PT99532B - Processo de caracterizacao de um defeito de agregacao de plaquetas - Google Patents

Description

Campo Técnico

O presente invento refere-se à caracterização de desordens das plaquetas sanguíneas. 0 invento refere-se particularmente a novos sistemas de anticorpos e a processos para a caracterização de defeitos das plaquetas.

Antecedentes

A agregação de plaquetas primária é essencial para a hemostase normal e também desempenha um papel na trombose. Os resultados dos estudos sobre a agregação de plaquetas durante as duas últimas décadas indicam que a agregação de plaquetas, normal, depende da ligação do fibrinogénio à glicoproteina plaquetária GPIIb-IIIa. A GPIIb-IIIa é uma glicoproteina da membrana das células das plaquetas que pertence a uma classe de receptores extracelulares denominados Integrinas. Verificou-se que pacientes possuindo uma deficiência na GPIIb-IIIa apresentam tempos de hemorragia prolongados ou diátese homorrágica devido à disfunção plaquetária.

O processo da agregação de plaquetas pode ser visto como uma série de acontecimentos celulares necessários; 1) uma activaçâo induzida por agonista da GPIIb-IIIa a qual origina a exposição do local de ligação do fibrinogénio; 2) ligação do ligando de fibrinogénio ao local de ligação exposto da GPIIb-IIIa; e 3) acontecimentos de pós-ocupação de acordo com a ligação do ligando. Acredita-se que os três passos sejam importantes para a agregação de plaquetas, normal. Assim, mesmo quando a GPIIb-IIIa se encontra presente na membrana plaquetária, a disfunção de qualquer um dos passos anteriores pode ter como consequência uma agregação de plaquetas defeituosa.

O suporte para a perspectiva anterior dos acontecimentos que conduzem à agregação de plaquetas é encontrado em diversos estudos recentes. Primeiro, verificou-se que a ligação eficiente de grandes ligandos de GPIIb-IIIa, tais como o fibrinogénio ou de certos anticorpos anti-GPIIb-IIIa, exige activaçâo de plaquetas

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-3w por um agonista tal como ADP ou trombina. Ver, por exemplo, Shattil e colab., J. Biol. Chem.. 260:11107 (1985). Adicionaimente, verificou-se que ligandos miméticos do fibrinogénio pequenos, tais como péptidos contendo Arg-Gly-Asp (RGD), se ligam à GPIIb-IIIa independentemente da activação. Ver, por exemplo, Lam, Sc-t, e colab., J. Biol. Chem.. 262:947-950 (1987); Frelinger, A. L. III, e colab., J. Biol. Chem.. 263:12397-402 (1988). Isto conduziu à hipótese de a região de ligação de fibrinogénio da GPIIb-IIIa possui apenas uma acessibilidade limitada para ligandos grandes na ausência de activação induzida por agonista da glicoproteína. Propôs-se que a expressão induzida por agonista do receptor de fibrinogénio envolvesse a activação mediada pela proteína G da fosfolipase C, seguida por activação da proteína-cinase C. Ver Shattil, S. J., e colab., J. Biol. Chem., 262:992-1000 (1987). A natureza exacta das alterações na GPIIb-IIIa gue a tornam capaz de ligar o fibrinogénio são presentemente indeterminadas.

Os acontecimentos de pós-ocupação, envolvendo o complexo GPIIb-IIIa também parecem desempenhar um papel na agregação de plaquetas. Por exemplo, quando a GPIIb-IIIa é ligada quer ao fibrinogénio quer a um péptido contendo RGD, observa-se que certos anticorpos anti-GPIIb e anti-GPIIIa são capazes de detectar a alteração da conformação correspondente no complexo GPIIb- -Illa. Este resultado sugere que ocorrem alterações conformacionais no complexo receptor/ligando subsequentes à ligação. Ainda se desconhece como as referidas alterações conformacionais influenciam a extensão da agregação de plaquetas. Ver, por ex., Frelinger e colab., supra. Frelinger e colab., J. Biol. Chem., 265:6346 (1990). Além disso, as alterações conformacionais no ligando fibrinogénio são induzidas pela ligação que pode aumentar a sua função adesiva. Ver, por ex., Zamarron e colab., Blood. 74:208a (Supl. 1) (1989).

Os defeitos mais profundos na agregação de plaquetas ocorrem em doentes atingidos com a desordem hereditária a trombastenia de

Glanzmann. As plaquetas da maioria dos homozigóticos apresentando a forma clássica desta doença possuem menos de 10% de GPIIb-IIIa.

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Ç:

-4Nestes indivíduos os defeitos observados na agregação de plaquetas podem ser simplesmente atribuídos à falta de CPIIb-Illa funcional.

Contudo, outros doentes atingidos com a trombastenia de Glanzmann apresentam formas variantes da doença nas quais estão presentes nas plaquetas níveis quase normais de GPIIb-IIIa. Consequentemente, estes últimos indivíduos podem possuir defeitos envolvendo a activação, ligação do ligando, e/ou funções de pós-ocupação da GPIIb-IIIa. Os referidos defeitos são provavelmente atribuíveis a um ou mais defeitos primários na sequência de aminoácidos da GPII-IIIa.

Os defeitos de agregação de plaquetas também são observados num certo número de quadros clínicos. Por exemplo, as desordens mieloproliferativas, a administração de drogas, a urémia e o pós-derivação cardiopulmonar, envolvem muitas vezes defeitos da agregação de plaquetas adquiridos. Os referidos defeitos são provavelmente atribuíveis a um ou mais dos processos anteriormente descritos de defeitos de activação, ligação do ligando, e pós-ocupação.

Os processos anteriores para o diagnóstico de disfunção da agregação de plaquetas, por ex., agregometria de plaquetas, não proporcionaram uma classificação da desordem em termos dos passos primários dos acontecimentos de activação, ligação e pós-ocupação. É desejável caracterizar a desordem em termos de um ou mais defeitos nos referidos passos a fim de diagnosticar com maior precisão a condição de um doente. Espera-se que diagnósticos mais precisos conduzam a programas de tratamento melhorados para doentes com disfunção plaquetária. A definição melhorada dos defeitos de agregação também seria importante em pesquisa, tal como na caracterização dos modos de acção de drogas anti-plaquetárias propostas.

Breve Sumário do Invento

O presente invento refere-se a um processo melhorado para a caracterização de defeitos da agregação de plaquetas num doente

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SCRF 199.0 POR —5— apresentando disfunção da agregação de plaquetas. O processo envolve a determinação da presença de plaquetas, que são competentes para a activação numa primeira amostra de fluido do doente. Também é determinada a presença de plaquetas possuindo competência de ocupação de ligando numa segunda amostra de fluido do doente. Os resultados dos testes para a competência de activação e para a competência de ocupação de ligando são registados e comparados com critérios predeterminados para a caracterização dos defeitos da agregação de plaquetas, de modo que uma deficiência de activação em plaquetas competente na primeira amostra indica um defeito de activação. Uma deficiência da ocupação de ligando em plaquetas competentes na segunda amostra indica um defeito de ligação do ligando. Quantidades suficientes de plaquetas competentes para a activação e competentes para a ligação do ligando indicam um defeito de pós-ocupação sempre que o doente não exibe um comportamento de agregação de plaquetas normal.

A determinação da competência de activação envolve preferivelmente a mistura da primeira amostra contendo plaquetas com uma quantidade predeterminada de um agonista plaquetário o qual activa as plaquetas para a ligação. É também misturado um ligando específico de activação (ASL) que liga preferencialmente plaquetas normais activadas em comparação com plaquetas normais em repouso. 0 ASL também pode apresentar ligação um pouco aumentada a plaquetas defeituosas submetidas a condições de activação; contudo, o ASL mostrará maior afinidade de ligação a plaquetas normais activadas do que a plaquetas defeituosas activadas. Após a manutenção da mistura reaccional sob condições predeterminadas durante um período de tempo suficiente para que as plaquetas normais activadas se liguem ao ASL, é determinada a quantidade do produto da reacção plaqueta-ASL formado na amostra. Em concretizações do invento ainda mais preferidas, o ligando específico de activação será um anticorpo monoclonal tal como PAC-1 (Shattil e colab., J. Biol. Chem.. 260:11107 (1985)) e seus equivalentes funcionais, ou fibrinogénio.

Preferivelmente, a análise para a competência de ligação do

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ligando nas plaquetas do doente compreende a mistura da segunda amostra do fluido corporal com um ligando independente da activação (AIL) suficiente para formar um local de ligação induzido por ligando (LIBS) em plaquetas contendo integrina normais. A amostra também é misturada com um anticorpo anti-LIBS que imunorreage com o local de ligação induzido pelo ligando do complexo integrina-ligando. A competência de ocupação de ligando das plaquetas examinadas é determinada pela quantidade de produto de imunorreacção formado. Numa concretização do invento ainda mais preferida, o AIL inclui uma sequência de aminoácidos RGD e a sonda de anticorpo anti-LIBS é PMI-1, que é produzida pelo hibridoma que tem o número de acesso do ATCC HB9476.

presente invento também proporciona um conjunto de diagnóstico que compreende um ASL, um AIL e um anticorpo anti-LIBS. Numa concretização preferida dos conjuntos do presente invento, o ASL será PAC-1, os seus equivalentes funcionais ou fibrinogénio. O AIL será preferivelmente um polipéptido que inclui uma sequência de resíduos de aminoácido tal como RGD, LGGAKQAGDV, KYGRGDS, GRGDSP, E KQAGDV.

Os novos processos e conjuntos do presente invento apresentam vantagens significativas sobre os processos anteriores para a caracterização dos defeitos da agregação de plaquetas. O presente invento pode empregar tamanhos de amostra pequenos, como 0,5 ml, em oposição aos processos de agregação convencionais que necessitam de 20 a 30 ml. O presente invento também proporciona análises rápidas, demorando menos de trinta minutos em plasma rico em plaquetas ou em sangue total. Mais significativamente, o presente invento proporciona definição melhorada dos defeitos da agregação de plaquetas sanguíneas em termos dos acontecimentos de activação, ligação do ligando e pós-ocupação. A referida caracterização mostrará o seu valor em pesquisa e na indústria farmacêutica. Os presentes processos também poderão conduzir a tratamentos clínicos melhorados para doentes apresentando disfunção plaquetária. Consequentemente, o presente invento proporciona agora a caracterização de desordens da agregação de plaquetas, tais como a variante Cam da trombastenia de Glanzmann

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SCRF 199.0 POR e a mielofibrose, cionados.

em termos dos defeitos anteriormente menBreve Descrição dos Desenhos

A Figura 1 mostra uma representação esquemática do mecanismo de agregação de plaquetas proposto. No canto superior esquerdo está representado um receptor de GPIIb-IIIa contendo fibrinogénio na superfície de uma plaqueta em repouso. Este receptor apresenta uma cavidade de ligação do ligando, mas não é competente para ligar ligandos macromoleculares tais como o fibrinogénio ou o anticorpo PAC1. Após activação com um agonista, tal como ADP, a cavidade de ligação do ligando torna-se acessível a ligandos macromoleculares, tais como o fibrinogénio e PAC1, como ilustrado pelo alargamento da abertura da cavidade. Após ligação do fibrinogénio, o receptor ocupado expressa epítopos dependentes da ocupação, como LIBS 1. Depois disto, através e processos adicionais, as células agregam-se. O receptor do fibrinogénio também pode ser ocupado por um ligando peptídico pequeno sem activação prévia, tendo como consequência uma alteração da conformação com exposição do epitopo LIBS 1 (canto inferior esquerdo; ( ), anticorpo anti-LIBS).

A Figura 2 mostra uma análise por citometria de fluxo da deficiência na variante Cam de trombastenia. Estão representados os histogramas com o log da intensidade da fluorescência na abcissa e o número de células na ordenada. 0 anticorpo em estudo encontra-se indicado na coluna da esquerda. As plaquetas Cam estão representadas nos painéis da esquerda e o controlo normal à direita. Cada linha de painéis contém uma legenda indicando o agonista, péptido ou anticorpo adicionado. O ADP foi adicionado a uma concentração final de 100 /imol/l; o GRGDSP estava a uma concentração final de 200 μιηοΐ/l. A última linha representa os resultados com um complexo anti-GPIIb-IIIa (A₂A_g) e um anti-GPIIIa (AB-15). Foram obtidos dados semelhantes com outros anticorpos da GPIIb-IIIa (7E3, 10E5, 4F10) e um anticorpo da GPIIb (Tab). Os dados da variante Cam apresentados são representativos de determinações em dois irmãos macho afectados com resultados idênticos.

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A Figura 3 mostra uma análise por citometria de fluxo da disfunção de agregação num doente com mielofibrose. Os dados obtidos a partir de plaquetas de um doente atingido com doença mieloproliferativa (MPD) estão representados nos painéis da esquerda, e os das plaquetas de controlo à direita. 0 anticorpo em estudo encontra-se indicado na coluna da esquerda. Em cada linha, a legenda indica o agonista ou péptido adicionado. As concentrações de agonista e de péptido foram idênticas às da Figura 2. 0 miristato-acetato de forbol estava presente numa concentração final de 50 nmol/1. Anti-TSP refere-se à ligação de um MoAb contra a trombospondina.

Descrição Detalhada do Invento

A. Definições

Resíduo de Aminoácido: um aminoácido formado por digestão química (hidrólise) de um polipéptido nas suas ligações peptídicas. Os resíduos de aminoácido aqui descritos encontram-se preferivelmente na forma isomérica ”L. Contudo, qualquer resíduo de L-aminoácido pode ser substituído por resíduos na forma isomérica D, desde que a propriedade funcional desejada seja conservada pelo polipéptido. NH₂ refere-se ao grupo amino livre presente no terminal amino de um polipéptido. COOH refere-se ao grupo carboxilo livre presente no terminal carboxilo de um polipétido. De acordo com a nomenclatura padrão dos polipéptidos (descrita em J. Biol. Chem.. 243:3552-59 (1969) e adopatada em 37 C.F.R. §1 822 (b)(2)), as abreviaturas para os resíduos de aminoácido encontram-se representadas na seguinte Tabela de Correspondência.

(segue Tabela de Correspondência)

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TABELA DE CORRESPONDÊNCIA

SÍMBOLO	AMINOÁCIDO
1-LETRA	3·	-LETRAS
Y		Tyr	tirosina
G		Gly	glicina
F		Phe	fenilalanina
M		Met	metionina
A		Ala	alanina
S		Ser	serina
I		Ile	isoleucina
L		Leu	leucina
T		Thr	treonina
V		Vai	valina
P		Pro	prolina
K		Lys	lisina
H		His	histidina
Q		Gin	glutamina
E		Glu	ácido glutâmico
Z		Glx	Glu e/ou Gin
W		Trp	triptofano
R		Arg	arginina
D		Asp	ácido aspártico
N		Asn	asparagina
B		Asx	Asn e/ou Asp
C		Cys	cisteína
J		Xaa	Desconhecido ou

outro

Deve referir-se que todas as sequências de resíduos de aminoácido aqui representadas por fórmulas possuem uma orientação da esquerda para a direita na direcção convencional do terminal amino para o terminal carboxilo. Além disso, a frase resíduo de aminoácido é definida de forma lata a fim de incluir os aminoácidos incluídos na Tabela de Correspondência e aminoácidos modificados ou invulgares, tais como aqueles registados em 37 C.F.R. §1 822 (b)(4), e aqui incorporados para referência. Além disso, deve referir-se que um traço no início ou no fim de uma

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sequência de resíduos de aminoácido indica uma ligação peptídica a uma sequência adicional de um ou mais resíduos de aminoácido ou a um grupo amino terminal tal como NH₂ ou a um grupo carboxilo terminal tal como COOH.

