CN111870700A - 十八烷基化修饰的r18-7aa多肽及其衍生多肽的应用 - Google Patents

十八烷基化修饰的r18-7aa多肽及其衍生多肽的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及十八烷基化修饰的R18‑7AA多肽及其衍生多肽的应用，属于抗血栓药物制备技术领域。本发明提供了所述多肽在制备抗血栓、抑制血小板聚集的药物中的应用。本发明所述多肽能够通过抑制14‑3‑3ζ蛋白与整合素蛋白的结合实现对胶原，凝血酶和ADP诱导的人血小板聚集的抑制作用；可以显著抑制血小板的延展，却不会影响血小板与纤维蛋白原的结合，即能够通过抑制整合素外向内信号通路的相关蛋白的磷酸化和影响14‑3‑3ζ蛋白、c‑Src蛋白与整合素β3蛋白的相互作用实现抑制血小板聚集功能；能够显著抑制血小板的聚集，实现抗血小板聚集和无出血风险抗血栓药物的制备，为以后新型安全抗血栓药物的研发提供新的思路。

Description

十八烷基化修饰的R18-7AA多肽及其衍生多肽的应用
技术领域
本发明涉及抗血栓药物制备技术领域，具体涉及十八烷基化修饰的 R18-7AA多肽及其衍生多肽的应用。
背景技术
血栓是血流在心血管系统血管内面剥落处或修补处的表面所形成的小凝血斑块。在凝血生理过程中，血栓是凝血系统级联反应的最终产物，它主要由沉积的血小板，不溶性纤维蛋白，积聚的白细胞和红细胞组成。血管中血栓的形成会阻碍血流的流动，甚至导致血管的完全闭塞，血栓从血管内壁剥落和脱离容易形成游走型栓塞。由此引发的心脑血管疾病包括心肌梗死、脑血栓、动脉血栓栓塞和静脉血栓栓塞等。血栓疾病形成是由遗传和环境因素相互作用、相互影响的多因素变化过程。其发病形式多样，而且往往具有反复性，综合发病率高居各种疾病之首，近年来还有发病率逐渐增加，发病时间年轻化的趋势，严重威胁着人类健康，是当代医学研究和药物研发的重点和热点之一。
血小板在血栓形成过程中起到至关重要的作用，血小板通过糖蛋白 GP1B复合物粘附于内皮下结合的血管性血友病因子(vWF)。这种初始相互作用本身和血小板激动剂的释放是细胞内Ca2+升高的信号。Ca2+的升高诱导血小板形态改变，前列腺素合成，颗粒内容物的释放和血小板整合素αIIbβ3 的构象变化。活化血小板中的αIIbβ3变得能够结合纤维蛋白原和其他粘附蛋白并介导血小板凝聚(初级止血塞)。此外，活化的血小板表面为凝血反应提供了有效的催化表面，最终导致纤维蛋白的形成(二次止血)。心血管疾病是非传染性疾病中死亡率最高的疾病，心血管疾病不仅发病率高，也是我国死亡率最高的疾病，我国心血管病患病率及死亡率仍处于上升阶段，心血管疾病的防治病刻不容缓。目前临床上用于预防和治疗血栓性疾病的药物主要有抗凝血药物，溶血栓药物和抗血小板聚集药物，但是常见的抗血栓药物如阿司匹林、氯吡格雷等往往会产生药效减弱、肠胃刺激、粒细胞减少、出血风险增加等副作用。
发明内容
本发明的目的在于提供十八烷基化修饰的R18-7AA多肽及其衍生多肽的应用。本发明十八烷基化修饰的R18-7AA多肽能够显著抑制血小板的聚集，实现抗血小板聚集和无出血风险抗血栓药物的制备，为以后新型安全抗血栓药物的研发提供新的思路。
本发明提供了如下(a)或(b)的十八烷基化修饰的多肽在制备抗血栓的药物中的应用，所述十八烷基化修饰为N端修饰；
(a)所述多肽为R18-7AA多肽，所述R18-7AA多肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO.1所示，
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且N端经十八烷基化修饰后具有抗血栓的活性的由(a)衍生的多肽。
本发明还提供了如下(a)或(b)的十八烷基化修饰的多肽在制备抑制血小板聚集的药物中的应用，所述十八烷基化修饰为N端修饰；
(a)所述多肽为R18-7AA多肽，所述R18-7AA多肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO.1所示，
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且N端经十八烷基化修饰后具有抑制血小板聚集的活性的由(a)衍生的多肽。
本发明还提供了如下(a)或(b)的十八烷基化修饰的多肽在制备通过抑制14-3-3ζ和整合素蛋白结合来抑制血小板聚集的药物中的应用，所述十八烷基化修饰为N端修饰；
(a)所述多肽为R18-7AA多肽，所述R18-7AA多肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO.1所示，
