CN105732789A - 森林山蛭镇痛肽mh2620及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种森林山蛭(Haemadipsa sylvestris)镇痛肽mh2620及其基因和应用，属于生物医学技术领域。镇痛肽mh2620及其基因和应用，属于生物医学技术领域。森林山蛭镇痛肽mh2620是森林山蛭镇痛肽基因编码的一种单链多肽，分子量2620.13道尔顿，等电点5.26。森林山蛭镇痛肽mh2620由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成。编码森林山蛭镇痛肽mh2620的基因，由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列组成。本发明所述的森林山蛭镇痛肽mh2620在制备钠离子通道抑制剂和镇痛药物中的应用。本发明的有益效果在于:森林山蛭镇痛肽mh2620能够抑制钠离子通道，有极显著的镇痛作用；该镇痛肽具有结构简单、人工合成方便、镇痛活性强，能作为制备钠离子通道抑制剂和制备镇痛药物的应用。

Description

森林山蛭镇痛肽mh2620及其基因和应用

技术领域：

本发明提供一种森林山蛭(Haemadipsasylvestris)镇痛肽mh2620及其基因和应用，属于生物医学技术领域。

背景技术：

蛭类是我国的一种传统中药，两千多年前的《神农本草经》中就有描述。《本草纲目》谓其：“咸走血，苦胜血。水蛭之咸苦，以除蓄血，乃肝经血分药，故能通肝经聚血。”中医认为水蛭是一种传统的破血药，有逐瘀、通经脉、利水道的功效，主要用于治疗血瘀经闭、中风偏瘫、跌打损伤等疾病。

森林山蛭(Haemadipsasylvestris)，又称草蛭。蛭纲,水蛭科。体略呈长椭圆形,长约3厘米。该物种的模式产地在缅甸长林山。分布于印度尼西亚、缅甸、印度、越南以及中国大陆的云南等地。主要栖息于潮湿的山区草地或竹林里以及水附近或水中。当人畜经过时，就附着吸食血液。山蛭能分泌抗凝血的物质，破坏凝血功能。因此被山蛭咬过的伤口常流血不止，且极少感到疼痛。民间也利用这一性质，用山蛭来治疗病人的局部血流不畅。但是人们对这些治疗作用的物质基础和分子机制还了解很少，特别是为什么山蛭叮咬时不会感觉疼痛？目前除了水蛭素和一些几个蛋白酶抑制剂外，蛭类中的其它生理功能的活性成分，例如抗炎、镇痛成分，特别是多肽类成分的研究还很少。而对山蛭的研究更是鲜有报导。

蛭类疗法有很长的历史，在公元前1500年的埃及法老陵墓中就有使用蛭类治疗的图画。2005年，欧洲正式批准蛭类疗法为合法的治疗手段^[8]。每年仅在德国就有35万条水蛭用于医疗。

很多文献都报导了蛭类疗法的镇痛作用，长期的临床实践也证明蛭类疗法对多种疼痛具有很好的疗效。蛭类疗法可以缓解风湿性关节炎的疼痛，并改善运动功能^[9]；慢性上髁炎会产生持续疼痛，并影响运动功能，很多疗法对其无效。在40个病人的临床研究中发现，运用蛭类治疗7天，多数病人的疼痛能够得到缓解。除了少数病人皮肤发痒外，没有其它的副作用；蛭类疗法也运用于多种背痛综合征。肌肉疼痛和肌肉硬化是多种背痛综合征的症状。通过蛭类疗法，背疼症状能够很快缓解；在包括运动损伤等多种血肿性疼痛中，蛭类疗法也得到了广泛的运用。有一些研究证明，蛭类疗法对静脉炎等血管性疼痛也具有很好的疗效；还有报导显示，口服水蛭能够完全缓解肾细胞瘤和平滑肌瘤引起的腰椎疼痛。虽然蛭类镇痛临床运用广泛，但是对其作用的物质基础的结构功能的研究却未见任何报导。人们通常感觉不到山蛭的叮咬，只是发现山蛭叮咬后伤口流血不止。在长期的临床实践中，人们也发现蛭类具有镇痛功能，并运用于多种类型的疼痛治疗。但是对其活性成分和作用机制却一无所知。

