparin besteht aus einem Mucopolysaccharid tierischen Ursprungs. Standardmäßige Heparine oder Heparine mit hohem Molekulargewicht (HMWHs) bestehen aus Molekülen von vielen unterschiedli chen Größen, während depolymerisierte Heparine oder Heparine mit niedrigem Molekulargewicht (LMWHs) ein Molekulargewicht zwischen 4 000 und 6 000 D besitzen.
Es gibt mehrere Nachteile, die mit der Verwendung von Heparin in Verbindung stehen, nämlich (1) Heparin ist ein parenterales Mittel, das die intravenöse (i.v.) oder subkutane (s.c.) Verabreichung erfordert; (2) die Antikoagulanz-Dosis-Reaktionskurve für Heparin ist nicht linear, und man muss nach ex vivo-Gerinnungsparametern (APTT) gehen, um den Grad der Antigerinnung zu überwachen; (3) Heparin ist unwirksam bezüglich der Inhibierung von Gerinnsel-gebundenem Thrombin; und (4) es gibt Berichte einer "Rebound"-Reaktivierung von instabiler Angina nach einer Nicht-Fortsetzung der Heparin-Therapie, und Heparin wurde mit Thrombocytopenie in Verbindung gebracht, welche die Überwachung von Blutplättchenzählungen erfordert. Durch Heparin induzierte Thrombocytopenie (HIT) ist eine durch Immunoglobulin vermittelte nachteilige Arzneistoffnebenreaktion, welche durch Blutplättchenaktivierung, Thrombocytopenie und ein hohes Risiko von thrombotischen Komplikationen unter Patienten, die Heparin bekommen oder die kürzlich Heparin bekommen haben, gekennzeichnet ist.
Im Fall von venöser Thrombose oder Lungenembolie folgt nach einer 7- bis 10-tägigen Gabe an parenteralem Heparin für gewöhnlich eine verlängerte Verabreichung des einzigen derzeit verfügbaren oralen Antikoagulanz-Arzneistoffes Warfarin, um die Behandlung von thrombotischen Komplikationen zu verlängern. Heparin wird im allgemeinen gleichzeitig mit Warfarin für einige wenige Tage vor dem Abbruch der Heparin-Therapie verabreicht.
Warfarin weist mehrere Nachteile auf (The Annals of Pharmcotherapy 1995, 29: 1274–1282; Clin. Pharmacokinet. 1996, 30: 416–444), d.h.: (1) Es trägt das Risiko des Blutens, (2) es zeigt schädigende Arzneistoff- und Nahrungsmittel-Wechselwirkungen und (3) es erfordert ein häufiges Überwachen.
Sowohl Heparin als auch Warfarin sind indirekte Antikoagulanzien, und ihre Funktionen hängen von der Gegenwart von Antithrombin bzw. Vitamin K ab. Folglich muss man nach der Beendigung der Warfarin-Behandlung auf die erneute Synthese von Vitamin K-abhängigen Gerinnungsfaktoren durch die Leber warten, um das hämostatische Gleichgewicht wieder herzustellen. Diese Nachteile limitieren die Akzeptanz und die Anwendung von Warfarin durch den Arzt bei der Behandlung von thrombotischen Störungen.
Die Nachteile der herkömmlichen Antikoagulanz-Therapie verlangten nach der Entwicklung von neuen Antikoagulanzien während der letzten zwei Jahrzehnte. Im Jahre 1976 fand man, dass LMWHs eine ähnliche Effizienz wie das Heparin besitzen. Ihre begünstigten pharmakokinetischen Profile und Risiko/Verhältnisse führten zur breit gefächerten Verwendung in Europa seit 1992 und in jüngerer Zeit zu der Zulassung ihrer Verwendung in den USA.
Die neue Antikoagulanz-Strategie basiert auf der direkten Inhibierung von kritischen Enzymen in der Gerinnungskaskade. Als letztes Enzym in der Gerinnungskaskade war Thrombin ein ausführlich getestetes Ziel. Thrombin, der Schlüsselregulator des thrombotischen Prozesses, ist eine Trypsin-artige Serin-Protease. Thrombin besitzt viele und verschiedentliche biologische Funktionen, jedoch ist seine Hauptwirkung, die Transformation von Fibrinogen zu Fibrin zu katalysieren, ob nun das Thrombin in Plasma löslich ist oder Fibrin-gebunden ist. Fibrin wird dann polymerisiert und vernetzt durch die Wirkung von aktiviertem Blutfaktor XIII unter Bildung eines unlöslichen Blutgerinnsels. Thrombin aktiviert ebenfalls die Blutfaktoren V und VIII, welche ihrerseits die Blutgerinnung durch einen Feedback-Mechanismus beschleunigen. Als ein potenter Aktivator von Blutplättchen spielt Thrombin ebenfalls eine wichtige Rolle bei der Steuerung des Wachstums von Blutplättchen-reichen Thrombi in der arteriellen Zirkulation. Die Fibrin-Abscheidung und Blutplättchenaggregation kann so unterbrochen werden, wenn Thrombin inhibiert wird. Jedoch ist Thrombin ähnlich zu zahlreichen Serin-Proteasen, welche im menschlichen Körper und insbesondere im Blut vorliegen, wie Plasmin. Ein Thrombin-Inhibitor muss deshalb für Thrombin spezifisch sein.
Thrombin-Inhibitoren können direkt Thrombin inaktivieren durch die Bindung an die aktive Stelle und/oder außenliegende Fibrinogen-Erkennungs-Stelle (fibrinogen recognition exosite); FRE von Thrombin, durch welche Fibrinogen zu Fibrin transformiert wird. Zum Beispiel ist Hirudin ein natürlich auftretendes 63-Aminosäure-Antikoagulanz, welches in den Speicheldrüsen des blutsaugenden Egels Hirudo medicinalis hergestellt wird. Hirudin inhibiert Thrombin durch direktes Binden sowohl der aktiven Stelle als auch des FRE von Thrombin mit einem Inhibitionskonstanten (K_i)-Wert von 2,0 × 10^–5 M gegenüber Thrombin (Biochemistry 1986, 25: 4622–4628). Hirugen ist ein Peptid, das sich vom anionischen Carboxy-Ende von Hirudin ableitet und nur das FRE von Thrombin mit einem K_i-Wert von 1,44 × 10^–7 M bindet (J. Biol. Chem. 1989, 264: 8692–8698). Hirulogs oder Bivalirudin ist ein synthetisches Peptid, das aus einer Hirugen-artigen FRE-Bindungs-Sequenz besteht, verknüpft durch einen Glycin-Spacer an die Substrat-artige Einheit, welche die aktive Stelle bindet, D-Phenylalanin-prolyl-arginin, mit einem K_i-Wert von 2,3 × 10^–9 M.
Außer eines etwas besseren Sicherheitsprofils hinsichtlich der Blutungskomplikationen haben die oben erwähnten direkten Thrombin-Inhibitoren keine besseren und sogar schlechtere Merkmale als Heparin gezeigt, d.h. (1) relativ kurze Halbwertszeiten, (2) parenterale Verabreichung und (3) Kosten-Ineffizienz.
Die US-Patente Nrn. 4 258 192 und 4 201 863 offenbaren einen synthetischen Thrombin-Inhibitor mit kleinem Molekül und einem K_i-Wert von 1,9 × 10^–10 M für humanes Thrombin, welcher als Argatroban kommerzialisiert wird (Novastan, Mitsubishi Chemical Corp. Cardiovasc. Drug Rev. 1991, 9: 247–263). Er wurde für die Indikationen eines chronischen Arterienverschlußes, akutem ischämischen Schlaganfall und Hämodialyse in Antithrombin III (ATIII)-Mangel-Patienten entwickelt, und als ein Ersatz für Heparin in Patienten mit Risiko für (HIT). Gleichwohl ist Argatroban immer noch kein idealer Thrombin-Inhibitor mit kleinem Molekül aufgrund der folgenden Probleme: Es ist (1) nicht oral bioverfügbar; (2) weniger wirksam bei venöser als bei arterieller Thrombose, (3) möglicherweise Dosis-abhängig, (4) Thrombin-Rebound-Effekt, (5) nicht effektiver als Heparin bei der Behandlung von instabiler Angina, koronarer Angioplastie und akutem myokardialem Infarkt.
Es wäre somit in starkem Maße wünschenswert, dass man mit einem oral verfügbaren Thrombin-Inhibitor versorgt werden könnte. Das Interesse an oral bioverfügbaren Thrombin-Inhibitoren ist hoch (Am. J. Cardiol. 1995, 75: 27B–33B). Ein Inhibitor mit kleinem Molekül der aktiven Stelle von Thrombin, welcher selektiv und reversibel Thrombin inhibieren könnte, würde einen entscheidenden Vorteil gegenüber Warfarin in Bezug auf Nebeneffekte und die Überwachung, wie es oben beschrieben wurde, bereitstellen. Die Selektivität eines Thrombin-Inhibitors im Vergleich zu Warfarin würde es erlauben, ihn mit relativer Sicherheit sowohl bei arterieller als auch venöser Thrombose zu verwenden. Ein anderer entschiedener Vorteil eines Thrombin-Inhibitors mit kleinem Molekül wäre sein potentiell wichtiges Vermögen, Gerinnsel-gebundenes Thrombin sowie Thrombin der Flüssigphase zu inhibieren.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines oral verfügbaren spezifischen Thrombin-Inhibitors.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Verbindung der folgenden Formel I bereitgestellt:
oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz und Stereoisomer hiervon, wobei R¹, R² und R⁴ aus einem Wasserstoffatom, Alkyl- oder Aryl-Rest bestehen, R³ aus einem Alkyl-, oder Aryl-Rest besteht, R⁵ aus einem Wasserstoffatom, Alkyl-, Aryl-, Hydroaryl-, Heteroaryl-, Hydroheteroaryl-, Sulfonylalkyl-, Sulfonylaryl-, Sulfonylhydroaryl-, Sulfonylheteroaryl- oder Sulfonylhydroheteroaryl-Rest besteht und R⁶ aus einem Wasserstoffatom, Alkyl-,Aryl-, Hydroaryl-, Heteroaryl- oder Hydroheteroaryl-Rest besteht. Eine solche Verbindung inhibiert die Thrombin oder Blutgerinnung und kann als ein antithrombotisches Mittel oder als ein Antikoagulanz verwendet werden.