Anticorpo: um polipéptido que se liga quimicamente a um grupo hapténico, isto é, ligando. Os anticorpos, tal como aqui utilizados, são moléculas de imunoglobulina e fragmentos imunologicamente activos de moléculas de imunoglobulina. As porções conhecidas na arte como Fab, Fab', F(ab')₂ ^{e F}v ^estão incluídas. Tipicamente, os anticorpos ligam ligandos que variam em tamanho desde cerca de 6 a cerca de 34 8 com constantes de associação na gama de cerca de 10⁴ a 10¹⁰ M^-1 e tão elevada como 10¹² MH¹. Os anticorpos podem ser policlonais ou monoclonais (MoAb). Os anticorpos podem ligar uma gama ampla de ligandos, incluindo moléculas pequenas como esteróides e prostaglandinas, biopolímeros como ácidos nucleicos, proteínas e polissacáridos, e polímeros sintéticos como o polipropileno. Um local de combinação do anticorpo¹ é aquela porção estrutural de uma molécula de anticorpo composta pelas regiões hipervariáveis e variáveis das cadeias leves e pesadas que ligam especificamente (imunorreagem com) o antigénio. 0 termo imunorreagir nas suas várias formas é aqui utilizado para referir a ligação entre uma molécula contendo uma determinante antigénica e uma molécula contendo um local de combinação do anticorpo, tal como uma molécula de anticorpo completa ou uma sua porção. Uma determinante antigénica é a porção estrutural precisa do antigénio que é imunologicamente ligada por um local de combinação do anticorpo. 0 termo é também utilizado de forma interpermutável com epitopo.

Ligando: uma molécula que contém uma porção estrutural que é ligada por interacção específica com uma molécula receptora particular.

Local de ligação induzido por ligando (LIBS): uma determinante neo-antigénica que é expressa por um complexo ligando-receptor da superfície celular produzido por uma reacção de

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-11<SF‘ ligação não aleatória (específica), mas que não é expressa nem pelo receptor não ocupado nem pelo ligando não ligado. Um LIBS pode ser conformacional ou sequencial”. Um LIBS tal como aqui utilizado pode ser o resultado de alterações específicas do receptor induzidas pela ligação do ligando, isto é, uma determinante antigéniea críptica, ou pode ser formado por uma combinação de resíduos de aminoácido do ligando e do receptor num local de contacto ligando-receptor.

Oligonucleótido ou Polinucleótido: um polímero de nucleótidos de cadeia simples ou dupla. Tal como aqui utilizado oligonucleótido e os seus equivalentes gramaticais incluirão a gama completa de ácidos nucleicos. Um oligonucleótido referir-se-á tipicamente a uma molécula de ácido nucleico constituída por uma cadeia linear de dois ou mais desoxirribonucleótidos e/ou ribonucleótidos. O tamanho exacto dependerá de muitos factores, os quais por sua vez dependem das condições finais de utilização, tal como é bem conhecido na arte.

Polipéptido ou Péptido: uma série linear de pelo menos dois resíduos de aminoácido, na qual os resíduos adjacentes estão unidos por ligações peptídicas entre o grupo amino alfa de um resíduo e o grupo carboxilo alfa de um resíduo adjacente.

Proteína: refere-se a uma série linear de mais do gue 50 resíduos de aminoácido na qual os resíduos adjacentes estão unidos por meio de ligações peptídicas.

Receptor: uma molécula proteica biologicamente activa que se liga especificamente a (ou com) outras moléculas (ligandos). Os receptores podem ser glicosados.

B. Processo de caracterização das plaquetas

Os presentes processos proporcionam protocolos para a caracterização dos defeitos da agregação de plaquetas em termos de defeitos da activação, ligação do ligando, e pós-ocupação. Com base no modelo representado na Figura 1, a agregação de plaquetas anormal pode resultar de um defeito na activação dos receptores

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de fibrinogénio das plaquetas, de um defeito na ligação do fibrinogénio per se. ou de um defeito nos acontecimentos de pós-ocupação necessários para uma agregação óptima. A utilidade deste modelo foi testada em doentes com defeitos graves e persistentes na agregação de plaquetas. Numa concretização preferida, a activação do receptor foi quantificada utilizando ¹²⁵I-fibrinogénio ou um MoAb marcado com fluoresceína (PAC1) (Shattil e colab., J. Biol. Chem.. 260:11107 (1985)), o qual reconhece especificamente a forma activada da GPIIb-IIIa. As descrições de todos as referências aqui citadas são aqui incorporadas para referência.

1. Determinação da Competência de Activação 0 presente processo compreende em parte a análise de uma amostra de fluido corporal contendo plaquetas recolhida de um doente quanto a plaquetas apresentando competência de activação. As amostras de fluidos corporais úteis são tipicamente amostras de fluidos vasculares, tais como sangue e porções de sangue contendo plaquetas, como plasma rico em plaquetas e semelhantes. A análise empregará preferivelmente citometria de fluxo activada por fluorescência para determinar a presença de plaquetas competentes para a activação. Tipicamente, o processo envolverá a mistura da amostra contendo plaquetas do doente com uma quantidade predeterminada de um agonista de plaquetas suficiente para activar plaquetas normais. A amostra também será misturada com um ligando específico d activação (ASL) que liga preferencialmente plaquetas normais activadas. A mistura reaccional contendo ASL e plaquetas activadas é mantida sob condições de ensaio biológico predeterminadas durante um período de tempo suficiente para que as plaquetas normais activadas se liguem com o ASL para formar um produto de reacção. A quantidade de produto de reacção é determinada, e geralmente registada, e é relacionada com a quantidade de plaquetas competentes para a activação presentes na amostra. A quantidade de produto formado pode ser correlacionada com valores de referência predeterminados utilizando os protocolos de ensaio aqui descritos para identificar os defeitos de activação.

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-13a. Agonistas de plaquetas

Os agonistas de plaquetas empregues no presente invento activam’' as plaquetas alvo normais para a agregação por conversão das plaquetas do seu estado de repouso normal para um estado adequado para a agregação subsequente. O mecanismo de activaçâo não é bem conhecido e acredita-se que varia de acordo com o tipo de agonista utilizado. Pelo menos uma via de activaçâo parece envolver a activaçâo da fosfolipase C mediada pela proteína G, seguida por activaçâo da proteína-cinase C. Shattil e colab., J. Biol. Chem.. 261:992 (1987).

A ligação do fibrinogénio às plaquetas envolve a glicoproteína da membrana plaquetária GPIIb-IIIa. Além disso, a ligação eficiente dos referidos ligandos grandes como o fibrinogénio requer a activaçâo por agonistas adequados. Agonistas ilustrativos incluem ADP (adenosina-difosfato), trombina e semelhantes. Adicionalmente, podem ser empregues agonistas como o PMA que activam directamente a proteína-cinase C. Podem ser empregues outros agonistas e são bem conhecidos dos especialistas na arte. Ver, por ex., Nuden e colab., Br J Haematol. 28:253 (1974); Mustard e colab., Blood, 54:987 (1979); Bennett e colab., J. Clin. Invest.. 64:1393 (1979); Marguerie e colab., J. Biol. Chem., 254:5357 (1979). Acredita-se que os agonistas utilizados actuam por indução da abertura da cavidade de ligação do ligando da GPIIb-IIIa, permitindo deste modo a acessibilidade aumentada de ligandos grandes ao local de ligação do ligando (Fig. 1).

b. Ligandos Específicos de Activaçâo

Um ligando específico de activaçâo (ASL) tal como aqui utilizado é uma molécula que liga especificamente uma molécula receptora activada. Tal como aqui utilizado, o termo ligação específica e os seus equivalentes gramaticais referem-se a uma reacção de ligação não aleatória entre um receptor da superfície celular e uma molécula de ligando. Um exemplo ilustrativo de um complexo ligando-receptor ligado especificamente tal como aqui considerado é aquele entre a GPIIb-IIIa de plaquetas activada e o fibrinogénio na superfície das plaquetas. Outros ligandos que se sabe ligarem especificamente a GPIIb-IIIa activada incluem o MoAb

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PAC-1 e os seus equivalentes funcionais [Shattil e colab., J. Biol. Chem.. 260-11107 (1985)], fibronectina, vitronectina e o factor de von Willebrand. Assim, ligandos adequados incluem ligandos nativos para a GPIIb-IIIa activada e anticorpos originados contra as determinantes antigénicas da GPIIb-IIIa.

As presentes moléculas de ASL adicionalmente ligam, preferencialmente, plaquetas activadas. Tal como aqui utilizado, uma molécula reagente do presente invento é considerada como ligando preferencialmente uma espécie alvo no ensaio quando o reagente se associa mais fortemente com a molécula alvo do que com outras espécies presentes no ensaio. Assim, a reacção da molécula reagente com o alvo apresentará, na generalidade, uma constante de associação maior do que a reacção do reagente com qualquer outra espécie presente no ensaio. Tipicamente, aqui um reagente ligará preferencialmente a sua espécie alvo, por ex. , um ASL ligará uma integrina activada, quando a afinidade de ligação do reagente pelo alvo for 2-3 vezes maior, e preferivelmente pelo menos 10 vezes maior, do que a afinidade correspondente do reagente por outras espécies, por ex., integrina não activada.

A afinidade de ligação relativa de uma molécula reagente pela sua espécie alvo é convenientemente determinada tal como aqui descrito utilizando o processo de citometria de fluxo activada por fluorescência. Consequentemente, um ASL marcado adequado para ser aqui utilizado apresentará um aumento na intensidade de fluorescência celular média (MCFI) de uma amostra de plaquetas normais quando a amostra sofre activação. 0 aumento na MCFI será tipicamente superior a cerca de duas vezes e preferivelmente superior a cerca de dez vezes, a MCFI para uma amostra de plaquetas normais não activadas.

Um anticorpo ASL do presente invento é caracterizado como contendo moléculas de anticorpo que imunorreagem com a GPIlb-Illa activada mas que não ligam preferencialmente (imunorreagem) com a GPIIb-IIIa não activada. Numa concretização preferida, as moléculas de anticorpo imunorreagem com as cadeias de GPIIIa ou GPIIb da integrina. Geralmente, os anticorpos também se

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-15ligarão ao local de ligação do ligando da GPIIb-IIIa, dado que o local de ligação do ligando estará próximo daqueles resíduos de aminoácido mais afectados pelo processo de activação. Noutra concretização preferida, uma composição de anticorpo deste invento possui mais do que uma espécie de paratopo capaz de imunorreagir com a GPIIb-IIIa activada.

anticorpo de ASL preferido tal como aqui considerado é tipicamente produzido por imunização de um mamífero com um inóculo contendo plaquetas de um animal hospedeiro pré-seleccionado, desse modo induzindo no mamífero moléculas de anticorpo possuindo a imunoespecificidade apropriada para as moléculas de GPIIb-IIIa nas plaquetas. As moléculas de anticorpo são então recolhidas do mamífero e examinadas na extensão desejada por técnicas bem conhecidas tais como, por exemplo, por imunoafinidade para plaquetas estimuladas. A composição de anticorpo assim produzida pode ser utilizada inter alia nos sistemas e processos de diagnóstico do presente invento para detectar plaquetas activadas numa amostra de fluido corporal.

Também é abrangido pelo presente invento um anticorpo monoclonal (MoAb) anti-GPIIb-IIIa activada. A frase composição de anticorpo monoclonal nas suas várias formas gramaticais refere-se a uma população de moléculas de anticorpo gue contém apenas uma espécie de local de combinação do anticorpo capaz de imunorreagir com um antigénio particular. Deste modo, a presente composição de MoAb apresenta tipicamente uma única afinidade de ligação para qualquer antigénio com o qual imunorreage. Uma composição de anticorpo monoclonal pode, consequentemente, conter uma molécula de anticorpo possuindo uma pluralidade de locais de combinação do anticorpo, cada um imunoespecífico para um antigénio diferente, por ex., um anticorpo monoclonal bi-específico.

Um MoAb do presente invento é composto tipicamente por anticorpos produzidos por clones de uma única célula, denominada hibridoma, que segregam (produzem) apenas um tipo de molécula de anticorpo. A célula de hibridoma é formada pela fusão de uma

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•..*S célula produtora de anticorpo com um mieloma ou com outra linha de células que se autoperpetuem. Os referidos anticorpos foram primeiro descritos por Kohler e Milstein, Nature 256:495-497 (1975), cuja descrição é aqui incorporada para referência.

Um anticorpo monoclonal também pode ser produzido por processos bem conhecidos dos especialistas na arte de produção de anticorpos quiméricos. Esses processos incluem o isolamento, manipulação e expressão do ácido nucleico que codifica toda ou parte de uma região variável de imunoglobulina, incluindo a porção da região variável compreendendo a região variável da cadeia leve da imunoglobulina e a porção da região variável compreendendo a região variável da cadeia pesada da imunoglobulina. Os processos para o isolamento, manipulação e expressão do ácido nucleico que codifica a região variável em hospedeiros procariotas e eucariotas encontram-se descritos em Robinson e colab., Publicação do PCT N². WO 89/0099; Winter e colab., Publicação de Patente Europeia N². 0239400; Reading, Patente dos E.U.A. N². 4 714 681; Cabilly e colab., Publicação de Patente Europeia N² . 0125023; Sorge e colab., Mol. Cell Biol. , 4:1730-1737 (1984); Beher e colab., Science. 240:1041-1043 (1988); Skerra e colab., Science, 240:1030-1041 (1988); e Orlandi e colab., Proc. Natl. Acad. Sei., U.S.A., 86:3833-3837 (1989). Tipicamente, o ácido nucleico codifica toda ou parte de uma região variável de imunoglobulina que liga um antigénio pré-seleccionado (ligando). As fontes de ácido nucleico são bem conhecidas de um especialista na arte e, por exemplo, pode ser obtido a partir de um hibridoma produzindo um anticorpo monoclonal que liga o antigénio pré-seleccionado, ou o antigénio pré-seleccionado pode ser utilizado para examinar uma biblioteca de expressão codificando uma pluralidade de regiões variáveis de imunoglobulina, deste modo isolando o ácido nucleico.

Estes anticorpos monoclonais preferidos imunorreagem com a

GPIIb-IIIa activada livre. Os anticorpos também podem reagir imunologicamente com a GPIIb-IIIa associada a plaquetas quando não ligada com o ligando, mas não quando ligada com um ligando, tal como fibrinogénio. Um exemplo representativo de um anticorpo

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-17monoclonal deste tipo é o anticorpo PAC-1.

O presente invento abrange um processo de formação de uma molécula de anticorpo monoclonal que imunorreage com uma região activada de GPIIb-IIIa, isto é, uma região que possui uma estrutura tridimensional diferente do que quando a integrina se encontra na sua conformação de repouso. 0 processo compreende os passos de:

(a) imunização de um animal com um complexo ligandoreceptor da superfície celular. Preferivelmente, o imunogénio é uma amostra homóloga de plaquetas recolhidas de uma espécie animal sujeita. Contudo, o antigénio também pode estar ligado a uma proteína portadora tal como a hemocianina de lapa (Género Fissurela) particularmente quando o antigénio é pequeno. A imunização é tipicamente executada por administração da amostra a um mamífero imunologicamente competente numa quantidade imunologicamente eficaz, isto é, numa quantidade suficiente para produzir uma resposta imunitária. Preferivelmene, o mamífero é um roedor tal como um coelho, uma ratazana ou um ratinho. O mamífero é, em seguida, conservado durante um período de tempo suficiente para que o mamífero produza células que segreguem moléculas de anticorpo que imunorreagem com o receptor.

(b) É, em seguida, preparada uma suspensão de células produtoras de anticorpo removidas do animal imunizado. Isto é tipicamente conseguido por remoção do baço do mamífero e por separação mecânica das células do baço individuais num meio fisiologicamente tolerável utilizando processos bem conhecidos na arte.

(c) As células produtoras de anticorpo suspensas são tratadas com um agente transformante capaz de produzir uma linha de células transformadas (imortalizadas). Os agentes transformantes e a sua utilização para produzir linhas celulares imortalizadas são bem conhecidos na arte, e incluem vírus de ADN como o vírus de Epstein Bar (EBV), o vírus de Símio 40 (SV40), o vírus de Polioma e semelhantes, vírus de ARN como o vírus da Leucemia Murina de Moloney (MoMuLV), o vírus do Sarcoma de Rous e

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-18semelhantes, células de mieloma como P3X63-Ag8,653, semelhantes.

