CN108059672A

CN108059672A - 森林山蛭抗血栓肽Sylvestin及其基因和应用

Info

Publication number: CN108059672A
Application number: CN201610979895.7A
Authority: CN
Inventors: 赖仞; 刘伟慧; 龙承波; 吕秋敏
Original assignee: Kunming Institute of Zoology of CAS
Current assignee: Yunnan Zhongke Liujin Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2016-11-08
Filing date: 2016-11-08
Publication date: 2018-05-22
Anticipated expiration: 2036-11-08
Also published as: US20190284258A1; CN108059672B; WO2018086540A1

Abstract

本发明涉及一种森林山蛭(Haemadipsa sylvestris)抗血栓肽Sylvestin及其基因和应用，属于生物医学技术领域。森林山蛭抗血栓肽Sylvestin是森林山蛭镇痛肽基因编码的一种单链多肽，分子量4790.5道尔顿，等电点6.28。森林山蛭抗血栓肽Sylvestin由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成。编码森林山蛭抗血栓肽Sylvestin的基因，由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列组成。本发明森林山蛭抗血栓肽Sylvestin能够抑制FXIIa和kallikrein，有极显著的抗血栓和抑制急性脑出血的作用；该抗血栓肽具有结构简单、人工合成方便、抗血栓活性强，能作为制备FXIIa、kallikrein抑制剂和抗血栓和抑制急性脑出血药物应用。

Description

森林山蛭抗血栓肽Sylvestin及其基因和应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种森林山蛭(Haemadipsasylvestris)抗血栓肽Sylvestin及其基因和应用。

背景技术

脑血管疾病是导致我国中老年人死亡的主要病因之一，也是世界性卫生战略研究重点之一。在脑血管疾病中，急性缺血性疾病的发病率居于首位，具有致残率高、死亡率高和复发率高的特点。全球脑卒中病死逾150万例/年，随着老年人口的增加呈逐年增长的趋势，严重威胁着人类生命健康和生活质量。因此，研究治疗急性脑缺血的药物具有巨大的社会需求和重要的社会意义。

急性脑缺血的主要病因是脑血管栓塞，这是由于脑血管中血栓形成导致血流不畅，进而造成血管梗死的结果。治疗急性脑缺血的关键措施之一是解除血管栓塞，恢复缺血区血液供应。因此，溶栓治疗成为临床治疗急性脑缺血的关键环节。溶栓药物的应用被临床证明能有效解除脑缺血，成为治疗急性脑缺血的主要方向。目前被美国FDA批准的抗脑缺血药物只有t-PA(组织型纤溶酶原激活物)一种，但该药仅在发病3h有效。t-PA的作用靶点是纤溶酶原，会导致较高的出血发生率。以FXIIa(激活型凝血酶原十二因子)和kallikrein(激肽释放酶)为作用靶点的药物出血倾向非常低，因此以它们为作用靶点，研究和开发新型药效好、副作用低的治疗抗血栓药物，具有良好的社会经济效益和市场前景。

蛭类是我国的一种传统中药，两千多年前的《神农本草经》中就有描述。《本草纲目》谓其：“咸走血，苦胜血。水蛭之咸苦，以除蓄血，乃肝经血分药，故能通肝经聚血。”中医认为水蛭是一种传统的破血药，有逐瘀、通经脉、利水道的功效，主要用于治疗血瘀经闭、中风偏瘫、跌打损伤等疾病。2005年，欧洲正式批准蛭类疗法为合法的治疗手段。每年仅在德国就有35万条水蛭用于医疗。

森林山蛭(Haemadipsa sylvestris)，又称草蛭。蛭纲,水蛭科。体略呈长椭圆形，长约3厘米。该物种的模式产地在缅甸长林山。分布于印度尼西亚、缅甸、印度、越南以及中国大陆的云南等地。主要栖息于潮湿的山区草地或竹林里以及水附近或水中。当人畜经过时，就附着吸食血液。山蛭能分泌抗凝血的物质，破坏凝血功能。因此被山蛭咬过的伤口常流血不止。民间也利用这一性质，用山蛭来治疗病人的局部血流不畅。我们首次从森林山蛭中识别了一个作用很强的FXIIa和kallikrein抑制剂Sylvestin。