Zum Beispiel kann R⁵ aus einem Alkyl-, Aryl-, Hydroaryl-, Heteroaryl- oder Hydroheteroaryl-Rest bestehen. Insbesondere kann R¹, R² und R⁴ aus einem Wasserstoff-Rest bestehen, R³ kann aus einem Methylrest bestehen, R⁵ kann aus 1,2,3,4-Tetrahydra-3-methyl-8-chinolinsulfonyl bestehen und R⁶ kann aus 3-Guanidinopropyl bestehen. Eine solche Verbindung besitzt eine hohe Inhibierungskonstante (K_i ist 5,3 × 10^–9 M).
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die eine solche Verbindung als einen aktiven Bestandteil umfasst, und zwar in Assoziation mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann zur oralen Verabreichung geeignet sein. Der aktive Bestandteil kann in einer Zusammensetzung, wie einer Tablette, Kapsel, Lösung oder Suspension, verwendet werden, enthaltend etwa 5 bis etwa 500 mg pro Dosis-Einheit einer Verbindung der Formel I oder einer Mischung davon. Die Verbindungen können in einer herkömmlichen Weise mit einem physiologisch verträglichen Vehikel oder Träger, einschließlich geeigneter Behelfsmittel, Bindemittel, Konservierungsstoffe, Stabilisatoren, Geschmacksstoffe etc., wie sie in der pharmazeutischen Praxis anerkannt sind, kombiniert werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ferner ein Verfahren zur substantiellen Verhinderung der Thrombin-Aktivität in einem Säuger oder einem Menschen oder einem Gewebe davon bereitgestellt. Das Verfahren umfasst die Verabreichung einer wirk samen Menge einer solchen Verbindung oder der pharmazeutischen Zusammensetzung an den Säuger, den Menschen oder das Gewebe.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ferner ein Verfahren zur Behandlung einer Gerinnungsstörung in einem Säuger oder einem Menschen oder einem Gewebe davon bereitgestellt. Das Verfahren umfasst die Verabreichung einer wirksamen Menge der Verbindung oder der pharmazeutischen Zusammensetzung an den Säuger, den Menschen oder das Gewebe. Beispiele für Gerinnungsstörungen schließen Thrombose oder Heparin-induzierte Thrombocytopenie (HIT) ein.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können oral verschiedenen Säugern, die für thrombotische Störungen bekannt sind, wie Menschen, Katzen, Hunden, Affen, Mäusen und dergleichen, in einem wirksamen Dosis-Bereich von 0,1 bis 100 mg/kg, vorzugsweise von etwa 0,2 bis 50 mg/kg und bevorzugter von etwa 0,5 bis 25 mg/kg in einer Therapie einer einzelnen Dosis oder täglich auf 2 bis 4 eingeteilten Dosen verabreicht werden.
Obgleich die Verbindung der Formel I der vorliegenden Erfindung Thrombin inhibiert und als ein Antikoagulanz verwendet werden kann, kann sie ebenfalls in Kombination mit anderen Antithrombotika oder Antikoagulanz-Arzneistoffen verwendet werden.
Die Verbindung der vorliegenden Erfindung umfasst einen extra Ring und Substitutionen an einer Diketopiperadin-Struktur und ist starrer im Vergleich zu bekannten Diketopiperadin-Derivaten.
Die Verbindung der vorliegenden Erfindung inhibiert die Blutgerinnung durch spezielles Binden an Thrombin. Im Vergleich zu Antikoagulanz-Arzneistoffen, wie Heparin, Warfarin, Hirudin, Hirugen, Hirulogs und Argatroban. Die Verbindung der vorliegenden Erfindung zeigt eine orale Bioverfügbarkeit, eine erhöhte Halbwertszeit, Wirksamkeit bezüglich venöser Thrombose und einen beschränkten oder keinen "Rebound"-Effekt bezüglich Thrombin, ganz im Gegensatz zu Heparin. Die Verbindung der vorliegenden Erfindung reduziert ebenfalls das Risiko einer Heparin-induzierten Thrombocytopenie (HIT).
Zum Zwecke der vorliegenden Erfindung werden die nachfolgenden Ausdrücke unten definiert.
Der Begriff "Alkyl" soll (einen) gerade(n) oder verzweigte(n) Ketten-Reste) oder cyclische(n) Ring(e) von bis zu 18 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, wie Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Pentyl, Hexyl, Heptyl, Octyl, Nonyl, Decyl, Undecyl, Dodecyl, und die verschiedenen verzweigten Ketten-Isomere davon und/oder 1 oder 2 der folgenden Substituenten bedeuten: ein Aryl-Substituent (z.B. zur Bildung von Benzyl oder Phenethyl), ein Cycloalkyl-Substituent, ein Alkylcycloalkyl-Substituent, ein Alkenyl-Substituent, ein Alkinyl-Substituent, Hydroxy-, Alkoxy-, Halogen-, Amino-, Alkylamino-, Dialkylamino-, Guanidino- oder Carboxy-Substituent.
Der Begriff "Aryl" soll (eine) monocyclische, bicyclische oder tricyclische aromatische Gruppe(n) mit 6 bis 14 Kohlenstoffatomen im Ring-Teil, wie Phenyl, Naphthyl oder Anthracenyl, bedeuten. Der Aryl-Rest kann substituiertes Aryl einschließen, welches ein oder zwei Substituenten, wie Alkyl, Cyano, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Nitro, Carboxy, Carboalkoxy, Trifluormethyl, Halogen, Alkoxy, Arylalkoxy oder Hydroxy, einschließen kann.
Der Begriff "Hydroaryl" soll 10- bis 14-gliedrige aromatische Ringe, wie Tetrahydronaphthyl, Tetrahydroanthracenyl und dergleichen, bedeuten. Hydroaryl kann substituiertes Hydroaryl einschließen, welches 1 oder 2 Substituenten, wie Alkyl, Cyano, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Nitro, Carboxy, Carboalkoxy, Trifluormethyl, Halogen, Alkoxy, Arylalkoxy oder Hydroxy, einschließen kann.
Der Begriff "Heteroaryl" soll (einen) 5- bis 14-gliedrige(n) aromatische(n) Ring(e) bedeuten, welcher) 1, 2 oder 3 Heteroatome, wie Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel, einschließt/einschließen, wie

und dergleichen. Die Heteroaryl-Ringe können gegebenenfalls zu Aryl-Ringen, wie sie vorstehend definiert sind, fusioniert werden. Die Heteroaryl-Ringe können ein substituiertes Heteroaryl einschließen, welches 1 oder 2 Substituenten, wie Alkyl, Cyano, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Nitro, Carboxy, Carboalkoxy, Trifluormethyl, Halogen, Alkoxy, Arylalkoxy oder Hydroxy, einschließen kann.
Der Begriff "Hydroheteroaryl" soll eine reduzierte Form der oben erwähnten Heteroaryl-Ringe bedeuten, wie:
Der Begriff "Sulfonylaryl" soll für eine Sulfonylgruppe (SO₂) stehen, in der eine Arylgruppe, wie sie vorausgehend definiert wurde, gebunden ist.
Der Begriff "Sulfonylhydroaryl" soll für eine Sulfonylgruppe (SO₂) stehen, in der eine Hydroarylgruppe, wie sie vorausgehend definiert wurde, gebunden ist.
Der Begriff "Sulfonylheteroaryl" soll für eine Sulfonylgruppe (SO₂) stehen, in der eine Heteroarylgruppe, wie sie vorausgehend definiert wurde, gebunden ist.
Der Begriff "Sulfonylhydroheteroaryl" soll für eine Sulfonylgruppe (SO₂) stehen, in der eine Hydroheteroarylgruppe, wie sie vorausgehend definiert wurde, gebunden ist.
Ein pharmazeutisch verträgliches Säuresalz kann aus der Verbindung der Formel I der vorliegenden Erfindung erhalten werden, indem die freie Base mit einer Säure, wie Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Iodwasserstoffsäure, Salpetersäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Zitronensäure, Maleinsäure, Bernsteinsäure, Milchsäure, Weinsäure, Gluconsäure, Benzoesäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure oder dergleichen, umgesetzt wird.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die 1 veranschaulicht eine Entwicklungskurve eines in vivo-Thrombin-Inhibierungs-Tests bei der Substratkonzentration ([S]) von 2,5 μM durch die Cycloargatrobanverbindung (Formel I), in der R¹, R² und R⁴ Wasserstoff sind, R³ Me=CH₃ ist, R⁵ 1,2,3,4-Tetrahydro-3-methyl-8-chinolinsulfonyl ist und R⁶ 3-Guanidinopropyl ist.
Die 2 veranschaulicht eine Entwicklungskurve eines in vivo-Thrombin-Inhibierungs- Tests bei der Substratkonzentration ([S]) von 10 μM durch die Cycloargatrobanverbindung (Formel I), in der R¹, R² und R⁴ Wasserstoff sind, R³ Me=CH₃ ist, R⁵ 1,2,3,4-Tetrahydro-3-methyl-8-chinolinsulfonyl ist und R⁶ 3-Guanidinopropyl ist.