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且N端经十八烷基化修饰后具有通过抑制14-3-3ζ和整合素蛋白结合来抑制血小板聚集的活性的由(a)衍生的多肽。
本发明还提供了如下(a)或(b)的十八烷基化修饰的多肽在制备通过同时抑制14-3-3ζ、c-Src蛋白和整合素β3蛋白的结合来抑制血小板聚集的药物中的应用，所述十八烷基化修饰为N端修饰；
(a)所述多肽为R18-7AA多肽，所述R18-7AA多肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO.1所示，
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且N端经十八烷基化修饰后具有通过同时抑制14-3-3ζ、c-Src蛋白和整合素β3蛋白的结合来抑制血小板聚集的活性的由(a)衍生的多肽。
本发明还提供了如下(a)或(b)的十八烷基化修饰的多肽在制备通过抑制c-Src蛋白、整合素β3和AKT1蛋白磷酸化来抑制血小板聚集的药物中的应用，所述十八烷基化修饰为N端修饰；
(a)所述多肽为R18-7AA多肽，所述R18-7AA多肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO.1所示，
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且N端经十八烷基化修饰后具有通过抑制c-Src蛋白、整合素β3和AKT1蛋白磷酸化来抑制血小板聚集的活性的由(a)衍生的多肽。
本发明还提供了如下(a)或(b)的十八烷基化修饰的多肽在制备通过不影响血小板与纤维蛋白原的结合、抑制p-选择素上膜来抑制血小板聚集的药物中的应用，所述十八烷基化修饰为N端修饰；
(a)所述多肽为R18-7AA多肽，所述R18-7AA多肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO.1所示，
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且N端经十八烷基化修饰后具有通过不影响血小板与纤维蛋白原的结合、抑制p-选择素上膜来抑制血小板聚集的活性的由(a)衍生的多肽。
本发明还提供了如下(a)或(b)的十八烷基化修饰的多肽在制备通过不影响血小板的血块回缩来抑制血小板聚集的药物中的应用，所述十八烷基化修饰为N端修饰；
(a)所述多肽为R18-7AA多肽，所述R18-7AA多肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO.1所示，
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且N端经十八烷基化修饰后具有通过不影响血小板的血块回缩来抑制血小板聚集的活性的由(a)衍生的多肽。
本发明还提供了如下(a)或(b)的十八烷基化修饰的多肽在制备通过不影响血小板与纤维蛋白原的结合、抑制血小板延展来抑制血小板聚集的药物中的应用，所述十八烷基化修饰为N端修饰；
(a)所述多肽为R18-7AA多肽，所述R18-7AA多肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO.1所示，
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且N端经十八烷基化修饰后具有通过不影响血小板与纤维蛋白原的结合、抑制血小板延展来抑制血小板聚集的活性的由(a)衍生的多肽。
优选的是，如(b)的十八烷基化修饰的多肽包括十八烷基化修饰的R18，所述R18的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选的是，所述血小板聚集包括胶原、凝血酶或ADP诱导的血小板聚集。
本发明提供了十八烷基化修饰的R18-7AA多肽及其衍生多肽的应用。本发明十八烷基化修饰的R18-7AA多肽及其衍生物(如十八烷基化修饰的 R18)能够抑制胶原和凝血酶诱导的血小板的聚集。本发明十八烷基化修饰的R18-7AA多肽能够通过抑制14-3-3ζ蛋白和整合素αIIbβ3蛋白的相互作用实现抗血小板聚集的功能。通过血小板聚集仪观察十八烷基化修饰的 R18-7AA多肽对多种激动剂诱导的富血小板血浆和洗过的血小板聚集的抑制作用；使用激光共聚焦显微镜观察FITC标记的十八烷基化修饰的 R18-7AA多肽与14-3-3ζ蛋白的共定位；通过免疫共沉淀和免疫印迹实验观察十八烷基化修饰的R18-7AA多肽对凝血酶和胶原诱导的洗过的血小板的抑制过程中，c-Src蛋白和14-3-3ζ蛋白与整合素β3蛋白的结合，以及对c-Src 蛋白磷酸化的影响；免疫印迹实验观察十八烷基化修饰的R18-7AA多肽对 AKT1蛋白磷酸化的影响；使用细胞流式仪观察十八烷基化修饰的R18-7AA 多肽对激动剂诱导的血小板聚集过程中对血小板与纤维蛋白原的结合的影响以及对p-selectin激活的影响；观察十八烷基化修饰的R18-7AA多肽对血小板Clot Retraction的影响；使用激光共聚焦显微镜观察烷基化R18-7AA对血小板延展以及与纤维蛋白原结合的影响。