目前，研究较多的和镇痛相关的钠离子通道主要为Na_v1.3、Na_v1.7、Na_v1.8和Na_v1.9。Nav1.3通道在DRG细胞中表达，在成年初级感觉传入神经元中表达量很低。当神经或脊柱受到损伤时，Nav1.3通道表达大大增加，证明该通道在神经性疼痛产生中的重要作用。Na_v1.7通道大量表达于初级感觉神经元和交感神经节神经元。Na_v1.7通道与炎性疼痛具有关系密切。Na_v1.8专一表达于外周神感觉经元，主要分布于伤害性感觉神经元。已有研究表明Na_v1.8在炎性疼痛和神经性疼痛中均具有重要作用。Na_v1.9通道主要表达于DRG、三叉神经节的伤害感受神经元和肠肌层神经元，实验证明Nav1.9在炎性疼痛中起到重要作用。

本发明涉及的多肽mh2620能够抑制大鼠DRG神经元钠离子通道。通过动物模型证实它具有很强的镇痛活性。发明人将本发明的森林山蛭镇痛肽mh2620全序列氨基酸结构经蛋白质数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同多肽。发明人将本发明的森林山蛭镇痛肽mh2620编码基因经基因数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同基因。

发明内容：

本发明的目的是基于上述理论研究和现有技术基础，提供一种新的具有强烈的镇痛活性的森林山蛭mh2620肽及其基因和应用。

为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案：

森林山蛭镇痛肽mh2620是森林山蛭镇痛肽基因编码的一种单链多肽，分子量2620.1道尔顿，森林山蛭镇痛肽mh2620的氨基酸序列(SEQIDNO:1)为：N-丙氨酸-半胱氨酸-赖氨酸-谷氨酸-酪氨酸-色氨酸-谷氨酸-半胱氨酸-甘氨酸-丙氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-半胱氨酸-异亮氨酸-谷氨酸-甘氨酸-异亮氨酸-半胱氨酸-缬氨酸-脯氨酸-甲硫氨酸-异亮氨酸(ACKEYWECGAFLFCIEGICVPMI)。

森林山蛭镇痛肽基因的克隆包括:

森林山蛭唾液腺总RNA提取，mRNA纯化，mRNA反转录及cDNA文库构建，设计引物，利用PCR方法筛选森林山蛭镇痛肽基因。扩增引物长度为27个核苷酸，其序列为5’CATNGGNACGCAAATGCCTTCGATGCA3’，PCR另一扩增引物为3’PCRPrimer引物，其序列为5’TACTGGGAATGCGGTGCCTTCTTG3’。所获阳性单克隆进行基因核苷酸序列测定。基因测序结果表明编码森林山蛭镇痛肽的由447个核苷酸组成，自5’端至3’端序列(核苷酸序列SEQIDNO:2)为:

AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAGCATTACGGCCGGGGAGTCATCAGTGAAGATGAGAACTCTCTTGGTATTCCTGTTGCTTGCAATCTTTGTTGCCGTTTTAATCGGCAATGTTCAAGTCGAAGCTGCTTGCAAAGAATACTGGGAATGCGGTGCCTTCTTGTTTTGCATCGAAGGCATTTGCGTGCCAATGATTGGATGAACCTCTAAAAATTTCAATGTTTCTTGCATTGGAAAAACTTCCCTTCCCATTTTGATCATTTAATTAAATGAAAATTGTTCTTGCATTGGCAGATATTCCTCCATCATTTAAATTTTGCAAGATTATCCATTATATGATATTGAAAACTCAAATTTAAAATTATTATAATAAATACAATTAAGTTATTAAATTCTTCAAAAAAATATGTGAAATTACTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

