DE69128966T2

DE69128966T2 - Charakterisierung von störungen der blutplättchenaggregation

Info

Publication number: DE69128966T2
Application number: DE69128966T
Authority: DE
Inventors: Mark H. San Diego Ca 92122 Ginsberg
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1990-11-15
Filing date: 1991-11-15
Publication date: 1998-06-18
Anticipated expiration: 2011-11-16
Also published as: EP0557451A1; WO1992008982A1; DK0557451T3; JPH06504842A; US5656442A; US5196309A; AU650312B2; PT99532B; IE62627B1; PT99532A; IE913975A1; CA2096230A1; DE69128966D1; EP0557451B1; GR3026510T3; CA2096230C; ATE163481T1; EP0557451A4; AU9082491A; ES2112310T3

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Charakterisierung von Blutplättchenkrankheiten. Die Erfindung bezieht sich im besonderen auf neue Antikörpersysteme und Verfahren zum Charakterisieren von Blutplättchendefekten.

Hintergrund

Primäre Blutplättchenaggregation ist für normale Hämostase essentiell und spielt ebenfalls eine Rolle bei Thrombose. Die Ergebnisse von Studien über Blutplättchenaggregation über die letzten 20 Jahre zeigen, daß normale Plättchenaggregation von der Bindung von Fibrinogen an Blutplättchenglycoprotein GPIIb-IIIa abhängt. GPIIb-IIIa ist ein Membranglycoprotein von Blutplättchenzellen, das zu einer Klasse von extracellulären Rezeptoren, die Integrine genannt werden, gehört. Es wurde beobachtet, daß Patienten, die eine GPIIb-IIIa Defizienz haben, verlängerten Blutungszeiten oder eine Neigung zur Blutung bedingt durch Blutplättchendysfunktion haben.
Der Prozeß der Blutplättchenaggregation kann als eine Serie von notwendigen cellulären Abläufen gesehen werden: 1) Eine agonisteninduzierte Aktivierung von GPIIb-IIIa, die in der Exposition der Fibrinogenbindungsstelle resultiert; 2) das Binden von Fibrinogenligand an die exponierte Bindungsstelle von GPIIb-IIIa; und 3) Post-Bindungsabläufen, die auf Ligandenbindung folgen. Es wird angenommen, daß alle drei Schritte für normale Blutplättchenaggregation wichtig sind. Daher kann, selbst wenn GPIIb-IIIa in der Blutplättchenmembran vorhanden ist, eine Dysfunktion in jedem der o.g. Schritte in defekter Blutplättchenaggregation resultieren.
Unterstützung für die oben geschilderte Sichtweise der Abläufe, die zur Plättchenaggregation führen, kann in mehreren kürzlich erschienenen Studien gefunden werden. Zuerst wird festgestellt, daß effizientes Binden von großen GPIIb-IIIa Liganden, wie Fibrinogen oder bestimmten Anti-GPIIb-IIIa-Antikörpern, Blutplättchenaktivierung durch einen Agonisten wie ADP oder Thrombin benötigen. Siehe z. B. Shattil et al., J. Biol. Chem. 260:11107 (1985). Zusätzlich wurde festgestellt, daß kleine Fibrinogen-nachahmende Liganden wie Arg-GIY-Asp (RGD)-enthaltende Peptide unabhängig von Aktivierung an GPIIb-IIIa binden. Siehe z. B. Lam, Sc-t, et al., J. Biol. Chem., 262:947- 950 (1987); Frelinger, A. L. III, et al., J. Biol. Chem., 263:12397-402 (1988). Das führte zu der Hypothese, daß die Fibrinogenbindungsregion von GPIIb-IIIa nur eingeschränkte Zugänglichkeit zu großen Liganden in der Abwesenheit von Agonist-induzierter Aktivierung von Glycoprotein hat. Es wird vermutet, daß Agonist-induzierte Expression des Fibrinogenrezeptors G Protein-vermittelte Aktivierung von Phospholipase C, gefolgt von Aktivierung von Proteinkinase C nach sich zieht. Siehe Shattil, S. J., et al., J. Biol. Chem., 262:992-1000 (1987). Der genaue Charakter der Änderungen in GPIIb- IIIa, die es in die Lage versetzen, Fibrinogen zu binden, sind momentan nicht bestimmt.
Post-Bindungsabläufen, die den GPIIb-IIIa-Komplex mit einbeziehen, scheinen ebenfalls eine Rolle in der Blutplättchenaggregation zu spielen. Zum Beispiel wurde beobachtet, daß wenn GPIIb-IIIa an entweder Fibrinogen oder an RGD-enthaltende Peptide gebunden ist, gewisse Anti-GPIIb und Anti-G PIIIa-Antikörper in der Lage sind, den entsprechenden Konformationswechsel in dem GPIIb-IIIa Komplex zu detektieren. Dieses Ergebnis läßt vermuten, daß Konformationsänderungen in dem Rezeptor/Ligandenkomplex nach der Bindung auftreten. Wie solche Konformationsänderungen das Ausmaß der Blutplättchenaggregation beeinflussen, ist noch unbekannt. Siehe z. B. Frelinger et al., supra: Frelinger et al., J. Biol. Chem., 265:6346 (1990). Außerdem sind Konformationsänderungen in dem Fibrinogenliganden nach Bindung induziert, welches seine adhäsive Funktion verstärken kann. Siehe z. B. Zamarron et al., Blood. 74:208a (Ergänzung 1) (1989).
Die tiefgreifendsten Defekte in der Blutplättchenaggregation treten in Patienten auf, die von der erblichen Krankheit Glanzmann's Thrombozytenschwäche (engl.: thrombasthenia) betroffen sind. Die Blutplättchen der meisten homozygoten Träger, die die klassische Form dieser Krankheit haben, besitzen weniger als 10 % GPIIb-IIIa. In diesen Individuen können die beobachteten Effekte in der Blutplättchenaggregation einfach dem Mangel an funktionellen GPIIb-IIIa zugeschrieben werden.
Jedoch zeigen andere Patienten, die von Glanzmann's Thrombozytenschwäche betroffen sind, verschiedene Formen der Krankheit, bei denen annähernd normale Werte von GPIIb-IIIa in den Blutplättchen vorhanden sind. Dementsprechend können diese Individuen Defekte haben, die die Aktivierung, Ligandenbindung und/oder Post-Bindungsfunktionen von GPIIb-IIIa betreffen. Solche Defekte sind wahrscheinlich einem oder mehreren primären Defekten in der Aminosäuresequenz von GPIIb-IIIa zuzuschreiben. Blutplättchenaggregationsdefekte werden ebenfalls in einer Reihe klinischer Schauplätze beobachtet. Zum Beispiel haben myeloproliferierende Krankheiten, Drogenverabreichung, Urämie und post-cardiopulmonarer Bypass oft erworbene Blutplättchenaggregationsdefekte zur Folge. Solche Defekte können wahrscheinlich einem oder mehreren der oben beschriebenen Prozesse der Aktivierung, Ligandenbindung und Post- Bindungsdefekten zugeschrieben werden.
Frühere Verfahren zum Diagnostizieren von Blutplättchenaggregationsdysfunktion, z. B. Blutplättchenaggregometrie, bieten keine Klassifizierung der Krankheit im Sinne der primaren Schritte der Aktivierung, Bindung und Post-Bindungsabläufe. Es ist wünschenswert, die Krankheit im Sinne einer oder mehrere Defekte in diesen Schritten zu charakterisieren, um den Zustand eines Patienten genauer zu diagnostizieren. Es wird erwartet, daß genauere Diagnosen zu verbesserten Behandlungsprogrammen für Patienten mit Blutplättchendysfunktionen führen. Eine verbesserte Definition von Aggregationsdefekten würde ebenfalls für das wissenschaftliche Umfeld wertvoll sein, so z. B. bei der Charakterisierung der Wirkweisen von vorgeschlagenen Anti-Blutplättchen medikamenten.