试验结果表明，十八烷基化修饰的R18-7AA多肽可以显著抑制多种激动剂(胶原、凝血酶和ADP)诱导的富血小板血浆和洗过血小板的聚集；十八烷基化修饰的R18-7AA多肽与 14-3-3ζ共定位明显；十八烷基化修饰的R18-7AA多肽可以同时抑制14-3-3ζ和c-Src蛋白与整合素β3蛋白的结合；显著抑制Src蛋白和整合素β3蛋白磷酸化以及AKT1蛋白的磷酸化；十八烷基化修饰的R18-7AA多肽不会影响血小板与纤维蛋白原的结合，可以抑制激动剂诱导的血小板激活过程中的P 选择素的上膜；十八烷基化修饰的R18-7AA多肽不会影响血小板的血块回缩；十八烷基化修饰的R18-7AA多肽不会影响血小板黏附于纤维蛋白原包被的表面，但是可以显著抑制血小板的延展。可见，本发明十八烷基化修饰的R18-7AA多肽能够显著抑制血小板的聚集，实现抗血小板聚集和抗血栓药物的制备。
本发明所述多肽能够通过抑制14-3-3ζ蛋白与整合素蛋白的结合实现对胶原，凝血酶和ADP诱导的人血小板聚集的抑制作用；而且十八烷基化修饰的R18-7AA多肽虽然可以显著抑制血小板的延展，却不会影响血小板与纤维蛋白原的结合，即本发明所述十八烷基化修饰的R18-7AA多肽能够通过抑制整合素外向内信号通路的相关蛋白的磷酸化以及影响14-3-3ζ蛋白、 c-Src蛋白与整合素β3蛋白的相互作用实现抑制血小板聚集功能，本发明十八烷基化修饰的R18-7AA多肽能够显著抑制血小板的聚集，实现抗血小板聚集和无出血风险抗血栓药物的制备，为以后新型安全抗血栓药物的研发提供新的思路。
附图说明
图1为本发明提供的myrR18和myrR18-7AA多肽对不同激动剂诱导的富血小板血浆和洗过的血小板激活的抑制结果图；
图2为本发明提供的myrR18-7AA多肽与14-3-3ζ共定位结果图；
图3为本发明提供的myrR18-7AA多肽可以同时抑制14-3-3ζ和c-Src蛋白与整合素蛋白的结合(A)；myrR18-7AA多肽可以浓度依赖性的抑制不同激动剂诱导的血小板聚集过程中的相关蛋白的磷酸化(B，E)结果；C、D 和F分别显示通过免疫印迹实验确定myrR18-7AA多肽可以浓度依赖性的抑制凝血酶和胶原诱导的血小板聚集过程中整合素蛋白磷酸化，Src蛋白磷酸化和AKT1蛋白磷酸化统计结果图；
图4为本发明提供的myrR18-7AA多肽不会影响血小板与纤维蛋白原的结合(A)但可以浓度依赖性的抑制血小板p-选择素上膜(B)结果图；
图5为本发明提供的myrR18-7AA多肽不会影响血小板的血块回缩结果图；
图6为本发明提供的0.5μM、2.5μM和12.5μM的myrR18-7AA多肽和12.5μM的Integrilin分别在抑制血小板的延展，影响血小板与纤维蛋白原的结合方面的结果图；
图7为本发明提供的0.5μM、2.5μM和12.5μM的myrR18-7AA多肽和12.5μM的Integrilin分别在抑制血小板的延展的统计结果图；
图8为本发明提供的0.5μM、2.5μM和12.5μM的myrR18-7AA多肽和12.5μM的Integrilin分别在影响血小板与纤维蛋白原的结合方面的统计结果图。
具体实施方式
本发明提供了如下(a)或(b)的十八烷基化修饰的多肽在制备抗血栓的药物中的应用，所述十八烷基化修饰为N端修饰；
(a)所述多肽为R18-7AA多肽，所述R18-7AA多肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO.1所示(SWLDLEA)，
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且N端经十八烷基化修饰后具有抗血栓的活性的由(a)衍生的多肽。
在本发明中，(b)也称为十八烷基化修饰的R18-7AA多肽的衍生物。
本发明还提供了如下(a)或(b)的十八烷基化修饰的多肽在制备抑制血小板聚集的药物中的应用，所述十八烷基化修饰为N端修饰；
(a)所述多肽为R18-7AA多肽，所述R18-7AA多肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO.1所示，
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且N端经十八烷基化修饰后具有抑制血小板聚集的活性的由(a)衍生的多肽。