Sp2/O-Agl4 e

Em concretizações preferidas, o tratamento com o agente transformante tem como consequência a produção de um hibridoma imortalizado” por meio da fusão das células de baço suspensas com células de mieloma de ratinho de uma linha celular adequada, por exemplo, SP-2, pela utilização de um promotor de fusão adequado. A proporção preferida é de cerca de 5 células de baço por célula de mieloma numa suspensão contendo cerca de 10⁸ esplenócitos. Um promotor de fusão preferido é o polietilenoglicol possuindo uma massa molecular média de cerca de 1000 a cerca de 4000 (comercialmente disponível como PEG 1 000, etc.); contudo, podem ser empregues outros promotores de fusão conhecidos na arte.

A linha celular utilizada deve ser, preferivelmente, do tipo denominado resistente à droga, de modo que as células de mieloma não fundidas não sobrevivam num meio selectivo, sobrevivendo os híbridos. A classe mais comum é a das linhas celulares resistentes à 8-azaguanina, que não possuem a enzima hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferase e, consequentemente, não serão suportadas por meio HAT (hipoxantina, aminopterina e timidina). É também geralmente preferido que a linha celular de mieloma utilizada seja do tipo denominado não secretor o qual, por si próprio, não produz qualquer anticorpo. Em certos casos, contudo, podem ser preferidas linhas de mieloma secretoras.

(d) As células transformadas são, em seguida, clonadas, preferivelmente até à monoclonalidade. A clonagem é preferivelmente executada num meio de cultura de tecido que não sustentará (suportará) células não transformadas. Quando as células transformadas são hiforidomas, isto é tipicamente executado por diluição e cultura da mistura de células de baço não fundidas, de células de mieloma não fundidas e de células fundidas (hibridomas), em recipientes separados, num meio selectivo que não sustentará as células de mieloma não fundidas. As células são cultivadas neste meio durante um período de tempo suficiente para

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-19permitir a morte das células não fundidas (cerca de uma semana). A diluição pode ser uma diluição limitante, na qual o volume de diluente é calculado estatisticamente para isolar um certo número de células (por ex. , 1-4) em cada recipiente separado (por ex. , cada cavidade de uma placa de microtitulação). 0 meio será um (por ex., meio HAT) que não sustentará a linha de células de mieloma não fundidas resistentes à droga (por ex., resistentes à 8-azaguanina).

(e) 0 meio de cultura de tecido dos transformantes clonados é analisado (ensaiado imunologicamente) para detectar a presença de moléculas de anticorpo que reajam preferencialmente com a GPIIb-IIIa sobre as plaquetas activadas. Isto é executado utilizando técnicas imunológicas bem conhecidas.

(f) Um transformante desejado é em seguida seleccionado e cultivado num meio de cultura de tecido apropriado durante um período de tempo adequado, seguido por recuperação (colheita) do anticorpo desejado a partir do sobrenadante da cultura por técnicas bem conhecidas. 0 meio adequado e o período de tempo de cultura adequado também são bem conhecidos ou são prontamente determinados.

Para produzir uma concentração muito maior do anticorpo monoclonal ligeiramente menos puro, o hibridoma desejado pode ser transferido por injecção para ratinhos, preferivelmente ratinhos singénicos ou semi-singénicos. O hibridoma provocará a formação de tumores produtores de anticorpo após um tempo de incubação adequado, o que originará uma concentração elevada do anticorpo desejado (cerca de 5-20 mg/ml) na corrente sanguínea e no exsudado peritoneal (ascite) do ratinho hospedeiro.

Os meios e os animais úteis para a preparação destas composições são ambos bem conhecidos na arte e estão comercialmente disponíveis, e incluem meios de cultura sintéticos, ratinhos consanguíneos e semelhantes. Um meio sintético ilustrativo é o meio essencial mínimo de Dulbecco [DMEM; Dulbecco e colab., Virol. 8:396 (1959)] suplementado com 4,5 g/1 de glucose,

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-20glutamina 20 mM, e soro de vitelo fetal a 20%. Uma estirpe de ratinhos consanguíneos ilustrativa é a Balh/c.

Os anticorpos monoclonais produzidos pelo processo anterior podem ser utilizados, por exemplo, em modalidades diagnósticas e terapêuticas nas quais é desejada a formação de um produto de imunorreacção plaquetário competente para a activação. Os processos para a produção de hibridomas que produzem (segregam) moléculas de anticorpo possuindo uma imunoespecificidade desejada, isto é, possuindo a capacidade de ímunorreagirem com uma proteína particular, um epitopo identificável numa proteína particular e/ou num polipéptido, são bem conhecidos na arte e são aqui adicionaimente descritos. Particularmente aplicável é a tecnologia de hibridoma descrita por Niman e colab., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 80:4949-4953 (1983), e por Galfre e colab., Me th. Enzvmol.. 73:3-46 (1981), cujas descrições são aqui incorporadas para referência.

Um processo preferido adicional para a formação das presentes composições de anticorpo envolve a produção de bibliotecas de moléculas Fab utilizando o processo de Huse e colab., Science, 246:1275 (1989). Neste processo, as moléculas de ARNm para as cadeias pesada e leve do anticorpo são isoladas a partir do animal imunizado. Os ARNm são amplificados utilizando técnicas de reacção em cadeia de polimerase (PCR). Os ácidos núcleicos são então clonados aleatoriamente em fagos lambda para produzir uma biblioteca de partículas fágicas recombinada. Os fagos podem, em seguida, ser utilizados para infectar um hospedeiro de expressão como a E. coli. As colónias de E. coli e os recombinantes fágicos correspondentes podem então ser examinados quanto àqueles produzindo os fragmentos Fab desejados.

As composições contendo moléculas de anticorpo empregues no presente invento podem tomar a forma de soluções ou suspensões. A preparação de uma composição que contém moléculas de anticorpo como ingredientes àctivos é bem compreendida na arte. Tipicamente, essas composições são preparadas como soluções ou suspensões líquidas, contudo, também podem ser preparadas formas sólidas

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-21adequadas para solução ou suspensão num liquido. A preparação também pode ser emulsionada. 0 ingrediente terapêutico activo é muitas vezes misturado com excipientes que não interferem com o ensaio e são compatíveis com o ingrediente activo. Excipientes adequados são, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol, etanol ou semelhantes se desejado, a composição pode substâncias auxiliares tais emulsionantes, agentes tampão do eficácia do ingrediente activo.

e suas combinações. Além disso, conter quantidades menores de como agentes molhantes ou pH e semelhante, que aumentam a

Uma composição de molécula de anticorpo pode ser formulada sob uma forma de sal aceitável neutralizada. Sais aceitáveis incluem os sais de adição de ácido (formados com os grupos amino livres da molécula de anticorpo) que são formados com ácidos inorgânicos como, por exemplo, os ácidos clorídrico ou fosfórico, ou com ácidos orgânicos como os ácidos acético, tartárico, mandélico e semelhantes. Os sais formados com os grupos carboxilo livres também podem derivar de bases inorgânicas como, por exemplo, os hidróxidos de sódio, potássio, amónio, cálcio ou férrico, e de bases orgânicas como a isopropilamina, trimetilamina, 2-etílaminoetanol, histidina, procaína e semelhantes.

2. Determinação da Competência de Ocupação de Ligando presente invento também contempla a determinação da presença de plaquetas competentes para a ocupação de ligando numa amostra de fluido corporal contendo plaquetas. A determinação da competência de ocupação de ligando pode ser feita por determinação da capacidade de ligação do ligando de receptores activados ou pode ser feita por determinação da capacidade de ligação do ligando de receptores independentemente da activação. No último caso, será empregue um ligando independente da activação (AIL) para reagir com os receptores das plaquetas ligados à membrana.

A determinação da competência de ocupação de ligando compreenderá tipicamente a mistura de uma amostra de plaquetas com uma quantidade predeterminada de um AIL que é suficiente para

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formar um local de ligação induzido por ligando (LIBS) em plaquetas normais. 0 LIBS pode ser sondado com uma composição de anticorpo anti-LIBS que imunorreage com o LIBS. O LIBS pode estar localizado no receptor das plaquetas ou pode também prolongar-se sobre a superfície do ligando. Para determinar de forma simples se o LIBS está localizado apenas no receptor basta alterar o ligando de modo a que um epitopo diferente seja apresentado ao anticorpo anti-LIBS. De modo a ser uma sonda adequada para um LIBS, um anticorpo anti-LIBS deverá imunorreagir com o LIBS mas não deverá reagir substancialmente com o AIL livre ou com plaquetas que não estão ligadas ao ligando, isto é, plaquetas em repouso ou activadas mas não ocupadas.

Noutra concretização, a competência de ocupação de ligando será determinada em plaquetas competentes para a activação. O processo compreenderá a mistura de uma amostra de fluido corporal com uma quantidade predeterminada de agonista de plaquetas que é suficiente para activar plaquetas normais. De igual modo, um ligando específico de activação (ASL) será misturado com a amostra na qual o ASL liga as plaquetas activadas tal como descrito anteriormente para formar um 1IBS. Além disso, um anticorpo anti-LIBS, tal como aqui descrito, será misturado com a amostra para permitir a detecção da presença do LIBS, indicando desse modo a competência de ocupação de ligando nas plaquetas. A mistura reaecional assim formada será mantida tal como aqui descrito para formar uma quantidade de produto de imunorreacção que é relacionada por critérios predeterminados com uma quantidade de plaquetas competentes para a ocupação de ligando.

Preferivelmente, a detecção do LIBS no presente invento será proporcionada pelo processo de citometria de fluxo activada por fluorescência. Desta maneira, um anticorpo anti-LIBS marcado adequado para ser aqui utilizado apresentará um aumento na intensidade de fluorescência celular média (MCFI) de uma amostra de plaquetas normais exibindo o LIBS em comparação com uma amostra que não apresente um LIBS, por exemplo, plaquetas não ocupadas por um AIL. 0 aumento na MCFI será tipicamente maior do que cerca de duas vezes e, preferivelmente, maior do que cerca de dez

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-23vezes, da MCFI para uma amostra de plaquetas não

LIBS, isto é, não expostas aos AIL adicionados.

a. Ligandos Independentes de Activaçâo

Um ligando independente de activaçâo (AIL) do presente invento será uma molécula que se liga a plaquetas independentemente da sua activaçâo. Tipicamente, o AIL será uma molécula polipeptídica pequena que se liga a plaquetas, por ex., na região de ligação de péptidos dos receptores de GPIIb-IIIa. A ocupação de um tal local de ligação pode ser sondada directamente por determinação da inibição exercida pelo AIL sobre outros ligandos competitivos, por ex., ASL. Alternativamente, a ocupação de ligando da região de ligação pode ser determinada indirectamente por sondagem de um LIBS tal como aqui descrito.

Como mencionado, o polipéptido de AIL sujeito pode incluir uma sequência de resíduos de aminoácido que possui a capacidade de inibir a adesão de plaquetas, por ex., por ligação à GPIIb-IIIa. Polipéptidos inibidores de adesão de plaquetas particularmente preferidos incluem as sequências de resíduos de aminoácido RGD, tais como aquelas descritas nas Patentes dos E.U.A. N^a. 4 683 291 e 4 578 079. Um péptido contendo RGD particularmente preferido é GRGDSP.

Os resíduos de aminoácido presentes num polipéptido sujeito, para além de uma sequência correspondente a uma fórmula anteriormente descrita, podem ser quaisquer resíduos que não afectem, materialmente as características básicas e inovadoras do polipéptido, tal como aqui são discutidas. Os referidos resíduos adicionais são geralmente adicionados a um ou a ambos os terminais de um dado péptido e podem incluir repetições e repetições parciais de uma dada sequência peptídica ou resíduos contíguos da sequência polipeptídica. Um polipéptido preferido incluirá uma sequência RGD. Assim, um polipéptido do presente invento não necessita ser idêntico à sequência de resíduos de aminoácido dos polipéptidos aqui descritos, desde que seja capaz de exibir pelo menos uma das características preferidas de um polipéptido sujeito, nomeadamente ligação a plaquetas não activadas ou inibi-

-24<//

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SCRF 199.0 POR ção do ASL. Deste modo, um polipéptido sujeito pode ser submetido a várias alterações, como inserções, delecções e substituições conservativas ou não conservativas, proporcionando essas alterações certas vantagens na sua utilização.

Substituições conservativas são aquelas em que um resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo biologicamente semelhante. Exemplos de substituições conservativas incluem a substituição de um resíduo hidrofóbico, tal como isoleucina, valina, leucina ou metionina por outro, ou a substituição de um resíduo polar por outro tal como entre arginina e lisina, entre os ácidos glutâmico e aspártico ou entre glutamina e asparagina, e semelhantes. 0 termo substituição conservativa também inclui a utilização de um aminoácido substituído no lugar de um aminoácido original não substituído desde que um tal polipéptido também apresente a actividade de ligação exigida.

Quando um polipéptido do presente invento possui uma sequência que não é idêntica a uma sequência preferida porque foram efectuadas uma ou mais substituições conservativas ou não conservativas, geralmente são substituídas não mais do que cerca de 20% e mais geralmente não mais do que 10% dos resíduos de aminoácido. Existe uma excepção, quando são adicionados resíduos adicionais a qualquer dos terminais com o fim de proporcionar um ligador, pelo qual os polipéptidos deste invento podem ser convenientemente afixados a um marcador ou a uma matriz sólida ou a um portador antigénico. Descrevem-se em seguida marcadores, matrizes sólidas e portadores que podem ser utilizados com os polipéptidos deste invento.

Os ligadores de resíduos de aminoácido têm geralmente pelo menos um resíduo e podem ter 40 ou mais resíduos, mais frequentemente 1 a 10 resíduos. Os resíduos de aminoácido típicos utilizados para ligação são tirosina, cisteína, lisina, ácidos glutâmico e aspártico, ou semelhantes. Um ligador representativo é um tripéptido Cys-Gly-Gly (CGG-) ligado ao terminal amino de um polipéptido sujeito pelo resíduo de glicina do terminal carboxilo do ligador. Além disso, uma sequência polipeptídica deste invento

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SCRF 199.0 POR pode diferir da sequência natural, por modificação da sequência por acilação do terminal NH₂, por ex., acetilação, ou amidação de ácido tioglicólico, amidação do terminal carboxilo, por ex. , amónia, metilamina, etc..

Um polipéptido sujeito pode ser sintetizado por qualquer das técnicas que são bem conhecidas dos especialistas na arte polipeptídica. Um sumário excelente das muitas técnicas disponíveis pode ser encontrado em J. M. Steward e J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969, e J. Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides, Vol. 2, pág. 46, Academic Press (New York), 1983 para a síntese peptídica de fase sólida e E. Schroder e K. Kubke, The Peptides, Vol. 1, Academic Press (New York), 1965 para a síntese clássica em solução.

Uma concretização relacionada abrange uma composição para a promoção da fixação (adesão) de células a um substrato. Com base na capacidade de um polipéptido sujeito para se ligar a plaquetas, o polipéptido sujeito pode ser utilizado para promover a actividade de fixação celular quando o polipéptido está imobilizado sobre um substrato.

É utilizada uma composição contendo um polipéptido sujeito para tratar um substrato e, desse modo, imobilizar o polipéptido contido na composição sobre o substrato. 0 substrato pode ser qualquer superfície sobre a qual a actividade promotora da adesão celular é desejada e inclui recipientes para cultura de células, dispositivos médicos, dispositivos protésicos uma fibra de resina sintética, enxertos vasculares ou de vaso sanguíneo, um dispositivo percutâneo, órgãos artificiais e similares. A superfície pode ser constituída por vidro, uma resina sintética, nitrocelulose, poliéster, agarose, colagénio ou um polisacárido de cadeia longa.