Kurze Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung dient einem verbesserten Verfahren zum Charakterisieren von Blutplättchenaggregationsdefekten in einem Patienten, der Blutplättchenaggregationsdysfunktion zeigt. Das Verfahren betrifft das Bestimmen der Anwesenheit von Blutplättchen, die in einer ersten Flüssigkeitsprobe des Patienten aktivierungskompetent (engl.: activation competent) sind. Die Anwesenheit von Blutplättchen, die die Fähigkeit zur Ligandenbindung besitzen, wird ebenfalls in einer zweiten Flüssigkeitsprobe des Patienten bestimmt. Die Ergebnisse der Tests zur Aktivierungskompetenz und Ligandenbindungskompetenz werden festgehalten und mit vorher bestimmten Kriterien zum Charakterisieren von Blutplättchenaggregationsdefekten verglichen, so daß ein Defizit an aktivierungskompetenten Blutplättchen in der ersten Probe ein Aktivierungsdefekt anzeigt. Eine Defizienz an Blutplättchen mit Ligandenbindungskompetenz in der zweiten Probe zeigt einen Ligandenbindungsdefekt. Ausreichende Mengen an aktivierungskompetenten und Liganden bindungskompetenten Blutplättchen zeigen einen Postbindungsdefekt, wenn immer der Patient kein normales Blutplättchenaggregationsverhalten zeigt. Die Bestimmung der Aktivierungskompetenz betrifft vorzugsweise das Mischen der ersten Blutplättchen enthaltenden Probe mit einem einer vorher bestimmten Menge eines Blutplättchenagonisten, der die Blutplättchen zur Bindung aktiviert. Ein aktivierungsspezifischer Ligand (ASL), der vorzugsweise aktivierte normale Blutplättchen im Gegensatz zu ruhenden normalen Blutplättchen bindet, wird ebenfalls beigemischt. Der ASL kann ebenfalls eine leicht erhöhte Bindung an defekte Blutplättchen, die Aktivierungsbedingungen unterzogen wurden, zeigen; jedoch wird der ASL größere Bindungsaffinität zu aktivierten normalen Blutplättchen als zu aktivierten defekten Blutplättchen zeigen. Nach dem Erhalten der Reaktionsmischung unter vorher bestimmten Bedingungen für einen Zeitraum, der für aktivierte normale Blutplättchen ausreicht an den ASL zu binden, wird die Menge an ASL - Blutplättchenreaktionsprodukt, das in der Probe gebildet wird, bestimmt. In noch weiteren bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist der aktivierungsspezifische Ligand ein monoclonaler Antikörper wie PAC-1 (Shattil et al., J. Biol. Chem., 260:11107 (1985)) und funktionelle Äquivalente davon, oder Fibrinogen. Vorzugsweise umfaßt die Analyse zur Ligandenbindungskompetenz in Blutplättchen des Patienten das Mischen der zweiten Probe an Körpertlüssigkeit mit einem aktivierungsunabhängigen Liganden (AIL), welches ausreicht, eine Liganden-induzierte Bindungsstelle (LIBS) auf normalen integrin enthaltenden Blutplättchen zu bilden. Die Probe wird ebenfalls mit einem Anti-LIBS-Antikörper gemischt, der mit der Liganden-induzierten Bindungsstelle des Ligand-Integrinkomplexes eine Immunreaktion eingeht. Die Ligandenbindungskompetenz der untersuchten Blutplättchen wird durch die Menge des gebildeten Immunreaktionsproduktes bestimmt. In einer noch weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung schließt der AIL eine RGD-Aminosäuresequenz ein und die Anti-LIBS-Antikörperprobe ist PMI-1, welches von dem Hybridom mit der ATCC Hinterlegungsnummer H89476 hergestellt wird.
Die vorliegende Erfindung gewährt ebenfalls diagnostische Kits, die einen ASL, einen AIL und einen Anti-LIBS-Antikörper umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Kits der vorliegenden Erfindung ist der ASL PAC-1, dessen funktionelle Äquivalente oder Fibrinogen. Der AIL ist vorzugsweise ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz einschließt, wie RGD, LGGAKQAGDV, KYGRGDS, GRGDSP und KQAGDV. Die neuen Verfahren und Kits der vorliegenden Erfindung gewähren bedeutende Vorteile im Vergleich zu früheren Verfahren zum Charakterisieren von Blutplättchenaggregationsdefekten. Die vorliegende Erfindung kann kleine Probengrößen wie 0,5 ml benutzen im Gegensatz zu herkömmlichen Aggregationsverfahren, die 20 bis 30 ml benötigen. Die vorliegende Erfindung bietet ebenfalls schnelle Analysen, die weniger als 30 Minuten in blutplättchenreichem Plasma oder Gesamtblut benötigen. In höchstem Maße bedeutend ist, daß die vorliegende Erfindung eine verbesserte Definition von Blutplättchenaggregationsdefekten im Sinne der Abläufe der Aktivierung, Ligandenbindung und Post-Bindung bietet. Diese Charakterisierung wird im wissenschaftlichen Umfeld und im Umfeld der pharmazeutischen Industrie von Wert sein. Die vorliegenden Verfahren können ebenfalls zu verbesserten klinischen Behandlungen für Patienten, die Biutplättchendysfunktion haben, führen. Demgemäß bietet die vorliegende Erfindung nun Charakterisierung von Blutplättchenaggregationskrankheiten wie der Cam-Variante von Glanzmann's Thrombozytenschwäche und Myelofibrose im Sinne der vorher erwähnten Defekte.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung des vorgeschlagenen Blutplättchenaggregationsmechanismusses. In der oberen linken Ecke ist ein GPIIb-IIIa enthaltender Fibrinogenrezeptor auf der Oberfläche eines ruhenden Blutplättchens dargestellt. Dieser Rezeptor hat eine Ligandenbindungstasche, jedoch nicht die Fähigkeit, macromolekulare Liganden wie Fibrinogen oder den PAC1 Antikörper zu binden. Nach Aktivierung mit einem Agonisten wie ADP, wird die Ligandenbindungstasche für macromolekulare Liganden wie Fibrinogen und PAC1 zugänglich, wie durch die Öffnung des Mundes der Tasche dargestellt wird. Nach Fibrinogenbindung exprimiert der gebundene Rezeptor bindungsabhängige Epitope wie LIBS 1. Danach aggregieren die Zellen durch zusätzliche Prozesse. Der Fibrinogenrezeptor kann ebenfalls durch einen kleinen Peptidliganden ohne vorherige Aktivierung gebunden werden, was in einer Konformationsänderung mit Exposition des LIBS 1 Epitopes resultiert (untere linke Ecke; ( ), Anti-LIBS-Antikörper).
Abbildung 2 zeigt eine flußzytometrische Analyse des Defizites der Cam-Variante von Thrombozytenschwäche. Gezeigt sind Histogramme mit der Fluoreszenzintensität auf der Abszisse als Logskala und Zellzahl auf der Ordinate. Der berichtete Antikörper wird in der linken Spalte gezeigt. Cam-Blutplättchen werden in den linken Bildern und normale Kontrollen in den rechten Bildern gezeigt. Jede Reihe an Bildern enthält eine Legende, die den zugesetzten Agonisten, Peptid oder Antikörper angibt. Das ADP wurde zu einer Endkonzentration von 100 µmol/l zugesetzt; das GRGDSP wurde zu einer Endkonzentration von 200 µmol/l zugesetzt. Die unterste Reihe zeigt Resultate mit einem Anti- GPIIb-IIIa-Komplex (A&sub2;A&sub9;) und mit einem Anti-GPIIIa (AB-15). Ähnliche Daten wurden mit anderen Antikörpern gegen GPIIb-IIIa (7E3, 10E5, 4F10) und einem Antikörper gegen GPIIb (Tab) erhalten. Die gezeigten Cam-Varianten Daten sind repräsentativ für Bestimmungen an zwei betroffenen männlichen Geschwistern mit ähnlichen Resultaten. Figur 3 zeigt eine flußcytometrische Analyse einer Aggregationsdysfunktion in einem Patienten mit Myelofibrose. Daten, die von Blutplättchen aus einem Patienten, der von myeloproliferativer Krankheit (MPD) betroffen ist, erhalten wurden, sind in dem linken Bild gezeigt, Kontrollblutplättchen in dem rechten Bild. Der gezeigte Antikörper ist in der linken Säule gezeigt. In jeder Reihe zeigt die Legende den zugesetzten Agonisten oder das zugesetzte Peptid. Agonist- und Peptidkonzentrationen waren identisch zu denen in Abbildung 2. Phorbolmyristatacetat (PMA) war in einer Endkonzentration von 50 nmol/l vorhanden. Anti-TSP bezieht sich auf das Binden eines Moab an (engl.: against) Thrombospondin.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