其中128-200的片段编码森林山蛭镇痛肽成熟肽。森林山蛭镇痛肽基因作为基因工程制备森林山蛭镇痛肽的应用。

森林山蛭的分离纯化方法：

收集的森林山蛭唾液腺分泌液首先过凝胶层析柱SephadexG-50，收集具有镇痛活性的峰，冻干，过反向高液相(RP-HPLC)C18柱，纯化得到森林山蛭镇痛肽。

森林山蛭镇痛肽的化学合成方法：

根据Edman降解法测得序列和编码森林山蛭镇痛肽肽基因推断的氨基酸序列，用自动多肽合成仪(433A,AppliedBiosystems)合成其全序列。通过HPLC反向柱层析脱盐纯化，并确定其纯度大于95％。用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)测定其分子量。合成的镇痛肽肽溶于灭菌水，用于活性测定。

本发明的有益效果在于:

分离纯化得到森林山蛭镇痛肽mh2620,并克隆得到其cDNA序列。该镇痛肽能够抑制钠离子通道，有极显著的镇痛作用。另外该镇痛肽具有结构简单、人工合成方便、镇痛活性强，能作为钠离子通道抑制剂和制备镇痛药物应用。

附图说明：

图1显示森林山蛭镇痛肽mh2620的钠离子通道抑制活性

图2显示森林山蛭镇痛肽mh2620的镇痛作用。

具体实施方式:

下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。

森林山蛭镇痛肽基因克隆：

I、森林山蛭唾液腺总RNA提取：

A.活体森林山蛭用水清洗干净，放入液氮中速冻4小时，取唾液腺组织，称重，取300mg组织，加入10m1总RNA提取缓冲液(Trizol溶液，美国GIBCOBRL公司产品)，于20m1玻璃匀浆器中匀浆30分钟。

B.加入等体积酚/氯仿溶液，震荡混匀，室温放置10分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃除沉淀。

C.上清加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为森林山蛭唾液腺总RNA。

II、森林山蛭唾液腺mRNA的纯化：

森林山蛭唾液腺mRNA分离纯化采用美国PROMEGA公司的mRNAIsolationSystems试剂盒。

A.取森林山蛭唾液腺总RNA500μg溶于500μlDEPC水中，放入65℃水浴10分钟，加人3μl的Oligo(dT)探针和13μl20×SSC溶液，混匀，放置室温冷却，称为A液。

B.磁珠(SA-PMP)的洗涤：将磁珠轻弹混匀，至磁力架吸附30秒，弃上清，加0.5×SSC0.3m1，至磁力架吸附30秒，最后加0.1ml0.5×SSC悬浮，称之为B液。

C.将A液加入B液中，室温放置10分钟，至磁力架吸附30秒，弃上清，用0.1×SSC洗涤4次，最后弃上清，加0.lmlDEPC水悬浮，至磁力架上吸附30秒，将上清移至新的试管，再加入0.15m1DEPC水重新悬浮，至磁力架吸附30秒，移上清至上述试管，则上清中为纯化的森林山蛭唾液腺mRNA。

D.加入1/10体积3M乙酸钠，pH5.2，等体积异丙醇，于-70℃放置30分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀溶解于10μlDEPC水中。

III、森林山蛭唾液腺cDNA文库构建：采用CLONTECH公司Creator^TMSMART^TMcDNALibraryConstructionKit质粒cDNA文库构建试剂盒。

A.cDNA第一链合成(mRNA反转录)：

1.在0.5ml无菌的离心管加入1μl森林山蛭唾液腺mRNA、1μlSMARTIV寡聚核苷酸、1μlCDSIII/3’PCR引物，加2μl去离子水使总体积达到5μl。

2.混匀离心管中的试剂并离心，72℃保温2分钟。将离心管在冰上孵育2分钟。在离心管中加入以下试剂2.0μl5×第一链缓冲、1.0μl20mM二硫苏糖醇、1.0μl10mMdNTP混合物、1.0μlPowerScript反转录酶。

3.混合离心管中试剂并离心，在42℃保温1小时。

4.将离心管置于冰上中止第一链的合成。

5.从离心管取2μl所合成的cDNA第一链备用。

B.采用长末端聚合酶链式反应(LD-PCR)方法扩增第二链

1.95℃预热PCR仪。

2.将2μlcDNA第一链(mRNA反转录)、80μl去离子水、10μl10×Advantage2PCR缓冲、2μl50×dNTP混合物、2μl5’PCR引物、2μlCDSIII/3’PCR引物以及2μl大肠杆菌聚合酶离心管进行反应。

