JP3290661B2

JP3290661B2 - 陸蛭からの新規トロンビン阻害性蛋白質

Info

Publication number: JP3290661B2
Application number: JP50976693A
Authority: JP
Inventors: カール−ヘルマンシュトルーベ，; ジークフリートビアロヤン，; ブルクハルトクレーガー，; トーマスフリードリッヒ，
Original assignee: ビーエーエスエフアクチエンゲゼルシャフト
Priority date: 1991-11-26
Filing date: 1992-11-19
Publication date: 2002-06-10
Anticipated expiration: 2017-06-10
Also published as: US5455181A; DK0616642T3; EP0616642A1; DE59208025D1; MX9206732A; JPH07501529A; WO1993011239A1; CA2121601A1; ES2097368T3; EP0616642B1; DE4209110A1; ATE148744T1

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、陸蛭（Landegel）ヘマディプサ・シルベス
トリス（Haemadipsa sylvestris）からの新規トロンビ
ン阻害性蛋白質ならびにその取得法に関する。

トロンビン阻害剤は、例えば血栓症又は動脈再閉塞の
予防又は処置のために使用される、重要な治療用物質で
ある。

欧州特許（EP）第142860号明細書には、医療用蛭（Hi
rudo medicinalis）からのトロンビン阻害剤、ヒルジン
がその主要構造と共に記載されている。更に、遺伝子技
術によるヒルジンの製造が、欧州特許（EP）第168342号
明細書から公知である。

ところで、今般、陸蛭ヘマディプサ・シルベストリス
から新規のトロンビン阻害性蛋白質が単離された。

この新規蛋白質は、次の物理化学的特性を有する。分
子篩クロマトグラフィにより、これには、11200±1000
ダルトンの分子量が関係付けられる。SDS−ポリアクリ
ルアミドゲルでは、5000±1000ダルトンの分子量が測定
される。

この蛋白質は、特異的に、トロンビン−親和性カラム
に結合する。これは、インビトロ酵素試験で、トロンビ
ンの生物学的活性を抑制する。

次のＮ−末端アミノ酸配列が、この蛋白質から測定さ
れた（SEQ−ID NO:3）：（ここでＡはAsp又はPheであり、ＢはGlu又はTrpであ
り、ＣはLys、Asn又はAspであり、ＤはPro又はLeuであ
る）。

この新規蛋白質は、ヘマディプサ属の陸蛭から単離す
ることができる。このために、蛭をpH6〜９有利に、pH7
〜８で緩衝液中に入れ、ホモゲナイザー有利に、ミキサ
ー中で、ホモゲナイズするのが有利である。引続き不溶
分を有利に遠心分離により分離除去する。

こうして得られた溶液から、蛋白質を更にクロマトグ
ラフィ法で、有利にイオン交換クロマトグラフィ及び／
又はアフィニティクロマトグラフィにより精製すること
ができる。特に、トロンビン−アフィニティクロマトグ
ラフィによる精製工程が有利である。

トロンビン−カラムでのアフィニティクロマトグラフ
ィの後に、逆相HPLCにより、トロンビン阻害活性を有す
る種々異なるイソ蛋白質を分離して取得することができ
る（第１図参照）。

この蛋白質の精製は、トロンビン−活性試験を経て行
なうことができる。このために、色原性基質例えばクロ
モチーム（Chromozym）THがトロンビンにより変換され
る光学的試験を使用するのが有利である。新規蛋白質を
含有するフラクションは、この光学的試験でのそのトロ
ンビンへの添加時に阻害作用が認めることができる。

本発明の蛋白質の製造のためには、遺伝子技術的方法
が特に好適である。

このために、自体公知の方法で、蛭からのcDNA−遺伝
子バンクを設定する。この遺伝子バンクから、本発明に
よる蛋白質をコードする遺伝子を単離することができ、
ここでは、例えば、前記Ｎ−末端アミノ酸配列から遺伝
子コードに応じた逆翻訳により得られる配列を有するDN
A−プローブを製造する。このDNA−プローブとのハイブ
リド形成により、相応する遺伝子を見つけ、かつ単離す
ることができる、。

しかしながら、この相応する遺伝子の製造のために、
ポリメラーゼ−鎖−反応（PCR）−技術を使用すること
もできる。例えば、前記Ｎ−末端アミノ酸配列から逆翻
訳により得られた配列を有するプライマーを用いて、か
つcDNA遺伝子フラグメントの３′−末端に対して相補的
な配列を有する第２のプライマーを用いて、有利には、
配列ポリ（dT）と共に、本発明による蛋白質に関するcD
NA−遺伝子フラグメントをPCR技術で製造することがで
きる。相応する遺伝子は、蛭の発現遺伝子バンクを設定
し、これを本発明の蛋白質と反応する抗体で捜査する方
法で単離することもできる。

この本発明による蛋白質をコード化する。cDNAは、SE
Q ID NO 22で表わされる。

他の好適なDNA−配列は、SEQ ID NO 22に挙げられ
ているもの以外のヌクレオチド配列を有するが、遺伝子
コードの縮重の結果、SEQ ID NO 22に記載のポリペ
プチド鎖又はその一部をコード化するものである。更
に、トロンビン阻害作用を有する蛋白質をコード化し、
標準的条件下で、SEQ ID NO 22で表わされるヌクレ
オチド配列又はSEQ ID NO22で表わされる蛋白質をコ
ード化するヌクレオチド配列とハイブリド形成するよう
なDNA−配列が好適である。DNA−ハイブリド形成のため
の実験条件は、遺伝子技術の教科書、例えばManiatis等
の“Molecular Cloning",Cold Spring Harbor Laborato
ry 1990に記載されている。