A. Definitionen

Aminosäurerest: Eine Aminosäure entstand nach chemischem Verdauen (Hydrolyse) eines Polypeptids an seiner Peptidbindung. Die Aminosäurereste, die hier beschrieben sind, sind bevorzugt in der "L" isomeren Form. Jedoch können Reste in der "D" isomeren Form gegen jeden L-Aminosäurerest ausgetauscht werden, so lange die gewünschte funktionelle Eigenschaft des Polypeptids erhalten bleibt. NH&sub2; bezieht sich auf die freie Aminogruppe, die am Aminoterminus eines Polypeptids vorhanden ist. COOH bezieht sich auf die freie Carboxygruppe, die an dem Carboxyterminus eines Polypeptids vorhanden ist. Unter Beibehaltung der Standardpolypeptidnomenklatur (beschrieben in J. Biol. Chem., 243:3552-59 (1969) und adaptiert von 37 C.F.R. §1.822(b) (2)), sind Abkürzungen für Aminosäurereste in der folgenden Korrespondenztabelle gezeigt: Korrespondenztabelle
Es sollte angemerkt werden, daß alle hier durch Formeln dargestellten Aminosäurerestsequenzen eine links nach rechts Orientierung in der konventionsgemäßen Richtung von Aminoterminus nach Carboxyterminus haben. Zusätzlich ist der Ausdruck "Aminosäurerest" breit definiert, um die Aminosäuren, die in der Korrespondenztabelle aufgelistet sind und modifizierte und ungewöhnliche Aminosäuren, wie solche in 37 C.F.R. § 1.822(b) (4), aufgeführten und hier durch Zitat mit aufgenommen sind, mit einzuschließen. Weiterhin sollte erwähnt werden, daß ein "-" am Beginn oder Ende einer Aminosäurerestsequenz eine Peptidbindung zu einer weiteren Sequenz von einem oder mehreren Aminosäureresten oder zu einer aminoterminalen Gruppe wie NH&sub2; oder zu einer carboxyterminalen Gruppe wie COOH anzeigt.
Antikörper: Ein Polypeptid, das chemisch an eine haptene Gruppe, d.h. Liganden bindet. Antikörper, wie hier benutzt, sind Immunglobulinmoleküle und immunologisch aktive Fragmente von Immunoglobinmolekülen. Diese Teile sind in Fachkreisen als Fab, Fab'; F(ab')&sub2; und Fv bekannt und miteingeschlossen. Typischerweise binden Antikörper Liganden, die in ihrer Größe von ungefähr 6 bis ungefähr 34 Å mit Assoziationskonstanten in dem Bereich von 10&sup4; bis 10¹&sup0; M&supmin;¹ und bis zu 10¹² M&supmin;¹ liegen. Antikörper können polyclonal oder monoclonal (MoAb) sein. Antikörper können ein weites Spektrum an Liganden, einschließlich kleiner Moleküle wie Steroide und Prostaglandine, Biopolymere wie Nucleinsäuren, Proteine und Polysaccharide und synthetische Polymere wie Polypropylene binden. Eine "Antikörperkombinierungsstelle" (engl.: antibody combining site) ist der strukturelle Teil eines Antikörpermoleküls, das schwere und leichte Ketten-, variable und hypervariable Regionen umfaßt, und welcher spezifisch Antigen bindet (eine Immunreaktion eingeht mit). Der Ausdruck "eine Immunreaktion eingehen" wird hier in seinen verschiedenen Formen benutzt, um die Bindung zwischen einem Molekül, welches eine antigene Determinante enthält, und einem Molekül, das eine Antikörperkombinierungsstelle wie ein gesamtes Antikörpermolekül oder einen Teil davon enthält, bezeichnet. Eine "antigene Determinante" ist der tatsächliche strukturelle Teile des Antigens, das immunologisch durch die Antikörperkombinierungsstelle gebunden wird. Der Ausdruck wird ebenfalls austauschbar mit "Epitop" benutzt.
Ligand: Ein Molekül, das einen strukturellen Teil enthält, der durch spezifische Interaktion mit einem bestimmten Rezeptormolekül gebunden ist.
Liganden-induzierte Bindungsstelle (LIBS): Eine neoantigene Determinante, die von einem Komplex aus Zelloberflächenrezeptor und Ligand exprimiert wird, wobei der Komplex durch eine nicht zufällige (spezifische) Bindungsreaktion hergestellt wird, aber nicht durch entweder den nicht besetzten Rezeptor oder den nicht gebundenen Liganden exprimiert wird. Ein LIBS kann entweder "konformationell" oder "sequentiell" sein. Eine wie hier benutzte LIBS kann das Ergebnis von spezifischen Änderungen des Rezeptors, induziert durch Ligandenbindung, d.h. eine "cryptische antigene Determinante" sein oder sie kann durch eine Kombination von Rezeptor- und Ligand-Aminosäureresten an einer Rezeptor-Liganden-Kontaktstelle gebildet werden.
Oligonucleotide oder Polynucleotide: Ein Polymer von einzel- oder doppelsträngigen Nucleotiden. "Oligonucleotid" wie hier benutzt und seine grammatikalischen Äquivalente schließen das gesamte Spektrum an Nucleinsäuren ein. Ein Oligonucleotid bezieht sich typischerweise auf ein Nucleinsäuremolekül, das von einem linearen Strang von zwei oder mehr Deoxyribonucleotiden und/oder RiboNucleotiden umfaßt wird. Die exakte Größe hängt von vielen Faktoren ab, welche wiederum von den letztendlichen Verwendungsbedingungen abhängen, wie in Fachkreisen bekannt ist.
Polypedtide oder Peptide: Eine lineare Reihe von mindestens zwei Aminosäuren in denen benachbarte Reste durch Peptidbrücken verbunden sind, zwischen der Alpha- Aminogruppe des einen Restes und der Alpha-Carboxygruppe des benachbarten Restes.
Protein: bezieht sich auf eine lineare Reihe von mehr als 50 Aminosäureresten in der benachbarte Reste durch Peptidbindungen verbunden sind.
Rezeptor: Ein biologisch aktives Molekül mit Proteincharakter, das spezifisch an (oder mit) anderen Molekülen (Liganden) bindet. Rezeptoren können glycosyliert sein.

B. Verfahren zur Blutplättchencharakterisierung

Die vorliegenden Verfahren bieten Protokolle zur Charakterisierung von Blutplättchenaggregationsdefekten im Sinne von Aktivierung, Ligandenbindung und Post-Bindungsdefekten. Basierend auf dem in Abbildung 1 gezeigten Modell, kann abnormale Blutplättchenaggregation aus einem Defekt in der Aktivierung von Blutplättchenfibrinogenrezeptoren, einem Defekt in Fibrinogenbindung per se, oder einem Defekt in Post-Bindungsabläufen, die für optimale Aggregation benötigt werden, auftreten. Die Nützlichkeit dieses Modells wurde an Patienten mit fortwährenden und schweren Defekten in der Blutplättchenaggregation getestet. In einer bevorzugten Ausführungsform wurde Rezeptoraktivierung unter Verwendung von entweder ¹²&sup5;I-Fibrinogen oder einem Fluorescein markierten MoAb (PAC1) (Shattil et al., J. Biol. Chem., 260:11107 (1985)) quantifiziert, wobei diese spezifisch die aktivierte Form des GPIIb-IIIa erkennt. Die Offenbarungen aller hier zitierten Referenzen sind hiermit durch Zitat eingeschlossen.

1. Bestimmung von Aktivierungskompetenz

Das vorliegende Verfahren umfaßt teilweise das Analysieren von Blutplättchen enthaltenen Körperflüssigkeitsproben, die von einem Patienten entnommen wurden, in Bezug auf Blutplättchen, die Aktivierungskompetenz zeigen. Nützliche Körperflüssigkeitsproben sind typischerweise Blutgefäßflüssigkeitsproben, wie Blut und Blutplättchen enthaltende Teile des Blutes sowie blutplättchenreiches Plasma und ähnliches. Die Analyse benutzt vorzugsweise fluoreszenzaktivierte Flußzytometrie, um die Anwesenheit von aktivierungskompetenten Blutplättchen zu bestimmen. Typischerweise betrifft dieses Verfahren das Mischen der Blutplättchen enthaltenen Probe des Patienten mit einer vorher bestimmten Menge eines Blutplättchenagonisten, welche ausreicht, um normale Blutplättchen zu aktivieren. Die Probe wird ebenfalls mit eiriem aktivierungsspezifischen Liganden (ASL), der vorzugsweise an aktivierte normale Blutplättchen bindet, gemischt. Die Reaktionsmischung, die ASL und aktivierte Blutplättchen enthält, wird unter vorher bestimmten biologischen Testbedingungen für eine Zeitspanne, die für normale aktivierte Blutplättchen ausreicht, um ASL zu binden erhalten, um ein Reaktionsprodukt zu bilden. Die Menge des Reaktionsproduktes wird bestimmt und gewöhnlich aufgezeichnet und steht ihn Beziehung zu der Menge an aktivierungskompetenten Blutplättchen, die in der Probe vorhanden sind. Die Menge an gebildetem Produkt kann mit vorher bestimmten Referenzwerten unter Verwendung des hier beschriebenen Testprotokolls korreliert werden, um Aktivierungsdefekte zu identifizieren.