3.在PCR仪中按以下程序扩增：

①95℃20秒钟

②22个循环：

95℃5秒钟

68℃6分钟

4.循环结束后，将离心管中合成的cDNA双链进行抽提。

C.PCR产物用PROMEGA公司的SVGelandPCRClean-UpSystem试剂盒进行抽提回收，步骤如下：

1.将通过PCR得到的cDNA双链加入等体积的膜结合缓冲颠倒混匀，然后将混和液转入离心纯化柱，室温静置5分钟，使DNA充分与硅胶膜结合。16,000g离心1分钟，倒掉收集管中的废液。

2.加入700μl的洗脱液(含乙醇)于离心纯化柱中，16,000g离心1分钟，倒掉收集管中的废液。

3.重复步骤2。

4.16,000g离心5分钟。

5.将离心纯化柱置于新的离心管中。

6.加入30μl超纯水，在室温下静置5分钟。

7.16,000g离心1分钟，管底溶液即为所纯化过的cDNA双链。

D.大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备：

1.挑取单个DH5α菌落，接种于3m1不含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1:100再接种于50m1LB培养液中，37℃振荡2小时。当OD₆₀₀值达到0.35时，收获细菌培养物。

2.将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50m1聚丙烯管中，在冰上方置10min，使培养物冷却至0℃。

3.于4℃以4100r/min离心10min，以回收细胞。

4.倒出培养液，将管倒置lmin以使最后的痕量培养液流尽。

5.每50ml初始培养液且30ml预冷的0.1mol/LCaCl₂-MgCl₂溶液(80mmol/LMgCl₂,20mmol/LCaCl₂)重悬每份细胞沉淀。

6.于4℃以4100r/min离心10min，以回收细胞。

7.倒出培养液，将管倒置lmin以使最后的痕量培养液流尽。

8.每50m1初始培养物用2m1用冰预冷的0.1mol/LCaCl₂重悬每份细胞沉淀，分装后备用。

E.酶切、连接以及连接产物的转化：

1.在微量离心管中加入1μlTakarapMD18-T载体、4μl森林山蛭cDNA双链溶液，全量为5μl。

2.加入5μl(等量)的连接酶缓冲混合物。

3.16℃反应2小时。

4.全量(10μl)加入至100μlDH5α感受态细胞中，冰中放置30分钟。

5.42℃加热90秒钟后，再在冰中放置1分钟。

6.加入37℃温浴过的LB培养基890μl，37℃缓慢振荡培养60分钟。

7.取200μl涂布于含有X-Gal、IPTG、Amp的LB培养基上37℃培养16小时，形成单菌落。

8.每个LB平皿用5m1LB液体培养基洗涤菌落，加30％甘油冻存。构建的cDNA大约含1×10⁶个单独克隆。

Ⅳ、森林山蛭镇痛肽mh2620基因克隆筛选：

扩增引物长度为20个核苷酸，其序列为5’ATGTTCACCATGAAGAAATC3’，PCR另一扩增引物为CLONTECH公司SMART^TMcDNALibraryConstructionKit中的3’PCRPrimer引物，其序列为5＇ATTCTACAGGCCGAGGCGGCCGACATG3＇。

PCR反应在如下条件下进行：94℃30秒钟，60℃30秒钟和72℃45秒钟，35个循环。

首先滴定构建的细菌cDNA文库，然后用含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基稀释至适当的细菌浓度(5000个细菌/毫升，和30个细菌/毫升分别用于首轮筛选第二轮筛选)，在96孔培养板上按8×8矩阵铺板(共64孔，每孔100μ1),37℃过夜培养。按行、列分别合并细菌培养液，有16个样品进行PCR鉴定，交叉阳性孔细菌样品进入第二轮筛选。