本发明涉及的多肽Sylvestin能够抑制血栓形成。通过动物模型证实它具有很强的抗血栓和抑制急性脑缺血活性。发明人将本发明的森林山蛭抗血栓肽Sylvestin全序列氨基酸结构经蛋白质数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同多肽。发明人将本发明的森林山蛭抗血栓肽Sylvestin编码基因经基因数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同基因。

发明内容

本发明的目的是基于上述理论研究和现有技术基础，提供一种新的具有强烈的抗血栓性的森林山蛭Sylvestin肽及其基因和应用。

为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案：

森林山蛭抗血栓肽Sylvestin是森林山蛭抗血栓肽基因编码的一种单链多肽，分子量4790.5道尔顿，森林山蛭抗血栓肽Sylvestin的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)为：TSEPVCACPK MLFWVCGKDG ETYTHPCIAK CHNVEVEHDG KCK。

森林山蛭抗血栓肽基因的克隆包括:

森林山蛭唾液腺总RNA提取，mRNA纯化，mRNA反转录及cDNA文库构建，设计引物，利用PCR方法筛选森林山蛭抗血栓肽基因。扩增引物长度为20个核苷酸，其序列为5’AAACCTCGGAACCGGTATGT 3’，PCR另一扩增引物为3’PCR Primer引物，其序列为5’CCGAGGTTTGGTGGCTCATT 3’。所获阳性单克隆进行基因核苷酸序列测定。基因测序结果表明编码森林山蛭抗血栓肽的由316个核苷酸组成，自5’端至3’端序列(核苷酸序列SEQ ID NO:2)为:

GGGAACCCGAAACGGGCATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTAAACCTCGGAACCGGTA TGTGCATGCCCAAAAATGCTATTTTGGGTTTGTGGTAAAGATGGTGAGACTTACACCCATCCTTGCATTGCAAAATG CCATAATGTTGAAGTTGAACATGATGGGAAGTGCAAATGAAAGGGACCATTCTTCGAAATTGCCTGAAACTTAAAAATATTGATTTGAATTTAATTAATTCTTATTAATTATAACGTTTCATCATAATAAATGAATTACGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

其中55-183的片段编码森林山蛭抗血栓肽成熟肽。森林山蛭抗血栓肽基因作为基因工程制备森林山蛭抗血栓肽的应用。

森林山蛭抗血栓肽的分离纯化方法：

收集的森林山蛭匀浆液首先过凝胶层析柱Sephadex G-50，收集具有抗血栓活性的峰，冻干，过反向高压液相(RP-HPLC)C₄、C₁₈柱，纯化得到森林山蛭抗血栓肽。

森林山蛭抗血栓肽的化学合成方法：

根据Edman降解法测得序列和编码森林山蛭抗血栓肽肽基因推断的氨基酸序列，用自动多肽合成仪(433A,Applied Biosystems)合成其全序列。通过HPLC反向柱层析脱盐纯化，并确定其纯度大于95％。用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)测定其分子量。合成的抗血栓肽溶于灭菌水，用于活性测定。

一种药物组合物，该药物包括：

a.权利要求1所述的抗血栓肽Sylvestin或药学上能接受的盐；

b.药学上能接受的载体或赋形剂。

本发明的有益效果在于:

分离纯化得到森林山蛭抗血栓肽Sylvestin，并克隆得到其cDNA序列。该抗血栓肽能够抑制FXIIa、kallikrein，有极显著的抗血栓和抑制急性脑缺血作用。另外该抗血栓肽具有结构简单、人工合成方便、抗血栓活性强，能作为抑制FXIIa、kallikrein的试剂和制备抗血栓、抗急性脑出血药物中的应用。

附图说明

图1显示森林山蛭抗血栓肽Sylvestin的抗血栓作用。

图2显示森林山蛭抗血栓肽Sylvestin的抗急性脑缺血作用。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。