標準条件とは、例えば、0.1〜１×SSC（１×SSC:0.15
M NaCl、15mMクエン酸ナトリウムpH7.2）の濃度を有す
る水性緩衝液中での42〜58℃の温度と解すべきである。

相応するこの遺伝子が単離された後、これは、遺伝子
技術により、発現ベクターを用いて自体公知の方法で、
生物中に、例えば細菌、酵母又は高級真核細胞中に発現
させることができる。

本発明の蛋白質を融合蛋白質の形で構成する原核性発
現系を使用するのが有利である。このような発現系の例
は、市場で入手されプロフュジョン−システム（Prof
usion−System;New England Biolabs）であり、これ
は、所望の蛋白質を、マルトース−結合蛋白質との融合
蛋白質として、誘導可能なtac−プロモーターのコント
ロール下に合成する。

この融合蛋白質から、所望の蛋白質を、ファクターXa
を用いる分解により遊離させることができる。

この組換え宿主系から、蛋白質は、前記の物理化学的
特性に基づき、単離することができる。

公知アミノ酸部分配列での新規蛋白質の遺伝子技術的
製造のための一般的処置法は、遺伝子技術の教科書に、
例えばE.L.Winnackerの“Gene und Klone",Verlag Chem
ie,Weinheim,1984に記載されている。個々の方法に関す
る実験条件、例えば、遺伝子バンクの設定、ハイブリド
形成、遺伝子の発現は、T.Maniatisの“Molecular Clon
ing",Cold Spring Harbor Laboratory,1990に記載され
ている。

SEQ ID NO 22に記載のcDNA−配列は、それでコー
ド化された蛋白質の公知方法を用いる突然変異生成の可
能性を提供する。これによって、個個のアミノ酸がSEQ
ID NO 22に記載の蛋白質配列で交換されている蛋白
質を製造することができる。特に好適な蛋白質は、ポリ
ペプチド末端の変更により、殊に、末端の短縮により得
られるものである。特に好適な蛋白質は、Ｃ−末端の所
で有利に１〜12個のアミノ酸の短縮により得られる。こ
のように短縮された突然変異体は、同様にトロンビン阻
害作用を有する。

本発明による蛋白質は、その薬剤学的に認容しうる塩
の形で使用するのが有利である。

新規蛋白質は、血液凝固抑制特性を有する。これら
は、例えば、血栓症又は動脈再閉塞の予防のため、血栓
症の処置のため、血液の保存のため又は体外循環の場合
に使用することができる。この新規蛋白質は、有効なト
ロンビン阻害剤である。これは、単独でも、公知の凝固
阻害因子と一緒にしても医薬品として使用することがで
きる。凝固阻害因子としては、トロンビン阻害剤例えば
ヒルジン、因子Xa−阻害剤、例えばTAP（Waxman等のSci
ence 248,1990,593−596頁）又は血小板−凝集抑制剤例
えばクリストン（Kristrin）（Dennis等のProc.Natl.Ac
ad.Sci.USA 87,1989,2471〜2475頁）を使用するのが有
利である。

本発明を次の実施例で更に説明する：例１陸蛭からのトロンビン阻害性蛋白質の精製ａ）蛭ホモジネートの取得生きている陸蛭（Haemadipsa sylvestris）150gを20m
M燐酸ナトリウム（pH7.4）400m中で、ミキサーを用
い、４℃で10分間均質化した。このホモジネートを、20
00U/min（Sorvall RC−5B,Rotor GS−３）で15分間、
次いで沈殿物の除去の後に、8000U/minで30分間遠心し
た。沈殿を捨て、上澄みを50mMトリス（ヒドロキシメチ
ル）−アミノ−メタン/HCl−緩衝液（pH8.5）（トリス/
HCl−緩衝液）で、約60mの量まで稀釈した。

この蛋白質溶液は580mの量で、その蛋白質濃度は4.
49mg/mであり、トロンビン阻害活性は22.2U/mであ
った。

ｂ）イオン交換クロマトグラフィによる陸蛭−ホモジ
ネートの分離陸蛭から得られた蛋白質溶液を50mMトリス/HCl−緩衝
液（pH8.5）で平衡化されたＱ−セファロース−カラ
ム（50〜70m、直径2.5cm）上に施与した。結合してい
ない物質を平衡化緩衝液で洗浄除去した後、結合した蛋
白質を20mMトリス/HCl（pH8.5）中の０〜1M NaCl勾配
液で溶離させた。約7mのフラクションを捕集し、蛋白
質含有率及びトロンビン阻害活性を検査した（第１
表）。トロンビン阻害活性を有するフラクションを集め
た。

ｃ）アフィニティクロマトグラフィによるトロンビン
阻害活性を有する蛋白質の単離Ｑ−セファロース−カラムの有用フラクションを、
1:2で、20mM燐酸塩緩衝液（pH7.5）で稀釈し、トロンビ
ンセファロース（製造は例３に記載）上に施与した。結
合しなかった蛋白質の除去の後に、カラムをまず、10カ
ラム量の20mM燐酸塩緩衝液、500mM NaCl（pH7.5）で洗
浄した。これにより、場合によってなお非特異的に吸着
された蛋白質が除去された。引続き、特異的に結合した
トロンビン阻害剤を、100mMグリシン/HCl（pH2.8）を用
いて、溶離させた。溶離液中に含有したトロンビン阻害
活性を測定し、有用フラクションを集めた（第２表）。
3000D膜（Filtron Omega Alpha Cat.No.AM003062）を用
いる濃縮の後に、濃縮物を、真空蒸発器中で蒸発乾涸さ
せた。