Die 3 veranschaulicht eine Entwicklungskurve eines in vivo-Trypsin-Inhibierungs-Tests bei der Substratkonzentration ([S]) von 22 μM durch die Cycloargatrobanverbindung (Formel 1), in der R¹, R² und R⁴ Wasserstoff sind, R³ Me=CH₃ ist, R⁵ 1,2,3,4-Tetrahydro-3-methyl-8-chinolinsulfonyl ist und R⁶ 3-Guanidinopropyl ist.
Die 4 veranschaulicht eines kinetischen in vivo-Test, um die Inhibierungskonstante (K_i) für Thrombin durch die Cycloargatrobanverbindung (Formel I) zu bestimmen, in der R¹, R² und R⁴ Wasserstoff sind, R³ Me=CH₃ ist, R⁵ 1,2,3,4-Tetrahydro-3-methyl-8-chinolinsulfonyl ist und R⁶ 3-Guanidinopropyl ist.
Die 5 veranschaulicht einen ex vivo-Gerinnungs-Test der Cycloargatrobanverbindung (Formel I), in der R¹, R² und R⁴ Wasserstoff sind, R³ Me=CH₃ ist, R⁵ 1,2,3,4-Tetrahydro-3-methyl-8-chinolinsulfonyl ist und R⁶ 3-Guanidinopropyl ist, und die Referenzverbindung von Argatroban von der chemischen Zusammensetzung ist, wie sie unten in Struktur XIII gezeigt ist.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Verbindungen bereitgestellt, welche als potente und spezifische Inhibitoren von Thrombin und der Blutgerinnung in vitro und in vivo in Säugern brauchbar sind.
Die Erfindung involviert die Herstellung von Diketopiperazin-Derivaten der Formel I:
Die Verbindungen der Formel I der Erfindung können gemäß der folgenden Reaktionssequenz I hergestellt werden:
Die Aminosäure II wird mit einer tert-Butoxycarbonylgruppe (BOC) unter Verwendung von Di-tert-butyldicarbonat in 10% Triethylamin (TEA) in Methanol oder mit einer Benzyloxycarbonylgruppe (Cbz) unter Verwendung von Benzylchlorformiat und wässeriger Natriumhydroxidlösung in einem organischen Lösungsmittel, wie Dioxan, Tetrahydrofuran (THF) oder Ether, geschützt. Die geschützte Aminosäure III wird unter Verwendung einer Kupplungsreaktion mit einem Alkohol in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), Diisopropylcarbodiimid (DIC) oder 2-(1H-Benzotriazol- 1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluorborat (TBTU) und 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) oder N-Hydroxybenzotriazol (HOBT) und in Gegenwart eines inerten organischen Lösungsmittels, wie Dimethylformamid (DMF), N-Methylpyrrolidinon (NMP), Dichlormethan (DCM) oder THF bei Temperaturen im Bereich von –20 bis –5°C unter Bildung eines Esters IV verestert.
Der Ester IV wird durch die Behandlung mit Trifluoressigsäure (TFA) oder Chlorwasserstoffsäure (HCl) in Gegenwart eines trockenen inerten Lösungsmittels, wie DCM, THF, Ethylacetat oder Chloroform (BOC), oder durch Hydrierung über Palladium auf Kohlenstoff in einem alkoholischen Lösungsmittel (Cbz) bei Umgebungstemperatur entschützt. Alternativ kann der Ester V durch die Zugabe von Thionylchlorid zu einer alkoholischen Lösung der Aminosäure II bei einem Temperaturbereich innerhalb von 0°C bis 20°C, gefolgt von der Neutralisation mit einer Base, wie Natriumbicarbonat oder Kaliumcarbonat und dergleichen, hergestellt werden. Der Ester V erfährt eine Kupplungsreaktion mit einem geschützten Aminosäure-Derivat VI in Gegenwart eines Kupplungsreagenzes, wie DCC, DIC oder TBTU, und DMAP oder HOBT, und einer tertiären organischen Amin-Base, wie TEA oder Diisopropylethylamin (DIPEA), und in Gegenwart eines inerten organischen Lösungsmittels, wie DMF, NMP, THF oder DCM, bei Temperaturen innerhalb eines Bereichs von 0 bis 20°C, um das Peptid VII zu bilden. Das Peptid VII wird entschützt und cyclisiert in Gegenwart von Piperidin oder Diethylamin und einem inerten organischen Lösungsmittel, wie DMF, NMP, DCM oder THF, und bei Umgebungstemperatur (Fmoc) oder entschützt durch die Behandlung mit TFA oder HCl in Gegenwart eines trockenen inerten Lösungsmittels, wie DCM, THF, Ethylacetat oder Chloroform (BOC) oder durch Hydrierung über Palladium auf Kohlenstoff in einem alkoholischen Lösungsmittel (Cbz) bei Umgebungstemperatur, gefolgt von Basen-Zugabe, um eine Cyclisierung zu verursachen. Das Diketopiperazin VIII wird mit einer organischen Amid-Base, wie Lithium-bis-(trimethylsilyl)amid (LHMDS) oder Lithium-diisopropylamid (LDA), und im trockenen THF-Lösungsmittel bei 0°C behandelt, gefolgt von der Zugabe eines Alkylierungsmittels IX bei einer Temperatur innerhalb des Bereiches von 0°C und 20°C, um das Diketopiperazin I zu bilden.
Die Verbindungen der Formel I der vorliegenden Erfindung können ebenfalls gemäß der folgenden Reaktionssequenz II hergestellt werden:
Das Peptid VII, in dem PG BOC oder Cbz ist, wird durch die Behandlung mit TFA oder HCl in Gegenwart eines trockenen inerten Lösungsmittels, wie DCM, THF, Ethylacetat oder Chloroform, bei Umgebungstemperatur (BOC), oder durch Hydrierung über Palladium-auf-Kohlenstoff in einem alkoholischen Lösungsmittel (Cbz) entschützt. Das Peptid X lässt man mit einem Alkylierungsmittel IX in Gegenwart einer tertiären organischen Amin-Base, wie Pyridin, TEA oder DIPEA, und in Gegenwart eines trockenen inerten Lösungsmittels, wie DCM, THF oder Chloroform, bei Umgebungstemperatur reagieren, um ein Peptid XI zu bilden. Der Ester des Peptids XI wird durch die Behandlung mit einer Alkalimetall-Base, wie Natriumhydroxid (NaOH) oder Lithiumhydroxid (LiOH), in Gegenwart eines Alkohollösungsmittels, wie Methanol oder Ethanol, hydrolysiert. Die Reaktionsmischung wird mit HCl oder Schwefelsäure (H₂SO₄) angesäuert, um eine Säure XII zu bilden.
Die Säure XII wird einer intramolekularen Cyclisierungsreaktion in Gegenwart von TBTU und HOBT und DIPEA in einem inerten organischen Lösungsmittel, wie DMF, NMP, THF oder DCM, bei Umgebungstemperatur unterzogen, um das Diketopiperazin I zu bilden.
Die Verbindungen der Formel I der vorliegenden Erfindung, in der R⁶
ist und Y ein Alkyl-, Aryl-, Hydroaryl-, Heteroaryl- oder Hydroheteroaryl-Rest ist, kann gemäß der folgenden Reaktionssequenz III hergestellt werden:
Das Diketopiperazin I wird gemäß der folgenden Reaktionssequenz I oder II hergestellt, wobei R⁶:
ist, und durch die Behandlung mit TFA oder HCl in Gegenwart eines trockenen inerten Lösungsmittels, wie DCM, THF, Ethylacetat oder Chloroform (BOC, Trityl und dergleichen) oder durch die Hydrierung über Palladium auf Kohlenstoff in einem alkoholischen Lösungsmittel (Cbz) bei Umgebungstemperatur entschützt. Das Diketopiperazin XIII wird guanidinyliert in Gegenwart von Guanidinylierungsreagenzien XIV, wie N,N'-bis(tert-Butoxycarbonyl)-N''-trifluormethansulfonylguanidin, 1-[N,N'-bis(tert- Butoxycarbonyl)-amido]pyrazol oder N,N'-bis(tert-Butoxycarbonyl)-S-methylisothioharnstoff, und einer tertiären organischen Amin-Base, wie TEA oder DIPEA, und in Gegenwart eines inerten organischen Lösungsmittels, wie DMF, NMP, THF oder DCM, bei Umgebungstemperatur, um ein geschütztes guanidinyliertes Diketopiperazin XV zu bilden.
Das Diketopiperazin XV wird durch die Behandlung mit TFA oder HCl in Gegenwart eines trockenen inerten Lösungsmittels, wie DCM, THF, Ethylacetat oder Chloroform, bei Umgebungstemperatur unter Bildung von Diketopiperazin I entschützt, wobei R⁶:
ist.
Die Verbindungen der Formel I der Erfindung, in der R⁵ Hydroheteroaryl ist, können gemäß der folgenden Reaktionssequenz IV hergestellt werden.
wobei R⁵ = Hydroheteroaryl
Die Säure XII wird der Reaktionssequenz II folgend hergestellt, worin R⁵ ein Aryl-Rest ist, und wird einer Reduktion in Gegenwart eines Katalysators, der Metalle, wie Palladium, Platin, Rhodium oder Nickel, enthält, und bei Temperaturen innerhalb des Bereiches von 20°C bis 100°C und Drücken innerhalb des Bereiches von 1 bis 100 Atmosphären unterzogen, um die Säure XII, in der R⁵ ein Hydroheteroaryl-Rest ist, zu bilden. Die Säure XII, in der R⁵ Hydroheteroaryl ist, erfährt eine intramolekulare Cyclisierungsreaktion in Gegenwart eines Kupplungsmittels TBTU und HOBT und DIPEA und in Gegenwart eines inerten organischen Lösungsmittels, wie DMF, NMP, THF oder DCM, bei Umgebungstemperatur, um das Diketopiperazin I zu bilden, wobei R⁵ Hydroheteroaryl ist.