森林山蛭抗血栓肽基因克隆：

1.森林山蛭总RNA提取：

(1)迅速从液氮中取出多条山蛭，用剪刀剪下山蛭前端(包括山蛭口腔和咽部)，总重量100mg左右，放入研钵中，加入液氮后充分研磨。待研成粉末状后，加入1ml Trizol提取缓冲液(Invitrogen)，与液氮共研磨。待Trizol溶化，将研钵中全部液体吸出至1.5ml离心管中，室温放置5min。

(2)加入200μL氯仿，剧烈震荡混匀15s，室温放置5min；4℃，12000g离心10min；吸取上层无色水相至新的1.5ml离心管中(尽量多吸上层液体，但一定要避免吸到中下层，中层白色为蛋白沉淀，粉红色下层为酚-氯仿)。

(3)加入等体积4℃预冷异丙醇，颠倒混匀，室温放置15min，4℃，12000g离心10min，管底微量沉淀为RNA，用移液枪轻微吸去上清。

(4)沉淀加入1ml 75％冰上预冷乙醇洗涤，4℃，7500g离心5min，弃上清，重复两次；超净台中放置5-10min，晾干(无乙醇味)，即为森林山蛭头部总RNA；往晾干的EP管中加入30μL 0.1％DEPC水，轻微震荡溶解RNA。从中吸取2μL加98μL DEPC水，于230nm、260nm、280nm波长处检其吸光值。取10μL用于1％琼脂糖胶电泳。其余总RNA于-80℃冻存。

2.森林山蛭cDNA双链的合成：

按照Creator^TM SMART^TM cDNALibrary Construction Kit(Clontech)说明书操作构建森林山蛭头部cDNA文库。具体操作如下：

(1)cDNA第一链合成(mRNA反转录)

在无RNase PCR管中加入2μL森林山蛭头部总RNA、1μL SMART^TMⅣoligonucleotide、1μL CDSⅢ/3’Primer，加1μL DEPC水使总体积达到5μL，混匀并离心10s；72℃保温2min，冰上孵育2min；在上述PCR管中加入2μL 5×第一链buffer、1μL 20mM DTT、1μL 10mM dNTP混合物、1μL PowerScript逆转录酶，混匀并离心10s。PCR仪中42℃保温1h，冰上终止反应。(2)采用长末端聚合酶链式反应(LD-PCR)方法扩增cDNA第二链

将1μL cDNA第一链(mRNA反转录)，40μL去离子水，5μL 10×buffer缓冲，1μL 50×dNTP混合物，1μL 5’PCRprimer，1μL CDSⅢ/3’PCR引物以及1μL聚合酶于PCR管中混匀。按以下程序进行PCR扩增：

①95℃ 1min

②20个循环：

95℃ 15sec

65℃ 30sec

68℃ 6min

扩增结束后，合成好的cDNA双链用PCR管分装成10μL每管，取出5μL进行1％琼脂糖电泳，其余立刻置于-80℃保存。

3.大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备：

(1)挑取单个DH5α菌落，接种于1mL不含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1:100再接种于1mL LB培养液中，37℃振荡2h。