A imobilização dos polipéptidos sobre o substrato pode ser efectuada por uma variedade de modos e depende, inter alia, do substrato e do mecanismo de imobilização desejado. Os processos

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para acoplamento ou imobilização do péptido são bem conhecidos na arte e envolvem tipicamente ligações covalentes entre um grupo amino ou tiol no polipéptido e um grupo reactivo presente no substrato. Para processos de imobilização de polipéptidos ilustrativos ver Aurameas e colab., Scand J. Immunol.. Vol. 8 Supl. 7:7-23 (1978); Patente dos E.U.A. N^as. 4 493 795, 4 578 079 e 4 671 950; Klipstein e colab., J. Infect. Dis. . 147:318-326 (1983) e Liu e colab., Biochem.. 80:690 (1979). Para exemplos de utilização de polipéptidos promotores da adesão celular ver a Patente dos E.U.A. N^e. 4 578 079.

b. Anticorpos anti-LIBS

A presença de plaquetas competentes para a ocupação de ligando numa amostra de fluido será geralmente detectada através da utilização de anticorpos anti-LIBS. Estes anticorpos imunorreagem com epitopos nas plaquetas que são originados pela formação do complexo ligando-receptor. Assim, os anticorpos não reagirem substancialmente com plaquetas sem formação do complexo nem reagirão com ligandos não ligado. Os epitopos originados pela formação do complexo podem localizar-se no receptor, no ligando, ou em ambos. 0 local, ou locais, de ligação exacto dos anticorpos anti-LIBS ao complexo pode ser sondado por técnicas tais como RMN, cristalografia de raios X, cromatografia de imunoadsorção utilizando receptores mutantes e reacções de entrecruzamento entre o receptor e o ligando.

Os presentes anticorpos anti-LIBS podem ser espécies monoclonais ou policlonais e podem ser preparados utilizando técnicas como as anteriormente descritas para os ASL. A preparação e as propriedades dos anticorpos anti-LIBS encontram-se discutidas duma forma mais completa na Patente dos E.U.A. com o número de série 417 565, cuja descrição é aqui incorporada para referência.

Numa concretização preferida, os anticorpos anti-LIBS serão monoclonais, como o anticorpo produzido pelo hibridoma PMI-1, o qual imunorreage com um LIBS na adesina de GPIIb-IIIa.

Um meio adicional de detecção de plaquetas competentes para

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a ligação de ligando empregará anticorpos para locais de ligação induzidos por receptor (RIBS) no ligando para o receptor. Dado que a competência de ligação do ligando pode ser inferida a partir da produção de locais induzidos por receptor no ligando, este processo detecta a formação do complexo ligando/receptor. Os anticorpos anti-RIBS são adicionalmente discutidos em Zamarron e colab., Blood 74:208a (Supl. 1) (1989).

3. Correlação de Resultados - Identificação de Defeitos de Pós-Ocupação

Os resultados das análises quanto a plaquetas competentes para a activação e competentes para a ligação de ligando serão comparados com critérios predeterminados a fim de avaliar a presença de defeitos. Assim, a quantidade determinada de plaquetas competentes para a activação será comparada com um nível limiar predeterminado das referidas plaquetas abaixo do qual é indicada uma deficiência. O referido nível de referência de plaquetas competentes é geralmente determinado antes do ensaio utilizando condições de reacção seleccionadas, por ex., pH, temperatura, tempos de reacção, etc., aqui descritos de forma mais completa. As condições de reacção utilizadas serão habitualmente optimizadas para maximizar a indicação de activação em plaquetas normais. A medição real de plaquetas pode ser expressa de qualquer modo conveniente, por ex., peso, número de células, concentração , etc..

De forma semelhante, a quantidade de plaquetas competentes para a ocupação de ligando será determinada utilizando condições de reacção predeterminadas. A quantidade apurada de plaquetas competentes será correlacionada com um nível de competência predeterminado a fim de determinar se a quantidade de plaquetas competentes é menor do que o nível limiar para a indicação de defeito. É indicado um defeito de ligação de ligando se a presença de plaquetas é inferior ao nível predeterminado.

Quando está indicada uma disfunção grave da agregação de plaquetas, por ex., por agregometria, as indicações de quantidades suficientes de plaquetas competentes para a activação e

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-28para a ligação de ligando permitem a de pós-ocupação.

identificação de um defeito

C. Sistemas Diagnósticos

Também estão abrangidos pelo presente invento conjuntos de diagnóstico para a execução das caracterizações de plaquetas descritas. Um sistema diagnóstico na forma de conjunto de acordo com o presente invento inclui, numa quantidade suficiente para pelo menos um ensaio, uma composição contendo moléculas de anticorpo ou anticorpo monoclonal ou seus fragmentos de acordo com o presente invento, como um reagente embalado separadamente, em conjunto com um marcador que indica a presença de um produto de imunorreacção. Estão também tipicamente incluídas as instruções para a utilização do reagente embalado. As instruções para a utilização incluem tipicamente uma expressão tangível descrevendo a concentração do reagente ou pelo menos um parâmetro do processo de ensaio, como as quantidades relativas de reagente e amostra a serem misturadas, os períodos de tempo para a manutenção das misturas de reagente/amostra, temperatura, condições de tampão e semelhantes. Numa concretização é contemplado um sistema de diagnóstico para ensaio quanto à presença de plaquetas activadas e de um complexo de ligando-receptor, numa amostra de fluido vascular contendo o complexo, como sangue ou plasma.

O conjunto é proporcionado como um invólucro (embalagem) gue compreende um recipiente para as moléculas de ASL que reagem com as plaquetas activadas. Tipicamente, o conjunto também conterá um agonista de plaquetas para a estimulação das plaquetas normais para os seus estados activados. Agonistas ilustrativos incluem ADP e trombina, enquanto que as moléculas de ASL serão anticorpos PAC-1.

conjunto também compreende um recipiente para moléculas de AIL que se ligam com receptores nas plaquetas para formar LIBS sobre o receptor. Um composto AIL preferido é GRGDSP.

De igual modo, o sistema de diagnóstico compreende um recipiente para moléculas de anticorpo anti-LIBS que imunorreagem

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2L»».

<

com um LIBS presente num complexo de ligando-receptor. Um anticorpo anti-LIBS preferido é PMI-l. são adioionalrnente preferidos conjuntos nos quais as moléculas de anticorpo estão ligadas a um marcador radionucleótido, preferivelmente moléculas de anticorpo marcadas com ¹²⁵I

Um sistema de diagnóstico in vitro de acordo com o presente invento inclui um marcador ou meio indicador capaz de assinalar a formação de um complexo ligado especificamente contendo uma molécula de anticorpo do presente invento. Tal como aqui utilizados, os termos marcador'' e meio indicador nas suas várias formas gramaticais referem-se a átomos e moléculas simples que estão directa ou indirectamente envolvidos na produção de um sinal detectável para indicar a presença de um complexo. Marcadores ilustrativos incluem ¹¹³·Ιη, ⁹⁹Tc, ⁶⁷Ga e ¹³²I, e marcadores não radioactivos como a biotina e anticorpos ligados a enzima. Qualquer marcador ou meio indicador pode ser ligado ou incorporado numa molécula de anticorpo que faça parte de uma composição de anticorpo ou anticorpo monoclonal do presente invento, ou utilizado separadamente, e esses átomos ou moléculas podem ser utilizados sós ou em conjunto com reagentes adicionais. Os referidos marcadores são, eles próprios, bem conhecidos na química de diagnóstico clínico e constituem uma parte deste invento apenas na medida em que são utilizados com processos e/ou sistemas de outro modo novos.

A ligação de marcadores aos polipéptidos e proteínas é bem conhecida na arte. Por exemplo, as moléculas de anticorpo produzidas por um hibridoma podem ser marcadas por incorporação metabólica de aminoácidos contendo radio-isótopos proporcionados como um componente no meio de cultura. Ver, por exemplo, Galfre e colab., Meth. Enzymol., 73:3-46 (1981). As técnicas de acoplamento ou conjugação de proteínas através de grupos funcionais activados são particularmente aplicáveis. Ver, por exemplo, Aurameas, e colab., Scand. J. Immunol.. Vol. 8, Supl. 7:7-23 (1978), Rodwell e colab., Biotech.. 3:889-894 (1984), e Patente dos E.U.A. N^s. 4 493 795.

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-30Os sistemas de diagnóstico também podem incluir um agente de ligação específico. Um agente de ligação específico é uma espécie química capaz de ligar selectivamente uma espécie reagente do presente invento mas que não é, por ela própria, uma molécula de anticorpo do presente invento. Agentes de ligação específicos ilustrativos são moléculas de anticorpo, proteínas do complemento ou seus fragmentos, proteína A e semelhantes, que reagem com uma molécula de anticorpo deste invento quando está presente como parte de um complexo.

Em concretizações preferidas, o agente de ligação específico está marcado. Contudo, quando o sistema de diagnóstico inclui um agente de ligação específico que não está marcado, o agente é tipicamente utilizado como um reagente ou meio amplificador. Nestas concretizações, o agente de ligação específico marcado é capaz de ligar especificamente o meio amplificador quando o meio amplificador se encontra ligado a um complexo contendo um dos reagentes presentes.

Por exemplo, os conjuntos diagnósticos do presente invento podem ser utilizados num formato ELISA para detectar a presença ou quantidade de plaquetas ligadas ao fibrinogénio numa amostra de fluido corporal tal como soro, plasma ou urina. ELISA refere-se a um ensaio de imunossorção de enzima ligado que emprega um anticorpo ou antigénio ligado a uma fase sólida e um conjugado enzima-antigénio ou enzima-anticorpo para detectar e quantificar a quantidade de um antigénio ou anticorpo presente numa amostra. A descrição da técnica ELISA encontra-se no Capítulo 22 da 4^a. Edição de Basic and Clinicai Immunoloqy por D.P. Sites e colab., publicado por Lange Medicai Publications de Los Altos, CA em 1982 e nas Patentes dos E.U.A. N². 3 654 090; N². 3 850 752 e N^a. 4 015 043, os quais são aqui incorporados para referência.

Em concretizações preferidas, o componente reagente de anticorpo ou antigénio pode ser afixado a uma matriz sólida para formar um suporte sólido que é embalado separadamente nos sistemas de diagnóstico sujeito. 0 reagente é tipicamente afixado à

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-31matriz sólida por adsorção a partir de um meio aquoso, possam ser utilizados outros modos de fixação bem conhecidos dos especialistas na arte. As matrizes sólidas úteis são bem conhecidas na arte. Os referidos materiais incluem dextrano reticulado disponível sob a marca registada SEPHADEX de Pharmacia Fine Chemicals (Piscataway, NJ); agarose; pérolas de polistireno com cerca de 1 micron a cerca de 5 milímetros de diâmetro disponíveis em Abbott Laboratories de North Chicago, IL; poli(cloreto de vinilo), poliestireno, poliacrilamida reticulada, telas baseadas em nitrocelulose ou nylon, tais como folhas, tiras ou pás; ou tubos, placas ou as cavidades de uma placa de microtitulação tal como aqueles fabricados em poliestireno ou poli(cloreto de vinilo).

A espécie reagente, agente de ligação específico marcado ou reagente amplificador de qualquer sistema de diagnóstico aqui descrito podem ser proporcionados em solução, como uma dispersão líquida ou como um pó substancialmente seco, por ex., sob a forma liofilizada. Quando o meio indicador é uma enzima, o substrato da enzima também pode ser proporcionado numa embalagem separada de um sistema. Um suporte sólido, tal como a placa de microtitulação anteriormente mencionada e um ou mais tampões também podem ser incluídos como elementos embalados separadamente neste sistema de diagnóstico de ensaio.

As embalagens aqui discutidas em relação aos sistemas de diagnóstico são aquelas habitualmente utilizadas nos sistemas de diagnóstico. As referidas embalagens incluem garrafas de vidro e de plástico (por ex., polietileno, polipropileno e policarbonato), frascos, invólucros de laminados de plástico e de folha de plástico e semelhantes. Geralmente, os reagentes serão embalados sob uma atmosfera inerte.

D. Processos de Ensaio presente invento contempla qualquer processo que resulte na detecção de um ASL ou de um LIBS num complexo ligando-receptor da superfície celular. Preferivelmente, o ASL liga GPIIb-IIIa activada e o LIBS é expresso em resposta à ligação de um ligando

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-32à GPIIb-IIIa.

A afinidade de ligação relativa de uma molécula reagente pela sua espécie alvo é convenientemente determinada tal como aqui descrito utilizando o processo da citometria de fluxo activada por fluorescência. Assim, será indicado um defeito de activação sempre que a intensidade de fluorescência celular média (MCFI) de uma amostra contendo plaquetas de um doente, suspeito de ter o defeito, for menor do que cerca de 50% e, preferivelmente, menor do que cerca de 10%, da MCFI de uma amostra de plaquetas normais.

O processo para a detecção de um LIBS compreende a formação de um produto de imunorreacção entre um LIBS e uma molécula de anticorpo anti-LIBS, tal como aqui descrito e a detecção subsequente do produto de imunorreacção assim formado. 0 LIBS a ser detectado pode estar presente numa amostra de fluido vascular, como uma amostra de sangue contendo plaquetas, ou pode estar presente num tecido corporal. Os especialistas na arte compreenderão que existem numerosos processos da química de diagnóstico clínico bem conhecidos que podem ser utilizados para formar imunocomplexos detectáveis. Assim, embora sejam aqui descritos processos de ensaio ilustrativos, o invento não se encontra limitado a eles.

Um processo de ensaio particularmente preferido emprega citometria de fluxo activada por fluorescência para detectar um LIBS. Deste modo, será indicado um defeito de ligação do ligando sempre que a MCFI de uma amostra contendo plaquetas de um doente suspeito de apresentar o defeito for menor do que cerca de 50%, e preferivelmente menor do que cerca de 10%, da MCFI de uma amostra de plaquetas normais, utilizando os processos de ensaio aqui descritos.

Podem ser empregues vários protocolos de ensaio homogéneos e heterogéneos, competitivos ou não competitivos, para a detecção da presença e preferivelmente da quantidade de plaquetas ligadas ao fibrinogénio numa amostra corporal contendo plaquetas,

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-33preferivelmente uma amostra de fluido corporal, mais preferivelmente uma amostra de fluido vascular como o sangue ou uma porção de sangue contendo plaquetas. 0 processo envolve a mistura de uma amostra de sangue contendo plaquetas com moléculas de anticorpo que imunorreagem com a GPIIb-IIIa de plaquetas. A mistura imunorreaccional assim formada é mantida sob condições de ensaio biológico durante um período de tempo suficiente para que todas as plaquetas ligadas a fibrinogénio imunorreajam com os anticorpos marcados e formem um produto de imunorreacção marcado. Os produtos de imunorreacção marcados são, em seguida, separados dos anticorpos marcados não reagidos, tipicamente por centrifugação suficiente para sedimentar todas as plaquetas presentes na amostra. A quantidade de produto de imunorreacção marcado formado é então analisada.

As condições de ensaio biológico são aquelas que mantêm a actividade biológica das moléculas de anticorpo e das moléculas polipeptídicas deste invento e das plaquetas ligadas ao fibrinogénio a serem analisadas. Essas condições incluem uma gama de temperaturas de cerca de 4°C a cerca de 45°C, preferivelmente cerca de 37 °C, a uma gama de valor do pH de cerca de 5 a cerca de 9, preferivelmente cerca de 7, e uma força iónica variando desde aquela da água destilada até à do cloreto de sódio 1M, preferivelmente próxima da do soro fisiológico. Os processos para optimizar as referidas condições são bem conhecidos na arte.

Na medida em que várias drogas tais como o péptido sintético GRGDSP ou o péptido de veneno de cobra trigramina, podem ser utilizadas para modular a função das plaquetas, por formação de complexos da GPIIb-IIIa por meio do local de ligação para ligandos contendo RGD, o presente invento também abrange processos para detectar o grau de ocupação do local de ligação do ligando pela droga na GPIIb-IIIa. 0 processo é posto em prática essencialmente como anteriormente descrito para a detecção de plaquetas ligadas ao fibrinogénio, com a excepção que um análogo do ligando contendo RGD, e não o fibrinogénio, se ter ligado às plaquetas. O processo é utilizado para quantificar a quantidade de análogo (droga) ligado, isto é, o grau de ocupação do local de ligação do

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-34ligando de RGD.