a) Blutplättchenagonisten

Die Blutplättchenagonisten, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, "aktivieren" normale Zielblutplättchen zur Aggregation durch Umwandlung der Blutplättchen von ihrem normalen Ruhestadium in ein Stadium, das für nachfolgende Aggregation geeignet ist. Der Aktivierungsmechanismus ist nicht genau bekannt und es wird angenommen, daß dieser gemäß der Art des Agonisten, der verwendet wird, variiert. Mindestens ein Aktivierungsweg scheint G-Protein vermittelte Aktivierung von Phospholipase C, gefolgt von Aktivierung von Protein Kinase C zu betreffen. Shattil et al., J. Biol. Chem., 261:992 (1987).
Das Binden von Fibrinogen an Blutplättchen betrifft das Blutplättchenmembranglycoprotein GPIIb-IIIa. Weiterhin benötigt effizientes Binden solch großer Liganden wie Fibrinogen Aktivierung durch geeignete Agonisten. Veranschaulichende Agonisten schließen ADP (Adenosindiphosphat), Thrombin und ähnliche ein. Zusätzlich können Agonisten wie PMA eingesetzt werden, die direkt Protein Kinase C aktivieren. Andere Agonisten können verwendet werden und sind dem Fachmann bekannt. Siehe z. B. Nurden, et al., Br J Haematol. 28:253 (1974); Mustard et al., Blood. 54:987 (1979); Bennett et al., J. Biol. Invest., 64:1393 (1979); Marguerie et al., J. Biol. Chem., 254:5357 (1979). Es wird angenommen, daß die hier verwendeten Agonisten funktionieren, indem sie die Ligandenbindungstasche von GPIIb-IIIa veranlassen, sich zu öffnen, wodurch eine erhöhte Zugänglichkeit von großen Liganden an die Ligandenbindungsstelle erlaubt wird (Abb. 1).