(2)当OD₆₀₀达到0.35时，将菌液在冰上放置10min使培养物冷却至0℃。

(3)4℃，5000rpm离心5min，以回收细胞。

(4)倒出培养液，将管倒置lmin以使最后的痕量培养液流尽。

(5)每1mL初始培养液加入600μL预冷的0.1M CaCl₂-MgCl₂溶液(80mM MgCl₂,20mMCaCl₂)重悬每份细胞沉淀。

(6)4℃，5000rpm离心5min，以回收细胞。

(7)倒出培养液，将管倒置lmin以使最后的痕量液体流尽。

(8)每1mL初始培养物加入60μL用冰预冷的0.1M CaCl₂重悬细胞沉淀。4℃冰箱放置10-18h。

4.cDNA文库的筛选：

(1)特异性引物的合成

使用primer blast设计两条引物。

(2)从山蛭cDNA中克隆目标序列

20μL体系：Tag酶0.1μL，CDSIII、SMART4各0.4μL，dNTP0.4μL，buffer2μL，Mg²⁺1.2μL，PCR水16μL

(3)序列的连接、转化与检测。在微量离心管中加入0.2μL Takara PMD19-T载体，2.3μL DNA双链；加入2.5μL等量的连接酶缓冲液混合物(冰上溶解)；16℃反应过夜；全部5μL连接产物加至60μLDH5α感受态细胞中，冰上放置30min；42℃热激90s，轻放于冰上3-5min,修复细胞膜；尽快加入温浴过的LB培养基，37℃，80rpm摇菌45min；取100μL涂布与含有100ug/ml的AMP LB培养基中，37℃培养16h；菌落长出后，挑单克隆进行10μL菌液PCR。

5.挑取单克隆测序及序列筛选：

挑取20个与目标序列核酸大小相近的单菌落送测序公司进行DNA测序。采用ABI3730测序仪测序。测序引物为M13(+)：5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’,M13(-):5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’。测序结果进行序列筛选。

6.森林山蛭抗血栓肽Sylvestin基因序列测定：

提取质粒DNA用双脱氧法测定核苷酸序列，使用仪器为美国AppliedBiosystems373A全自动核苷酸序列测定仪，测序引物为BcaBEST^TM Sequencing Primer RV-M和BcaBEST^TM Sequencing Primer M13-47，BcaBEST^TM Sequencing Primer RV-M序列：5`GAGCGGATAACAATTTCACACAGG 3’，BcaBEST^TM Sequencing Primer M13-47：5’CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3’。基因测序结果自5’端至3’端序列(核苷酸序列SEQ ID NO:2)为:

GGGAACCCGAAACGGGCATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTAAACCTCGGAACCGGTATGTGCATGCCCAAAAATGCTATTTTGGGTTTGTGGTAAAGATGGTGAGACTTACACCCATCCTTGCATTGCAAAATGCCATAATGTTGAAGTTGAACATGATGGGAAGTGCAAATGAAAGGGACCATTCTTCGAAATTGCCTGAAACTTAAAAATATTGATTTGAATTTAATTAATTCTTATTAATTATAACGTTTCATCATAATAAATGAATTACGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

森林山蛭抗血栓肽Sylvestin基因核苷酸的序列表为：序列长度为316个碱基，序列类型：核酸，链数：单链，拓扑学：直链状，序列种类：cDNA，来源：森林山蛭唾液腺。

编码森林山蛭成熟抗血栓肽Sylvestin的为核苷酸序列SEQ ID NO:2的第55-183位核苷酸。森林山蛭抗血栓肽Sylvestin的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)为:TSEPVCACPKMLFWVCGKDG ETYTHPCIAK CHNVEVEHDG KCK。

森林山蛭抗血栓肽Sylvestin基因作为基因工程制备森林山蛭抗血栓肽的应用。

森林山蛭抗血栓肽Sylvestin分离纯化：

1.山蛭的处理

用液氮直接速冻活的森林山蛭。在低温下，用棉布包裹山蛭并用铁锤把山蛭敲成数段。把敲过的山蛭和适量的50Mm Tris(pH 8.0)缓冲溶液混合匀浆，4℃，12000g离心30min，上清即为森林山蛭体腔液粗样。把全部上清混合在一起，分装成3ml每管，于-80℃保存。

2.山蛭Sephadex G-50凝胶分离与反相高压色谱分离

第一步Sephadex G-50凝胶层析。取2ml山蛭匀浆液上样于Tris-HCl(0.02mol/L，pH 7.8)缓冲液平衡过的Sephadex G-50(Amersham Bioscience)凝胶柱(26mm×100cm)。用同样浓度的平衡缓冲液洗脱，流速为0.3ml/min，3ml/管，使用CBS-A程控全自动部分收集器收集(上海青浦沪西仪器厂)。使用ΜLtrospec 2100pro分光光度计(AmershamBiosciences)测定280nm和215nm值。收集各峰组分存于-20℃备用。