/ff '

A capacidade das plaquetas para ligarem o fibrinogénio e/ou para expressarem um LIBS pode ser monitorizada num processo de diagnóstico do presente invento. Uma amostra de fluido corporal contendo plaquetas é misturada e incubada com um ligando específico da GPIIb-IIIa tal como o fibrinogénio ou um péptido sintético tal como GRGDSP, ou com outros ligandos específicos da GPIIb-IIIa tal como o polipéptido da cadeia gama do fibrinogénio (Fb gama 400-411), durante um período de tempo suficiente para o ligando se ligar e formar um complexo com o receptor contendo GPIIb-IIIa na superfície das plaquetas. A quantidade de ligando misturada é uma quantidade suficiente para saturar o LIBS específico da GPIIb-IIIa presente nas plaquetas na amostra corporal. A formação do complexo de GPIIb-IIIa tem como consequência a expressão de LIBS na GPIIIa em plaquetas normais.

Numa concretização preferida, a amostra de sangue a ser analisada é retirada de um doente e dividida em alíquotas. Pelo menos uma alíquota é utilizada para a determinação da competência de activação e pelo menos uma alíquota é utilizada para a análise da competência de ligação do ligando. A análise pode ser efectuada simultaneamente, mas geralmente é efectuada sequencialmente. Quando as análises são efectuadas sequencialmente, a medição da competência de ligação do ligando pode ser efectuada antes ou depois da análise da competência de activação.

Numa concretização preferida, os dados obtidos nas presentes análises da competência de activação e de ocupação de ligando serão registados por um meio tangível, por ex., armazenagem em memória de computador ou versões em cópia impressa. Os dados podem ser automaticamente admitidos e armazenados por meio de instrumentação A/D comum que se encontra disponível comercialmente. De igual modo, os dados podem ser chamados novamente e descritos ou expostos como desejado para a melhor apresentação das presentes correlações de dados. Desta maneira, a instrumentação e software adequados para utilização com os presentes processos estão abrangidos dentro do âmbito do presente

-3573 371

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O presente invento é melhor compreendido com os exemplos específicos aqui em seguida descritos e com as reivindicações anexas.

Exemplos

Os exemplos seguintes ilustram, mas não limitam, o presente invento.

Com base no modelo representado na Fig. 1, a agregação de plaquetas, anormal pode ter origem num defeito na activaçâo dos receptores do fibrinogénio das plaquetas, num defeito na ligação do fibrinogénio per se, ou num defeito nos acontecimentos de pós-ocupação necessários para uma agregação óptima. A utilidade potencial deste modelo foi testada pelo estudo de dois doentes com defeitos na agregação de plaquetas, graves e persistentes. Para quantificar a activaçâo do receptor de fibrinogénio e a ligação do ligando, foi empregue um MoAb (PACl) marcado com fluoresceína, o qual reconhece especificamente a forma activada da GPIIb-IIIa. (Shattil e colab., J. Biol. Chem.. 260:11107 (1985)). A ligação do anticorpo foi, medida em amostras pequenas (5 μΐ) de plasma rico em plaquetas por citometria de fluxo.

1. Anticorpos do Presente Invento

A preparação e a caracterização dos anticorpos aqui utilizados foram descritas em detalhe noutro local, e as suas propriedades encontram-se registadas na Tabela 1. Os processos para a preparação e análise dos anticorpos registados na Tabela 1 encontram-se descritos nas referências seguintes: PAC-1: Shattil e colab., J. Biol. Chem.. 260:11107 (1985); PMI-1; Frelinger e colab., J. Biol. Chem., 263:12397 (1988), Loftus e colab., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 840:7114 (1987); Anti-LIBS 1 e Abl5: Frelinger e colab., J. Biol. Chem., 265:6346 (1990); Tab: McEver e colab., J. Biol. Chem., 258:5269 (1983); 4F10: Woods e colab., J. Biol. Chem.. 261:15242 (1986); 10E5: Coller e colab., J. Clin. Invest., 72:325 (1983); 7E3: Coller e colab., J. Clin. Invest.. 76:901 (1985); A₂A_g: Gartner e colab., Blood, 66:305a

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-36(1985), Bennett e colab., Proc. Natl. Acad. Scl. USA, 80:2417 (1983)? TSPI-1: Aiken e colab., Blood, 69:58 (1987).

Os anticorpos conjugados com isotiocianato de fluoresceína foram preparados tal como descrito para se obterem proporções molares de fluoresceína/proteína de 3:6 (Shattil e colab., Blood, 70:307 (1987)).

Tabela 1

Anticorpos Monoclonais Utilizados

Anticorpo	Especificidade	Ligação do f ibrinoaéniob	Efeito de Péptidosc >d
PAC 1	GPIIb-IIIaa	Diminuição	Diminuição
PMI-1	em plaquetas activadas cadeia pesada da GPIlb	Nenhum	Aumento
LIBS1	(Terminal C) GPIIIa	Nenhum	Aumento
Ab 15	GPIIIa	Nenhum	Nenhum
Tab	GPIlb	Nenhum	Nenhum
4F10	GPIIb-IIIa	Diminuição	N.D.
10E5	GPIIb-IIIa	Diminuição	N.D.
7E3	GPIIb-IIIa	Diminuição	N.D.
A2Ag	GPIIb-IIIa	Diminuição	RGD=Nenhum

gama (402-411)=Diminuição

Anti-TSP Trombospondina	Nenhum	Nenhum
a Complexo de GPIIb-IIIa

^b Efeito do anticorpo sobre a ligação do fibrinogénio às plaquetas ^c Efeito dos péptidos do terminal C do RGD ou da cadeia gama do fibrinogénio sobre a ligação do anticorpo

N.D. = não determinado

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-372. Peptidos do Presente Invento

Foram sintetizados peptidos utilizando peptídico de Applied Biosystems (Mountain View, sos recomendados pelo fabricante. Os peptidos homogéneos por cromatografia líquida de elevado um sintetizador

CA) e os proceseram mais de 90% rendimento, e as composições em aminoácidos eram compatíveis com a sequência desejada. Os peptidos eram Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro (GRGDSP), fibrinogénio gama (402-411)=Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val (LGGAKQAGDV), Lys-Tyr-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser (KYGRGDS), e por Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val (KQAGDV).

3. Análise da GPIIb-IIIa da Superfície das Plaquetas por Citometria de Fluxo

Foi obtido plasma rico em plaquetas por colheita de sangue venoso de doentes e de controlos que não tinham ingerido medicamentos durante pelo menos 10 dias, anticoagulação com 1/10 em volume de citrato de sódio a 3,8%, e sedimentação dos glóbulos vermelhos e brancos a 180 g durante 20 minutos, à temperatura ambiente. Imediatamente a seguir, foram adicionadas aliquotas de 5 μΐ de plasma rico em plaquetas a tubos de polipropileno contendo um anticorpo monoclonal conjugado com isotiocianato de fluoresceína (IO^-9 a IO”⁶ mol/1) em tampão de Tyrode (albumina de soro de bovino a 1%, MgCl₂ 2 mmol/1, NaCl 137,5 mmol/1, NaHCO₃ 12 mmol/1, KCl 2,6 mmol/1, pH 7,4). Ver Figura 2. As amostras foram incubadas sem agitação num volume total de 50 μΐ durante 15 minutos à temperatura ambiente com agonistas e péptidos como indicado. As amostras foram de seguida diluídas até 0,5 ml com tampão de Tyrode e analisadas num citómetro de fluxo FACStar (Becton-Dickinson Immunocytometry Systems, Mountain View, CA). Os sinais de fluorescência e dispersão da luz foram conseguidos com ganho logarítmico e foram analisadas 10 000 plaquetas em cada amostra. Os resultados são expressos como intensidade de fluorescência média em unidades de fluorescência arbitrárias ou como histogramas de log da intensidade de fluorescência das plaquetas em unidades arbitrárias na abcissa e número de plaquetas na ordenada.

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A variante Cam de trombastenia é devida a um defeito no Reconhecimento do Ligando

A variante Cam da trombastenia de Glanzmann é caracterizada por uma redução marcada da ligação do fibrinogénio às plaquetas que contêm quantidades praticamente normais de GPIIb-IIIa (Ginsberg e colab., J. Clin. Invest. 78:1103 (1986)). A presença da GPIIb-IIIa na superfície das plaquetas Cam foi confirmada por citometria de fluxo, na qual existiu ligação comparável de um MoAb anti-GPIIb (Tab) e de um MoAb anti-GPIIIa (AB-15) às plaquetas Cam e às normais. Além disso, quatro MoAb específicos para o complexo da GPIIb-IIIa (A₂A₉, 7E13, 10E5, 4F10), todos eles reconhecendo a forma não activada da GPIIb-IIIa em estequiometria 1:1 e inibindo a ligação do fibrinogénio às plaquetas, também se ligarem em quantidades comparáveis às plaquetas Cam e às normais (Fig. 2); McEver e colab., J. Biol. Chem.. 258:5269 (1983); Woods e colab., J. Biol. Chem.. 258:5269 (1983); Coller e colab., J. Clin. Invest. 73:325 (1983); Coller e colab., J. Clin. Invest, 76:101 (1985); Gartner e colab., Blood, 66:305a (1985). Em vivo contraste, existiu uma completa falta de ligação do MoAb específico da activação PAC 1 às plaquetas Cam activadas por ADP (Fig. 2). Este defeito não era específico para a estimulação por ADP, dado que plaquetas Cam activadas com miristato-acetato de forbol 50 nmol/1 (PMA) também não apresentarem qualquer aumento na fluorescência de PAC 1 (não representado).

Dado que o PAC 1 pode reconhecer o local de ligação do ligando na GPIIb-IIIa, a ausência de ligação do PAC 1 poderia ser devida a uma falha de activação da GPIIb-IIIa, a um defeito na ligação do ligando ou a ambos. Shattil e colab., J. Biol. Chem., 260:11107 (1985); Shattil e colab., Blood. 68:1224 (1986); Taub e colab., J. Biol. Chem.. 264:259 (1989)). Para distinguir estas possibilidades, foi explorada a observação de que pequenos péptidos miméticos do fibrinogénio se ligam à GPIIb-IIIa duma forma independente da activação. (Lam e colab., J. Biol. Chem.. 262:947 (1987); Frelinger e colab., J. Biol. Chem., 263:12397 (1988). A ligação de um tal péptido (GRGDSP) foi analisada pela utilização de PMI-1 e MoAb anti-LIBSl, os quais reconhecem preferencialmente a GPIIb-IIIa numa estequiometria a 1:1 após a ligação de

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-39fibrinogénio ou de ligandos peptídicos pequenos (Frelinger e colab., J. Biol. Chem.. 263:12397 (1988)). As plaquetas de um indivíduo normal mostraram um aumento de 2,5 vezes na ligação de PMI-1 na presença de GRGDSP a 200 gmol/1 (intensidade de fluorescência média de plaquetas não tratadas = 60 unidades arbitrárias de fluorescência; plaquetas tratadas com GRGDSP = 151 unidades de fluorescência). Em contraste, as plaquetas Cam não apresentaram qualquer aumento da ligação de PMI-1 em resposta ao GRGDSP (intensidade de fluorescência média de plaquetas não tratadas = 102 unidades de fluorescência; plaquetas tratadas com GRGDSP = 107 unidades de fluorescência) (Fig. 2).

Deverá referir-se que a ligação de PMI 1 a plaquetas Cam não tratadas foi maior do que as normais sugerindo que a ligação do PMI-1 não pode ser utilizada como um indicador de confiança para a ligação do GRGDSP às plaquetas Cam. Contudo, o anticorpo anti-LIBSl foi mais informativo neste aspecto. Tal como mostrado na Fig. 2, as plaquetas Cam não tratadas ligaram menos anti-LIBSl do que as plaquetas de controlo (fluorescência média de 27 e 58 U, respectivamente). 0 péptido mimético do fibrinogénio, GRGDSP, provocou um aumento de quatro vezes na ligação do anti-LIBSl às plaquetas normais (fluorescência média, 205 U); contudo, não foi observado qualquer aumento na ligação do anticorpo às plaquetas Cam (fluorescência média, 25 U). A ligação do anti-LIBSl às plaquetas Cam também não conseguiu aumentar quando as plaquetas foram tratadas com outro péptido gama (402-411) mimético do fibrinogénio (400 μιιιοί/ΐ) , em vez do GRGDSP (plaquetas de controlo, 201 unidades de fluorescência; plaquetas Cam, 31 U) (Kloczewiak e colab., Biochem. Biophvs. Res. Commun.. 107:181 (1982); Plow e colab., J. Biol. Chem., 259:5388 (1984)).

Quando a ligação do anti-LIBSl foi examinada ao longo de uma gama de concentrações do péptido GRGDSP, as plaquetas de controlo apresentaram um aumento saturável na ligação do anticorpo, de modo que foi observada uma expressão semi-máxima do epitopo de LIBS1 na GPIIIa a uma concentração do péptido de 20 /zmol/1. Isto é semelhante à ICgg deste péptido para a ligação do fibrinogénio às plaquetas activadas (Plow e colab., Proc.

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Natl. Acad. Sei USA. 82:8057 (1985)). Em contraste, a 20 gmol/l de GRGDSP a ligação do anti-LIBSl às plaquetas Cam foi menor do que a observada com as plaquetas de controlo na presença de péptido a 1 Mmol/l, sugerindo que a afinidade da GPIIb-IIIa Cam por este péptido é pelo menos 200 vezes menor do que a da GPIIb-IIIa normal. Ver Tabela 2.

Tabela 2
Relação entre a dose do péptido GRGDSP e JL do LIBS-1 em plaquetas normais e Cam	a expressão
ΓGRGDSP1 (uMI	Aumento na Normal	Fluorescência I
2	20	3
4	31	3
10	48	3
40	70	3
200	106	6

* A ligação do Anti-LIBSl foi determinada na presença das concentrações indicadas do péptido GRGDSP

4. Isolamento e Radio-iodacão de Superfície de Plaquetas Os dados precedentes, pela utilização de anticorpos específicos de conformação e de células intactas, indicaram que a variante Cam é devida, pelo menos em parte, a uma deficiência no reconhecimento do ligando pela GPIIb-IIIa. Para examinar directamente a função de ligação do ligando da GPIIb-IIIa Cam, extractos de plaquetas marcadas com ¹²⁵i à superfície foram submetidos a cromatografia de afinidade utilizando um péptido RGD imobilizado.

As plaquetas foram isoladas a partir de sangue humano anticoagulado com citrato-dextrose ácido por centrifugação diferencial seguida por filtração em gel em Sepharose 2B (Ginsberg e colab., Blood, 69:58 (1987)). Os lisados de plaquetas marcadas na superfície foram analisadas por cromatografia de afinidade com KYGRGDS tal como descrito por Lam e colab., J. Bi-

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-41ol. Chem.. 262:947 (1987). Resumidamente, as plaquetas intactas foram radio-iodadas pelo processo da lactoperoxidase-H₂0₂, de seguida ressuspensas até 2 x 10θ plaquetas/ml e solubilizadas em tampão de lise contendo ácido N-2-hidroxietilpiperazino-N'-2-etanossulfónico (HEPES) 10 mmol/1, pH 7,5, NaCl 0,15 mol/1, CaCl₂ 1 mmol/1, MgCl₂ 1 mmol/1, leupeptina 0,1 mmol/1, fluoreto de fenilmetanossulfonilo (PMSF) 1 mmol/1, N-etilmaleimida 10 mmol/1 e octilglucósido 50 mmol/1. Os lisados foram incubados a 4°C durante 12 horas com KYGRGDS acoplado a Sepharose activado com CNBr, lavados, e eluídos com GRGDSP a 1 mmol/1. Sob estas condições, aproximadamente 10% da GPIIb-IIIa normal é ligada e eluída. Uma quantidade comparável é ligada por recromatografia da fracção que atravessa a coluna, indicando que uma ligação inferior a 100% é devida à baixa afinidade da interacção em vez de a uma subpopulação de GPIIb-IIIb inactiva.