Die vorliegende Erfindung wird leichter durch den Bezug auf die folgenden Beispiele verstanden, welche eher zur Veranschaulichung der Erfindung als zur Beschränkung ihres Umfangs angegeben werden.
BEISPIEL 1
N-(tert-Butoxycarbonyl)-D-2-piperidincarbonsäure, Allylester
N-(tert-Butoxycarbonyl)-D-2-piperidincarbonsäure (2,0 g, 8,7 mMol, BACHEM) wurde in Dichlormethan (40 ml) gelöst, auf –20°C gekühlt, Allylalkohol (1,0 ml, 15,0 mMol, Aldrich), Dicyclohexylcarbodiimid (1,8 g, 8,7 mMol, Aldrich) und 4-Dimethylaminopyridin (0,11 g, 0,87 mMol, Aldrich) wurden hinzugesetzt, und die Reaktionsmischung wurde zwischen –5°C und –10°C 4 Stunden lang gerührt. Nach der Filtration, um das Harnstoff-Nebenprodukt zu entfernen, wurde die Reaktionsmischung im Vakuum konzentriert. Das resultierende Öl wurde einer Chromatographie auf 100 g Silikagel unterzogen und mit 15:1 Hexan/Ethylacetat eluiert, um die Titelverbindung als eine klare farblose Flüssigkeit zu erhalten (2,33 g, 99%).
BEISPIEL 2
(2R,4R)-N-(tert-Butoxycarbonyl)-4-methyl-2-piperidincarbonsäure, Allylester
(2R,4R)-4-Methyl-2-piperidincarbonsäure (250 mg, 1,75 mMol) wurde in 10% Triethylamin in Methanol (30 ml) gelöst, auf 0°C gekühlt, und Di-tert-butyldicarbonat (0,48 ml, 2,10 mMol, Aldrich) wurde hinzugesetzt. Nach 2 Stunden wurde die Reaktionsmischung im Vakuum konzentriert, und Natriumdihydrogenphosphat (10 mg) wurde hinzugesetzt. Der Rückstand wurde in 1:1 Ethylacetat/Wasser (10 ml) gelöst, und die Lösung wurde auf einen pH-Wert von 2 mit 1 N Chlorwasserstoffsäure eingestellt. Die Mischung wurde mit Ethylacetat (4 × 20 ml) extrahiert, und die vereinigten organischen Extrakte wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert. Der resultierende weiße Feststoff wurde in Dichlormethan (8 ml) gelöst und auf –20°C gekühlt. Allylalkohol (0,20 ml, 2,98 mMol, Aldrich), Dicyclohexylcarbodiimid (361 m , 1,75 mMol, Aldrich) und 4-Dimethylaminopyridin (22 mg, 0,18 mMol, Aldrich) wurden hinzugesetzt, und die Reaktionsmischung wurde zwischen –5 und –10°C 5 Stunden lang gerührt. Nach der Filtration zur Entfernung des Harnstoff-Nebenprodukt s wurde die Reaktionsmischung im Vakuum konzentriert. Das resultierende Öl wurde einer Chromatographie auf 10 g Silikagel unterzogen und mit 9:1 Hexan/Ethylacletat eluiert, um die Titelverbindung als eine klare farblose Flüssigkeit zu erhalten (457 mg, 92%).
BEISPIEL 3
(3S,6R)-Bicyclo[4.4.0]-1,4-diaza-3-[(4-nitrophenyl)methyl]-4-N-(4-tert-butylbenzolsulfonyl)-2,5-decandion, Trifluoracetatsalz
3A) 1-[N^α-(9-Fluorenylmethoxycarbonyloxy)-L-4-nitrophenylalanyl]-D-2-piperidincarbonsäure, Allylester
Der Pipecolinester von Beispiel 1 (259 mg, 0,96 mMol) wurde in 1:1 Trifluoressigsäure/Dichlormethan (5 ml) gelöst und 3 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum konzentriert und über Nacht an eine Vakuumpumpe gelegt. Das resultierende Öl wurde in Dimethylformamid (5 ml) gelöst, auf 0°C gekühlt, und Diisopropylethylamin (0,50 ml, 2,88 mMol, Aldrich) wurde hinzugesetzt. Nach dem 5-minütigen Rühren wurde N^α-(9-Fluorenylmethoxycarbonyloxy)-L-4-nitrophenylalanin (500 mg, 1,16 mMol, Novabiochem), N-Hydroxybenzotriazol (205 mg, 1,34 mMol, Novabiochem) und 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluorborat (430 mg, 1,34 mMol, Novabiochem) hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 72 Stunden lang gerührt, in Ethylacetat (125 ml) gegossen und mit 10% Chlorwasserstoffsäure (2 × 25 ml), gesättigter Natriumbicarbonatlösung (2 × 25 ml) und Salzlösung (25 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert. Das resultierende Öl wurde einer Chromatographie auf 50 g Silikagel unterzogen und mit 7:3 Hexan/Ethylacetat eluiert, wodurch man die Titelverbindung als einen weißen Feststoff (457 mg, 82%) erhielt.
3B) (3S,6R)-Bicyclo[4.4.0]-1,4-diaza-3-[(4-nitrophenyl)methyl]-2,5-decandion
Zu einer Lösung aus dem Ester von Teil 3A (200 mg, 0,34 mMol) in Dichlormethan (68 ml) wurde Piperadin (1,68 ml, 17,0 mMol, Aldrich) gegeben, und die Reaktionsmischung wurde 1 Stunde lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum konzentriert, und das resultierende Öl wurde einer Chromatographie auf 20 g Silikagel unterzogen und mit 19:1 Dichlormethan/Methanol eluiert, wodurch man die Titelverbindung als einen blassgelben Feststoff erhielt (69 mg, 67%).
3C) (3S,6R)-Bicyclo[4.4.0]-1,4-diaza-3-[(4-nitrophenyl)methyl]-4-N-(4-tertbutylbenzolsulfonyl)-2,5-decandion, Trifluoracetatsalz
Zu einer Lösung von Diketopiperazin vom Teil 3B (20 mg, 0,066 mMol) in wasserfreiem Tetrahydrofuran (1 ml, Aldrich) unter einer Stickstoffatmosphäre bei 0°C wurden 1,0 M Lithium-bis(trimethylsilyl)amid in Tetrahydrofuran (0,090 ml, 0,090 mMol, Aldrich) gegeben, und die Reaktionsmischung wurde 1 Stunde lang gerührt. 4-tert-Butylbenzolsulfonylchlorid (23 mg, 0,10 mMol) wurde in einem Schuss hinzugesetzt, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden lang gerührt. Salzlösung (5 ml) wurde hinzugesetzt, und die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat (3 × 10 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert. Das resultierende Öl wurde einer Chromatographie auf 25 g Silikagel unterzogen und mit 9:1 Hexan/Ethylacetat, dann mit 7:3 Hexan/Ethylacetat eluiert, wodurch man die Titelverbindung als einen weißen Feststoff (23 mg, 70%) erhielt: Massenspektrum (EI): (M⁺) bei 499.
BEISPIEL 4
(3S,6R)-Bicyclo[4.4.0]-1,4-diaza-3-(3-guanidinopropyl)-4-N-(4-tert-butylbenzolsulfonyl)-2,5-decandion, Trifluoracetatsalz
4A) 1-[N^γ-(4-Methyltrityl)-N^α-(9-fluorenylmethoxycarbonyloxy)-L-ornithinyl]-D-2-piperidincarbonsäure, Allylester
Der Pipecolinester von Beispiel 1 (500 mg, 1,86 mMol) wurde in 1:1 Trifluoressigsäure/Dichlormethan (8 ml) gelöst und 3 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum konzentriert und über Nacht an eine Vakuumpumpe gelegt. Das resultierende Öl wurde in Dimethylformamid (8 ml) gelöst, auf 0°C gekühlt, und Diisopropylethylmin (0,97 ml, 5,58 mMol, Aldrich) wurde hinzugesetzt. Nach dem 5-minütigen Rühren wurde N^γ-(4-Methyltrityl)-N^α-(9-fluorenylmethoxycarbonyloxy)-L-ornithin (1,36 g, 2,23 mMol, Novabiochem), N-Hydroxybenzotriazol (398 mg, 2,60 mMol, Novabiochem) und 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluorborat (835 mg, 2,60 mMol, Novabiochem) hinzugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde 96 Stunden lang gerührt, in Ethylacetat (125 ml) gegossen und mit 10% Chlorwasserstoffsäure (2 × 25 ml), gesättigter Natriumbicarbonatlösung (2 × 25 ml) und Salzlösung (25 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert. Das resultierende Öl wurde einer Chromatographie auf 75 g Silikagel unterzogen und mit 3:1 Hexan/Ethylacetat eluiert, wodurch man die Titelverbindung als einen weißen Feststoff erhielt (1,22 g, 86%).