本发明还提供了如下(a)或(b)的十八烷基化修饰的多肽在制备通过抑制14-3-3ζ和整合素蛋白结合来抑制血小板聚集的药物中的应用，所述十八烷基化修饰为N端修饰；
(a)所述多肽为R18-7AA多肽，所述R18-7AA多肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO.1所示，
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且N端经十八烷基化修饰后具有通过抑制14-3-3ζ和整合素蛋白结合来抑制血小板聚集的活性的由(a)衍生的多肽。
本发明具体实施例中，对需要使用到的14-3-3ζ的来源没有特殊限定，优选使用本领域技术人员公知的常规市售产品即可，如货号AF2669，品牌 R&D的14-3-3ζ。
本发明还提供了如下(a)或(b)的十八烷基化修饰的多肽在制备通过同时抑制14-3-3ζ、c-Src蛋白和整合素β3蛋白的结合来抑制血小板聚集的药物中的应用，所述十八烷基化修饰为N端修饰；
(a)所述多肽为R18-7AA多肽，所述R18-7AA多肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO.1所示，
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且N端经十八烷基化修饰后具有通过同时抑制14-3-3ζ、c-Src蛋白和整合素β3蛋白的结合来抑制血小板聚集的活性的由(a)衍生的多肽。
本发明还提供了如下(a)或(b)的十八烷基化修饰的多肽在制备通过抑制c-Src蛋白、整合素β3和AKT1蛋白磷酸化来抑制血小板聚集的药物中的应用，所述十八烷基化修饰为N端修饰；
(a)所述多肽为R18-7AA多肽，所述R18-7AA多肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO.1所示，
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且N端经十八烷基化修饰后具有通过抑制c-Src蛋白、整合素β3和AKT1蛋白磷酸化来抑制血小板聚集的活性的由(a)衍生的多肽。
本发明还提供了如下(a)或(b)的十八烷基化修饰的多肽在制备通过不影响血小板与纤维蛋白原的结合、抑制p-选择素上膜来抑制血小板聚集的药物中的应用，所述十八烷基化修饰为N端修饰；
(a)所述多肽为R18-7AA多肽，所述R18-7AA多肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO.1所示，
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且N端经十八烷基化修饰后具有通过不影响血小板与纤维蛋白原的结合、抑制p-选择素上膜来抑制血小板聚集的活性的由(a)衍生的多肽。
本发明还提供了如下(a)或(b)的十八烷基化修饰的多肽在制备通过不影响血小板的血块回缩来抑制血小板聚集的药物中的应用，所述十八烷基化修饰为N端修饰；
(a)所述多肽为R18-7AA多肽，所述R18-7AA多肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO.1所示，
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且N端经十八烷基化修饰后具有通过不影响血小板的血块回缩来抑制血小板聚集的活性的由(a)衍生的多肽。
本发明还提供了如下(a)或(b)的十八烷基化修饰的多肽在制备通过不影响血小板与纤维蛋白原的结合、抑制血小板延展来抑制血小板聚集的药物中的应用，所述十八烷基化修饰为N端修饰；
(a)所述多肽为R18-7AA多肽，所述R18-7AA多肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO.1所示，
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且N端经十八烷基化修饰后具有通过不影响血小板与纤维蛋白原的结合、抑制血小板延展来抑制血小板聚集的活性的由(a)衍生的多肽。
在本发明中，如(b)的十八烷基化修饰的多肽包括十八烷基化修饰的 R18，所述R18的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示 (PHCVPRDLSWLDLEANMCLP)。本发明通过在血小板N端修饰十八烷基从而协助R18多肽进入血小板发挥作用，发现myrR18多肽具有抗血小板聚集活性。对R18多肽的氨基酸序列长度进行简化，通过血小板聚集仪观察多肽对激动剂诱导的血小板聚集的抑制结果发现，R18-7AA能够显著抑制多种激动剂诱导的血小板聚集，即在保留了myrR18多肽的抗血小板聚集活性的基础上对氨基酸序列进行了精简。