Quando as plaquetas normais marcadas na superfície passaram sobre a matriz peptídica KYGRGDS seguida pelo péptido GRGDSP, a GPIIb e a GPIIIa ligaram-se e eluiram. Em contraste, com as plaquetas Cam a referida GPIIb-IIIa não eluíu, apesar do extracto de partida conter quantidades comparáveis de GPIIb-IIIa marcada na superfície. 0 teor em GPIIb-IIIa no material de partida e nas fracções da coluna foi quantificado pela utilização de um anticorpo anti-GPIIb-IIIa policlonal num ensaio ELISA. O extracto de controlo continha 332 /zg; o Cam individual continha 240 /zg no extracto de partida. As fracções eluídas a partir do extracto de controlo continham 20 /zg de GPIIb-IIIa. Em contraste, aquelas do extracto Cam continham 2,6 μg. Consequentemente, a GPIIb-IIIa Cam apresenta uma deficiência no reconhecimento de ligandos tais como os peptidos RGD.

5. Doentes

A variante Cam da trombastenia de Glanzmann foi descrita em detalhe (Ginsberg e colab., J. Clin. Invest, 78:1103 (1986)). Os doentes com esta variante possuem quantidades quase normais de GPIIb-IIIa, ligação do fibrinogénio às plaquetas indetectável, e agregação de plaquetas ausente. Os presentes resultados foram obtidos em dois irmãos macho afectados com resultados idênticos.

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Uma mulher de 58 anos de idade que notou aumento de facilidade de formação de equimoses em 1984, foi identificada como apresentando doença mieloproliferativa (MPD). Os estudos mostraram uma contagem de plaquetas de 1 500 000/μ1 e uma medula óssea com hiperplasia megacariocitica e mielofibrose. Desde o diagnóstico que a tendência à formação de equimoses foi constante, primeiramente envolvendo as extremidades e a parede torácica anterior, e epistaxe ocasionais. Apresentou quatro episódios de hemorragia gastrintestinal, cada um deles necessitando de transfusão com 2 a 5 unidades (U) de eritrócitos. Antes do início da tendência à formação de equimoses vários desafios hemostáticos, incluindo amigdalectomia, hemorroidectomia e coccigectomia, bem como três partos por via vaginal sem complicações. O exame fisico habitual foi normal excepto por hepatoesplenomegália e equimoses generalizadas. Achados laboratoriais recentes: hematócrito 33%, contagem de leucócitos 29 600/μ1 com 27 neutrófilos, 18 bastões, 12 metamielócitos, 11 mielócitos, 8 blastos, 2 monócitos, 21 linfócitos, 7 basófilos e 6 eritrócitos nucleados. A doente apresentava um tempo de hemorragia anormal >20 minutos, um perfil de coagulação normal (tempo de protrombina, tempo de tromboplastina parcial activada, tempo de trombina e produto de degradação da fibrina) e um painel de von Willebrand normal (actividade do cofactor da ristocetina e antigénio de von Willebrand, e distribuição dos multímeros de von Willebrand normal). Os estudos da agregação de plaquetas, executados enquanto não tomava medicação, revelaram agregação ausente a 10 e 100 /imol/1 de adenosina difosfato (ADP), 50 /imol/1 de epinefrina e colagénio.

A Agregação de Plaquetas Diminuída num Doente com Mielofibrose é Causada por um Defeito na Activação da GPIIb-Illa

Em seguida esta estratégia foi aplicada à caracterização de um doente com mielofibrose e um defeito adquirido grave na agregação de plaquetas. As plaquetas deste doente (MPD) não expressaram locais de ligação de PAC 1 quando estimuladas com 10 /im de ADP (Fig. 3) ou 50 jLtmol/l de epinefrina (não representado) indicando um defeito na activação da GPIIb-IIIa ou na ligação do

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-43ligando

Em contraste com o doente Cam, os sinais de anti-LIBSl e PMI-l na presença e na ausência de GRGDSP foram semelhantes aos do controlo normal (Fig. 3), indicando função de ligação do ligando intacta. Além disso, o PAC 1 liga as plaquetas MPD em resposta ao PMA, o qual rodeia as vias mediadas por receptor normais ao activar directamente a proteína quinase C. As plaquetas do doente também exibiam secreção normal de grânulos α em resposta ao PMA, tal como evidenciado pela expressão à superfície da proteína do grânulo α trombospondina. O defeito de agregação nas plaquetas do doente não pode ser revestido por suspensão das suas plaquetas em plasma normal, e o defeito não pode ser induzido em plaquetas normais por incubação no plasma do doente. Deste modo, a GPIIb-IIIa deste doente apresenta o potencial para ligar ligandos RGD, mas parece existir um defeito celular intrínseco na activação mediada por receptor da GPIIb-IIIa.

6. Discussão dos Exemplos 1-5

Durante duas décadas, foram rotineiramente utilizados os estudos da agregação de plaquetas in vitro na caracterização de doentes com um tempo de hemorragia prolongado ou diátese hemorrágica devida a disfunção plaquetária. Os resultados de estudos recentes demonstraram que a agregação normal exige a ligação de fÍbrinogénio à GPIIb-IIIa plaquetária. Além disso, o processo de agregação pode ser visto como uma série de acontecimentos celulares necessários: (a) activação da GPIIb-IIIa induzida por agonista, tendo como consequência a exposição do local da ligação do fÍbrinogénio; (b) ligação do fíbrinogénio; e (c) acontecimentos de pós-ocupação que ocorrem após a ligação do ligando (Fig. 1). Com base na abordagem por citometria de fluxo anteriormente descrita, é possível classificar as desordens da agregação de plaquetas em função desta série de acontecimentos. 0 processo da citometria de fluxo aqui utilizado é rápido e pode ser executado com plasma rico em plaquetas ou com sangue total. Esta abordagem foi tornada possível pela disponibilidade de MoAb que conseguem fazer a distinção entre as formas em repouso,

F73 371

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-44activada e ocupada por ligando da GPIIb-IIIa. Os três tipos de disfunção plaquetária que podem conduzir a agregação de plaquetas reduzida e os resultados previstos da citometria de fluxo encontram-se resumidos na Tabela 3.

Tabela 3

Análise por Citometria de Fluxo da Disfunção da Agregação de Plaquetas

Tipo de Defeito Nenhum Activação Ligação do Ligando Pós-Ocupação

AGG^a +

Resposta

PAC l^b + + ou anti-LIBS l^c +

+ + ou Resposta positiva (+) ou negligível (-) ^a Agregação de plaquetas estimulada por agonista ^b + = ligação aumentada do ligando dependente de activação (Anticorpo PAC 1) em resposta ao agonista ^c + = ligação aumentada do anticorpo dependente de ocupação (anti-LIBS 1) na presença do ligando independente de activação GRGDSP

Utilizando esta abordagem, verificou-se que uma variante da trombastenia de Glanzmann é devida a um defeito na função de ligação do ligando da GPIIb-IIIa e que a agregação acentuadamente diminuída de um doente com mielofibrose é devida a um defeito na activação da GPIIb-IIIa específica do agonista.

Embora um doente apresentando uma disfunção de pós-ocupação não seja aqui identificado, os doentes apresentando a referida desordem podem ser subsequentemente identificados. Os defeitos de pós-ocupação podem explicar o processo de dessensibilização.

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-45Por exemplo, plaquetas não agitadas activadas durante mais de 10 minutos com ADP ou epinefrina na presença de fibrinogénio mostram uma marcada redução na sua resposta de agregação subsequente quando comparada com a das mesmas plaquetas incubadas sem fibrinogénio. (Peerschke e colab., Blood, 57:663 (1981); Shattil e colab., Blood. 68:1224 (1986)). Isto não pode ser explicado por uma redução na ligação do fibrinogénio. Na prática clínica são encontrados muitos doentes com formação fácil de equimoses, um tempo de hemorragia prolongado e uma diminuição na agregação de plaquetas em resposta a um ou mais agonistas. Após a exclusão de ingestão de aspirina e de doença de armazenamento, a causa subjacente é geralmente não aparente. Este grupo de indivíduos é muitas vezes referido como apresentando defeitos do tipo da aspirina, e alguns podem apresentar defeitos metabólicos das plaquetas, congénitos ou adquiridos, conduzindo a uma anomalia da activação da GPIIb-IIIa. Parece provável que entre este grupo heterogéneo de doentes, também possam ser identificados indivíduos com o fenotipo de disfunção pós-ocupação.

A variante Cam da trombastenia parece ser primariamente devida a um defeito no reconhecimento do ligando pela GPIIb-IIIa. Esta conclusão é baseada (1) na falha da GPIIb-IIIa Cam para ligar um péptido RGD insolubilizado e (2) numa redução superior a 200 vezes na capacidade dos ligandos peptídicos independentes de activação para aumentar a ligação do anticorpo anti-LIBSl dependente de ocupação. Estudos anteriores com fragmentos proteolíticos do fibrinogénio e péptidos relacionados com a fibrina implicam o reconhecimento das sequências peptídicas da cadeia gama de fibrinogénio e RGD na ligação do fibrinogénio. (Kloczewiak e colab., Biochem. Biophvs. Res. Commun., 107:181 (1982)); Plow e colab., J. Biol. Chem. . 259:5388 (1984); Plow e colab., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 82:8057 (1985); Ginsberg e colab., J. Biol. Chem.. 260:3931 (1985). No presente estudo, a GPIIb-IIIa sem a capacidade de ligar estas sequências peptídicas perde a capacidade para suportar a ligação do fibrinogénio e a agregação de plaquetas. Considerando a aparente herança autossómica recessiva da variante Cam, o grave defeito funcional na GPIIb-IIIa, e o defeito funcional intermediário dos progenitores, é provável que

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-46o defeito Cam básico seja devido a uma mutação pontual na GPIIb-IIIa (Ginsberg e colab., J. Clin, Invest., 78:1103 (1986)). A referida mutação pontual foi recentemente identificada num doente Cam (Loftus e colab., Blood. 74:58A, supl. 1 (1989)). A observação de que esta única troca de aminoácido conduz à perda da ligação das sequências peptídicas da cadeia gama e do RGD é a favor da possibilidade de ambas as sequências peptídicas serem reconhecidas por um local de ligação comum (Lam e colab., J. Biol. Chem.. 263:12397 (1988)).

anticorpo PAC1 foi utilizado para monitorizar a activaçâo da GPIIb-IIIa dado que se liga selectivamente e com afinidade elevada às plaquetas estimuladas. (Plow e colab., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 82:8057 (1985)). Além disso, com base na inibição da ligação do PAC1 pelo fibrinogénio e por péptidos miméticos do fibrinogénio e na capacidade dos péptidos derivados da região hipervariável do PAC1 inibirem a ligação do fibrinogénio, é provável que este anticorpo reconheça o local de ligação do ligando na GPIIb-IIIa. (Shattil e colab., Blood. 73:150 (1989); Bennett e colab., J. Biol. Chem., 263:12948 (1988); Taub e colab., J. Biol. Chem. . 264: 259 (1989)). Esta hipótese é fortemente apoiada pela verificação de que o PAC1 não reconhece a GPIIb-IIIa mutante Cam, a qual carece da função de ligação do ligando. É improvável que a deficiência do PAC1 para interagir com as plaquetas Cam seja devida a uma desnaturação bruta da GPIIb-IIIa, dado que quatro outros anticorpos anti-GPIIb-IIIa específicos do complexo parecem ligar na mesma extensão que os anticorpos anti-GPIIb ou anti-GPIIIa. Destes quatro anticorpos, o 7E3 liga mais rapidamente células activadas e o A₂A₉ é inibido por péptidos sintéticos derivados da cadeia gama do fibrinogénio (Coller e colab., J. Clin. Invest.. 76:101 (1985)); Bennett e colab., J. Biol. Chem.. 263:12948 (1988)). Dado que a GPIIb-IIIa Cam carece da capacidade de reconhecer o fibrinogénio ou os ligandos peptídicos, parece provável que as verificações anteriores sejam devidos a um relacionamento indirecto entre os epitopos do 7E3 e A₂A_g e o local de ligação do ligando da GPIIb-IIIa.

A GPIIb-IIIa é um membro da família das Integrinas de re73 371

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-47ceptores da adesina estruturalmente relacionados. (Hynes e colab. , Cell, 48:549 (1987); Pytela e colab., Science, 231:1559 (1986); Ginsberg e colab., J. Biol. Chem.. 262:5437 (1987); Charo e colab.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 83:8351 (1986)). Estão incluídos nesta família um receptor do colagénio de plaquetas, receptores de leucócitos envolvidos na inflamação e defesa contra a infecção piogénica, e receptores envolvidos na orientação de linfócitos. (Staatz e colab., J. Cell Biol., 108:1917 (1989); Anderson e colab., Annu. Rev. Med.. 38:175 (1987); Holzmann e colab., Cell, 56:37 (1989)). No caso dos receptores de leucócitos, estudos recentes relataram que a activação destes receptores induz a agregação de leucócitos e a aderência às células endoteliais (Harlan e colab., Blood, 66:167 (1985)). Além disso, foram preparados MoAb dependentes da ocupação contra uma integrina das células endoteliais (Frelinger e colab., J. Biol. Chem., 265:6346 (1990)). Isto sugere que anticorpos específicos da activação e dependentes da ocupação podem ser preparados contra outras Integrinas e podem ser utilizados para analisar a disfunção de leucócitos duma forma análoga à aqui descrita para a GPIIb-IIIa. Na realidade, estas estratégias também deveriam permitir a análise rápida das funções de ligação de receptores não-integrinas.

7. Preparação de Anticorpos Anti-LIBS A. Isolamento da GPIIb-IIIa (1) Isolamento das Plaquetas

Sessenta mililitros (ml) de sangue humano total foram recolhidos em 5 ml de ACD (ácido cítrico 0,65 M, citrato de sódio 0,085M, dextrose a 2%) contendo hirudina (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) a uma concentração final de 0,06 unidades por mililitro (U/ml), e centrifugados durante 15 minutos a 120xg. 0 sobrenadante resultante, designado por plasma rico em plaquetas (PRP), foi recuperado, isolado e adicionalmente centrifugado durante 15 minutos a 1200xg para formar uma pelota das plaquetas isoladas. 0 sobrenadante formado foi recolhido e utilizado noutros ensaios como plasma pobre em plaquetas.

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(2) Isolamento da GPII-IIIa a partir das Plaquetas

Uma pelota de plaquetas preparada como no Exemplo 7A(1), foi ressuspensa em 5 ml de TBS (NaCl O,15M, Tris 0,2M, pH 7,4, CaCl₂ 0,5 mM, leupeptina 0,01 mM) e sonicada em gelo durante 10 minutos com um ajustamento máximo utilizando um sonicador Modelo W-375 (Heat Systems Ultrasonics, Plainview, NY). A suspensão sonicada foi congelada e descongelada duas vezes utilizando um banho de gel seco-metanol gelado, e armazenada a -20°C. O sonicado de plaquetas congelado-descongelado foi colocado numa camada sobre 5 ml de uma solução de sacarose (40% v/v em TBS), e centrifugado a 4’C durante uma hora a 38 000 rotações por minuto (RPM) num rotor de centrífuga SW41 (Beckman Instruments, Fullerton, CA) para formar um infranadante leitoso. O infranadante leitoso foi de seguida recuperado e centrifugado a 43 000 RPM num rotor de centrífuga SW50.1 (Beckman) a 4°c durante uma hora. A pelota resultante foi ressuspensa, tipicamente, em 1-2 ml de TBS para formar uma solução de membrana de plaquetas, cuja concentração proteica foi determinada como estando na gama de 10-25 mg/ml, utilizando o Bio-Rad Protein Assay Kit (Bio-Rad, Richmond, CA) de acordo com as instruções do fabricante.