第二步C4反向高压色谱法。活性蛋白使用反相高压色谱(Waters 1525BinaryHPLC Pump)C₄柱(Lichrospher 10×250mm)继续分离；溶剂A：0.1％TFA的超纯水溶液，溶剂B：0.1％TFA的乙腈溶液。洗脱使用线性浓度梯度：0-10min，B：0％；10-11min，B：0-5％；11-40min，B：5-33％；40-50min，B：33-38％；50-60min，B：38-70％,60-70，B：70-100％。流速为1.5ml/min，上样量为3mg粗样蛋白。峰收集使用Waters 2489可见/紫外检测器检测(215nm)，每一个峰为一个收集单位。

第三步C₈柱反向高压色谱法。C8柱(X Bridge^TM 4.6×250mm)。溶剂A：0.1％TFA的超纯水溶液，溶剂B：0.1％TFA的乙腈溶液。洗脱使用线性浓度梯度：0-10min，B：0％；10-14min，B：0-20％；14-24min，B：20％；24-55min，B：20-35％；55-60min，B：35-100％。流速为0.7ml/min，上样量为1mg粗样蛋白。峰收集使用Waters 2489可见/紫外检测器检测(215nm)，每一个峰为一个收集单位。以上步骤跟踪检测和收集FXIIa和kallikrein抑制活性部分。Edman讲解法对其纯化所得的抗血栓肽纯品进行N-端测序(model 491,ABI,美国)。电喷雾电离质谱(ESI-MS)测定抗血栓肽分子量。

森林山蛭抗血栓肽Sylvestin的化学合成：

1.森林山蛭抗血栓肽Sylvestin的化学合成方法：根据编码森林山蛭抗血栓肽Sylvestin的蛋白测序结果和基因推断森林山蛭抗血栓肽的氨基酸序列，用自动多肽合成仪合成其全序列。通过HPLC反相C₁₈柱层析脱盐、纯化。

2.分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fast atom bombardment massspectrometry,FAB-MS)，以甘油:间硝基苄醇:二甲亚砜(1:1:l，V:V:V，体积比)为底物，Cs⁺作为轰击粒子，电流为1μA，发射电压为25Kv。

3.纯化的森林山蛭抗血栓肽用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用快原子轰击质谱法，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。

森林山蛭抗血栓肽Sylvestin是森林山蛭抗血栓肽基因编码的一种单链多肽，分子量4790.5道尔顿，等电点6.28。森林山蛭抗血栓肽Sylvestin的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)为：TSEPVCACPK MLFWVCGKDG ETYTHPCIAK CHNVEVEHDG KCK。

森林山蛭抗血栓肽Sylvestin的药理实验：

1.酶动力学：在96孔板中10μL样品与10μL终浓度为0.2μM的FXIIa混合于40μL缓冲液(100mMNacl、50mM Tris-HCl(pH8.0)、5mM CaCl₂)中。室温放置5分钟后，加入30μL缓冲液与10μL终浓度为0.04mM发色底物的混合液，终体积为100μL。凝血反应的动力学使用Epoch(BioTek)酶标仪、GEN CHS 1.09软件检测OD₄₀₅，20min，间隔47s。样品浓度为10μM。Sylvestin对凝血酶、FXa等无抑制作用。可以抑制FXIIa和kallikrein。经计算Sylvestin对FXIIa和kallikrein的抑制常数分别为2.9μM、17.8nM。

2.APTT和PT实验：将APTT试剂平衡至室温，轻轻倒置混匀APTT试剂。50μLAPTT试剂、50μL正常血浆和5μL样品混匀后，在37℃的水浴锅中孵育3分钟，加入50μL预热的CaCl₂溶液，立即混匀，用酶标仪记检测OD₆₅₀。PT实验：37℃预热凝血酶原试剂15分钟。50μL正常血浆与5μL样品在37℃水浴锅中孵育3分钟，加入预热的凝血酶原试剂100μL，立即混匀，用酶标仪记录OD₆₅₀。Sylvestin对PT实验无作用，对APTT实验具有浓度依赖效果，表明Sylvestin抑制内源性凝血途径，与是FXIIa抑制剂的结果一致。