4B) (3S,6R)-Bicyclo[4.4.0]-1,4-diaza-3-(3-N-(4-methyltrityl)aminopropyl)-2,5-decandion
Zu einer Lösung des Esters vom Abschnitt 4A (500 mg, 0,66 mMol) in Dichlormethan (132 ml) wurde Piperidin (3,26 ml, 33,0 mMol, Aldrich) gegeben, und die Reaktions mischung wurde 3 Stunden lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum konzentriert, und das resultierende Öl wurde einer Chromatographie auf 40 g Silikagel unterzogen und mit 1:1 Hexan/Ethylacetat eluiert, wodurch man die Titelverbindung als einen weißen Feststoff erhielt (288 mg, 91 %).
4C) (3S,6R)-Bicyclo[4.4.6]-1,4-diaza-3-(3-N-(4-methyltrityl)aminopropyl)-4-N-(4-tert-butylbenzolsulfonyl)-2,5-decandion
Zu einer Lösung des Diketopiperazins vom Abschnitt 4B (150 mg, 0,31 mMol) in wasserfreiem Tetrahydrofuran (5 ml, Aldrich) unter einer Stickstoffatmosphäre bei 0°C wurde 1,0 M Lithium-bis-(trimethylsilyl)amid in Tetrahydrofuran (0,42 ml, 0,42 mMol, Aldrich) gegeben, und die Reaktionsmischung wurde 1 Stunde lang gerührt. 4-tert-Butylbenzolsulfonylchlorid (109 mg, 0,47 mMol) wurde in einem Schuss hinzugesetzt, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden lang gerührt. Salzlösung (10 ml) wurde hinzugesetzt, und die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat (3 × 20 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert. Das resultierende Öl wurde einer Chromatographie auf 25 g Silikagel unterzogen und mit 9:1 Hexan/Ethylacetat, dann mit 7:3 Hexan/Ethylacetat eluiert, wodurch man die Titelverbindung als einen weißen Feststoff (135 mg, 64%) erhielt.
4D) (3S,6R)-Bicyclo[4.4.0]-1,4-diaza-3-(3-N,N'-(di-tert-butoxycarbonyl)-guanidinopropyl)-4-N-(4-tert-butylbenzolsulfonyl)-2,5-decandion
Diketopiperazin vom Abschnitt 4C (296 mg, 0,44 mMol) wurde in 1 % Trifluoressigsäure in Dichlormethan (30 ml) gelöst und 30 Minuten lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum konzentriert und das resultierende Öl wurde einer Chromatographie auf 25 g Silikagel unterzogen, mit 1:1 Hexan/Ethylacetat eluiert, dann mit 4:1 Dichlormethan/Methanol eluiert und lyophilisiert, wodurch man (3S,6R)-Bicyclo[4.4.0]-1,4-diaza-3-(3-aminopropyl)-4-N-(4-tert-butylbenzolsulfonyl)-2,5-decandion, Trifluoracetatsalz als einen weißen Feststoff erhielt.
Zu einer Lösung des obigen Amins in Dichlormethan (10 ml) wurde Triethylamin (0,061 ml, 0,44 mMol, Aldrich) und N,N'-Di-tert-butoxy-N''-trifluormethansulfonylguanidin (157 mg, 0,40 mMol, Journal of Organic Chemistry 63(12): 3804–3805 (1998)) gegeben. Nach dem 12-stündigen Rühren wurde die Reaktionsmischung in Dichlormethan (50 ml) gegossen und mit 1 M wässerigem Natriumbisulfat (10 ml), 5% wässerigem Natriumbicarbonat (10 ml) und Wasser (10 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert. Das resultierende Öl wurde einer Chromatographie auf 20 g Silikagel unterzogen und mit 9:1 Hexan/Ethylacetat, dann mit 1:1 Hexan/Ethylacetat eluiert, wodurch man die Titelverbindung als einen weißen Feststoff (239 mg, 93%) erhielt.
4E) (3S,6R)-Bicyclo[4.4.0]-1,4-diaza-3-(3-guanidinopropyl)-4-N-(4-tert-butyl-benzolsulfonyl)-2,5-decandion, Trifluoracetatsalz
Zu einer Lösung des Diketopiperazins vom Abschnitt 4D (100 mg, 0,16 mMol) wurde in 1:1 Trifluoressigsäure/Dichlormethan (2 ml) gelöst, 1 Stunde lang gerührt, und die Reaktionsmischung wurde im Vakuum konzentriert. Das resultierende Öl wurde einer Chromatographie auf 5 g Silikagel unterzogen, mit 19:1 Dichlormethan/Methanol, dann mit 9:1 Dichlormethan/Methanol eluiert und lyophilisiert, wodurch man die Titelverbindung als einen weißen Feststoff erhielt (88 mg, 96%). Elektrosprayen m.s.: (M+H⁺) bei 464,5.
BEISPIEL 5
(3S,6R)-Bicyclo[4.4.0]-1,4-diaza-3-(4-guanidinobutyl)-4-N-(4-tert-butylsulfonyl)-2,5-decandion, Trifluoracetatsalz
5A) 1-(N^ε-(4-Methyltrityl)-N^α-(9-fluorenylmethoxycarbonyloxy)-L-lysinyl]-D-2-piperidincarbonsäure, Allylester
Der Pipecolinester von Beispiel 1 (253 g, 0,94 mMol) wurde in 1:1 Trifluoressigsäure/Dichlormethan (5 ml) gelöst und 2 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum konzentriert und an eine Vakuumpumpe über Nacht angelegt. Das resultierende Öl wurde in Dimethylformamid (5 ml) gelöst, auf 0°C gekühlt, und Diisopropylethylamin (0,49 ml, 2,82 mMol, Aldrich) wurde hinzugesetzt. Nach 5-minütigem Rühren wurde N^ε-(4-Methyltrityl)-N^α-(9-fluorenylmethoxycarbonyloxy)-L-lysin (706 mg, 1,13 mMol, Novabiochem), N-Hydroxybenzotriazol (202 mg, 1,32 mMol, Novabiochem) und 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluorborat (424 mg, 1,32 mMol, Novabiochem) hinzugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde 72 Stunden lang gerührt, in Ethylacetat (125 ml) gegossen und mit 10%iger Chlorwasserstoffsäure (2 × 25 ml), gesättigten Natriumbicarbonatlösung (2 × 25 ml) und Salzlösung (25 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert. Das resultierende Öl wurde einer Chromatographie auf 50 g Silikagel unterzogen; mit 3:1 Hexan/Ethylacetat eluiert, wodurch man die Titelverbindung als einen weißen Feststoff erhielt (605 mg, 83%).
5B) (3S,6R)-Bicyclo[4.4.0]-1,4-diaza-3-(4-N-(4-methyltrityl)butyl)-2,5-decandion
Zu einer Lösung des Esters vom Abschnitt 5A (250 mg, 0,32 mMol) in Dichlormethan (64 ml) wurde Piperidin (1,58 ml, 16,0 mMol, Aldrich) hinzugesetzt, und die Reaktionsmischung wurde 2 Stunden lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum konzentriert, und das resultierende Öl wurde einer Chromatographie auf 25 g Silikagel unterzogen und mit Ethylacetat eluiert, wodurch man die Titelverbindung als einen weißen Feststoff erhielt (149 mg, 94%).
5C) (3S,6R)-Bicyclo[4.4.0]-1,4-diaza-3-(4-N-(4-methyltrityl)butyl)-4-N-(4-tert-butylbenzolsulfonyl)-2,5-decandion
Zu einer Lösung des Diketopiperazins vom Abschnitt 5B (50 mg, 0,10 mMol) in wasserfreiem Tetrahydrofuran (1,5 ml, Aldrich) unter einer Stickstoffatmosphäre bei 0°C wurden 1,0 M Lithium-bis(trimethylsilyl)amid in Tetrahydrofuran (0,14 ml, 0,14 mMol, Aldrich) gegeben, und die Reaktionsmischung wurde 1 Stunde lang gerührt. 4-tert-Butylbenzolsulfonylchlorid (35 mg, 0,15 mMol) wurde in einem Schuss hinzugesetzt, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden lang gerührt. Salzlösung (5 ml) wurde hinzugesetzt, und die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat (3 × 10 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert. Das resultierende Öl wurde einer Chromatographie auf 10 g Silikagel unterzogen und mit 9:1 Hexan/Ethylacetat, dann 7:3 Hexan/Ethylacetat eluiert, wodurch man die Titelverbindung als einen weißen Feststoff erhielt (47 mg, 68%).
5D) (3S,6R)-Bicyclo[4.4.0]-1,4-diaza-3-(4-aminobutyl)-4-N-(4-tert-butylbenzolsulfonyl)-2,5-decandion, Trifluoracetatsalz
Diketopiperazin vom Abschnitt 5C (57 mg, 0,082 mMol) wurde in 1%iger Trifluoressigsäure in Dichlormethan (2 ml) gelöst und 15 Minuten lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum konzentriert, und das resultierende Öl wurde einer Chromatographie auf 2 g Silikagel unterzogen, mit 1:1 Hexan/Ethylacetat, dann mit Methanol eluiert und lyophilisiert, um die Titelverbindung als einen weißen Feststoff zu erhalten (40 mg, 89%).
5E) (3S,6R)-Bicyclo[4.4.0]-1,4-diaza-3-(4-N,N'-(di-tert-butoxycarbonyl)guanidinobutyl)-4-N-(4-tert-butylbenzolsulfonyl)-2,5-decandion
Zu einer Lösung des Amins vom Abschnitt 5D (40 mg, 0,073 mMol) in Dichlormethan (5 ml) wurden Triethylamin (0,011 ml, 0,082 mMol, Aldrich) und N,N'-Di-tert-butoxy-N''-trifluormethansulfonylguanidin (29 mg, 0,074 mMol, Journal of Organic Chemistry 63(12): 3804–3805 (1998)) hinzugesetzt. Nach einem Rühren für 12 Stunden wurde die Reaktionsmischung in Dichlormethan (25 ml) gegossen und mit 1 M wässerigem Natriumbisulfat (5 ml), wässerigem 5%igem Natriumbicarbonat (5 ml) und Wasser (5 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert. Das resultierende Öl wurde einer Chromatographie auf 5 g Silikagel unterzogen und mit 9:1 Hexan/Ethylacetat, dann mit 1:1 Hexan/Ethylacetat eluiert, wodurch man die Titelverbindung als einen weißen Feststoff erhielt (35 mg, 71 %).