ｄ）逆相HPLCによるトロンビン阻害剤の精製トロンビンセファロース−クロマトグラフィの有用フ
ラクション（P₃）をH₂O中の0.1重量％トリフルオロ酢酸
（TFA）中に溶かし、逆相HPLCカラム（Biorad rp 30
4）上に装入した。カラムを水中の0.1重量％TFAで５
分洗浄した後に、水中の0.1重量％TFA/アセトニトリル
中の0.1重量％TFAの直線状勾配液を用いて１％/minで分
離させた（第１図）。HPLC−カラムから溶離する蛋白質
を、210nmでのUV検査により測定し、分別させた。個々
のフラクション中に含有するトロンビン阻害活性を、溶
剤の除去及び水（0.2m）中への再懸濁の後に測定した
（第３表）。

トロンビン阻害活性を有するフラクションのアミノ末
端配列をペプチドシーケネーター（Peptidsequenators;
Applied Biosystem,MOdell 477A）を用いて測定した。
第４表に、第３表の主フラクションE,F,G及びＪのアミ
ノ末端配列を示す：括弧内に記載のアミノ酸は、明白に同定されていない。
Ｘは同定できなかったアミノ酸を表わす。

単離されたトロンビン阻害性蛋白質のペプチド−地図
化他のアミノ酸部分配列の決定のために、トロンビン阻
害活性を有するフラクションを、還元及びピリジル−エ
チリル化（Huang等のBiochemistry,1989,Vol.28,661−6
66）の後に、トリプシン−プロテアーゼによる分解に供
した。この場合に、蛋白質／プロテアーゼ−比は20〜40
対１であった。

製造者の指示により、37℃で４時間プロテアーゼイン
キュベーションを実施した。得られたペプチドフラグメ
ントを、Ｃ−４−カラム（rp304 Bio Rad）を用いる
逆相HPLCにより分離した。このために、カラムを、H₂O
中の0.5重量％TFAで５分間洗浄した後、120分で60％ま
でのH₂O中の0.5重量％TFA勾配、アセトニトリル中の0.1
重量％TFAを使用した。210nmで検出されたペプチドを別
別に捕集し、溶剤の溜去の後に気相シーケンサー（Gasp
hasensequenzer;Applied Biosystems Model 477A）中
で分析した。

第２図は、フラクションＦ（第１図）の消化から得ら
れるトリプティックペプチドの分離を示す。第５表に、
立証されたアミノ酸配列をまとめる。

Ｘは天然アミノ酸を表わす。括弧内には、明白に同定
することのできなかったアミノ酸が存在する。（D/F）
は、この位置では、アミノ酸AspもPheも検出されたこと
を意味する。

例２阻害剤によるトロンビンの抑制の測定トロンビン（Boehringer Mannheim）を燐酸塩緩衝さ
れた塩溶液（PBS）（NaCl0.8g/,HCl0.2g/、燐酸ナ
トリウム0.144g/，燐酸カリウム0.2g/,pH7.5）中に
最終濃度（25mU/m）で溶かした。

クロモツィム（Chromozym）TH（Boehringer Mannhei
m）を、H₂O 20m／面中に溶かした。

トロンビン溶液50μ及びクロモツィム100μ並び
に試料又は緩衝液25μをマイクロ滴定プレートのウェ
ル中に入れた。その後直ちに、０分及び30分後に、37℃
で405nmの吸収を測定した。

試料の強力な固有色で、他の対照をトロンビン不含で
前記のように処理した。

トロンビンの活性により、色原性着色基質から405nm
で吸収性の色素が放出される。トロンビン阻害剤による
トロンビンの抑制は、405nmでの低められた吸収により
認識でき、検量曲線を用いて定量化した。

例３リガントとしてのトロンビンを有するアフィニティカラ
ムの製造ａ）カップリンク： CNBr活性化セファロース（Pharmacia）6.6gをヌッツ
ェ上で1mM HCl 200mで洗浄した。ゲルを100mM NaH
CO₃、500mM NaCl pH8.3中に入れ、直ちに、100mM Na
HCO₃、500mM NaCl pH8.3中のトロンビン（Sigma）100
00単位（Units）と混合した。

この溶液を４℃で24時間注意深く振動させた。

ｂ）ブロッキング：ゲル物質を、沈殿の後に100mM NaHCO₃、500mM NaC
l、pH8.3で洗浄した。次いで、セファロースを100mM N
aHCO₃、500mM NaCl、1M エタノールアミンpH8.3と共
に２時間インキュベートした。

ｃ）予備調製：結合していないトロンビンを除去するために、ゲル物
質を使用前にもう一度、カラム中で、20倍カラム量のPB
S（pH7.4）で洗浄した。

例４分子篩クロマトグラフィによる分子量の測定トロンビンセファロース−クロマトグラフィの有用フ
ラクションを、精製トロンビン阻害剤の見かけの分子量
の測定のために、分子篩カラム（セファロース12、Phar
macia）上で分離した。次のクロマトグラフィ−パラメ
ータを用いた：溶離速度0.25m/min;検出280nm;フラク
ションの大きさ0.25m；緩衝液 20mM燐酸塩緩衝食塩
溶液（20mM燐酸ナトリウム、0.15M 塩化ナトリウム、p
H7.4）。