Ⅴ、森林山蛭镇痛肽mh2620基因序列测定和结果：

提取质粒DNA用双脱氧法测定核苷酸序列，使用仪器为美国AppliedBiosystems373A全自动核苷酸序列测定仪，测序引物为BcaBEST^TMSequencingPrimerRV-M和BcaBEST^TMSequencingPrimerM13-47，BcaBEST^TMSequencingPrimerRV-M序列：5`GAGCGGATAACAATTTCACACAGG3’，BcaBEST^TMSequencingPrimerM13-47：5’CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC3’。基因测序结果自5’端至3’端序列(核苷酸序列SEQIDNO:2)为:

AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAGCATTACGGCCGGGGAGTCATCAGTGAAGATGAGAACTCTCTTGGTATTCCTGTTGCTTGCAATCTTTGTTGCCGTTTTAATCGGCAATGTTCAAGTCGAAGCTGCTTGCAAAGAATACTGGGAATGCGGTGCCTTCTTGTTTTGCATCGAAGGCATTTGCGTGCCAATGATTGGATGAACCTCTAAAAATTTCAATGTTTCTTGCATTGGAAAAACTTCCCTTCCCATTTTGATCATTTAATTAAATGAAAATTGTTCTTGCATTGGCAGATATTCCTCCATCATTTAAATTTTGCAAGATTATCCATTATATGATATTGAAAACTCAAATTTAAAATTATTATAATAAATACAATTAAGTTATTAAATTCTTCAAAAAAATATGTGAAATTACTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

森林山蛭镇痛肽mh2620基因核苷酸的序列表为：序列长度为306个碱基，序列类型：核酸，链数：单链，拓扑学：直链状，序列种类：cDNA，来源：森林山蛭唾液腺。

编码森林山蛭成熟镇痛肽mh2620的为核苷酸序列SEQIDNO:2的第128-200位核苷酸。森林山蛭镇痛肽mh2620的氨基酸序列(SEQIDNO:1)为:N-丙氨酸-半胱氨酸-赖氨酸-谷氨酸-酪氨酸-色氨酸-谷氨酸-半胱氨酸-甘氨酸-丙氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-半胱氨酸-异亮氨酸-谷氨酸-甘氨酸-异亮氨酸-半胱氨酸-缬氨酸-脯氨酸-甲硫氨酸-异亮氨酸(ACKEYWECGAFLFCIEGICVPMI)。

森林山蛭镇痛肽mh2620基因作为基因工程制备森林山蛭镇痛肽的应用。

森林山蛭镇痛肽mh2620，在制备钠离子通道抑制剂和镇痛药物中的应用。

森林山蛭镇痛肽mh2620分离纯化：

1、SephadexG-50凝胶过滤层析:

将3g冻干的森林山蛭唾液腺分泌液溶于20ml0.1M磷酸盐缓冲液(pH6.0),12000rpm离心10分钟，取上清上样于已平衡好的SephadexG-50凝胶过滤柱(26×100cm)，用同样缓冲液洗脱，并用自动部分收集器进行收集，流速为3ml/管/10min,于280nm紫外检测收集液中蛋白质或多肽的浓度，合并具有镇痛活性的部分，冻干，-20℃保存备用。

Ⅱ、反向高压液相层析(RP-HPLC):

将SephadexG-50凝胶过滤层析所得到的活性峰用2ml0.1M磷酸盐缓冲液(pH6.0)重新溶解，4℃，12000rpm离心15分钟，取上清液，用0.45μm滤膜过滤，收集滤液上样于反相高压液相C18柱，以水(含0.1％三氟乙酸)：乙腈(含0.1％三氟乙酸)构成的洗脱系统进行梯度洗脱，洗脱速度为0.7ml/min。收集具有镇痛活性的峰，冻干，-20℃保存。Edman讲解法对其纯化所得的镇痛肽纯品进行N-端测序(model491,ABI,美国)。电喷雾电离质谱(ESI-MS)测定镇痛肽分子量。

森林山蛭镇痛肽mh2620的化学合成：

Ⅰ、森林山蛭镇痛肽mh2620的化学合成方法：根据编码森林山蛭镇痛肽mh2620的蛋白测序结果和基因推断森林山蛭镇痛肽的氨基酸序列，用自动多肽合成仪合成其全序列。通过HPLC反相C₁₈柱层析脱盐、纯化。