5F) (3S,6R)-Bicyclo[4.4.0]-1,4-diaza-3-(4-guanidinobutyl)-4-N-(4-tert-butyl-benzolsulfonyl)-2,5-decandion, Trifluoracetatsalz
Eine Lösung von Diketopiperazin vom Abschnitt 5E (35 mg, 0,052 mMol) wurde in 1:1 Trifluoressigsäure/Dichlormethan (1 ml) gelöst, 1 Stunde lang gerührt, und die Reaktionsmischung wurde im Vakuum konzentriert. Das resultierende Öl wurde einer Chromatographie auf 4 g Silikagel unterzogen und mit 19:1 Dichlormethan/Methanol, dann mit 9:1 Dichlormethan/Methanol eluiert, wodurch man die Titelverbindung als einen weißen Feststoff (28 mg, 90%) erhielt. Elektrosprayen m.s.: (M+H⁺) @ 478,0.
BEISPIEL 6
(3S,6R)-Bicyclo[4.4.0]-1,4-diaza-3-(3-guanidinopropyl)-4-N-(3-methyl-8-chinolinsulfonyl)-2,5-decandion, Hydrochloridsalz
6A) (3S,6R)-Bicyclo[4.4.0]-1,4-diaza-3-(3-N-(4-methyltrityl)aminopropyl-4-N-(3-methyl-8-chinolinsulfonyl)-2,5-decandion
Zu einer Lösung des Diketopiperazins vom Beispiel 4, Abschnitt B (350 mg, 0,73 mMol) in wasserfreiem Tetrahydrofuran (12 ml, Aldrich) wurde unter einer Stickstoffatmosphäre bei 0°C 1,0 M Lithium-bis(trimethylsilyl)amid in Tetrahydrofuran (0,88 ml, 0,88 mMol, Aldrich) gegeben, und die Reaktionsmischung wurde 1 Stunde lang gerührt. 3-Methyl-8-chinolinsulfonylchlorid (168 mg, 0,69 mMol) wurde in einem Schuss hinzugesetzt, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden lang gerührt. Salzlösung (15 ml) wurde hinzugesetzt, und die Reaktionsmischung wurde mit Ethyl acetat (3 × 25 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert. Das resultierende Öl wurde einer Chromatographie auf 35 g Silikagel unterzogen und mit 1:1 Hexan/Ethylacetat eluiert, wodurch man die Titelverbindung als einen weißen Feststoff erhielt (304 mg, 64%).
6B) (3S,6R)-Bicyclo[4.4.0]-1,4-diaza-3-(3-aminopropyl)-4-N-(3-methyl-8-chinolinsulfonyl)-2,5-decandion, Trifluoracetatsalz
Das Diketopiperazin vom Abschnitt 6A (304 mg, 0,44 mMol) wurde in 1 % Trifluoressigsäure in Dichlormethan (30 ml) gelöst und 30 Minuten lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum konzentriert, und das resultierende Öl wurde einer Chromatographie auf 25 g Silikagel unterzogen, mit 1:1 Hexan/Ethylacetat, dann mit 4:1 Dichlormethan/Methanol eluiert und lyophilisiert, wodurch man die Titelverbindung als einen weißen Feststoff erhielt (240 mg, 100%).
6C) (3S,6R)-Bicyclo[4.4.0]-1,4-diaza-3-(3-N,N'-(di-tert-butoxycarbonyl)-guanidinopropyl)-4-N-(3-methyl-8-chinolinsulfonyl)-2,5-decandion
Zu einer Lösung des Amins vom Abschnitt 6B (240 mg, 0,44 mMol) in Dichlormethan (10 ml) wurde Triethylamin (0,12 ml, 0,88 mMol, Aldrich) und N,N'-Di-tert-butoxy-N''-trifluormethansulfonylguanidin (164 mg, 0,42 mMol, Journal of Organic Chemistry 63(12): 3804–3805 (1998)) gegeben. Nach dem Rühren für 12 Stunden wurde die Reaktionsmischung in Dichlormethan (50 ml) gegossen und mit wässeriger 1 M Natriumbisulfatlösung (10 ml), wässerigem 5%igem Natriumbicarbonat (10 ml) und Wasser (10 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert. Das resultierende Öl wurde einer Chromatographie auf 25 g Silikagel unterzogen und mit 1:1 Hexan/Ethylacetat eluiert, wodurch man die Titelverbindung als einen weißen Feststoff (216 mg, 73%) erhielt.
6D) (3S,6R)-Bicyclo[4.4.0]-1,4-diaza-3-(3-guanidinopropyl)-4-N-(3-methyl-8-chinolinsulfonyl)-2,5-decandion, Hydrochloridsalz
Eine Lösung des Diketopiperazins vom Abschnitt 6C (10 mg, 0,015 mMol) wurde in 3 N Chlorwasserstoffsäure in Ethylacetat (0,27 ml) gelöst, 1 Stunde gerührt, die Reaktionsmischung wurde im Vakuum konzentriert und lyophilisiert, wodurch man die Titelverbindung als einen weißen Feststoff erhielt (7 mg, 88%). Elektrosprayen m.s.: (M+H⁺) @ 473,5.
BEISPIEL 7
(3S,6R,8R)-Bicyclo[4.4.0]-1,4-diaza-3-(3-guanidinopropyl)-4-N-(3-methyl-8-chinolinsulfonyl)-8-methyl-2,5-decandion, Hydrochloridsalz
7A) (2R,4R)-1-[N^γ-(4-Methyltrityl)-N^α-(9-fluorenylmethoxycarbonyloxy)-L-ornithinyl]-4-methyl-2-piperidincarbonsäure, Allylester
Der Pipecolinester vom Beispiel 2 (406 mg, 1,43 mMol) wurde in 1:1 Trifluoressigsäure/Dichlormethan (7 ml) gelöst und 2 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum konzentriert und über Nacht an eine Vakuumpumpe gelegt. Das resultierende Öl wurde in Dimethylformamid (7 ml) gelöst, auf 0°C gekühlt, und Diisopropylethylamin (0,75 ml, 4,29 mMol, Aldrich) wurde hinzugesetzt. Nach dem Rühren für 5 Minuten wurden N^γ-(4-Methyltrityl)-N^α-(9-fluorenylmethoxycarbonyloxy)-L-ornithin (1,05 g, 1,72 mMol, Novabiochem), N-Hydroxybenzotriazol (306 mg, 2,00 mMol, Novabiochem) und 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluorborat (642 mg, 2,00 mMol, Novabiochem) hinzugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde 72 Stunden lang gerührt, in Ethylacetat (125 ml) gegossen und mit 10% Chlorwasserstoffsäure (2 × 25 ml), gesättigter Natriumbicarbonatlösung (2 × 25 ml) und Salzlösung (25 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert. Das resultierende Öl wurde einer Chromatographie auf 75 g Silikagel unterzogen und mit 3:1 Hexan/Ethylacetat eluiert, wodurch man die Titelverbindung als einen weißen Feststoff erhielt (1,05 g, 95%).
7B) (3S,6R,8R)-Bicyclo[4.4.0]-1,4-diaza-3-(3-N-(4-methyltrityl)aminopropyl)-8-methyl-2,5-decandion
Zu einer Lösung des Esters vom Abschnitt 7A (958 mg, 1,23 mMol) in Dichlormethan (246 ml) wurde Piperidin (6,1 ml, 61,7 mMol, Aldrich) gegeben, und die Reaktionsmischung wurde 4 Stunden lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum konzentriert, und das resultierende Öl wurde einer Chromatographie auf 65 g Silikagel unterzogen und mit 4:1 Hexan/Ethylacetat, dann mit 1:1 Hexan/Ethylacetat eluiert, wodurch man die Titelverbindung als einen weißen Feststoff erhielt (520 mg, 96%).
7C) (3S,5R,8R)-Bicyclo[4.4.0]-1,4-diaza-3-(3-N-(9-methyltrityl)aminopropyl)-4-N-(3-methyl-8-chinolinsulfonyl)-8-methyl-2,5-decandion
Zu einer Lösung des Diketopiperazins vom Abschnitt 7B (250 mg, 0,50 mMol) in wasserfreiem Tetrahydrofuran (7 ml, Aldrich) unter einer Stickstoffatmosphäre bei 0°C wurde 1,0 M Lithium-bis(trimethylsilyl)amid in Tetrahydrofuran (0,50 ml, 0,50 mMol, Aldrich) gegeben, und die Reaktionsmischung wurde 1 Stunde gerührt. 3-Methyl-8-chinolinsulfonylchlorid (97 mg, 0,40 mMol) wurde in einem Schuss hinzugesetzt, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden lang gerührt. Salzlösung (7ml) wurde hinzugesetzt, und die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat (3 × 20 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert. Das resultierende Öl wurde einer Chromatographie auf 25 g Silikagel unterzogen und mit 3:1 Hexan/Ethylacetat, dann mit 3:2 Hexan/Ethylacetat eluiert, wodurch man die Titelverbindung als einen weißen Feststoff (177 mg, 63%) erhielt.