在本发明中，所述血小板聚集包括胶原、凝血酶和/或ADP诱导的血小板聚集。
下面结合具体实施例对本发明所述的十八烷基化修饰的R18-7AA多肽及其衍生多肽的应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
血小板聚集抑制实验
健康人血小板用血浆稀释至2.5x10^8/mL，取稀释后的血小板300μL，分别加入10μM，30μM和100μM的myrR18-7AA多肽，37℃孵育5min 后，加入30μM的ADP和2.25μg/mL的胶原诱导血小板聚集，在血小板聚集仪上绘制5min内的聚集曲线。使用台式液洗涤血小板，并最终用台式B 液将血小板稀释至2.5x10^8/mL，取300μL洗过的血小板，分别加入0.21μM，0.63μM，1.85μM和5.56μM的myrR18多肽，37℃孵育5min后，加入2.25 μg/mL的胶原诱导血小板聚集；分别加入1.85μM，5.55μM，16.67μM，50 μM和150μM的myrR18多肽，37℃孵育5min后，加入0.18U/mL的胶原诱导血小板聚集；分别加入0.1μM，0.3μM和1μM的myrR18-7AA多肽， 37℃孵育5min后，加入2.25μg/mL的胶原和0.18U/mL的凝血酶诱导血小板聚集，在血小板聚集仪上绘制5min内的聚集曲线。以myrR18-7AAscr和 myrR18scr(scr，无序多肽，在本发明中，所述无序多肽为将R18-7AA序列或R18打乱，合成的氨基酸序列)样品处理过的血小板聚集为对照。
图1中的A和B为myrR18多肽抑制胶原和凝血酶诱导的洗过的血小板聚集的效果图。如图1中的A和B所示，十八烷基化修饰的myrR18多肽 (Myristoylated-PHCVPRDLSWLDLEANMCLP)可以浓度依赖性的抑制胶原(2.25μg/mL)和凝血酶(0.18U/mL)诱导的洗过的血小板聚集。
图1中的C和D是myrR18-7AA抑制ADP和胶原诱导的富血小板血浆的效果图。如C和D所示，十八烷基化修饰的R18-7AA多肽(Myristoylated- SWLDLEA)以梯度依赖性的抑制ADP和胶原诱导的血小板聚集。而100μM 的myrR18-7AA能完全抑制30μM ADP诱导的血小板的聚集，100μM的 myrR18-7AA能完全抑制2.25μg/mL胶原诱导的血小板的聚集。
图1中的E和F为myrR18-7AA抑制胶原和凝血酶洗过的血小板聚集的效果图，因为凝血酶在富血小板血浆中无法正常检测其诱导血小板聚集的活性，故没有进行检测和统计。检测凝血酶诱导的血小板聚集使用洗涤的人血小板。如图1中的E和F所示，myrR18-7AA以梯度依赖的方式抑制由2.25 μg/mL胶原和0.18U/mL的凝血酶诱导的洗过的血小板的聚集。而1μM的 myrR18-7AA能完全抑制胶原和凝血酶诱导的血小板的聚集。
myrR18-7AA浓度依赖性的抑制胶原(E)和凝血酶(F)诱导的洗过的血小板聚集，以及浓度依赖性的抑制ADP(C)和胶原(D)诱导的富血小板血浆的聚集。
血小板洗涤方法如下：
a.每个1.5mL EP管装1.4mL血小板(浓缩血小板血浆)，室温400g 离心5min，弃上清；
b.每管用0.5mL台式A液重悬血小板，把两管重悬的血小板合并到新的1.5mL EP管，混匀，400g室温离心5min；
c.每管用1mL台式A液重悬血小板，移到新的EP管中400g室温离心5min；
d.每管用1mL台式B液重悬血小板，并用台式B液调整血小板到适当的浓度。
台式液母液(1L)：
Figure RE-GDA0002673976320000101
Figure RE-GDA0002673976320000111
台式A液(pH 6.5)：
50mL母液
BSA 0.175g
0.5M EDTA 250μL
Glucose 0.05g
台式B液(pH 7.35-7.45)：
50mL母液
Glucose 0.05g
实施例2
十八烷基化修饰的R18-7AA多肽与14-3-3ζ共定位情况；