Ⅱ、分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fastatombombardmentmassspectrometry,FAB-MS)，以甘油:间硝基苄醇:二甲亚砜(1:1:l，V:V:V，体积比)为底物，Cs⁺作为轰击粒子，电流为1μA，发射电压为25Kv。

Ⅲ、纯化的森林山蛭镇痛肽用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用快原子轰击质谱法，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。

森林山蛭镇痛肽mh2620是森林山蛭镇痛肽基因编码的一种单链多肽，分子量2620.13道尔顿，等电点4.26，森林山蛭镇痛肽mh2620全序列为：N-丙氨酸-半胱氨酸-赖氨酸-谷氨酸-酪氨酸-色氨酸-谷氨酸-半胱氨酸-甘氨酸-丙氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-半胱氨酸-异亮氨酸-谷氨酸-甘氨酸-异亮氨酸-半胱氨酸-缬氨酸-脯氨酸-甲硫氨酸-异亮氨酸(ACKEYWECGAFLFCIEGICVPMI)。

森林山蛭镇痛肽mh2620的药理实验：

1、钠离子通道抑制活性

年龄4周左右、体重约为140-200g的SD大鼠，麻醉后断颈处死，迅速挑出脊椎并将其剪成3段，将椎管沿与肋骨垂直的方向剪开，在胸椎和腰椎部分，可挑选10-15个较好的背根神经节放入装有2ml临时培养液的培养皿中(临时培养液：NaHCO₃74mg、DMEM干粉346mg。用20ml去离子水溶解粉末，配好的溶液必须用纯的氧充气约5min，直到溶液变成红色，34℃预热备用)。分离出神经节以及神经纤维后，用维娜斯剪切除神经节外的絮状物和轴索，放入盛有约0.5ml临时培养液的培养皿中。倒去临时培养液，用维娜斯剪将分离的神经节剪碎。然后将剪碎后神经细胞转入含有15ml消化液的离心管中，在34℃每分钟200转的摇床中用消化液酶解20-30min(消化液：胶原蛋白酶1.56mg、胰蛋白酶0.66mg。用充氧后的饱和溶液溶解，34℃预热备用)。酶解完成向消化液中加入胰蛋白酶抑制剂1.5-1.6mg终止酶解反应。将酶解后的溶液转入15ml离心管中离心(1000rpm、2-5min)，去除上清。用含10％小牛血清的培养液重悬细胞，重悬后的细胞分成3-4皿，每皿加入2ml培养液，放入37℃恒温培养箱(5％CO₂、95％空气)中，培养2-4小时后可用于记录电压门控钠电流。倒置显微镜下选择细胞膜较为光滑、细胞质均匀的细胞，在室温20-25℃条件下进行膜片钳实验。选用100μl硼硅酸盐玻璃毛细管为玻璃电极材料，玻璃电极在拉制仪(PC-10，Narishige)上经两步拉制而成，玻璃电极热抛光后电极尖端口径为1.5-3.0μm，拉制完成后在玻璃电极内灌细胞内液。玻璃电极初始电阻为1.5-2.5MΩ比较好。待电极与细胞膜之间形成高阻抗的京欧(GΩ)封接后，补电极快电容。然后将细胞钳制在-60mV，给予一短而有力的负压，将钳制在电极中的细胞膜迅速打破，再补偿细胞慢电容。形成全细胞记录模式后将细胞钳制为-80mV，细胞稳定4-6min使用适宜的脉冲电压开始记录电流。系统电阻(Rs)在实验过程中始终保持在5-10MΩ的范围之内维持不变，系统串联电阻补偿一般在30-60％之间。实验数据用Clampfit(Axon,American)软件分析，数据的进一步分析使用Sigmaplot(sigma,American)软件。所有结果均采用平均值±标准误的方法表示，n代表实验的数据个数。首先线性拟合I-V关系曲线或是采用作图法可得到钠通道的翻转电位(Erev)，再采用公式G＝I/(Erev-V)计算各个膜电导，以最大膜电导(Gmax)为标准标拟合各个膜电位对应的膜电导后可得出相对膜电导(G/Gmax)，G/Gmax作图后采用Boltzmann方程来拟合钠通道的稳态激活曲线。