7D) (3S,6R,8R)-Bicyclo[4.4.0]-1,4-diaza-3-(3-aminopropyl)-4-N-(3-methyl-8-chinolinsulfonyl)-8-methyl-2,5-decandion, Trifluoracetatsalz
Das Diketopiperazin vom Abschnitt 7C (264 mg, 0,38 mMol) wurde in 1% Trifluoressigsäure in Dichlormethan (26 ml) gelöst und 30 Minuten lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum konzentriert, und das resultierende Öl wurde einer Chromatographie auf 20 g Silikagel unterzogen, mit 1:1 Hexan/Ethylacetat, dann mit 19:1 Dichlormethan/Methanol eluiert und lyophilisiert, wodurch man die Titelverbindung als einen weißen Feststoff erhielt (206 mg, 100%).
7E) (3S,6R,8R)-Bicyclo[4.4.0]-1,4-diaza-3-(3-N,N'-(di-tert-butoxycarbonyl)-guanidinopropyl)-4-N-(3-methyl-8-chinolinsulfonyl)-8-methyl-2,5-decandion
Zu einer Lösung des Amins des Abschnitts 7D (206 mg, 0,38 mMol) in Dichlormethan (8 ml) wurde Triethylamin (0,053 ml, 0,38 mMol, Aldrich) und N,N'-Di-tert-butoxy-N''-trifluormethansulfonylguanidin (82 mg, 0,34 mMol, Journal of Organic Chemistry 63(12): 3804–3805 (1998)) gegeben. Nach einem Rühren für 12 Stunden wurde die Reaktionsmischung in Dichlormethan (50 ml) gegossen und mit wässeriger 1 M Natriumbisulfatlösung. (10 ml), wässerigem 5%igem Natriumbicarbonat (10 ml) und Wasser (10 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert. Das resultierende Öl wurde einer Chromatographie auf 15 g Silikagel unterzogen und mit 1:1 Hexan/Ethylacetat eluiert, wodurch man die Titelverbindung als einen weißen Feststoff (140 mg, 60%) erhielt.
7F) (3S,6R,8R)-Bicyclo[4.4.0]-1,4-diaza-3-(3-guanidinopropyl)-4-N-(3-methyl-8-chinolinsulfonyl)-8-methyl-2,5-decandion, Hydrochloridsalz
Eine Lösung des Diketopiperazins vom Abschnitt 7E (10 mg, 0,15 mMol) wurde in 3 N Chlorwasserstoffsäure in Ethylacetat (0,27 ml) gelöst, 1 Stunde lang gerührt, die Reaktionsmischung wurde im Vakuum konzentriert und lyophilisiert, wodurch man die Titelverbindung als einen weißen Feststoff (7,5 mg, 94%) erhielt. Elektrosprayen m.s.: (M+H⁺) bei 487,5.
BEISPIEL 8
(3S,6R,8R)-Bicyclo[4.4.0]-1,4-diaza-3-(3-guanidinopropyl)-4-N-(1,2,3,4-tetrahydro-3-methyl-8-chinolinsulfonyl)-8-methyl-2,5-decandion, Hydrochloridsalz
8A) (2R,4R)-1-[N^γ-(4-Methoxy-2,3,6-trimethylbenzolsulfonyl)-N^α-(tert-butoxycarbonyl)-L-arginyl]-4-methyl-2-piperidincarbonsäure
Der Pipecolinester vom Beispiel 2 (375 mg, 1,32 mMol) wurde in 1:1 Trifluoressigsäure/Dichlormethan (8 ml) gelöst und 2 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum konzentriert und über Nacht an eine Vakuumpumpe gelegt. Das resultierende Öl wurde in Dimethylformamid (8 ml) gelöst, auf 0°C gekühlt, und Diisopropylethylamin (1,15 ml, 6,6 mMol, Aldrich) wurde hinzugesetzt. Nach dem Rühren für 5 Minuten wurden N^γ-(4-Methoxy-2,3,6-trimethylbenzolsulfonyl)-N^α-(tert-butoxycarbonyl)-L-arginin (769 mg, 1,58 mMol, Novabiochem), N-Hydroxybenzotriazol (283 mg, 1,85 mMol, Novabiochem) und 2-(1N-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium (594 mg, 1,85 mMol, Novabiochem) hinzugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde 18 Stunden lang gerührt, in Ethylacetat (75 ml) gegossen und mit 10%iger Zitronensäure (2 × 10 ml), gesättigter Natriumbicarbonatlösung (2 × 10 ml) und Salzlösung (10 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert, wodurch man (2R,4R)-1-[N^γ-(4-Methoxy-2,3,6-trimethylbenzolsulfonyl)-N^α-(tert-butoxycarbonyl)-L-arginyl]-4-methyl-2-piperidincarbonsäure, Allylester als einen schaumartigen Feststoff erhielt.
Das Peptid von oben wurde in 1:1 Trifluoressigsäure/Dichlormethan (8 ml) gelöst und 5 Minuten lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum konzentriert und 5 Minuten lang an eine Vakuumpumpe gelegt. Das resultierende Öl wurde in Dichlormethan (20 ml) gelöst, und Triethylamin (1,8 ml, 13,2 mMol, Aldrich) und 3-Methyl-8-chinolinsulfonylchlorid (319 mg, 1,32 mMol) wurden hinzugesetzt. Nach 1-stündigem Rühren wurde die Reaktionsmischung in Dichlormethan (50 ml) gegossen und mit Wasser (15 ml) und Salzlösung (15 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert, wodurch man (2R,4R)-1-[N^γ-(4-Methoxy-2,3,6-trimethylbenzolsulfonyl)-N^α-(3-methyl-8-chinolinsulfonyl)-L-arginyl]-4-methyl-2-piperidincarbonsäure, Allylester als einen blassgelben, schaumartigen Feststoff erhielt.
Das Peptid von oben wurde in absolutem Ethanol (14 ml) und wässeriger 1 N Natriumhydroxidlösung (3,6 ml) gelöst. Nach dem Rühren für 21 Stunden wurde die Reaktionsmischung auf einen pH-Wert von 7 mit 1 N Chlorwasserstoffsäure eingestellt und im Vakuum konzentriert. Der resultierende Rückstand wurde in 1:1 Ethylacetat/Wasser (20 ml) gelöst, die Lösung wurde auf einen pH-Wert von 11 mit 1 N Natriumhydroxid eingestellt und mit Ethylacetat (2 × 30 ml) extrahiert. Die wässerige Schicht wurde auf einen pH-Wert von 2 mit 1 N Chlorwasserstoffsäure eingestellt und mit Chloroform (3 × 50 ml) extrahiert. Die vereinigten Chloroform-Extrakte wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert, wodurch man die Titelverbindung als einen weißen schaumartigen Feststoff erhielt (829 mg, 88% über 3 Stufen).
8B) (2R,4R)-1-[N^γ-(4-Methoxy-2,3,6-trimethylbenzolsulfonyl)-N^α-(1,2,3,4-tetrahydro-3-methyl-8-chinolinsulfonyl)-L-arginyl]-4-methyl-2-piperidincarbonsäure
Eine Suspension der Säure vom Abschnitt 8A (100 mg, 0,14 mMol) und 10% Palladium-auf-Kohlenstoff (28 mg, Aldrich) in 95% Ethanol (2 ml) und 1 N Chlorwasserstoffsäure (0,12 ml) wurde in einem verschlossenen 15 ml-Röhrchen unter einer Wasserstoffatmosphäre bei 75 bis 80°C 65 Stunden lang erhitzt. Die Mischung wurde auf Raumtemperatur gekühlt, filtriert und im Vakuum konzentriert. Das resultierende Öl wurde einer Chromatographie auf 15 g Silikagel unterzogen und mit Ethylacetat, dann mit 4:1 Dichlormethan/Methanol eluiert, wodurch man die Titelverbindung als einen weißen Feststoff erhielt (58 mg, 58%).
8C) (3S,6R,8R)-Bicyclo[4.4.0]-1,4-diaza-3-(3-(N^γ-4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzol-sulfonyl)guanidinopropyl)-4-N-(3-methyl-1,2,3,4-tetrahydro-8-chinolinsulfonyl)-8-methyl-2,5-decandion
Zu einer Lösung der Säure vom Abschnitt 8B (58 mg, 0,080 mMol) in Dichlormethan (16 ml) wurden N-Hydroxybenzotriazol (12 mg, 0,080 mMol, Novabiochem), 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluorborat (26 mg, 0,080 mMol, Novabiochem) und Diisopropylethylamin (0,014 ml, 0,80 mMol, Aldrich) gegeben. Die Reaktionsmischung wurde 3 Stunden lang gerührt, in Ethylacetat (30 ml) gegossen und mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung (10 ml) und Salzlösung (10 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert. Das resultierende Öl wurde einer Chromatographie auf 6 g Silikagel unterzogen, mit 1:4 Hexan/Ethylacetat eluiert und lyophilisiert, wodurch man die Titelverbindung als einen weißen Feststoff (51 mg, 91 %) erhielt.
8D) (3S,6R,8R)-Bicyclo[4.4.0]-1,4-diaza-3-(3-guanidinopropyl)-4-N-(1,2,3,4-tetrahydro-3-methyl-8-chinolinsulfonyl)-8-methyl-2,5-decandion, Hydrochloridsalz
Das Diketopiperazin vom Abschnitt 8C (36 mg, 0,051 mMol) wurde in 1:1 Trifluoressigsäure/Dichlormethan (4 ml) gelöst, 20 Stunden lang gerührt und im Vakuum konzentriert. Das resultierende Öl wurde in 3 N Chlorwasserstoffsäure in Ethylacetat (4 ml) gelöst, 1 Stunde lang gerührt und im Vakuum konzentriert. Das resultierende Öl wurde einer Chromatographie auf 2 g Silikagel unterzogen, mit Ethylacetat, dann mit Methanol eluiert und lyophilisiert, wodurch man die Titelverbindung als einen weißen Feststoff erhielt (20 mg, 74%). Elektrosprayen m.s.: (M+H⁺) bei 491,5.