取浓度为1×104/mL的血小板，分别加入FITC-myrR18-7AA多肽(30μM，氨基酸序列Myristoylated-SWLDLEA)，FITC标记的myrR18-7AA无序多肽 (FITC-myrR18-7AAscr)作为阴性对照。混匀后放在37℃恒温箱中，孵育 10min。12孔板中加入1mg/mL的纤维蛋白原，风干2h后，加入孵育好的血小板，加入凝血酶(0.12U/mL)，混匀后置于恒温箱中，37℃孵育40min，去除12孔板中的血小板混合液，加入PBS去除掉没有与纤维蛋白原结合而贴壁的血小板，加入质量百分浓度为4％多聚甲醛固定，10min后，去掉多聚甲醛，用PBS洗涤三次，每次5min，之后用PBS溶解的0.3％的Triton X-100溶液破膜，10min后去除，加入PBS清洗三次，每次5min，之后用 2％的BSA溶液封闭1h，PBS洗涤两次后加入14-3-3ζ蛋白抗体，避光4℃过夜孵育，用PBS洗涤三次后，避光加入Cy3荧光的对应一抗物种的荧光二抗(货号112-165-167，品牌Jackson；已过滤)，室温避光孵育1h。PBS 洗涤五次，每次5min。使用激光共聚焦显微镜观察并记录实验结果。
图2为myrR18-7AA多肽与14-3-3ζ共定位情况，如图2所示，相较于 myrR18-7AAScr多肽，myrR18-7AA多肽与14-3-3ζ蛋白共定位明显。可见， myrR18-7AA多肽可以通过与14-3-3ζ蛋白结合从而实现抗血小板聚集的功能。
实施例3
myrR18-7AA多肽对整合素外向内信号通路的相关蛋白(c-Src蛋白， 14-3-3ζ，AKT蛋白)的影响；
(1)洗过的血小板，使用血小板聚集仪，用胶原(1μg/mL)诱导激活，加入不同浓度(0μM，0.5μM，2.5μM，12.5μM)的myrR18-7AA多肽抑制血小板的激活，血小板样品获得后，充分裂解；
(2)取20μL Dynabeads ProteinA，用磁力架吸附磁珠后，去除溶液，加入200μL加入0.02％Tween-20的PBS溶液，清洗两次后，加入2μL的β3蛋白抗体，室温孵育10min。
(3)使用磁力架吸附磁珠，去除溶液，血小板样品充分裂解后，10000 g离心5min，取上清加入到磁珠中，室温孵育10～30min(根据蛋白与抗体的结合特异性调整孵育时间)；
(4)用PBS溶液清洗三次后每管加入20μL的50mM Glycine溶液(pH 2.8)，20μL的PBS溶液，和10μL的5x Loading Buffer，混匀后沸水浴5min 后，离心，上清液上样，进行蛋白电泳。
图3myrR18-7AA多肽可以同时抑制14-3-3ζ和c-Src蛋白与整合素蛋白的结合(A)；myrR18-7AA多肽可以浓度依赖性的抑制不同激动剂诱导的血小板聚集过程中的相关蛋白的磷酸化(B，E)，C、D和F分别显示通过免疫印迹实验确定myrR18-7AA多肽可以浓度依赖性的抑制凝血酶和胶原诱导的血小板聚集过程中整合素蛋白磷酸化，Src蛋白磷酸化和AKT1蛋白磷酸化统计结果。如图3所示，myrR18-7AA多肽可以浓度依赖性的抑制c-Src 蛋白和14-3-3ζ蛋白与整合素β3蛋白的结合，并且可以抑制c-Src和整合素β3 蛋白的磷酸化，以及血小板整合素外向内信号通路下游的AKT1蛋白的磷酸化。
实施例4
myrR18-7AA对血小板与纤维蛋白原的结合的影响以及对血小板P选择素上膜的影响；
使用细胞流式仪观察血小板与纤维蛋白原的结合情况以及激动剂诱导的血小板P选择素上膜的影响，具体步骤如下：
将洗过的血小板用含有100μg/mL的FITC偶联的纤维蛋白原的台式B 液重悬，血小板浓度为1x 107个/mL，将血小板按照组别分开，每组500μL，加入待测myr-R18-7AA样品后，37℃避光孵育40min，使用细胞流式分析仪(LSR Fortessa(BD,USA))检测加入myr-R18-7AA样品后血小板与纤维蛋白原的结合情况；
洗过的浓度为1×107个/mL的血小板中，加入1μg/mL的带有藻红蛋白(P-phycoerythrin，PE)荧光标记的P选择素抗体(RB40.34,BD Pharmingen)，加入待测myr-R18-7AA样品，之后加入激动剂诱导血小板版聚集，37℃避光孵育40min。之后使用细胞流式分析仪检测P选择素的激活情况。
图4为myrR18-7AA多肽不会影响血小板与纤维蛋白原的结合(A)但可以浓度依赖性的抑制血小板p-选择素上膜(B)，图4中的A显示通过细胞流式分析仪确定myrR18-7AA多肽不会影响血小板与荧光标记的纤维蛋白原的结合；图4中的B显示通过细胞流式分析仪确定myrR18-7AA多肽可以浓度依赖性的抑制P-选择素上膜。如图4所示，myrR18-7AA不会显著影响血小板与纤维蛋白原的结合，从而为止血功能的实现提供可能。另外 myrR18-7AA多肽可以浓度依赖性的抑制P-选择素上膜，显著抑制了血小板的激活。
实施例5
MyrR18-7AA多肽对血块回缩的影响；
在干净的硅烷化玻璃试管中加入800μL新鲜的人的富血小板血浆以及 300μM待测myr-R18-7AA样品，37℃共孵育5min，加入200μL的CaCl2溶液(50mM)，混匀后加入凝血酶(0.05U/mL)，在37℃培养箱中静置孵育，在不同时间点拍摄血块收缩情况。使用Image J1.35h软件量化照片上血块回缩的大小。