3.卡拉胶致鼠尾血栓模型：实验动物用昆明小鼠，体重25-30g(昆明医学院实验动物中心提供)，饲养一周后，随机分组(n＝6)，雌雄各半。第1组为生理盐水对照组，样品组为2mg/kg、4mg/kg，阳性对照为500U/只肝素钠(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)。尾静脉给药处理30min后，以60mg/kg的剂量从小鼠腹腔注射卡拉胶(carrageenan，type I，Sigma，用生理盐水溶解成1％的浓度)，由于在低温环境下，血栓形成率>90％，所以饲养温度为17.5℃。12、24、36、48h后根据尾部皮肤颜色变化测定血栓形成的平均长度。随着时间的增加，各组血栓的平均长度都增加了。12h由于血栓形成的不明显，测量时有较大的误差，但对照组明显比其他组症状明显；肝素钠从12h到24h长度增加了一倍；对照组基本不变，可能因为限于鼠尾的长度；样品组长度略微增加。在每个测量时间点，相对于对照组，4mg/kg和肝素对鼠尾血栓形成的影响都有意义。数据处理为Graphpad Prime 5，数据平均值±SD，t-test(*p<0.05)。在12h到36h，Sylvestin组对血栓的抑制率都降低了，然而在48h抑制率有升高了，不过整体上随着时间的延长，抑制率降低了。相对于肝素组和2mg/kg组，4mg/kg组抑制率变化不大。Sylvestin对血栓的抑制率随着浓度的增加变大(图1)。

4.急性脑缺血线栓模型：使用2％戊巴比妥钠(80mg/kg)麻醉昆明小鼠(30～35g)，中深度麻醉后，颈正中切口逐层切开大鼠皮肤及皮下组织，分离胸锁乳突肌，切断二腹肌前腹，暴露右侧颈总动脉(CCA)，颈内动脉(ICA)和颈外动脉(ECA)，使用电凝器凝结ECA上甲状腺动脉和咽动脉并剪断。结扎ECA的远心端，并在其近心端挂线，暂时夹闭CCA和ICA，剪断ECA,将线栓从ECA残端插入ICA，结扎ECA残端，移除ICA的动脉夹，由ICA向内上方缓慢推进。适当调整方向，插入到线栓标记处(从CCA分叉处计算10mm)，开始计时，1h后移去线栓，观察无活动性出血后缝合切口。整个过程用电热毯保温，温度为36～37℃。将苏醒后的动物放回笼内，使其自由饮食。脑缺血24h，按Bederson Score评分法评估并记录神经功能缺损评分：0分为无功能障碍；1分为不能伸展右前肢；2分为向右侧旋转；3分为向右倾倒；4分为无自主活动伴意识障碍；5分为死亡。24h后麻醉剪下头部，取出脑组织，置于脑模具中(冰上)，沿视交叉向后切成2mm厚的切片，将其放入2％TTC的磷酸盐缓冲液，于37℃温箱中染色30min，再用4％多聚甲醛过夜固定并拍照。缺血体积百分数＝[缺血体积-(左半脑体积-右半脑体积)]/右半脑体积×100。缺血再灌注前10min，尾静脉给药1次，实验组分别为1、3、5mg/kg，对照组为生理盐水，体积100μl。缺血再灌注后10min内，尾静脉给药1次，剂量同上；6h再给药一次。每组6只。Sylvestin可以有效减轻脑缺血再灌注造成的损伤(图2)。

综上所述，森林山蛭抗血栓肽Sylvestin，能用于制备FXIIa和kallikrein抑制剂和抗血栓、抗急性脑出血药物中的应用。

一种药物组合物，该药物包括：

a.权利要求1所述的抗血栓肽Sylvestin或药学上能接受的盐；

b.药学上能接受的载体或赋形剂。

其中，本发明多肽可以由药学上或生理学可接受的酸或碱衍生的盐形式。这些盐包括(但不限于)与如下酸形成的盐：氢氯酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲璜酸、乙璜酸、苯璜酸或羟乙磺酸。其他盐包括：与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以及以酯、氨基甲酸酯或其他常规的“前体药物”的形式。