b) Aktivierungsspezifische Liganden

Ein wie hier benutzter "aktivierungsspezifischer Ligand" (ASL) ist ein Molekül, das spezifisch an aktivierte Rezeptormoleküle bindet. Der Ausdruck "spezifische Bindung" wie hier benutzt und seine grammatikalische Äquivalente beziehen sich auf eine nicht zufällige Bindungsreaktion zwischen einem Zelloberflächenrezeptor und einem Ligandenmolekül. Veranschaulichend für einen spezifisch gebundenen Rezeptor-Liganden-Komplex, wie hier in Betracht gezogen, ist der Komplex zwischen aktiviertem Blutplättchen GPIIb-IIIa und Fibrinogen auf der Blutplättchenzelloberfläche. Andere Liganden, von denen bekannt ist, daß sie spezifisch aktiviertes GPIIb-IIIa binden, schließen den Moab PAC-1 und funktionelle Äquivalenten davon [Shattil et al., J. Biol. Chem., 260:11107 (1985)] Fibronectin, Vitronectin und von Willebrand Faktor ein. Daher schließen geeignete Liganden native Liganden für aktiviertes GPIIb-IIIa und Antikörper, die gegen antigene Determinanten von GPIIb-IIIa gerichtet sind ein.
Die vorliegenden ASL-Moleküle binden vorzugsweise zusätzlich an aktivierte Blutplättchen. Ein wie hier benutztes Reagenzmolekül der vorliegenden Erfindung wird als "vorzugsweise eine Zielart bindend" in dem Test betrachtet, wenn das Reagenz stärker mit dem Zielmolekül als mit anderen Arten, die in dem Test vorhanden sind, assoziiert. Daher wird die Reaktion des Reagenzmoleküls mit dem Zielmolekül im allgemeinen eine größere Assoziationskonstante als die Reaktion des Reagenz mit allen anderen Arten, die in dem Test vorhanden sind, haben. Typischerweise bindet hier ein Reagenz "vorzugsweise" seine Zielart, z. B. ein ASL bindet ein aktiviertes Integrin, wenn die Bindungsaffinität für das Zielreagenz 2 - 3 mal größer und vorzugsweise mindestens 10 mal größer als die entsprechende Affinität des Reagenzes zu anderen Arten, z. B. nicht aktiviertes Integrin, ist.
Die relative Bindungsaffinität eines Reagenzmoleküls zu seiner Zielart wird herkömmlicherweise, wie hierin beschrieben, unter Verwendung der fluoreszenzaktivierten Flußzytometrie bestimmt. Entsprechend zeigt ein markierter ASL, der hier für die Benutzung geeignet ist, einen Anstieg an durchschnittlicher Zellfluoreszenzintensität (MCFI) einer normalen Blutplättchenprobe, wenn die Probe Aktivierung durchläuft. Der Anstieg in MCFI ist typischerweise größer als zweifach und vorzugsweise größer als zehnfach von der MCFI einer nicht aktivierten normalen Blutplattchenprobe.
Ein Antikörper ASL der vorliegenden Erfindung ist als Antikörpermolekül enthaltend charakterisiert, wobei das Antikörpermolekül mit aktiviertem GPIIb-IIIa eine Immunreaktion eingeht, aber vorzugsweise nicht unaktiviertes GPIIb-IIIa bindet (eine Immunreaktion eingeht). In einer bevorzugten Ausführungsform gehen die Antikörpermoleküle eine Immunreaktion mit entweder den GPIIIa- oder GPIIb-Ketten des Integrins ein. Gewöhnlich binden die Antikörper ebenfalls an die Ligandenbindungsstelle von GPIIb-IIIa, wobei die Ligandenbindungsstelle nahe an den Aminosäureresten, die am meisten durch den Aktivierungsprozeß betroffen sind, liegt. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform hat eine Antikörperzusammensetzung dieser Erfindung mehr als eine Art von Paratopen, die in der Lage sind, mit aktiviertem GPIIb-IIIa eine Immunreaktion einzugehen.
Der hier betrachtete bevorzugte ASL Antikörper ist typischerweise durch Immunisierung eines Säugers mit einem Inoculum, das Blutplättchen aus einem vorher ausgewählten Wirtstier enthält, hergestellt, wodurch in dem Säuger Antikörpermoleküle induziert werden, die die geeignete Immunspezifität für die GPIIb-IIIa-Moleküle auf den Blutplättchen haben. Die Antikörpermoleküle werden dann von dem Säuger gewonnen und in gewünschtem Maße durch bekannte Techniken, wie z. B. durch Immunaffinität für stimulierte Blutplättchen, gescreent. Die so hergestellte Antikörperzusammensetzung kann inter alia, in den diagnostischen Verfahren und Systemen der vorliegenden Erfindung benutzt werden, um aktivierte Blutplättchen in einer Körperflüssigkeitsprobe zu detektieren. Ein gegen aktiviertes GPIIb-IIIa gerichteter monoclonaler Antikörper (MoAb) wird von der vorliegenden Erfindung ebenfalls in Betracht gezogen. Der Ausdruck "monoclonale Antikörperzusammensetzung" in seinen verschiedenen grammatikalischen Formen bezieht sich auf eine Population von Antikörpermolekülen, die nur eine Art Antikörperkombinierungsstellung enthalten, die in der Lage ist, mit einem bestimmten Antigen eine Immunreaktion einzugehen. Die vorliegende MoAb Zusammensetzung zeigt daher typischerweise eine einzige Bindungsaffinität für ein Antigen, mit dem es eine Immunreaktion eingeht. Eine Zusammensetzung monoclonaler Antikörper kann daher ein Antikörpermolekül enthalten, das eine Vielzahl von Antikörperkombinierungsstellen enthält, von denen jede immunspezifisch für ein anderes Antigen ist, z. B. ein bispezifischer monoclonaler Antikörper.
Ein vorliegender MoAB ist typischerweise zusammengesetzt aus Antikörpern, die von Klonen einer einzelnen Zelle hergestellt werden, genannt ein Hybridoma, welches lediglich eine Art von Antikörpermolekülen absondert (herstellt). Die Hybridomzelle wird durch Fusion einer Antikörper produzierenden Zelle und eines Myeloms oder einer anderen unsterblichen Zellinie gebildet. Solche Antikörper wurden zuerst von Köhler und Milstein, Nature 256:495-497 (1975) beschrieben, wobei die Beschreibung durch Referenz hier mit eingeschlossen ist.
Ein monoclonaler Antikörper kann ebenfalls durch Verfahren zum Herstellen chimärer Antikörper, die dem Fachmann wohl bekannt sind, hergestellt werden. Solche Verfahren schließen das Isolieren, Manipulieren und Exprimieren der Nucleinsäure, die für alle oder einen Teil einer immunglobulinvariablen Region einschließlich beider Teiler der variablen Region codiert, umfassend die variable Region der Immunglobulin leichten Kette und den Teil der variablen Region, umfassend die variable Region der Immunglobulin schweren Kette. Verfahren zum Isolieren, Manipulieren und Exprimieren der Nucleinsäure, die die variable Region codiert, in procaryontischen und eucaryontischen Wirten sind in Robinson et al., PCT Veröffentlichungsnummer WO 89/0099; Winter et al., Europäische Patentveröffentlichungsnummer 0239400; Reading, U. S. Patentnummer 4,714,681; Cabilly et al., Europäische Patentveröffentlichungsnummer 0125023; Sorge et al., Mol. Cell Biol., 4:1730-1737 (1984); Beher et al., Science. 240:1041-1043 (1988); Skerra et al., Science, 240:1030 - 1041(1988); und Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 86:3833-3837 (1989), veröffentlicht. Typischerweise codiert die Nucleinsäure für alle oder einen Teil einer immunglobulin variablen Region, die an ein vorher ausgewähltes Antigen (Ligand) bindet. Quellen für solch eine Nucleinsäure sind dem Fachmann bekannt und können z. B. von einem Hybridom, das einen monoclonalen Antikörper herstellt, welcher an ein vorher ausgewähltes Antigen bindet, erhalten werden oder das vorher ausgewählte Antigen kann benutzt werden, um eine Expressionsgenbank, die für eine Vielzahl von Immunglobulin variablen Regionen codiert, zu screenen, wobei so die Nucleinsäure isoliert wird.
Diese bevorzugten monoclonalen Antikörper gehen einer Immunreaktion mit einem freien aktivierten GPIIb-IIIa ein. Die Antikörper können ebenfalls immunologisch mit Blutplättchen-assoziiertem GPIIb-IIIa reagieren, wenn sie nicht mit Liganden gebunden sind, jedoch nicht, wenn sie mit einem Liganden wie Fibrinogen gebunden sind. Repräsentativ für einen monoclonalen Antikörper dieses Typs ist der PAC-1 Antikörper.
Die vorliegende Erfindung zieht ein Verfahren zum Bilden eines monoclonalen Antikörpermoleküls in Betracht, das mit einer aktivierten Region von GPIIb-IIIa eine Immunreaktion eingeht, d.h. eine Region, die eine andere dreidimensionale Struktur hat, als wenn das Integrin in seiner Ruhekonformation vorliegt. Das Verfahren umfaßt die Schritte von:
(a) Immunisieren eines Tieres mit einem Komplex aus Zelloberflächenrezeptor und Ligand. Vorzugsweise ist das Immunogen eine homologe Probe von Blutplättchen, die von einer Versuchstierart stammen. Jedoch kann das Antigen ebenfalls an ein Trägerprotein gekoppelt sein, wie Schlüsselblumenhämocyanin, besonders, wenn das Antigen klein ist. Die Immunisierung wird typischerweise vollzogen durch Verabreichen der Probe an einen immunologisch kompetenten Säuger in einer immunologisch wirksamen Menge, d.h. eine Menge, die ausreicht, um eine Immunantwort herzustellen. Vorzugsweise ist der Säuger ein Nager, wie Kaninchen, Ratte oder Maus. Der Säuger wird dann für eine Zeitspanne gehalten, die für den Säuger ausreichend ist, Zellen herzustellen, die Antikörpermoleküle absondern, die mit dem Rezeptor eine Immunreaktion eingehen.
(b) Dann wird eine Suspension von Antikörper herstellenden Zellen, die dem immunisierten Säuger entnommen wurden, vorbereitet. Dies wird typischerweise durch Entfernen der Milz des Säugers und mechanisches Trennen der einzelnen Milzzellen in einem physiologisch geeigneten Medium unter Verwendung von in Fachkreisen bekannten Verfahren vollzogen.
(c) Die suspendierten Antikörper herstellenden Zellen werden mit einem transformierenden Mittel, das in der Lage ist, eine transformierte ("immortalisierte") Zellinie herzustellen, behandelt. Transformierende Mittel und ihre Verwendung zum Herstellen immortalisierter Zellinien sind in Fachkreisen bekannt und schließen DNA-Viren, wie Epstein Bar Virus (EBV), Simian Virus 40 (SV40), Polyoma Virus und ähnliche, RNA-Viren wie Moloney Murine Leukemia Virus (MoMuLV), Rous Sarcoma Virus und ähnliche, Myelomzellen wie P3X63-Ag8.653, Sp2/0-Ag14 und ähnliche ein.
In bevorzugten Ausführungsformen resultiert Behandlung mit dem transformierenden Mittel in der Herstellung eines "immortalisierten" Hybridoms durch Fusion der suspendierten Milzzellen mit Mausmyelomzellen einer geeigneten Zellinie, z. B. SP-2, unter Verwendung eines geeigenten Fusionspromotors. Das bevorzugte Verhältnis ist ungefähr 5 Milzzellen pro Myelomzelle in einer Suspension, die ungefähr 10&sup8; Milzzellen enthält. Ein bevorzugter Fusionspromoter ist Polyethylenglycol, das ein durchschnittliches Molekulargewicht von ungefähr 1.000 bis 4.000 (kommerziell erhältlich als PEG 1.000, etc.) hat; jedoch können auch andere im Fach bekannte Fusionspromotoren eingesetzt werden.
Die eingesetzte Zellinie sollte vorzugsweise vom sog. "Chemikalien-resistenten" ("drug resistant") Typ sein, so daß nicht fusionierte Myelomzellen in einem selektiven Medium nicht überleben, während Hybride überleben. Die meistbenutzte Klasse sind 8-Azaguanin-resistente Zellen, die das Enzym Hypoxanthinguanin Phosphoribosyltransferase nicht besitzen und daher nicht durch HAT (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) Medium unterstützt werden. Es ist ebenfalls im allgemeinen bevorzugt, daß die eingesetzte Myelomzellinie vom sog. "nicht-absondernden" ("non-secreting") Typs ist, welcher selbst keine Antikörper herstellt. In besonderen Fällen jedoch können absondernde Myelomlinien bevorzugt sein.
(d) Die transformierten Zellen werden dann kloniert, vorzugsweise so daß sie als Monoclone vorliegen. Das Klonieren wird vorzugsweise in einem Zellkulturmedium durchgeführt, das keine nicht transformierten Zellen erhält (unterstützt). Wenn die transformierten Zellen Hybridome sind, wird dies typischerweise durch Verdünnen und in Kultur halten der Mischung von nicht fusionierten Milzzellen, nicht fusionierten Myelomzellen und fusionierten Zellen (Hybridome) in getrennten Behältern in einem selektiven Medium durchgeführt, welches keine nicht fusionierten Myelomzellen erhält. Die Zellen werden in diesem Medium für eine Zeit, die ausreicht das Absterben der nicht fusionierten Zellen (ungefähr eine Woche) zu erlauben, in Kultur gehalten. Die Verdünnung kann eine limitierende Verdünnung sein, in der das Volumen des Verdünnungsmittels statistisch errechnet wird, um eine bestimmte Anzahl von Zellen (z.B. 1 - 4) in jedem getrennten Behälter (z. B. jede Vertiefung einer Micotiterplatte) zu isolieren. Das Medium ist ein Medium (z. B. HAT-Medium), das die Chemikalien-resistente (z. B. 8-Azaguaninresistente) nicht fusionierte Myelomzellinie nicht erhält.
(e) Das Zellkulturmedium der klonierten Transformanden wird analysiert (immunologisch getestet), um die Anwesenheit von Antikörpermolekülen, die vorzugsweise mit GPIIb-IIIa auf aktivierten Blutplättchen reagieren, zu detektieren. Dies wird mit Hilfe bekannter immunologischer Verfahren durchgeführt.
(f) Ein gewünschter Transformand wird dann ausgewählt und in einem geeigneten Zellkulturmedium für eine geeignete Zeitspanne wachsen gelassen, gefolgt von der Wiedergewinnung (ernten) des gewünschten Antikörpers aus dem Kulturüberstand durch bekannte Verfahren. Das geeignete Medium und die geeignete Zeitspanne zum Kultivieren sind ebenso bekannt oder einfach zu bestimmen.
Um eine wesentlich größere Konzentration von etwas weniger reinem monoclonalem Antikörper herzustellen, kann das gewünschte Hybridom durch Injektion in Mäuse übertragen werden, vorzugsweise syngenische oder semisyngenische Mäuse. Das Hybridom verursacht die Bildung von antikörperherstellenden Tumoren nach geeigeneter Inkubationszeit, welches in einer hohen Konzentration des gewünschten Antikörpers (ungefähr 5-20 mg/ml) im Blutstrom und peritoneal Exudat (Aszites) der Wirtsmaus resultiert. Medien und Tiere, die zur Herstellung dieser Zusammensetzungen nützlich sind, sind in Fachkreisen bekannt und kommerziell erhältlich und schließen synthetische Kulturmedien, Inzuchtmäuse und ähnliches ein. Ein beispielhaftes synthetisches Medium ist Dulbecco's minimal essential medium (DMEM; Dulbecco et al., Virol. 8:396 (1959)] ergänzt mit 4,5 gm/l Glucose, 20 mM Glutamin und 20 % fötalem Kälberserum. Ein beispielhafter Inzuchtmausstamm ist der Balb/c-Stamm.
Die durch das oben beschriebene Verfahren hergestellten monoclonalen Antikörper können z. B. in diagnostischen und therapeutischen Modalitäten, wobei die Bildung eines aktivierungskompetenten Blutplättchenimmunreaktionsproduktes gewünscht ist, benutzt werden. Verfahren zum Herstellen von Hybridomen, die Antikörpermoleküle, welche eine gewünschte Immunspezifität haben, d.h. die Fähigkeit mit einem bestimmten Protein eine Immunreaktion einzugehen haben, ein identifizierbares Epitop oder ein bestimmtes Protein und/oder ein Polypeptid haben, erzeugen (absondern) sind in Fachkreisen bekannt und im weiteren hier beschrieben. Besonders anwendbar ist die Hybridomtechnologie beschrieben von Niman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80:4949-4953 (1983) und von Galfre et al., Meth. Enzymol., 73:3-46 (1981), wobei die Beschreibungen hier durch Referenz miteingeschlossen sind.
Ein weiteres bevorzugtes Verfahren zum Bilden von vorliegenden Antikörperzusammensetzungen betrifft das Erzeugen von Genbanken des Fab-Moleküls unter Verwendung des Verfahrens von Huse et al., Science, 246:1275 (1989). In diesem Verfahren werden mRNA-Moleküle für schwere und leichte Antikörperketten aus dem immunisierten Tier isoliert. Die mRNAS werden unter Verwendung der Polymerase Kettenreaktions (PCR) Techniken amplifiziert. Die Nucleinsäuren werden dann zufallsmäßig in Lambdaphagen kloniert, um eine Genbank von rekombinierten Phagenpartikeln zu erzeugen. Die Phagen können dann benutzt werden, um einen Expressionswirt wie E. coli zu infizieren. Die E. coli Kolonien und korrespondierende Phagenrekombinanten können dann nach solchen gescreent werden, die die gewünschten Fab-Fragmente herstellen.
Die Antikörpermolekül enthaltenen Zusammensetzungen, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, können die Form von Lösungen oder Suspensionen einnehmen. Die Herstellung einer Zusammensetzung, die Antikörpermoleküle als aktive Bestandteile enthält, ist in Fachkreisen bekannt. Typischerweise werden solche Zusammensetzungen als flüssige Lösungen oder Suspensionen hergestellt, jedoch können ebenfalls feste Formen, die geeignet zum Lösen oder Suspendieren in Flüssigkeiten sind, hergestellt werden. Das Präparat kann ebenfalls emulgiert sein. Der aktive therapeutische Bestandteil wird oft mit Trägern gemischt, die mit dem Test nicht interferieren und mit dem aktiven Bestandteil kompatibel sind. Geeigente Träger sind z. B. Wasser, Kochsalzlösung, Dextrose, Glycerol, Ethanol oder ähnliche und Kombinationen davon. Zusätzlich kann, wenn gewünscht, die Zusammensetzung geringe Mengen von Hilfssubstanzen, wie benässende oder emulgierende Mittel, pH-puffernde Mittel oder ähnliche, die die Wirksamkeit des aktiven Bestandteils unterstützen, enthalten.
Eine Antikörpermolekülzusammensetzung kann zu einer neutralisierten verträglichen Salzform formuliert werden. Verträgliche Salze schließen die sauren Zusatzsalze (engl.: addition salt) (gebildet mit der freien Aminogruppe des Antikörpermoleküls) ein, welche mit inorganischen Säuren gebildet werden, wie z.B. Hydrochlorid oder Phosphorsäure, oder solchen organischen Säuren wie Essigsäure, Weinsteinsäure, Mandelsäure und ähnliche Salze, die mit den freien Carboxylgruppen gebildet werden, können ebenfalls aus inorganischen Basen, wie z.B. Natrium, Calium, Ammonium, Calcium oder Eisenhydroxiden, und solchen organischen Basen, wie Isopropylamin, Trimethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Procain und ähnlichen erhalten werden.