A solução de membrana de plaquetas foi novamente centrifugada num rotor de centrífuga SW50.1 como anteriormente, e a pelota resultante foi ressuspensa em 2 ml de tampão de extracção (Tris 0,03M, pH 7,4, leupeptina 0,01 mM, n-octil-beta-D-glucopiranósido 200 mM; Calbiochem-Behring, La Jolla, CA). 0 extracto de membrana de plaquetas assim formado foi cuidadosamente misturado por agitação em vórtex e, em seguida, foi mantido à temperatura ambiente durante 30 minutos. O extracto foi seguidamente centrifugado a 45 000 RPM num rotor de centrífuga SW50.1 durante 1 hora a 4°C, e foi recuperado o sobrenadante do extracto de membrana de plaquetas assim formado.

sobrenadante recuperado foi aplicado a uma coluna de filtração de gel LKB Ultrogel Aca 34 (3 x 97 cm, LKB Instruments,

Gaithersburg, MD) que tinha sido equilibrada com 1 litro de tampão de coluna (Tris 0,03M, pH 7,4, CaCl₂ 0,1 mM, n-octil-be73 371

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ta-D-glucopiranósido a 0,1%), e foram recolhidas fracções de 5 ml a partir do efluente de coluna resultante. Foi determinada a densidade óptica a 280 nanómetros de cada fracção, e as fracções em torno dos diversos picos foram combinadas para formar uma combinação para cada pico. Foram analisadas amostras de cada combinação por electroforese em pranchas de geles de poliacrilamida a 6% utilizando os tampões redutores e os processos descritos por Laemmli, Nature (Londres), 227:680-685 (1970), e padrões proteicos de baixa massa molecular variando em tamanho desde 14,4 quilodaltons (KDa) até 92,5 KDa (Bio-Rad, Richmond, CA). Foi recuperada a combinação contendo predominantemente duas espécies proteicas possuindo pesos moleculares correspondendo a GPIIb e GPIIIa, isto é, 120 KDa e 100 KDa, respectivamente. A concentração proteica da preparação de GPIIb-IIIa isolada assim preparada foi tipicamente determinada, utilizando os Bio-Rad Protein Assay Kits, como situando-se na gama de 0,3 a 0,8 mg/ml.

(3) Isolamento da GPIIb-IIIa por Afinidade Polipeptidica

A síntese do péptido da fórmula Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys foi conseguida utilizando a técnica de Merrifield, J. Am. Chem. Soc.. 85:2149-54 (1963) ou ele foi adquirindo em Península Laboratories (Belmont, CA). Todos os péptidos eram mais de 90% homogéneos guando analisados por cromatografia líquida de elevado rendimento (HPLC) utilizando uma coluna bondapak C₁₈ e um gradiente linear de acetonitrilo de 0-60% em ácido trifluoroacêtico a 0,1%. Foram preparadas matrizes de afinidade contendo o péptido Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys imobilizado por acoplamento do péptido a Sepharose 4B activado com brometo de cianogénio (Pharmacia P-L Biochemicals, Piscataway, NJ) de acordo com as instruções do fabricante. A matriz de afinidade contendo o péptido imobilizado foi empacotada em colunas (0,7 x 15 cm) e equilibrada com PBS a pH 7,5 contendo octilglucosido 50 mM, fluoreto de fenilmetanossulfonilo (PMSF) 1 mM, CaCl2 1 mM e MgCl2 1 mM a 4°C. 0 sobrenadante do extracto de membrana de plaquetas, preparado de acordo com o Exemplo 7A(2), foi aplicado à matriz de afinidade contendo Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys. As proteínas não ligadas foram eluídas com 100 ml de PBS a pH 7,5 contendo octil73 371

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-50glucosido 25 mM, PMSF 1 mM, CaCl₂ 1 mM e MgCl₂ 1 mM (tampão de coluna). A GPIIb-IIIa ligado foi então eluída por lavagem da coluna com 10 ml de tampão de coluna contendo o péptido designado a uma concentração de 1,7 mM, seguidos por outros 10 ml de tampão de coluna. Foram recolhidas fracções de 2,5 ml cada, e as proteínas de cada fracção foram analisadas por electroforese sobre geles de dodecilsulfato de sódio-poliacrilamida (7,5%) após redução com 2-mercaptoetanol a 10%. As bandas proteicas foram visualizadas por coloração com azul de Coomassie de acordo com os processos descritos em Current Protocols in Molecular Biology. Ausubel e colab., ed., John Wiley and Sons, NY, 1987.

(4) Isolamento da GPIIb-IIIa por Imunoafinidade Foi preparada uma coluna de imunoafinidade por acoplamento do anticorpo PMI-1 (o qual liga a GPIIb, ATCC, Rockville, MD), a Affi-Gel 10 (Biorad, Richmond, CA), a 4 mg de anticorpo por ml de resina utilizando as instruções fornecidas pelo fabricante da resina activada. As plaquetas preparadas de acordo com o Exemplo IA (6 χ 10¹⁰) foram lisadas em 1 ml de octilglucosido 50 mM num tampão de coluna constituído por N-[2-hidroxietil]piperazino-N-[ácido 2'etanossulfónico] (HEPES) 10 mM, CaCl₂ 1 mM, MgCl₂ 1 mM, NaCl 0,15 M, fluoreto de fenilmetanossulfonilo (PMSF) a 1 mg/ml, N-etilmaleimida a 1,25 mg/ml e leupeptina a 0,1 mg/ml. 0 material insolúvel foi removido por centrifugação a 45 000 RPM num rotor SW50.1 durante 1 hora a 4°C. 0 sobrenadante designado como lisado de plaquetas, foi recolhido, o péptido Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro (GRGDSP) foi misturado a 1 mM e, em seguida, misturado com 2 ml de anticorpo-Affi-Gel 10 e mantido durante 12 a 18 horas a 4°C. Esta mistura foi de seguida colocada numa coluna e lavada com 10 volumes de coluna de tampão de coluna contendo 1 mM do péptido Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro e octilglucosido 25 mM, e eluída com cinco volumes de coluna de tampão de coluna a pH 5 contendo octilglucosido 25 mM e nenhum péptido. As fracções eluídas foram neutralizadas imediatamente até pH 7,2, reunidas e dialisadas contra tampão de coluna contendo octilglucosido 5 mM. A concentração proteica da preparação de GPIIb-IIIa isolada assim preparada foi determinada utilizando o Bio-Rad Protein Assay Kit.

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-51B. Preparação de Composições de Anticorpo Monoclonal

Foram produzidos anticorpos monoclonais que activavam a GPIIb-IIIa e imunorreagiam com um local de ligação induzido por ligando na GPIIb-IIIa, utilizando tecnologia comum de hibridoma com excepções como anotado. Resumidamente, dois ratinhos Balb/c foram imunizados quatro vezes, intraperitonealmente, com intervalos de uma semana com doses crescentes (1 μg_/ 10 μg, 25 μg, 50 μg e 100 μg_l respectivamente) de imunogénio, composto pelo complexo ligando-receptor constituído pela GPIIb-IIIa isolada por afinidade, tal como preparada no Exemplo 7A(3) (1,25 mg/ml) e pelo péptido Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro a 3 mg/ml. O imunogénio foi diluído a 1:1 em Adjuvante Completo de Freund para a primeira imunização, em Adjuvante Incompleto de Freund para as segunda e terceira imunizações, e em solução salina normal para a quarta. Três dias depois da quarta imunização cerca de 1 χ 10⁸ linfócitos foram isolados a partir dos baços de ambos os ratinhos, misturados numa suspensão e fundidos com 5 χ 10⁷ células de mieloma de ratinho P3X63AG8.053 utilizando PEG 1500 a 50% como promotor da fusão celular. As células produtoras de anticorpo transformadas (fundidas) resultantes (hibridomas) foram inicialmente transferidas para placas de microtitulação de 96 cavidades, a uma densidade de cerca de 1 χ 10⁶ células por cavidade, e cultivadas em meio HAT selectivo.

Os sobrenadantes da cultura de tecido de cerca de 2 000 cavidades parecendo conter células de hibridoma viáveis, resistentes ao HAT, após 8 dias de cultura, foram examinadas no ensaio ELISA descrito no Exemplo 7C(1) quanto à presença de moléculas de anticorpo que imunorreagissem com a GPIIb-IIIa imobilizada em plástico. Foram identificadas cerca de 44 culturas de hibridoma que produziam moléculas de anticorpo que imunorreagiam com a GPIIb-IIIa. Os hibridomas isolados foram de seguida subclonados duas vezes a diluições limitativas para proporcionarem cerca de 1 célula por cavidade. Vinte e quatro das culturas de hibridoma resultantes mostraram ser de origem monoclonal com base em três critérios: (1) cada sobrenadante provinha de um único foco celular e imunorreagia com a GPIIb-IIIa na análise ELISA, (2) cada sobrenadante apresentava uma única

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banda homogénea quando analisado por electroforese em geí de acetato de celulose de acordo com o processo descrito em Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, J. W. Goding, ed., Academic Press, Inc., Orlando, Florida, 1983, e (3) cada sobrenadante continha um único isotipo de imunoglobulina quando analisado utilizando o Mouse Ig Screening and Isotyping Kit” de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante, Boehringer-Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana. Os resultados das análises de isotipo de alguns dos sobrenadantes de hibridoma caracterizados estão representados na Tabela 4.

TABELA 4

Modulação de GRGDSP da Expressão do Epitopo do LIBS em ELISA para Identificar o Anticorpo Monoclonal anti-LIBS

B/B_o ^b

Especificidade % de

MAb	de subunidade	Isotino	-	+	diminuição
LIBSa	GPIIIa	G-jJK	0,61	0,32	48
LIBSb	GPIIIa	G2aK	0,62	0,35	44
LIBSc	GPIIIa	GiK	0,45	0,21	53
LIBSd	GPIIIa	G2bK	0,79	0,62	22
LIBSe	GPIIIa	GjK	0,82	0,52	37
LIBSf	GPIIIa	ND3	0,29	0,17	41
LIBSg	GPIIIa	ND	0,64	0,51	20
LIBSh	GPIIIa	G2aK	0,38	0,28	26
LIBSi	GPIIIa	G2aK	0,22	0,17	23
PMI-2®	GPIIIa	G2aK	0,58	0,46	21
Mabl5	GPIIIa	G1K	0,25	0,23	8
Mabl9	GPIIIa	MK	0,32	0,32	0
Mab23	GPIIIa	G2aK	0,17	0,15	12
LIBSj	hGPIIb	MK	0,90	0,70	22
PMI-le	hGPIIb	G2bK	0,98	0,36	63
Mabl3	hGPIIb	G1K	0,61	0,51	16
MablO	hGPIIb	G±K	0,84	0,79	6
Mabl8	lGPIIb	MK	0,40	0,34	15
Mablõ	lGPIIb	MK	0,54	0,47	13
Mab5	lGPIIb	MK	0,66	0,64	3
LIBSk		G-jK	0,80	0,59	26
Mab38		GXK	0,82	0,69	16
Mab51		ND	0,76	0,73	4

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^a A especificidade de subunidade foi determinada por transferência de Western tal como descrito no Exemplo 7B.

^b Β/Βθ indica a razão entre a absorvância medida a A490 na presença (B) de lisado de plaquetas (equivalente a 5 χ 10⁸ plaquetas/ml) e a absorvância medida a A490 na ausência do lisado (Βθ). A razão Β/Βθ foi determinada na presença (+) de GRGDSP (1 mM) e na ausência (-) de GRGDSP.

^c Uma alteração em Β/Βθ por adição de GRGDSP indica a presença de um LIBS. Considerou-se os anticorpos como sendo anti-LIBS se a percentagem de alteração em Β/Βθ era superior a 20%.

ND = não determinado.

^e PMI-1 e PMI-2 foram produzidos numa fusão e imunização distintas utilizando membranas de plaquetas como o imunogénio, tal como descrito por Shadle e colab., J. Cell Biol.. 99:

:2056-60 (1984), e foram examinados quanto a actividade anti-LIBS tal como aqui descrito.

processo de análise anterior originou a identificação de hibridomas que produzem moléculas de anticorpo que imunorreagem com a GPIIb-IIIa imobilizada em plástico.

Para identificar os hibridomas que produzem moléculas de anticorpo que imunorreagem com um local de ligação induzido por ligando (LIBS) na GPIIb-IIIa (isto é, um LIBS da GPIIb-IIIa), foi efectuada uma análise ELISA de competição tal como descrita no Exemplo 7C(2) aqui descrito em seguida, na qual a mistura de imunorreacção foi mantida na presença e na ausência de um ligando específico da GPIIb-IIIa para expressar um LIBS da GPIIb-Illa. Moléculas de anticorpo anti-LIBS da GPIIb-IIIa são aquelas que exibem uma maior afinidade de imunorreacção com a GPIIb-Illa quando medida na presença de um ligando específico da GPIIb-IIIa em comparação com a sua medida na ausência de ligando específico, de modo que a maior afinidade representa uma alteração na razão da absorvância a 490 nm (Β/Βθ) superior a 20% quando

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SCRF 199.0 POR —54 — medida na presença (tal como comparado com a ausência) do ligando específico da GPIIb-IIIa.

Do grupo de vinte e dois hibridomas da Tabela 4 foram identificados doze hibridomas que produzem moléculas de anticorpo que imunorreagem com o LIBS da GPIIb-IIIa, e os hibridomas são aqui designados como LIBSa-LIBSm, tal como representado na Tabela 4.

Além disso, observou-se que, pelos processos descritos, foram isoladas outras moléculas de anticorpo anti-LIBS, tal como representadas na Tabela 4, que imunorreagem com outros epitopos de LIBS presentes nas subunidades GPIIb ou GPIIIa do receptor de plaquetas.

São particularmente preferidos os anticorpos que exibem afinidade aumentada para imunorreacção com um epitopo LIBS tal como detectado na Tabela 4. São estes os anticorpos que exibem alteração na B/B_o, por adição do ligando específico, superior a 25%, preferivelmente 30% e mais preferivelmente 40%.

As localizações dos LIBS das GPIIb-IIIa particulares detectados pelos anticorpos monoclonais representados na Tabela 4 foram mapeadas nas regiões das subunidades do receptor das plaquetas por imunotransferência de Western de acordo com os processos gerais descritos por Tobwin e colab., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 76:4350-54 (1979). Resumidamente, a GPIIb-IIIa isolada no Exemplo 7A(2) foi submetida a electroforese em geles de SDS poliacrilamida a 7,5% (SDS-PAGE) sob condições redutoras, foi transferida para uma membrana e feita imunorreagir com sobrenadantes dos hibridomas representados na Tabela 4. Os produtos de imunorreacção formados entre os anticorpos monoclonais proporcionados nos sobrenadantes de hibridoma e as subunidades da proteína da GPIIb-IIIa nas membranas, foram detectados utilizando anticorpo secundário biotinado e peroxidase conjugada com avidina de acordo com as instruções do fabricante (Vectastain ABC Method, Vector Laboratories, Burlingame, CA).

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Os resultados do mapeamento por imunotransferêncíà de Western mostraram que a maior parte dos sobrenadantes de hibridoma continham moléculas de anticorpo que imunorreagiam com uma proteína possuindo uma massa molecular aparente na SDS-PAGE de 120 quilodaltons (KDa), 20 KDa ou 100 KDa, correspondendo à cadeia pesada da GPIlb (hGPIIb), cadeia leve da GPIlb (lGPIIb) ou GPIIIa, respectivamente. Em alguns casos, as moléculas de anticorpo não reagiram com qualquer das subunidades de GPIIb-IIIa isoladas, deixando a sua especificidade de subunidade não caracterizada. As especificidades de subunidade determinadas estão representadas na Tabela 4.

Assim, observou-se que a molécula de anticorpo monoclonal produzida por exemplo pelo hibridoma LIBSa, cuja molécula de anticorpo é também aqui designada como LIBSa e como LIBS1, imunorreage com a subunidade GPIIIa do receptor de plaquetas da GPIIb-Illa. Além disso, a molécula de anticorpo LIBSa imunorreage com o epitopo de LIBS1 presente num complexo ligando-receptor constituído pela GPIIb-IIIa e por um ligando específico da GPIIb-IIIa.

As composições de anticorpo monoclonal constituídas por moléculas de anticorpo isoladas também foram preparadas por isolamento das moléculas de anticorpo a partir do fluido ascítico de um ratinho contendo uma das linhas de células de hibridoma representadas na Tabela 4 utilizando proteína A-Sepharose tipicamente obtido em Pharmacia Inc. (Piscataway, NJ) e utilizado de acordo com as instruções do fabricante.

A concentração proteica das composições de molécula de anticorpo isoladas, como necessário, foi determinada utilizando o Bio-Rad Protein Assay Kit (Bio-Rad, Richmond, CA), de acordo com as instruções do fabricante.