得られたクロマトグラムを第３図に示す。フラクショ
ンのトロンビン阻害活性を前記のように測定し、クロマ
トグラムに記入した。カラムを標準蛋白質で検量するこ
とにより、阻害剤の分子量を測定すると、11200±1000
ダルトンであった。

例５トリス／トリシン−SDS−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動による分子量の測定（文献:Analytical Biochemistry,166,368−379（198
7）,Tricine−Sodium Dodecyl Sulfate−Polyacrylamid
e Gel Electrophoresis for the Separation of Protei
n in the range from 1−1000kDa,Schraeger H.and von
Jagow.G.）精製された阻害剤の更なる特徴付けのために、５μｇ
に相当する少量を、16％トリス／トリシンゲル（Bai G
mbH,Bensheim）上で分離した。第４図は、このゲルのク
マシー・ブリリアント・ブルーによる着色後の結果を示
している。ここでは、マーカー蛋白質（第１列及び４
列）及び組換えヒルジン（第３列）が標準として機能し
ている。新規阻害剤（第３列）の分子量は5000±1000ダ
ルトンで測定された。

例６トロンビン阻害性蛋白質をコード化するDNA−配列の製
造ａ） RNAの単離及びcDNA−バンクの製造ヘマディプサ・シルベストリス種の動物全個体からの
全−RNAを、グアニジウムチオシアネート中での溶解に
より取得した。この際、Strategen,La Jolla,CA,USA社
のRNA単離キット（カタログNo.200345）による材料を用
い、かつ指針に従って操作した。

ポリアデニル化されたメッセンジャーRNAを、前記全
−RNAから、オリゴ（dT）−アフィニティ分離により選
択した。この方法は、Promega,Madison,WI,USA社の「Po
ly AT tract mRNA Isolation System」による材料を
用い、指針に従って実施した。

ポリアデニル化されたメッセンジャーRNAから、Strat
agene,La Jolla,CA,USA社の「ZAP−cDNA合成キット」
（カタログNo.237611）の材料を用い、指針に従って、
ラムダファージ中にパッキングした。

ｂ） PCRに関するオリゴヌクレオチドプローブの製造ポリメラーゼ連鎖反応を用いるcDNA−フラグメントの
クローン化（PCR,Molecular Cloning,第２版（1989）,S
ambrook,J.等.,CSH Press14.1頁以降参照）のために、
例１に記載の蛋白質配列のペプチドから出発した。

遺伝子コードを基礎として、ペプチド配列： NH₂−Gly Met Gly Lys Val Pro Cys Pro（位置４−11）
（SEQ ID NO:11）から、このコード化されたDNA−鎖の核酸配列：を、かつ、ペプチド配列：から、核酸配列：を引き出すことができる。遺伝子コードの公知の変性の
故に、多くの位置で、いくつかのヌクレオチド（N:A,C,
G,T;Y:C,T;R:A,G;H:A,C,T）が使用可能である。従っ
て、SEQ ID NO:12に関して、256倍の、かつSEQ ID
NO:14に関して、384倍の混合コンプレキシティ（Gemisc
hkmplexitaet）が生じる。前記配列は、オリゴヌクレオ
チドとして合成された。

付加的に次のオリゴヌクレオチドが３′プライマーと
して合成された：この合成は、Applied Biosystem Typ 360A DNA−シ
ンセサイザー（Synthesizer）を用いて実施した。オリ
ゴヌクレオチドは、保護基の除去の後に、アクリルアミ
ド／尿素−ゲル上でのゲル電気泳動により精製した。

ｃ） PCRに関するDNA−テンプレートの製造ａ）に記載のRNA−調製の全−RNA5μｇ又はポリ
（Ａ）^＋−RNA1μｇを、オリゴヌクレオチド 15μｇ及び酵素逆トランスクリプターゼを用いて、１本
鎖cDNA（１゜cDNA）に翻訳した。この場合に、Gibco BR
L,Eg′genstein社（ドイツ）のスーパースクリプト・プ
レアンプリフィケーション・システム（Super Script P
reamplification System）（カタログNo.8089SA）に依
る材料を用い、指針に従って操作した。反応の終了後
に、合成生成物を、BIO 101,La Jolla,CA,USA社の
「ゲネクリーン（Geneclean）IIキット」を用いて、小
分子及び過剰のオリゴヌクレオチドから精製した。

ｄ） PCRs及び部分−cDNA−配列のクローニングポリメラーゼ−連鎖反応を公知のプロトコルに従って
実施した（Molecular Cloning,第２版（1989）,Sambroo
k,J.等,CSH−Press,14.1頁以降参照）。このために、Pe
rkin Elmer社の「DNAサーマル・サイクラー（Thermal C
ycler）」を使用した。この際、フローマン（Frohman
n）,M.A.等の「フェルシャハテルテン・プライマー（ve
rschachteltenprimer）」の原理（Proc.Natl.Acad.Sci.
USA（1988）,85,8998−9002）を用い、フリッツ（Frit
z）等の（Nucl.Acids Res.（1991）,19,3747）により変
更して用いた。

個々には、ｃ）からの１゜cDNAを、オルゴヌクレオチ
ドSEQ ID NO:12及びSEQ IDNO:16各々20ピコモルを用
いて増幅させた。この場合の条件は、35サイクルに関し
て95℃で１分;55℃で２分;72℃で３分であった。