图5为myrR18-7AA多肽不会影响血小板的血块回缩结果图。图5中的 A从上到下代表不同时间点(10min、20min、30min)富血小板血浆血块回缩的情况，从左到右分别代表未加入任何处理，加入myrR18-7AAscr多肽处理，myrR18-7AA多肽处理以及加入Integrilin处理，后三个加入0.6U/mL 的凝血酶后，富血小板血浆血块回缩情况。从结果来看，随时间变化，加入 myrR18-7AAscr和myrR18-7AA多肽后，富血小板血浆血块回缩明显，而未进行任何处理的和加入Integrilin的富血小板血浆并未出现明显的血块回缩，因此，加入myrR18-7AAscr多肽和myrR18-7AA多肽后并不会影响富血小板血浆的血块回缩。
通过血块回缩实验我们确定myrR18-7AA多肽不会抑制血小板血块回缩，Integrilin作为阳性对照。如图5中的B所示，相较于阳性对照Integrilin， 300μM的myrR18-7AA多肽并不会对血块回缩造成影响。也说明 myrR18-7AA多肽不会影响止血功能。
实施例6
MyrR18-7AA多肽对血小板延展的影响
将100μg/mL的纤维蛋白原包被到十二孔细胞培养板(150628，Nunc，内含20mm的盖玻片)上；
将浓度为1×104/mL的洗过的血小板和待测myr-R18-7AA样品混匀后，放到由100μg/mL的纤维蛋白原包被的十二孔板上，37℃孵育40min；
使用4％的多聚甲醛溶液固定，室温，10min；
去掉多聚甲醛，用PBS洗涤三次，每次5min，之后用PBS溶解的0.3％的TritonX-100(T0694,Amresco)溶液破膜，室温，10min；
去掉十二孔板中的TritonX-100溶液，加入PBS清洗三次，每次5min，之后用2％的牛血清白蛋白(BSA，0037C,Biofroxx)溶液封闭，室温，1h；
孵育不同抗体，4℃孵育过夜，之后使用PBS清洗三次，每次5min，避光孵育对应的荧光二抗以及标记细胞骨架的FITC-鬼笔环肽(40735ES75, Yeasen)，室温，1h，使用PBS溶液清洗五次，每次5min；
将盖玻片从十二孔板中取出，使用50％的丙三醇作为封片剂，将包被血小板一侧的盖玻片倒扣在加有10μL的50％丙三醇的载玻片上，置于暗盒中，4℃保存；之后，使用激光共聚焦显微镜(A1 MP+,Nikon,Japan)观察血小板延展情况。使用ImageJ软件对血小板数量和面积进行分析。
由图6可知，myrR18-7AA多肽可以浓度依赖性的抑制血小板的延展，却不会影响血小板与纤维蛋白原的结合图。在图6中，Phallodine是鬼笔环肽，可以标记细胞骨架，在此目的是为了观察血小板的延展情况；p-selectin 是P选择素，在此用于观察血小板的激活情况，Merge是两种荧光的合并结果。myrR18-7AAscr作为阴性对照，Eptifibatide即为Integrilin，作为阳性对照，第一排代表阴性对照的血小板已经激活并显著延展，第二排至第四排代表随浓度梯度，血小板的激活受到了显著抑制，最后一排，代表阳性对照中血小板的激活受到显著抑制，且并未显著延展。最后从血小板结合纤维蛋白原的粘附情况来看，阴性对照和不同浓度的myrR18-7AA多肽并不会影响血小板与纤维蛋白原的结合，所以粘附数量不会有显著变化，而阳性对照显著影响了血小板与纤维蛋白原的粘附。
可见，myrR18-7AA不会影响血小板黏附于纤维蛋白原包被的表面，但是可以显著抑制血小板的延展。myrR18-7AA多肽可以浓度依赖性的抑制激动剂诱导的血小板延展，且相较于阳性对照Integrilin，myrR18-7AA多肽不会影响血小板与纤维蛋白原表面的结合。
图7为为本发明提供的0.5μM、2.5μM和12.5μM的myrR18-7AA多肽和12.5μM的Integrilin分别在抑制血小板的延展的统计结果图，由图7可知，myrR18-7AA可以浓度依赖性的抑制激动剂诱导的血小板延展。
图8为本发明提供的0.5μM、2.5μM和12.5μM的myrR18-7AA多肽和12.5μM的Integrilin分别在影响血小板与纤维蛋白原的结合方面的统计结果图，由图8可知，相较于阳性对照Integrilin，myrR18-7AA多肽不会影响血小板与纤维蛋白原表面的结合。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国科学院昆明动物研究所
<120> 十八烷基化修饰的R18-7AA多肽及其衍生多肽的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ser Trp Leu Asp Leu Glu Ala
1 5
<210> 3