2. Bestimmen der Liganden-Bindungskompetenz

Die vorliegende Erfindung zieht ebenfalls in Betracht die Anwesenheit von Liganden- Bindungskompetenten Blutplättchen in einer Blutplättchen enthaltenden Körperflüssigkeitsprobe zu bestimmen. Das Bestimmen der Liganden-Bindungskompetenz kann durchgeführt werden durch Bestimmen der Liganden-Bindungsfähigkeit von aktivierten Rezeptoren oder kann durchgeführt werden durch Bestimmen der Liganden-Bindungsfähigkeit von Rezeptoren unabhängig von der Aktivierung. In dem letzten Fall wird ein aktivierungsunabhängiger Ligand (AIL) eingesetzt, um mit membrangebundenen Blutplättchenrezeptoren zu reagieren.
Das Bestimmen der Liganden-Bindungskompetenz umfaßt typischerweise das Mischen einer Blutplättchenprobe mit einer vorher bestimmten Menge an AIL, wobei die Menge ausreichend ist, um eine Liganden-induzierte Bindungsstelle (LIBS) auf normalen Blutplättchen zu bilden. Die LIBS kann mit einer Anti-LIBS Antikörperzusammensetzung, die mit LIBS eine Immunreaktion eingeht, in Kontakt gebracht werden. Die LIBS kann auf dem Blutplättchenrezeptor lokalisiert werden oder kann auch bis auf die Oberfläche des Liganden reichen. Eine Bestimmung, ob die LIBS lediglich auf dem Rezeptor lokalisiert ist, kann einfach durch Wechsel des Liganden gemacht werden, so daß ein anderes Epitop dem Anti-LIBS Antikörper präsentiert wird. Um eine geeignete Sonde von einer LIBS zu sein, wird ein Anti-LIBS Antikörper mit der LIBS eine Immunreaktion eingehen, aber im wesentlichen nicht mit freiem AIL oder mit Blutplättchen, die nicht an einen Liganden gebunden sind, d.h. ruhende oder aktivierte, aber nicht gebundene Blutplättchen, reagieren.
In einer anderen Ausführungsform wird Liganden-Bindungskompetenz in aktivierungskompententen Blutplättchen bestimmt. Das Verfahren wird das Mischen einer Körperfiüssigkeitsprobe mit einer vorher bestimmten Menge von Blutplättchen Agonisten umfassen, wobei die Menge ausreicht, um normale Blutplättchen zu aktivieren. Ebenfalls wird ein aktivierungsspezifischer Ligand (ASL) mit der Probe gemischt, in der der ASL aktivierte Blutplättchen, wie oben beschrieben, bindet, um eine LIBS zu bilden. Zusätzlich wird ein Anti-LIBS Antikörper, wie hier beschrieben, mit der Probe gemischt, um die Detektion der Anwesenheit von LIBS zu ermöglichen und dadurch die Liganden-Bindungskompetenz in den Blutplättchen anzuzeigen. Die so gebildete Reaktionsmischung wird, wie hier beschrieben, erhalten, um eine Menge an Immunreaktionsprodukt zu bilden, die durch vorher bestimmte Kriterien in Bezug zu einer Menge an Liganden-Bindungskompetenten Blutplättchen gesetzt wird.
Vorzugsweise wird die Detektion von LIBS in der vorliegenden Erfindung durch das Verfahren der fluoreszenzaktivierten Flußzytometrie ermöglicht. Demgemäß wird ein markierter Anti-LIBS Antikörper, der zum Gebrauch hierfür geeignet ist, einen Anstieg in der durchschnittlichen Zellfluoreszenzintensität (MCFI) einer normalen Blutplättchenprobe zeigen, welche die LIBS, gegen eine Probe, welche kein LIBS zeigt, z. B. Blutplattchen, die nicht durch einen AIL gebunden sind, vorzeigt. Der Anstieg in MCFI ist typischerweise größer als ungefähr zweifach und vorzugsweise größer als ungefähr zehnfach, für die MCFI für eine Blutplättchenprobe, die keine LIBS vorweist, d.h. nichtzugesetzten AIL's ausgesetzt ist.