PCR−生成物を、1.2％低融点−アガロース/TBE−ゲル
上で電気泳動により分離した（TBE:100mM Tris,100mM
ホウ酸、2mM EDTA、pH8.0）。

このゲルから、油状物（Schmier）の全長に渡り、約1
0個のゲル板（Gelscheibchen）を切り出し、これらを別
々のフラクションとして、上昇性分子量のDNA−フラグ
メンと共に融解させた。

次いで、これらフラクションの少量分を、別々に、オ
リゴヌクレオチドSEQ ID NO:14及びSEQ ID NO:17各
々20ピコモルと共に、第２のPCRで使用した。この場合
に、アガロース分は、決してPCR−バッチの1/10量を越
えない。反応条件:35サイクルに関して95℃で１分;50℃
で２分;72℃で３分。

これらフラクションの増幅生成物のゲル電気泳動によ
る分離は、明らかに、第１のPCRの第2PCRの後の限定さ
れたバンドまでの複雑な生成スペクトルの減少を認識さ
せることができた。

このように選択されたPCR−生成物を、標準法で溶離
させた。ベクターpBluescript KSのEcoR V−切断位置で
のサブクローニング及びこのプラスミドのE.コリーDH5
α中での増殖の後に、クローン（SEQ ID NO:18）の配
列分析は、39アミノ酸の開放読取りラスタ（offene Les
eraster）（SEQ ID NO:19）を示し、これは、先に記
載の蛋白質配列と一致した。

ｅ）集められたコード化された領域のPCR及びクロー
ニング全−cDNA−配列を導出するために、もう１つのPCR増
幅を実施した。この反応のためのプライマーとしてオリ
ゴヌクレオチド：を合成した。

この場合に、SEQ ID NO:18中に記載の配列からSEQ
ID NO:20が導出でき；これは、158〜180の位置の対
ストランド（Gegenstrange）の配列に一致する。付加的
にSEQ ID NO:20の５′末端の18ヌクレオチドは、Sal
IもしくはBamH I切断位置を再構成するはずである。オ
リゴヌクレオチドSEQ ID NO:21は、市場の「逆（reve
rse）プライマー」（Stratagene,La Jolla,CA,USA）の
配列に一致し、Uni ZAPXRランダムファージの配列から
導出される。

これら双方のオリゴヌクレオチド及びａ）に記載のテ
ンプレート（template）としての全−ファージェンリゼ
ートの少量分を用いるPCRは、前記トロンビン阻害剤の
完全コード化領域を有するcDNA−配列（SEQ ID NO:2
2）を単離した。

個々には、この目的のために、ヘマディプサcDNA−バ
ンクの高力価のファージリゼート（10⁹〜10¹⁰pfu/m）
10μを10分間煮沸し、オリゴヌクレオチドSEQ ID N
O:20及びSEQ ID NO21各々20ピコモルを用いるPCR反応
で増幅させた。この際の条件は、35サイクルに関して95
℃で１分;55℃で２分;72℃で３分；全量100μであっ
た。

ゲル電気泳動分析されたPCR−生成物を、標準法で溶
離させた。ベクターpBluescript KSのEcoR V−切断位置
でのサブクローニング及びこのプラスミドのE.コリーDH
5α内での増殖の後に、クローン（SEQ ID NO:22）の
配列分析は、77アミノ酸（SEQ ID NO:23）の開放読取
りラスタを示し、これは、先に述べた蛋白質配列と一致
した。

ｆ）トロンビン阻害剤の異種表現組換えトロンビン阻害剤の製造のために、まず、アミ
ノ酸配列SEQ ID NO:23の位置１〜57をE.コリーに典型
的なコドン選択の考慮の下に、ヌクレオチド配列内に逆
翻訳した。この際に、次のコドン選択を用いた；２本鎖ヌクレオチド配列を公知方法での化学的オリゴ
ヌクレオチド合成及び酵素的リゲーションにより製造し
た。このオリゴヌクレオチド配列は、Xmn I−及びBamH
I−競合性末端を有し、E.コリー発現ベクターpMAL−p2
（New England Biolabs）中でクローン化された。

組換えプラスミドを用いて、E.コリーDH5α細胞を形
質転換させた。トロンビン阻害剤は、マルトース−結合
位置を有する融合蛋白質として製造され、ベクター製造
者の指示に従って単離及び精製された。

ペリプラスマ表現されたトロンビン阻害剤の濃度は、
培地１当り1250単位であった。

第１図〜第４図の記号説明第１図:BioRad rp 304カラムでの逆相HPLCによる
トロンビンセファロースの有用フラクション（P₃）の分
離。試料を水中の0.1重量％トリフルオロ酢酸中に溶か
し、水中の0.1重量％トリフルオロ酢酸での５分間洗浄
の後に、水中の0.1重量％TFA/アセトニトリル中の0.1重
量％TFAの線状勾配液を用い、１％/minで分離した。ト
ロンビン阻害活性を有するフラクション（Ａ−Ｊ）を別
々に集めた。

第２図：逆相HPLCによる有用フラクションＦ（第１
図）の典型的フラグメントの分離。切断により得られた
ペプチドフラグメントを、水中の0.1重量％TFAでのカラ
ムの５分間洗浄の後に、120分間に60％までの0.1％TFA/
アセトニトリルの線状勾配液を用いて分離した。210nm
での検出を行ない、得られたフラクション（１−６）を
溶剤の溜去の後に、気相シーケンサー（Gasphasensequn
zer）中で分析した。