Para preparar uma composição de anticorpo monoclonal contendo moléculas de anticorpo marcadas com ¹²⁵I, 350 microlitros (/il) de PBS (NaCl 0,15M, fosfato de sódio O/LM, pH 7,09) contendo miligrama por mililitro (mg/ml) das moléculas de anticorpo

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anteriormente isoladas, foram misturados com 40 microgramas (Mg) de cloramina-T e 1 miliCurie (mci) de Na¹²⁵I isento de portador (Amersham, Arlington Heights, IL). A mistura resultante foi mantida durante 5 minutos a cerca de 20°C e, em seguida, foi misturada com 20 μΐ de uma solução de metabissulfito de sódio a 2 mg/ml e 20 μΐ de uma solução de solução de iodeto de potássio. Em seguida, foram misturados 800 μΐ de PBS contendo BSA a 1%, seguidos pela mistura adicional de fluorofosfato de diisopropilo até uma concentração final de 10 mM. A mistura resultante foi mantida durante 60 minutos a 22°C e, em seguida, foi dialisada contra PBS. A actividade específica das moléculas de anticorpo marcadas com ¹²⁵I foi de cerca de 4,5 microCurie (gCi) por μg.

Foram preparadas composições contendo fragmentos Fab das moléculas de anticorpo anteriormente isoladas por digestão com papaína (200:1, peso por peso, de Ig para a papaína) durante 6 horas a 37°C, de acordo com os processos de Mage e colab., Methods in Enzvmoloqv. 70:142:150 (1980). Os fragmentos Fc e Ig não digeridos foram removidos por cromatografia em proteína A-Sepharose. As composições resultantes contendo fragmentos Fab encontravam-se, então, prontas para serem utilizadas, ou foram marcadas com ¹²⁵I, quando necessário, utilizando os mesmos processos como anteriormente descritos para as composições de anticorpo monoclonal.

C. Ensaios ELISA (1) ELISA para examinar Anticorpos Monoclonais

Moléculas de anticorpo contidas em sobrenadantes de cultura de hibridoma foram examinadas quanto à sua capacidade para imunorreagirem com a GPIIb-IIIa imobilizada em plástico. Cinquenta microlitros (μΐ) de solução de revestimento (NaHCO₃ 0,lM, pH 8,0, NaN₃ a 0,1%) contendo 10 Mg/ml de GPIIb-IIIa isolada preparada no Exemplo 7A(1), foram misturados nas cavidades de placas de microtitulação de 96 cavidades de fundo plano (Immulon 2; Dynatech Laboratories, Chantilly, VA). As placas foram, de seguida, mantidas durante 60 minutos a 37°C para permitir que a GPIIb-IIIa adsorvesse nas paredes das cavidades. A solução de revestimento foi removida por agitação, as cavidades foram lava73 371

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das duas vezes com tampão de lavagem (Tris 10 mM a pH 7,4, TWEEN-20 a 0,05% (v/v), NaCl 0,15M e mertiolato a 200 mg/ml), e 200 μΐ de solução bloqueadora [albumina de soro de bovino a 5% (BSA; p/v) em solução de revestimento] foram misturados em cada cavidade (suporte sólido) para bloquear os locais proteicos em excesso.

As cavidades foram mantidas a cerca de 37“C durante 60 minutos e, em seguida, a solução bloqueadora foi removida. Cerca de 50 μΐ de sobrenadante de cultura de hibridoma diluído a 1:1 em tampão de diluição constituído por BSA a 0,1% (p/v) em tampão de lavagem, foram adicionados a cada cavidde para formar uma mistura de imunorreacção. As misturas imunorreaccionais de fase sólida/líquida resultantes foram mantidas à temperatura ambiente durante 60 minutos para permitir a formação de um primeiro produto de imunorreacção ligado a fase sólida entre o complexo de ligando-GPIIb-IIIa ligado à fase sólida e os anticorpos misturados. As fases sólida e líquida foram de seguida separadas, as cavidades foram lavadas duas vezes com tampão de lavagem, e o líquido em excesso foi removido por agitação.

Cinquenta μΐ de uma solução contendo IgG de cabra anti-ratinho marcada com peroxidase de rábano silvestre (Tago Inc., Burlingame, CA), diluída a 1:1000 em tampão de diluição, foram misturados em cada cavidade para formar uma segunda mistura imunorreaccional de fase sólida/líquida (marcação da mistura imunorreaccional). As cavidades foram mantidas durante 60 minutos à temperatura ambiente para permitir a formação de um segundo produto de imunorreacção entre o anticorpo marcado e qualquer anticorpo ligado a fase sólida do primeiro produto de imunorreacção e, em seguida, foram lavadas duas vezes com tampão de lavagem para isolar os produtos de imunorreacção contendo marcador ligado à fase sólida. O líquido em excesso foi então removido das cavidades.

Cinquenta μΐ de solução de substrato cromogénico preparado recentemente contendo O-fenilenodiamina a 4,0 mg/ml e peróxido de hidrogénio a 0,012% (v/v) em tampão CP (243 ml de ácido

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citrico O,1M e 250 ml de fosfato de sódio dibásico 0,2M por litro de H₂0, pH 5,0), foram de seguida misturados em cada cavidade para formar uma mistura reaccional de revelação da cor. Após a manutenção da mistura reaccional de revelação da cor durante 10 minutos a cerca de 20°C, foram misturados 50 μΐ de H₂SO₄ 2N em cada cavidade para parar a reacção de revelação, e as soluções resultantes foram analisadas quanto à absorvância a um comprimento de onda de 490 nanómetros (nm) utilizando um leitor de placa de ELISA modelo 310 (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT).

Considerou-se que as composições de molécula de anticorpo continham moléculas de anticorpo imunorreactivo anti-GPIIb-IIIa se a absorvância medida a 490 nm (A490) fosse pelo menos 6 vezes superior à base, isto é, acima de cerca de 0,3 unidades de densidade óptica quando medida a A490.

(2) ELISA de competição para a Detecção de

Anticorpos anti-LIBS

As moléculas de anticorpo contidas nas composições de anticorpo foram examinadas quanto à sua capacidade para imunorreagir com o LIBS da GPIIb-IIIb num ELISA de competição conduzido de forma semelhante ao ELISA descrito no Exemplo 7C(1) com as seguintes excepções como anotado.

Antes de uma composição anticorpo ser adicionada às cavidades de microtitulação revestidas com GPIIb-IIIa, a cada cavidade de microtitulação foram adicionados 20 μΐ de tampão de ensaio ELISA constituído por Tris-HCl 10 mM a pH 7,4, NaCl 0,15M, TWEEN-20 a 0,05% (v/v), mertiolato de sódio a 0,02% (p/v), CaCl₂ 5 mM, MgCl₂ 5 mM e BSA a 0,1% (p/v). Em seguida, 10 μΐ de uma solução contendo lisado de plaquetas a 2 x 10⁷ plaquetas por ml, preparado como no Exemplo 7A(4), foram adicionados a uma série de cavidades e o lisado de plaquetas foi omitido de uma segunda série de cavidades. A ambas as séries, com ou sem lisado de plaquetas, foram adicionados 10 μΐ de uma segunda solução que continha ou 0 ou 5 mM do ligando polipeptidico contendo RGD, GRGDSP, em tampão de ensaio ELISA. Em seguida, a ambas as séries de cavidades foram adicionados 10 μΐ de uma composição de anti-

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-59corpo a 0,3 /xg/ml a uma concentração de anticorpo diluído em tampão de ensaio ELISA de modo a ser o componente limitante na mistura imunorreaccional de ELISA. As concentrações de anticorpo estão presentes como o componente limitante quando foi diluído em tampão de ensaio ELISA para produzir uma densidade óptica a A490 de cerca de 1,0 quando medida utilizando o ensaio ELISA do Exemplo 7C(1) com a excepção de ser utilização o tampão de ensaio ELISA em lugar do tampão de diluição.

Os resultados obtidos em cada mistura imunorreaccional foram medidos quanto à presença de uma reacção de cor revelada como anteriormente. A absorvância medida em cavidades que não continham lisado de plaquetas é designada como Βθ, e a absorvância medida em cavidades que continham lisado de plaquetas é designada como Β. A razão de absorvâncias é calculada para Β/Βθ, e expressa como medida na presença (+) ou na ausência (-) de ligando contendo RGD (GRGDSP). A expressão de uma determinante antigénica críptica de LIBS é determinada calculando a percentagem da diminuição observada em Β/Βθ quando é adicionado ligando à GPIIb-IIIa contida no lisado de plaquetas na mistura imunorreaccional. Uma diminuição na Β/Βθ por adição de ligando que excede 20% indica uma molécula de anticorpo que imunorreage com um epitopo de LIBS. A Tabela 4 apresenta os resultados do ELISA de competição para as moléculas de anticorpo monoclonal preparadas no Exemplo 7B que imunorreagem com a GPIIb-IIIa.

8- Ligação do Fibrinogénio Plaquetas Activadas

O fibrinogénio foi isolado e marcado com ¹²⁵I por processos comuns tal como descritos por Marguerie e colab., J. Biol. Chem. 255:154-161 (1980) para formar ¹²⁵I-Fg. Em seguida, a ligação do 125j__Fg _a plaquetas foi analisada como anteriormente descrito. Marguerie e colab., J. Biol. Chem.. 255:154-161 (1980). A ligação foi iniciada pela mistura de um milhão de plaquetas em repouso na presença e na ausência de adenosina-difosfato (ADP) 10 micromolar, com fibrinogénio radiomarcado a concentrações variáveis desde 0,01 a 1 nanomolar (nM), e incubação a 37°C durante 30 minutos. 0 fibrinogénio ligado foi separado do fibrinogénio livre por centrifugação da mistura de plaquetas-fibrinogénio

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através de 0,3 ml de sacarose a 20%, e a quantidade de fibrinogénio radiomarcado associado com a pelota celular foi determinada por detecção gama.

Observou-se que a adição de ADP 10 μΜ às plaquetas estimulava um aumento de pelo menos três vezes no número de moléculas de ¹²⁵I-Fg que ligavam as plaquetas. As plaquetas não estimuladas não exibiram qualquer aumento na ligação ao -*-²^I-Fg acima da base. Consequentemente, a activação das plaquetas é detectada quando a quantidade de fibrinogénio ligado é pelo menos três vezes superior à quantidade ligada quando as plaquetas não são estimuladas por ADP.

Embora o presente invento tenha sido descrito com algum detalhe por meio de ilustrações e exemplos para uma maior clareza e compreensão, é óbvio que podem ser efectuadas certas modificações dentro do âmbito das reivindicações anexas.

Claims (19)

1 - Processo de caracterização de um defeito de agregação de plaquetas num paciente possuindo o referido defeito como um defeito de activação, de ligação ao ligando ou defeito de pós-ocupação, caracterizado por compreender:

(a) a determinação da presença de plaquetas competentes na activação, numa primeira amostra contendo plaquetas, proveniente do referido paciente;

(b) a determinação da presença de plaquetas competentes para ocupação de ligando numa segunda amostra contendo plaquetas, proveniente do referido paciente; e (c) a correlação dos resultados dos passos (a) e (b) com critérios predeterminados para a caracterização de defeitos da agregação de plaquetas, sendo assim (i) identificados defeitos de activação, quando a presença de plaquetas competentes para a activação é inferior a um nível de activação predeterminado, usando os referidos critérios predeterminados; (ii) identificados defeitos de ligação ao ligando, quando a presença de plaquetas competentes para a ocupação do ligando é inferior a um nível de ocupação de ligando predeterminado, usando os referidos critérios predeterminados e (iii) identificados defeitos de pós-ocupação, quando a presença de plaquetas competentes na activação excede o referido nível de activação predeterminado e a presença de plaquetas competentes na ocupação do ligando excede o referido nível de ocupação de ligando predeterminado.

2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os passos (a) e (b) empregarem citometria de fluxo activada por fluorescência, para determinar a presença de plaquetas competentes para a activação e competentes para ocupação de ligando.

3 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o passo (a) compreender:

(i) misturar a referida primeira amostra com uma quantidade predeterminada de um agonista de plaquetas, suficiente para activar plaquetas normais, e com um ligando específico de activação (ASL) que liga, preferivelmente, plaquetas activadas,

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-62para formar uma mistura de reacção;

(ii) manter a referida mistura de reacção sob condições de ensaio biológico predeterminadas, durante um período de tempo suficiente para que as plaquetas normais activadas formem um produto de reacção com o referido ASL; e (iii) determinar a quantidade de produto de reacção formado no passo (ii), determinando, assim, a presença, de plaquetas competentes para a activação, na referida amostra.

4 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o referido ligando específico de activação ser um anticorpo monoclonal.

5 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o referido ligando específico de activação ser fibrinogénio.

6 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o passo (b) compreender:

(i) misturar a referida segunda amostra com uma quantidade predeterminada de um ligando independente da activação (AIL) que forma um local de ligação induzido por ligando (LIBS) em plaquetas normais e com um anticorpo anti-LIBS que, preferivelmente, se liga ao referido LIBS para se formar uma mistura de imunorreacção;

(ii) manter a referida mistura de imunorreacção sob condições de ensaio biológico pré-definidas durante um período de tempo suficiente para que o anticorpo anti-LIBS imunorreaja com o referido LIBS para formar um produto de imunorreacção; e (iii) determinar a quantidade do produto de imunorreacção formado no passo (ii), determinando, assim, a presença de plaquetas competentes para ocupação de ligando, na referida amostra.

7 - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a referido anticorpo anti-LIBS ser um anticorpo monoclonal.

8 - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o referido anticorpo monoclonal ser o anticorpo produzido

PMI-1, que tem o número de acesso do ATCC HB

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SCRF 199.0 POR pelo hibridoma 9476.

9 - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o ligando independente da activação ser seleccionado de entre o grupo Arg-Gly-Asp, Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val, Lys-Tyr-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser, Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro e Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val.

10 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o passo (b) compreender:

(i) misturar a referida segunda amostra com uma quantidade predeterminada de um agonista de plaquetas, suficiente para activar plaquetas normais, e com um ligando específico de activação (ASL) que liga, preferivelmente, plaquetas activadas, para formar um local de ligação induzido por ligando (LIBS) e com um anticorpo anti-LIBS que liga, preferivelmente, o referido LIBS, para formar uma sua mistura de reacção;

(ii) manter a referida mistura de reacção sob condições de ensaio biológico pré-definidas durante um período de tempo suficiente para que o anticorpo anti-LIBS imunorreaja com o referido LIBS para formar um produto de imunorreacção; e (iii) determinar a quantidade do produto de imunorreacção formado no passo (ii), determinando, assim, a presença de plaquetas competentes para ocupação de ligando na referida amostra.

11 - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por o referido ligando específico de activação ser o fibrinogénio.

12 - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por o referido anticorpo anti-LIBS ser um anticorpo monoclonal .

13 - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por o referido anticorpo monoclonal ser o anticorpo produzido pelo hibridoma PMI-1, com o número de acesso do ATCC HB

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-649476.

14 - Processo de produção de um sistema de diagnóstico na forma de um conjunto, oaracterizado por compreender um invólucro no qual são inseridos, em recipientes separados:

(a) um ligando específico da activaçâo (ASL) que se liga a plaquetas activadas;

(b) um ligando independente da activaçâo (AIL) que forma um local de ligação de induzido por ligando (LIBS) em plaquetas normais; e (c) um anticorpo anti-LIBS.

15 - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por o referido ligando específico de activaçâo ser o fibrinogénio.

16 - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por o referido ligando independente da activaçâo compreender uma sequência peptídica de menos do que cerca de 40 resíduos de aminoácido que inclui uma sequência de aminoácidos seleccionada de entre o grupo Arg-Gly-Asp, Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val, Lys-Tyr-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser, Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro e Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val.

17 - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a referido anticorpo anti-LIBS ser um anticorpo monoclonal.

18 - Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por o referido anticorpo monoclonal ser produzido pelo hibridoma PMI-1, com o número de acesso do ATCC HB 9476.

19 - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por compreender, adicionalmente, a inserção de um recipiente contendo um agonista de plaquetas.