森林山蛭镇痛肽mh2620对大鼠DRG神经元河豚毒素敏感的钠离子通道有抑制活性(图1A)，而对河豚毒素不敏感的钠离子通道(图1B)，钾离子通道(图1C)和钙离子通道(图1D)没有抑制作用。它对钠离子通道抑制的IC₅₀为18.9μM(图1E)，能够使膜电位向去极化方向迁移(图1F)。

2、镇痛活性

试验采用雄性昆明小鼠(18-22g)，分为四组(n＝10)。样品溶于无菌生理盐水，采用腹腔注射方式给药，阴性对照给予同样体积的生理盐水，阳性对照给予与对应样品相同浓度的吗啡。给药30min后，在小鼠右脚掌采用皮下注射方式，每只小鼠注射20μl2.5％的福尔马林，分别计算小鼠福尔马林0-5min(A纤维神经元上直接刺激TRAP1引起的神经源性痛，Ⅰ相)和15-30min(炎症性疼痛，Ⅱ相)的舔足时间。

在福尔马林镇痛试验中，与吗啡相比森林山蛭镇痛肽mh2620对I相(0-5min，神经源性痛，图2A)没有镇痛作用，对II相(15-30min，炎症性疼痛，图2B)有显著的镇痛效果，与吗啡效果相差不大。

SEQUENCELISTING1

<110>中国科学院昆明动物研究所

<120>森林山蛭镇痛肽mh2620及其基因和应用

<130>森林山蛭镇痛肽mh2620及其基因和应用

<160>1

<170>PatentInversion3.5

<210>1

<211>23

<212>PRT

<213>Haemadipsasylvestris

<220>

<221>ACKEYWECGAFLFCIEGICVPMI

<222>(1)..(23)

<400>1

AlaCysLysGluTyrTrpGluCysGlyAlaPheLeuPheCysIleGlu

151015

GlyIleCysValProMetIle

20

SEQUENCELISTING2

<110>中国科学院昆明动物研究所

<120>森林山蛭镇痛肽mh2620及其基因和应用

<130>森林山蛭镇痛肽mh2620及其基因和应用

<160>1

<170>PatentInversion3.5

<210>1

<211>447

<212>DNA

<213>Haemadipsasylvestris

<220>

<221>GCTTGCAAAGAATAC

<222>(1)..(5)

<220>

<221>GCTTGCAAAGAATACTGGGAATGCGGTGCCTTCTTGTTTTGCATCGAAGGCATTTGCGTGCCAAT

GATTGGA

<222>(1)..(24)

<400>1

aagcagtggtatcaacgcagagtagcattacggccggggagtcatcagtgaagatgagaa60

ctctcttggtattcctgttgcttgcaatctttgttgccgttttaatcggcaatgttcaag120

tcgaagctgcttgcaaagaatactgggaatgcggtgccttcttgttttgcatcgaaggca180

tttgcgtgccaatgattggatgaacctctaaaaatttcaatgtttcttgcattggaaaaa240

cttcccttcccattttgatcatttaattaaatgaaaattgttcttgcattggcagatatt300

cctccatcatttaaattttgcaagattatccattatatgatattgaaaactcaaatttaa360

aattattataataaatacaattaagttattaaattcttcaaaaaaatatgtgaaattact420

aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa447

Claims (4)

1.森林山蛭镇痛肽mh2620，其特征在于由SEQIDNO:1所示的氨基酸序列组成。

2.编码森林山蛭镇痛肽mh2620的基因，其特征在于由SEQIDNO:2所示的核苷酸序列组成。

3.权利要求1所述的森林山蛭镇痛肽mh2620在制备钠离子通道抑制剂中的应用。

4.权利要求1所述的森林山蛭镇痛肽mh2620在制备镇痛药物中的应用。