a) Aktivierungsunabhängige Liganden

Ein vorliegender aktivierungsunabhängiger Ligand (AIL) ist ein Molekül, das an Blutplättchen unabhängig von ihrer Aktivierung bindet. Typischerweise ist der AIL ein kleines Polypeptidmolekül, das an Blutplättchen bindet, z. B. in der Peptidbindungsregion von GPIIb-IIIa-Rezeptoren. Das Besetzen einer solchen Bindungsstelle kann direkt untersucht werden, durch Bestimmen der durch den AIL ausgeübten Inhibition auf andere konkurierende Liganden, z. B. ASLS. Alternativ kann Ligandenbindung der Bindungsregion indirekt durch Sondieren nach einer LIBS, wie hier beschrieben, bestimmt werden. Wie erwähnt kann das Versuchs-AIL-Polypeptid eine Aminosäurerestsequenz einschließen, die die Fähigkeit hat, Blutplättchenadhäsion zu inhibieren, z. B. durch Binden an GPIIb-IIIa. Besonders bevorzugte Blutplättchen Adhäsions-inhibierende Polypeptide schließen die Aminosäurerestsequenz RGD sowie solche, die in den US-Patenten Nummer 4,683,291 und 4,578,079 beschrieben sind, ein. Ein besonders bevorzugtes RGD-enthaltendes Peptid ist GRGDSP.
Aminosäurereste, die in einem Versuchspolypeptid vorhanden sind, können zusätzlich zu einer Sequenz, die mit einer oben beschriebenen Formel übereinstimmt, alle Reste sein, die nicht wesentlich die grundlegenden und neuen Charakteristika des Polypeptids beeinflussen, wie sie hier besprochen sind. Solche zusätzlichen Reste werden gewöhnlicherweise an einen oder beide Termini eines der aufgezählten Peptide angefügt und können Wiederholungen oder teilweise Wiederholungen einer aufgezählten Peptidsequenz oder aufeinanderfolgende Reste der Polypeptidsequenz sein. Ein bevorzugtes Polypeptid wird eine RGD-Sequenz einschließen. Daher braucht ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung nicht mit einer Aminosäurerestsequenz der hier gezeigten Polypeptide identisch zu sein, solange sie in der Lage ist, mindestens eines der oben bevorzugten Charakteristika eines Versuchspolypeptides, nämlich Binden an nicht-aktivierte Blutplättchen oder inhibieren von ASLs zu zeigen. Daher kann ein Versuchspolypeptid verschiedenen Änderungen unterworfen werden, wie Insertionen, Deletionen und Substitutionen, entweder konservative oder nichtkonservative, wo immer solche Änderungen zu gewissen Vorteilen für ihren Gebrauch führen.
Konservative Substitutionen sind solche, wo ein Aminosäurerest durch einen anderen biologisch ähnlichen Rest ersetzt wird. Beispiele für konservative Substitutionen schließen die Substitution eines hydrophoben Restes, wie Isoleucin, Valin, Leucin oder Methionin für einen anderen ein oder die Substitution eines polaren Restes für einen anderen, wie zwischen Arginin und Lysin, zwischen Glutaminsäure und Asparaginsäure oder zwischen Glutamin oder Asparagin und ähnliche. Der Ausdruck "konservative Substitution" umschließt ebenfalls den Gebrauch einer substituierten Aminosäure anstelle einer nicht substitutierten ursprünglichen Aminosäure, falls solch ein Polypeptid ebenfalls die benötigte Bindungsaktivität zeigt.
Wenn ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung eine Sequenz hat, die nicht identisch mit einer bevorzugten Sequenz ist, da ein oder mehrere konservative oder nicht konservative Substitutionen durchgeführt worden sind, sind gewöhnlicherweise nicht mehr als ungefähr 20 % und noch wahrscheinlicher nicht mehr als 10 % der Aminosäurereste substitutiert. Eine Ausnahme bildet, wo zusätzliche Reste an einen der beiden Termini angefügt wurden, zum Zweck des zur Verfügungstellens eines "Linkers", durch den die Polypeptide dieser Erfindung bequem an einen Marker oder eine feste Trägermatrix oder antigenen Träger befestigt werden können. Marker, feste Trägermatrizes und Träger, die mit den Polypeptiden dieser Erfindung benutzt werden können, sind im folgenden beschrieben.
Aminosäurerestlinker sind gewöhnlicherweise mindestens einen Rest und können bis 40 oder mehr Reste, öfter noch 1 bis 10 Reste lang sein. Typische Aminosäurereste, die zum Verbinden genutzt werden, sind Tyrosin, Cystein, Lysin, Glutaminsäure und Asparaginsäure oder ähnliche. Ein repräsentativer Linker ist ein Cys-Gly-Gly (CGG-) Tripeptid, das an den Aminoterminus eines Versuchspolypeptides über den carboxyterminalen Glycinrest des Linkers verbunden ist. Zusätzlich kann sich eine Polypeptidsequenz dieser Erfindung von der natürlichen Sequenz unterscheiden, indem die Sequenz durch terminale NH&sub2; Acylierung, z.B. Acetylierung oder Thioglycolsäureamidation, terminale Carboxylamidation, z. B. Ammoniak, Methylamin, etc. modifiziert wird.
Ein Versuchspolypeptid kann durch jedes einem Fachmann für Polypeptide bekannte Verfahren synthetisiert werden. Eine hervorragende Zusammenfassung vieler zur Verfügung stehender Verfahren kann in J. M. Steward und J. D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W. H. Freeman Co., San Francisco, 1969, und J. Meienhofer, "Hormonal Proteins and Peptides", Band 2, S. 46, Academic Press (New York), 1983 für Festphasenpeptidsynthesen und E. Schroder und K. Kubke, "The Peptides", Band 1, Academic Press (New York), 1965 für klassische Lösungssynthesen gefunden werden.
Eine verwandte Ausführungsform erwägt eine Zusammensetzung zum Fördern des Anheftens (Adhäsion) von Zellen an ein Substrat. Basierend auf der Fähigkeit eines Versuchspolypeptides an Blutplättchen zu binden, kann das Versuchspolypeptid benutzt werden, um Zellanheftungsaktivität zu fördern, wenn das Polypeptid auf einem Substrat immobilisiert ist. Eine Zusammensetzung, die ein Versuchspolypeptid enthält, wird benutzt, um ein Substrat zu behandeln und dadurch das in der Zusammensetzung enthaltene Polypeptid auf dem Substrat zu immobilisieren. Das Substrat kann jede Oberfläche, auf der zelladhäsionsfördernde Aktivität gewünscht wird sein und schließt Behälter für Zellkultur, medizinische Geräte, prothetische Geräte, eine synthetische Matrixfaser, ein Blutgefäß oder Vasculartransplantat, ein percutanes Gerät, künstliche Organe und ähnliches ein. Die Oberfläche kann von Glas, einer synthetischen Matrix, Nitrocellulose, Polyester, Agarose, Collagen oder einem Langketten-Polysaccharid umfaßt sein.
Immobilisierung von Polypeptiden auf Substrat kann durch eine Anzahl von Wegen durchgeführt werden und hängt inter alia von dem Substrat und dem gewünschten Immobilisierungsmechanismus ab. Verfahren zum Immobilisieren von Polypeptiden oder Verbinden sind in Fachkreisen bekannt und umfassen typischerweise covalente Bindungen zwischen einem Thiol oder einer Aminogruppe des Polypeptides mit einer reaktiven Gruppe, die auf dem Substrat vorhanden ist. Für exemplarische Polypeptidimmobilisierungsverfahren, siehe Aurameas et al., Scand J. Immunol., Band 8 Ergänzung 7:7-23 (1978); U. S. Patent-Nummern 4,493,795; 4,578,079 und 4,671,950; Klipstein et al., J. Infect. Dis., 147:318-326 (1983) und Liu et al., Biochem., 80:690 (1979). Für Beispiele zum Gebrauch von zelladhäsionsfördernden Polypeptiden siehe U. S. Patent-Nummer 4,578,079.