第３図：分子篩−カラム（Superose 12,Pharmacia）
によるトロンビン阻害剤の見かけの分子量の測定。装入
物：トロンビン−セファロースの有用フラクション；流
速:0.5m/min;緩衝液:20mM 燐酸ナトリウム、0.15M
塩化ナトリウム（pH7.4）；フラクションの量:250μ
；検出:280nm。トロンビン阻害活性を有するフラクシ
ョンは、クロマトグラム（１……１）で示されている。

第４図：トリス／トリシン−SDS−傾斜トレホレース
によるトロンビン阻害剤の見かけの分子量の測定。５μ
ｇに相当する少量分を、16％トリス／トリシン−ゲル
（Bai−GmbH,Bensheim）上で分離させ、クマシー・ブリ
リアント・ブルーを用いる着色により可視化した（第３
列）。分子量を市販の分子量マーカー（第１及び４列）
を用いて5000±1000ダルトンまで測定した。同様に組換
えヒルジンも掲載した（第２列）。

配列リスト（１）一般的情報：（ｉ）出願人：（Ａ）名称:BASFアクチエンゲゼルシャフト（Ｂ）通り：カール−ボッシュ−シュトラーセ38 （Ｃ）市：ルードウイッヒスハーフェン（Ｅ）国：ドイツ連邦共和国（Ｆ）郵便コード（ZIP）:D−67056 （Ｇ）電話:0621/6048526 （Ｈ）テレファックス:0621/6043123 （Ｉ）テレックス:1762175170 （ii）発明の名称：陸蛭からの新規トロンビン阻害性
蛋白質（iii）配列の数:23 （iv）コンピューター読み取り可能形：（Ａ）媒体型：フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター:IBM PCコンパチブル（Ｃ）オペレーティングシステム:PC−DOS/MS−D
OS （Ｄ）ソフトウエア：パテントインリリース＃
1.0,バージョン＃1.25（EPO）（ｖ）通用出願データ：出願番号：（２）SEQ ID NO:1に関する情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ:57アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：蛋白質（iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:No （ｖ）フラグメント型:N−末端フラグメント（vi）起源：（Ａ）生物名：ヘマディプサシルベストリス（Ｂ）株名:Blanchard （Ｄ）分化の程度：成熟体（Ｆ）組織の種類：動物全個体（ix）配列の特徴：（Ａ）名称／記号：蛋白質（Ｂ）存在位置:1..57 （xi）配列:SEQ ID NO:1: （２）SEQ ID NO:2に関する情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ:45アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:No （ｖ）フラグメント型:N−末端フラグメント（vi）起源：（Ａ）生物名：ヘマディプサ・シルベストリス（Ｂ）株名:Blanchard （Ｄ）分化の程度：成熟体（Ｆ）組織の種類：動物全個体（ix）配列の特徴：（Ａ）名称／記号：ペプチド（Ｂ）存在位置:1..45 （xi）配列:SEQ ID NO:2: （２）SEQ ID NO:3に関する情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ:44アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:No （ｖ）フラグメント型:N−末端フラグメント（vi）起源：（Ａ）生物名：ヘマディプサ・シルベストリス（Ｂ）株名:Blanchard （Ｃ）分化の程度：成熟体（Ｆ）組織の種類：動物全個体（ix）配列の特徴：（Ａ）名称／記号：ペプチド（Ｂ）存在位置:1..44 （ix）配列の特徴：（Ａ）名称／記号:Modified−site （Ｂ）存在位置:12 （Ｄ）他の情報:/label＝ambiquity /note＝“XaaはPro又はLeu" （ix）配列の特徴：（Ａ）名称／記号:Modified−site （Ｂ）存在位置:23 （Ｄ）他の情報:/label＝ambiquity /note＝“XaaはGlu又はTrp" （ix）配列の特徴：（Ａ）名称／記号:Modified−site （Ｂ）存在位置:24 （Ｄ）他の情報:/label＝ambiquity /note＝“XaaはLys,Asn又はAsp" （xi）配列:SEQ ID NO:3: （２）SEQ ID NO:4に関する情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ:25アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:No （ｖ）フラグメント型:N−末端フラグメント（vi）起源：（Ａ）生物名：ヘマディプサ・シルベストリス（Ｂ）株名:Blanchard （ix）配列の特徴：（Ａ）名称／記号：ペプチド（Ｂ）存在位置:1..25 （ix）配列の特徴：（Ａ）名称／記号:Modified−site （Ｂ）存在位置:22 （Ｄ）他の情報:/label＝unverified /note＝“位置は証明されず” （ix）配列の特徴：（Ａ）名称／記号:Modified−site （Ｂ）存在位置:24 （Ｄ）他の情報:/label＝unidentified /note＝“位置は同定されず” （ix）配列の特徴：（Ａ）名称／記号:Modified−site （Ｂ）存在位置:25 （Ｄ）他の情報:/label＝unverified /note＝“位置は証明されず” （xi）配列:SEQ ID NO:4: （２）SEQ ID NO:5に関する情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ:43アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:No （ｖ）フラグメント型:N−末端フラグメント（vi）起源：（Ａ）生物名：ヘマディプサ・シルベストリス（Ｂ）株名:Blanchard （ix）配列の特徴：（Ａ）名称／記号：ペプチド（Ｂ）存在位置:1..43 （ix）配列の特徴：（Ａ）名称／記号:Modified−site （Ｂ）存在位置:1..43 （Ｄ）他の情報:/label＝unidentified /note＝“Xaa位置は同定されず” （ix）配列の特徴：（Ａ）名称／記号:Modified−site （Ｂ）存在位置:39..40 （Ｄ）他の情報:/label＝unverified /note＝“位置は立証されず” （xi）配列:SEQ ID NO:5 （２）SEQ ID NO:6に関する情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ:25アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:No （ｖ）フラグメント型:N−末端フラグメント（vi）起源：（Ａ）生物名：ヘマディプサ・シルベストリス（Ｂ）株名:Blanchard （ix）配列の特徴：（Ａ）名称／記号：ペプチド（Ｂ）存在位置:1..25 （ix）配列の特徴：（Ａ）名称／記号:Modified−site （Ｂ）存在位置:1..25 （Ｄ）他の情報:/label＝unidentified /note＝“Xaa:位置は同定されず” （ix）配列の特徴：（Ａ）名称／記号:Modified−site （Ｂ）存在位置:18..22 （Ｄ）他の情報:/label＝unverified /note＝“位置は証明されず” （ix）配列の特徴：（Ａ）名称／記号:Modified−site （Ｂ）存在位置:25 （Ｄ）他の情報:/label＝unverified /note＝“位置は証明されず” （xi）配列:SEQ ID NO:6: （２）SEQ ID NO:7に関する情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ:17アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:No （ｖ）フラグメント型:N−末端フラグメント（vi）起源：（Ａ）生物名：ヘマディプサ・シルベストリス（Ｂ）株名:Blanchard （ix）配列の特徴：（Ａ）名称／記号：ペプチド（Ｂ）存在位置:1..17 （ix）配列の特徴：（Ａ）名称／記号:Modified−site （Ｂ）存在位置:2 （Ｄ）他の情報:/label＝undentified /note＝“位置は同定されず” （ix）配列の特徴：（Ａ）名称／記号:Modified−site （Ｂ）存在位置:16..17 （Ｄ）他の情報:/label＝unverified /note＝“位置は証明されず” （xi）配列:SEQ ID NO:7: （２）SEQ ID NO:8に関する情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ:15アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：長鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:No （ｖ）フラグメント型：中間部フラグメント（vi）起源：（Ａ）生物名：ヘマディプサ・シルベストリス（Ｂ）株名:Blanchard （ix）配列の特徴：（Ａ）名称／記号：ペプチド（Ｂ）存在位置:1..15 （xi）配列:SEQ ID NO:8: （２）SEQ ID NO:9に関する情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ:20アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:No （ｖ）フラグメント型：中間部フラグメント（vi）起源：（Ａ）生物名：ヘマディプサ・シルベストリス（Ｂ）株名:Blanchard （ix）配列の特徴：（Ａ）名称／記号：ペプチド（Ｂ）存在位置:1..20 （ix）配列の特徴：（Ａ）名称／記号:Modified−site （Ｂ）存在位置:5 （Ｄ）他の情報:/label＝ambiquity /note＝“位置５はPheとしても同