药物组合物还包括药学上能接受的载体。术语“药学上能接受的载体”指用于治疗剂给药的载体。它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。所述的载体包括(但不限于)：盐水、缓冲剂、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐剂及其组合。这些载体还可能存在辅助性的物质，如润湿剂、乳化剂、pH缓冲剂等。

所述的赋形剂指：在药物制剂中除主药以外的附加物，也可称为辅料。如片剂中的黏合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂；半固体制剂软膏剂、霜剂中的基质部分；液体制剂中的防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂、渗透压调节剂、着色剂等均可称为赋形剂。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院昆明动物研究所

<120> 森林山蛭抗血栓肽Sylvestin及其基因和应用

<130> Sylvestin

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 43

<212> PRT

<213> Haemadipsa sylvestris

<220>

<221> Sylvestin-protein

<222> (1)..(43)

<400> 1

Thr Ser Glu Pro Val Cys Ala Cys Pro Lys Met Leu Phe Trp Val

1 5 10 15

Cys Gly Lys Asp Gly Glu Thr Tyr Thr His Pro Cys Ile Ala Lys

16 20 25 30

Cys His Asn Val Glu Val Glu His Asp Gly Lys Cys Lys

31 35 40

<210> 2

<211> 316

<212> DNA

<213> Haemadipsa sylvestris

<220>

<221> Sylvestin-conding-DNA

<222> (55)..(183)

<400> 1

gggaacccga aacgggcatt cgagctcggt acccggggat cctctagaga ttaaacctcg 60

gaaccggtat gtgcatgccc aaaaatgcta ttttgggttt gtggtaaaga tggtgagact 120

tacacccatc cttgcattgc aaaatgccat aatgttgaag ttgaacatga tgggaagtgc 180

aaatgaaagg gaccattctt cgaaattgcc tgaaacttaa aaatattgat ttgaatttaa 240

ttaattctta ttaattataa cgtttcatca taataaatga attacgaaaa aaaaaaaaaa 300

aaaaaaaaaa aaaaaa 316

Claims

1.森林山蛭抗血栓肽Sylvestin，其特征在于，由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成。

2.编码森林山蛭抗血栓肽Sylvestin的基因，其特征在于，由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列组成。

3.根据权利要求1所述的森林山蛭抗血栓肽Sylvestin，其特征在于，所述抗血栓肽Sylvestin在制备FXIIa和kallikrein抑制剂中的应用。

4.根据权利要求1所述的森林山蛭抗血栓肽Sylvestin，其特征在于，所述抗血栓肽Sylvestin在制备抗血栓、抗急性脑出血药物中的应用。

5.一种药物组合物，其特征在于，该药物包括：

a.权利要求1所述的抗血栓肽Sylvestin或药学上能接受的盐；

b.药学上能接受的载体或赋形剂。

6.根据权利要求1所述的森林山蛭抗血栓肽Sylvestin，其特征在于，所述抗血栓肽Sylvestin的制备方法包括：从森林山蛭中分离纯化、化学合成或基因工程。

7.根据权利要求6所述的森林山蛭抗血栓肽Sylvestin，其特征在于，所述的分离纯化的制备方法为：将收集的森林山蛭匀浆液首先过凝胶层析柱Sephadex G-50，收集具有抗血栓活性的峰，冻干，过反向高压液相(RP-HPLC)C₄、C₁₈柱，纯化得到森林山蛭抗血栓肽。

8.根据权利要求6所述的森林山蛭抗血栓肽Sylvestin，其特征在于，所述的化学合成的制备方法为：根据Edman降解法测得序列和编码森林山蛭抗血栓肽肽基因推断的氨基酸序列，用自动多肽合成仪合成其全序列。

9.根据权利要求6所述的森林山蛭抗血栓肽Sylvestin，其特征在于，所述的基因工程的制备方法为：利用权利要求2所述的编码森林山蛭抗血栓肽Sylvestin的基因制备森林山蛭抗血栓肽。