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Pro His Cys Val Pro Arg Asp Leu Ser Trp Leu Asp Leu Glu Ala Asn
1 5 10 15
Met Cys Leu Pro
20

Claims (10)

1.如下(a)或(b)的十八烷基化修饰的多肽在制备抗血栓的药物中的应用，所述十八烷基化修饰为N端修饰；
(a)所述多肽为R18-7AA多肽，所述R18-7AA多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且N端经十八烷基化修饰后具有抗血栓的活性的由(a)衍生的多肽。
2.如下(a)或(b)的十八烷基化修饰的多肽在制备抑制血小板聚集的药物中的应用，所述十八烷基化修饰为N端修饰；
(a)所述多肽为R18-7AA多肽，所述R18-7AA多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且N端经十八烷基化修饰后具有抑制血小板聚集的活性的由(a)衍生的多肽。
3.如下(a)或(b)的十八烷基化修饰的多肽在制备通过抑制14-3-3ζ和整合素蛋白结合来抑制血小板聚集的药物中的应用，所述十八烷基化修饰为N端修饰；
(a)所述多肽为R18-7AA多肽，所述R18-7AA多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且N端经十八烷基化修饰后具有通过抑制14-3-3ζ和整合素蛋白结合来抑制血小板聚集的活性的由(a)衍生的多肽。
4.如下(a)或(b)的十八烷基化修饰的多肽在制备通过同时抑制14-3-3ζ、c-Src蛋白和整合素β3蛋白的结合来抑制血小板聚集的药物中的应用，所述十八烷基化修饰为N端修饰；
(a)所述多肽为R18-7AA多肽，所述R18-7AA多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且N端经十八烷基化修饰后具有通过同时抑制14-3-3ζ、c-Src蛋白和整合素β3蛋白的结合来抑制血小板聚集的活性的由(a)衍生的多肽。
5.如下(a)或(b)的十八烷基化修饰的多肽在制备通过抑制c-Src蛋白、整合素β3和AKT1蛋白磷酸化来抑制血小板聚集的药物中的应用，所述十八烷基化修饰为N端修饰；
(a)所述多肽为R18-7AA多肽，所述R18-7AA多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且N端经十八烷基化修饰后具有通过抑制c-Src蛋白、整合素β3和AKT1蛋白磷酸化来抑制血小板聚集的活性的由(a)衍生的多肽。
6.如下(a)或(b)的十八烷基化修饰的多肽在制备通过不影响血小板与纤维蛋白原的结合、抑制p-选择素上膜来抑制血小板聚集的药物中的应用，所述十八烷基化修饰为N端修饰；
(a)所述多肽为R18-7AA多肽，所述R18-7AA多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且N端经十八烷基化修饰后具有通过不影响血小板与纤维蛋白原的结合、抑制p-选择素上膜来抑制血小板聚集的活性的由(a)衍生的多肽。
7.如下(a)或(b)的十八烷基化修饰的多肽在制备通过不影响血小板的血块回缩来抑制血小板聚集的药物中的应用，所述十八烷基化修饰为N端修饰；
(a)所述多肽为R18-7AA多肽，所述R18-7AA多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且N端经十八烷基化修饰后具有通过不影响血小板的血块回缩来抑制血小板聚集的活性的由(a)衍生的多肽。
8.如下(a)或(b)的十八烷基化修饰的多肽在制备通过不影响血小板与纤维蛋白原的结合、抑制血小板延展来抑制血小板聚集的药物中的应用，所述十八烷基化修饰为N端修饰；
(a)所述多肽为R18-7AA多肽，所述R18-7AA多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且N端经十八烷基化修饰后具有通过不影响血小板与纤维蛋白原的结合、抑制血小板延展来抑制血小板聚集的活性的由(a)衍生的多肽。
9.根据权利要求1～8任一项所述的应用，其特征在于，如(b)的十八烷基化修饰的多肽包括十八烷基化修饰的R18，所述R18的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
10.根据权利要求2～8任一项所述的应用，其特征在于，所述血小板聚集包括胶原、凝血酶或ADP诱导的血小板聚集。
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