定された” （ix）配列の特徴：（Ａ）名称／記号:Modified−site （Ｂ）存在位置:17 （Ｄ）他の情報:/label＝ambiquity /note＝“位置17はAspとしても同
定された” （ix）配列の特徴：（Ａ）名称／記号:Modified−site （Ｂ）存在位置:16 （Ｄ）他の情報:/label＝unidentified /note＝“位置は同定されず” （xi）配列:SEQ ID NO:9: （２）SEQ ID NO:10に関する情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ:22アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:No （ｖ）フラグメント型：中間部フラグメント（vi）起源：（Ａ）生物名：ヘマディプサ・シルベストリス（Ｂ）株名:Blanchard （ix）配列の特徴：（Ａ）名称／記号：ペプチド（Ｂ）存在位置:1..22 （ix）配列の特徴：（Ａ）名称／記号:Modified−site （Ｂ）存在位置:21 （Ｄ）他の情報:/label＝unverified /note＝“位置は証明されず” （ix）配列の特徴：（Ａ）名称／記号:Modified−site （Ｂ）存在位置:22 （Ｄ）他の情報:/label＝unidentified /note＝“位置は同定されず” （xi）配列:SEQ ID NO:10: （２）SEQ ID NO:11に関する情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ:8アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:No （ｖ）フラグメント型：中間部フラグメント（vi）起源：（Ａ）生物名：ヘマディプサ・シルベストリス（Ｂ）株名:Blanchard （Ｄ）分化の程度：成熟体（Ｆ）組織の種類：動物全個体（xi）配列:SEQ ID NO:11: （２）SEQ ID NO:12に関する情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ:23塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:DNA（genomic）（iii）ハイポセティカル:Yes （iv）アンチセンス:No （vi）起源：（Ａ）生物名：ヘマディプサ・シルベストリス（Ｂ）株名:Blanchard （xi）配列:SEQ ID NO:12: （２）SEQ ID NO:13に関する情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ:8アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:No （ｖ）フラグメント型：中間部フラグメント（vi）起源：（Ａ）生物名：ヘマディプサ・シルベストリス（Ｂ）株名:Blanchard （Ｄ）分化の程度：成熟体（Ｆ）組織の種類：動物全個体（xi）配列:SEQ ID NO:13: （２）SEQ ID NO:14に関する情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ:23塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:DNA（genomic）（iii）ハイポセティカル:Yes （iv）アンチセンス:No （vi）起源：（Ａ）生物名：ヘマディプサ・シルベストリス（Ｂ）株名:Blanchard （xi）配列:SEQ ID NO:14: （２）SEQ ID NO:15に関する情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ:45塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:DNA（genomic）（iii）ハイポセティカル:Yes （iv）アンチセンス:No （xi）配列:SEQ ID NO:15: （２）SEQ ID NO:16に関する情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ:19塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:DNA（genomic）（iii）ハイポセティカル:Yes （iv）アンチセンス:No （xi）配列:SEQ ID NO:16: （２）SEQ ID NO:17に関する情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ:20塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:DNA（genomic）（iii）ハイポセティカル:Yes （iv）アンチセンス:No （xi）配列:SEQ ID NO:17: （２）SEQ ID NO:18に関する情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ:277塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:cDNA−mRNA （iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:No （vi）起源：（Ａ）生物名：ヘマディプサ・シルベストリス（Ｂ）株名:Blanchard （Ｄ）分化の程度：成熟体（Ｆ）組織の種類：動物全個体（vii）直接の起源：（Ｂ）クローン:pBSK/139.101＃６（vii）直接の起源：（Ａ）名称／記号:CDS （Ｂ）存在位置:1..120 （ix）配列の特徴：（Ａ）名称／記号:3′UTR （Ｂ）存在位置:121..257 （xi）配列:SEQ ID NO:18: （２）SEQ ID NO:19に関する情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ:39アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：蛋白質（xi）配列:SEQ ID NO:19 （２）SEQ ID NO:20に関する情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ:42塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:DNA（genomic）（iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:No （vi）起源：（Ａ）生物名：ヘマディプサ・シルベストリス（Ｂ）株名:Blanchard （xi）配列:SEQ ID NO:20: （２）SEQ ID NO:21に関する情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ:18塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:DNA（genomic）（iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:No （xi）配列:SEQ ID NO:21: （２）SEQ ID NO:22に関する情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ:353塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖：（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:cDNA−mRNA （iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:No （vi）起源：（Ａ）生物名：ヘマディプサ・シルベストリス（Ｂ）株名:Blanchard （Ｄ）分化の程度：成熟体（Ｆ）組織の種類：動物全個体（vii）直接の起源：（Ｂ）クローン:pBSKS/rev.148＃５（ix）配列の特徴：（Ａ）名称／記号:5′UTR （Ｂ）存在位置:1..40 （ix）配列の特徴：（Ａ）名称／記号:CDS （Ｂ）存在位置:41..274 （ix）配列の特徴：（Ａ）名称／記号:sig_peptide （Ｂ）存在位置:41..00 （ix）配列の特徴：（Ａ）名称／記号:mat_peptide （Ｂ）存在位置:101..274 （ix）配列の特徴：（Ａ）名称／記号:3′UTR （Ｂ）存在位置:275..335 （xi）配列:SEQ ID NO:22: （２）SEQ ID NO:23に関する情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ:77アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：蛋白質（xi）配列:SEQ ID NO:23:

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:19）Ａ６１Ｋ 37/64 ＡＣＢ (72)発明者クレーガー，ブルクハルトドイツ連邦共和国Ｄ―6703 リムブルガーホーフドナースベルクシュトラーセ 13 (72)発明者フリードリッヒ，トーマスドイツ連邦共和国Ｄ―6100 ダルムシュタットザールバウシュトラーセ 22 ―24 (56)参考文献Ｍ．ＳＣＨＡＲＦ，ＦＥＢＳＬＥＴＴＥＲＳ，1989年，Ｖｏｌ．255，Ｎｏ. １，ｐａｇｅｓ 105−110 ＥｌｅｃｔｒｉｃｗａｌａＡ．，ＢｌｏｏｄＣｏａｇｕｌＦｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ，1991年２月，Ｖｏｌ. ２，Ｎｏ．１，ｐａｇｅｓ 83−89 ＰａｌｌａｄｉｎｏＬＯ．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．, 1991年２月，Ｖｏｌ．２，Ｎｏ．１，ｐａｇｅｓ 37−42 ＢｌａｎｋｅｎｓｈｉｐＤＴ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，1990年，Ｖｏｌ. 166，Ｎｏ．３，ｐａｇｅｓ 1384− 1389 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C07K 14/435 A61K 38/55 C12P 21/02 ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ヘマディプサ属の陸蛭からの、アミノ酸配
列：又はSEQ ID NO:1のＣ末端の１〜12アミノ酸の短縮によ
り得られるアミノ酸配列を有する、トロンビン阻害作用
を有する蛋白質。
【請求項２】配列SEQ ID NO:2を有する請求項１に記
載の蛋白質。
【請求項３】トロンビン阻害作用を有する蛋白質をコー
ドし、次の群：ａ） SEQ ID NO 22に記載の構造のDNA ｂ）請求項１又は２に記載の蛋白質をコードするDNA
及びｃ）標準的条件下でDNA ａ）又はｂ）とのハイブリ
ド化により形成されるDNA から選択された、DNA。
【請求項４】請求項３に記載のDNAを含有する発現ベク
ター。
【請求項５】請求項３に記載のDNAによりコードされる
蛋白質１種以上を含有する血液凝固抑制剤。
【請求項６】請求項３に記載のDNAによりコードされる
蛋白質１種以上及びもう１種の凝固阻害因子を含有する
血液凝固抑制剤。
【請求項７】もう１種の凝固阻害因子としてヒルジンが
使用される、請求項６に記載の血液凝固抑制剤。