BEISPIEL 9
Biologische Tests für Cycloargatroban (Formel I), in der R¹, R² und R⁴ Wasserstoff sind, R³ Me=CH₃ ist, R⁵ 1,2,3,4-Tetrahydro-3-methyl-8-chinolinsulfonyl ist und R⁶ 3-Guanidinopropyl ist
Die Aktivität und Selektivität der vorliegenden Erfindung kann durch die Bestimmung der Inhibitions-Konstanten (K_i) für Serin-Proteasen, wie Thrombin und Trypsin, und fibrinolytische Enzyme, wie Urokinase, Plasmin und Gewebe-Plasminogen-Aktivator (tPA), identifiziert werden. Alle Enzyme wurden von Sigma gekauft. Die allgemeinen Test-Bedingungen sind wie folgt. Die fluorogenen Substrate werden in DMSO gelöst und unter Verwendung eines Test-Puffers, der 50 mM TrisHCl (pH 7,8 bei 25°C), 0,1 M NaCl und 0,1% Polyethylenglykol 8000 (PEG 8000) enthielt, verdünnt. Die fluorogenen Substrate sind Tos-Gly-Pro-Arg-AMC (Sigma, Km = 4,0 μM bei 25°C, pH 7,8) (Yudu Cheng et al., Biochemistry, 1996, 35: 13021–13029) für Thrombin, Bz-Arg-AMCHCl (Bachem, Km = 59±2 μM bei 25°C, pH 8,0) für Trypsin, N-Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC (Sigma, K_m = 400 μM bei 24°C und pH 7,5) für Urokinase, D-Ala-Leu-Lys-AMC (Sigma, K_m = 620 μM bei 25°C und pH 8,0) für Plasmin und Boc-L-(p-F)FPR-ANSNH-C₂H₅ (Haematologic Technologies Inc., K_m = 71 μM bei 25°C und pH 7,4) für tPA. Die Tests wurden unter Verwendung eines Hitachi F2500-Spektrophotometers unter Umgebungstemperatur und bei den Anregungs- und Emissionswellenlängen von 383 nm bzw. 455 nm durchgeführt. Die typischen Entwicklungsdaten der enzymatischen Tests sind in den 1 bis 3 gezeigt, und die Bestimmung der Inhibitions-Konstanten (K_i) ist in 4 gezeigt. Die Test-Ergebnisse sind im Vergleich zu Ar gatroban, einem derzeit klinisch in der Verwendung befindlichem Antikoagulanz und mit der chemischen Struktur XIII, in Tabelle 1 gezeigt.
Die Ergebnisse zeigen, dass das Cycloargatroban, welches von der Cyclisierung des Grundgerüstes von Argatroban abgeleitet ist, sich durch folgende Merkmale auszeichnet: (1) Beibehaltung einer hohen Thrombin-Inhibierungsaktivität (2,1-fach niedriger als Argatroban); (2) Erreichen einer hohen Selektivität für Thrombin gegenüber Trypsin (12-fach höher als Argatroban); (3) Aufrechterhalten von keiner signifikanten Inhibierung für fibrinolytische Enzyme (ähnlich wie Argatroban); (4) Beibehaltung der Diversität in Seitenketten (ähnlich wie Argatroban).
Tabelle I Test-Ergebnisse des Vergleichs von Argatroban (siehe untenstehende chemische Strukturen XIII) und Cycloargatroban (Formel I), worin R¹, R² und R⁴ Wasserstoff sind, R³ Me=CH₃ ist, R⁵ 1,2,3,4-Tetrahydro-3-methyl-8-chinolinsulfonyl ist und R⁶ 3-Guanidinopropyl ist
BEISPIEL 10
Ex vivo-Gerinnungs-Test
Die ex vivo-Antikoagulanz-Effekte von NPI999 im Vergleich zu Argatroban, einem Referenz-Antikoagulanz, das derzeit in der klinischen Verwendung ist und folgende chemische Struktur aufweist:
wurden durch Messung der Verlängerung der aktivierten partiellen Thromboplastin-Zeit (APTT) über einen breiten Konzentrationsbereich von jedem hinzugesetzten Thrombin-Inhibitor unter Verwendung von gepooltem normalem Humanplasma bestimmt. Gefrorenes gepooltes Humanplasma wurde von Sigma erhalten. Die Messung von APTT wurde unter Verwendung des automatisierten ELECTRA^TM 800- Koagulometers (Medical Laboratory Automation Inc.) unter Verwendung des Reagenzes zur automatisierten APTT-Bestimmung (Sigma) als Initiator der Gerinnselbildung gemäß den Instruktionen des Herstellers durchgeführt. Der Test wurde durchgeführt, indem eine Reihe von Verdünnungen der Referenz- und der Testverbindungen im schnell aufgetauten Plasma (Verbindung: Plasma = 0,1 ml:0,9 ml), gefolgt von der Zugabe der gemischten Lösung zu den Vertiefungen des Test-Karussels gemacht wurden. Tris-Puffer (pH 7,8 bei 25°C) wurden während des gesamten Tests verwendet.
Die 5 zeigt die Wirkung von NP1999 (offener Kreis) und Argatroban (offenes Quadrat) auf die aktivierte partielle Thromboplastin-Zeit (APTT) von normalem mit Citrat versetztem Humanplasma. Wie in der 5 gezeigt, verlängerten beide Verbindungen die APTT in einer Dosis-abhängigen Weise. Dies zeigt die Deaktivierung von koagulierenden Enzymen, die in dem Humanplasma vorliegen. Es ist anzumerken, dass APTT die gesamten Antikoagulanz-Effekte einer Verbindung gegenüber den verklumpenden Enzymen, wie Thrombin, Plasmin, Urokinase, Gewebe-Plasminogen-Aktivator (tPA) und Serin-Protease, wie Trypsin, Faktor X etc., misst. Deshalb kann der weniger starke Effekt von Cycloargatroban (Formel I) als Argatroban auf die APTT einer höheren Selektivität von Cycloargatroban (Formel I) zu der Gerinnselbildung und Serin-Protease als Argatroban zugeschrieben werden.
Obgleich die Erfindung in Verbindung mit spezifischen Ausführungsformen davon beschrieben worden ist, versteht es sich, dass sie zu weiteren Modifikationen in der Lage ist, und dass diese Anmeldung jegliche Variationen, Verwendungen oder Adaptionen der Erfindung, die allgemein den Prinzipien der Erfindung folgen, abdecken soll und solche Abweichungen von der Offenbarung einschließt, welche innerhalb der bekannten oder gängigen Praxis innerhalb des Fachbereichs, zu welchen die Erfindung gehört, liegen, und wie sie auf die hier vorstehend dargelegten wesentlichen Merkmalen anzuwenden ist, und wie sie aus dem Umfang der anhängigen Ansprüche folgt.

Claims

Verbindung der folgenden Struktur I:
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz und Stereoisomer hiervon, wobei R¹, R² und R⁴ aus einem Wasserstoffatom, Alkyl- oder Arylrest bestehen, R³ aus einem Alkyl- oder Arylrest besteht, R⁵ aus einem Wasserstoffatom, Alkyl-, Aryl-, Hydroaryl-, Heteroaryl-, Hydroheteroaryl-, Sulfonylalkyl-, Sulfonylaryl-, Sulfonylhydroaryl-, Sulfonylheteroaryl- oder Sulfonylhydroheteroarylrest besteht und R⁶ aus einem Wasserstoffatom, Alkyl-, Aryl-, Hydroaryl-, Heteroaryl- oder Hydroheteroarylrest besteht.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R¹, R² und R⁴ aus einem Wasserstoffatom, Alkyl- oder Arylrest bestehen, R³ aus einem Alkyl- oder Arylrest besteht und wobei R⁵ aus einem Alkyl-, Aryl-, Hydroaryl-, Heteroaryl- oder Hydroheteroarylrest besteht.
Verbindung nach Anspruch 2, wobei R³ aus einem Methylrest besteht, R⁵ aus 1,2,3,4-Tetrahydro-3-methyl-8-chinolinsulfonyl besteht und R⁶ aus 3-Guanidinopropyl besteht.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung nach Anspruch 1 als aktiven Bestandteil in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung nach Anspruch 1 in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung für die orale Verabreichung geeignet ist.
Verwendung der Verbindung nach Anspruch 1 für die Herstellung eines Medikaments, um im Wesentlichen die Thrombin-Aktivität bei einem Säuger oder einem Menschen oder einem Gewebe hiervon zu verhindern.
Verwendung der Verbindung nach Anspruch 1 für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Gerinnungsstörung bei einem Säuger oder einem Menschen oder einem Gewebe hiervon.
Verwendung nach Anspruch 6 oder 7, wobei die Störung in einer Trombose- oder Heparin-induzierten Thrombozytopenie (HIT) besteht.
Verwendung der Verbindung nach Anspruch 1 für die Herstellung eines Medikaments, um im Wesentlichen die fibrinolytische Enzymaktivität bei einem Säuger oder einem Menschen oder einem Gewebe hiervon zu verhindern.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei das fibrinolytische Enzym gewählt ist aus der Gruppe von Urokinase, Plasmin und Gewebe-Plasminogen-Aktivator (tPA).