b) Anti-LIBS Antikörper

Die Gegenwart von Liganden-bindungskompetenten Blutplättchen in einer Flüssigkeitsprobe wird im allgemeinen durch den Gebrauch von Anti-LIBS Antikörpern detektiert. Diese Antikörper gehen einer Immunreaktion mit Epitopen auf den Blutplättchen ein, welche nach Bildung eines Komplexes aus Rezeptor und Ligand erzeugt werden. Daher werden die Antikörper im wesentlichen weder mit Blutplättchen in der Abwesenheit von Komplexbildung reagieren, noch werden sie mit nicht gebundenem Ligand reagieren. Die nach Komplexbildung erzeugten Epitope können auf dem Rezeptor, dem Liganden oder beiden lokalisiert werden. Die exakte(n) Bindungsstelle(n) der Anti-LIBS Antikörper an den Komplex können mit Techniken wie NMR, Röntgenkristallographie, Immunadsorptionschromatographie unter Verwendung von mutierten Rezeptoren und Vernetzungsreaktionen zwischen Rezeptor und Ligand untersucht werden.
Die vorliegenden Anti-LIBS Antikörper können polydonale oder monoclonale Arten sein und können unter Verwendung von wie oben für ASL beschriebene Verfahren hergestellt werden. Die Herstellung und Eigenschaften von Anti-LIBS Antikörpern sind ausführlicher in U. S. Seriennummer 417,565 diskutiert, dessen Offenbarung durch Referenz hier miteingeschlossen ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Anti-LIBS Antikörper monoclonal, wie der durch das PMI-1 Hybridom erzeugte Antikörper, der mit einer LIBS auf dem GPIIb-IIIa Adhäsin eine Immunreaktion eingeht.
Eine weitere Möglichkeit zum Detektieren von Liganden-bindungskompetenten Blutplättchen setzt Antikörper gegen Rezeptor-induzierte Bindungsstellen (RIBS) auf dem Liganden für den Rezeptor ein. Da Liganden-Bindungskompetenz durch die Erzeugung von Rezeptor-induzierten Stellen auf dem Liganden gestört werden kann, detektiert dieses Verfahren die Bildung von Komplexen aus Rezeptor und Ligand. Anti-RIBS Antikörper werden weiter in Zamarron et al. Blood 74:208a (Ergänzung 1) (1989) diskutiert.

3. Korrelation von Ergebnissen - Identifikation von Post-Bindungsdefekten

Die Ergebnisse der Analysen für aktivierungskompetente und Liganden-Bindungskompetente Blutplättchen werden mit vorher bestimmten Kriterien zum Bewerten der Gegenwart von Defekten verglichen. Die Menge an aktivierungskompetenten Blutplättchen, die bestimmt wurde, wird daher mit einem vorher bestimmten Grenzwert solcher Blutplättchen verglichen, unter welchem eine Defizienz angezeigt wird. Solch ein Referenzwert von kompetenten Blutplättchen wird im allgemeinen vor dem Test unter Verwendung ausgewählter Reaktionsbedingungen z. B. pH, Temperatur, Reaktionszeiten, etc. bestimmt, welche hierin ausführlicher beschrieben sind. Die eingesetzten Reaktionsbedingungen werden gewöhnlicherweise optimiert, um den Hinweis auf Aktivierung in normalen Blutplättchen zu maximieren. Die tatsächliche Meßung von Blutplättchen kann in jeder zweckmäßigen Form z. B. Gewicht, Zellzahl, Konzentration etc. ausgedrückt werden.
Ähnlich wird die Menge von Liganden-Bindungskompetenten Blutplättchen unter Verwendung von vorher bestimmten Reaktionsbedingungen bestimmt. Die festgestellte Menge an kompetenten Blutplättchen wird mit einem vorher bestimmten Kompetenzwert korreliert, um zu bestimmen, ob die Menge an kompetenten Blutplättchen geringer ist als der Grenzwert für Indikation eines Defektes. Ein Defekt in Ligandenbindung ist angezeigt, wenn die Gegenwart von Blutplättchen geringer ist als der vorher bestimmte Wert. Wenn Bruttoblutplättchenaggregationsdysfunktion (engl.: gross platelet aggregation dysfunction) angezeigt wird, z. B. durch Thrombaggregometrie, erlauben Hinweise auf ausreichende Mengen an Aktivierungs- und Liganden-Bindungskompetenten Blutplättchen die Identifizierung eines Post-Bindungsdefektes.

c. Diagnostische Systeme

Von der vorliegenden Erfindung werden ebenfalls diagnostische Kitsysteme zum Durchführen der beschriebenen Blutplättchen-Charakterisationen in Betracht gezogen. Ein diagnostisches System der vorliegenden Erfindung in Kitform in einer Menge, die für mindestens einen Test ausreichend ist, schließt eine Zusammensetzung ein, die Antikörper oder monoclonale Antikörpermoleküle der vorliegenden Erfindung oder Fragmente davon als getrennt verpackte Reagenzien enthält, zusammen mit einem Marker, der die Anwesenheit eines Immunreaktionsproduktes anzeigt. Gebrauchsanweisungen für das verpackte Reagenz sind typischerweise ebenfalls eingeschlossen. "Gebrauchsanweisungen" schließen typischerweise einen greifbaren Ausdruck ein, der die Konzentration des Reagenz oder zumindest ein Testverfahrenparameter wie die relative Mengen an Reagenz und Probe, die gemischt werden sollen, Zeitspannen zur Erhaltung der Reagenz/Probenmischung, Temperatur, Pufferbedingungen und ähnliches beschreiben. In einer Ausführungsform wird ein diagnostisches System zum Testen der Anwesenheit von aktivierten Blutplättchen und für einen Rezeptor-Ligandenkomplex in einer komplexenthaltenden vaskulären Flüssigkeitsprobe wie Blut oder Plasma in Betracht gezogen. Der Kit wird als geschlossene Einheit (engl.: enclosure) (Schachtel) zur Verfügung gestellt, welche einen Behälter für ASL-Moleküle enthält, die mit aktivierten Blutplättchen reagieren. Typischerweise enthält der Kit ebenfalls einen Blutplättchenagonisten zum Stimulieren normaler Blutplättchen zu ihren aktivierten Stadien. Beispielhafte Agonisten schließen ADP und Thrombin ein, während die ASL-Moleküle PAC-1 Antikörper sind. Der Kit umfaßt ebenfalls einen Behälter für AIL-Moleküle, die mit Rezeptoren auf den Blutplättchen binden, um LIBS auf dem Rezeptor zu bilden. Eine bevorzugte AIL-Verbindung ist GRGDSP.
Das diagnostische System umfaßt ebenfalls einen Behälter für Anti-LIBS Antikörpermoleküle, die mit einer LIBS eine Immunreaktion eingehen, welche sich auf dem Rezeptor- Ligandenkomplex befindet. Ein bevorzugter Anti-LIBS Antikörper ist PMI-1. Weiterhin bevorzugt sind Kits, in denen die Antikörpermoleküle an einen Radionukleotidmarker gekoppelt sind, vorzugsweise ¹²&sup5;I-markierte Antikörpermoleküle.
Ein in vitro diagnostisches System der vorliegenden Erfindung schließt einen Marker oder anzeigende Mittel ein, die in der Lage sind, die Bildung eines spezifisch gebundenen Komplexes, der ein Antikörpermolekül der vorliegenden Erfindung enthält, anzuzeigen. Die Ausdrücke "Marker" und "anzeigende Mittel" wie hier benutzt in ihren verschiedenen grammatikalischen Formen beziehen sich auf einzelne Atome und Moleküle, die entweder direkt oder indirekt an der Herstellung eines detektierbaren Signals beteiligt sind, um die Gegenwart eines Komplexes anzuzeigen. Beispielhafte Marker schließen ¹¹¹In, &sup9;&sup9;Tc, &sup6;&sup7;Ga und ¹³²I und nicht radioaktive Marker wie Biotin und enzymgekoppelte Antikörper ein. Jeder Marker oder anzeigendes Mittel kann gekoppelt oder inkorporiert sein an / mit einem Antikörpermolekül, das Teil einer Antikörper- oder monoclonalen Antikörperzusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist oder getrennt benutzt werden und solche Atome oder Moleküle können alleine oder in Verbindung mit zusätzlichen Reagenzien benutzt werden. Solche Marker selbst sind in der klinischen diagnostischen Chemie bekannt und stellen nur insofern einen Teil dieser Erfindung dar, als sie mit ansonsten neuen Verfahren und/oder Systemen benutzt werden.
Das Koppeln von Markern an Polypeptide und Proteine ist in Fachkreisen bekannt. Zum Beispiel können Antikörpermoleküle, die von einem Hybridom hergestellt werden, durch metabolische Inkorporation von Radioisotop enthaltenden Aminosäuren markiert werden, welche als Komponente in dem Kulturmedium zur Verfügung gestellt werden. Siehe z. B. Galfre et al., Meth. Enzymol., 73:3-46 (1981). Die Verfahren zur Proteinkopplung oder Kopplung durch aktivierte funktionelle Gruppen sind besonders anwendbar. Siehe z. B. Aurameas, et al., Scand J. Immunol., Band 8, Ergänzung 7:7-23 (1978), Rodwell et al., Biotech., 3:889-894 (1984) und U. S. Patentnummer 4,493,795.
Die diagnostischen Systeme können ebenfalls ein spezifisches Bindungsagens einschließen. Ein "spezifisches Bindungsagens" ist eine chemische Spezies, die in der Lage ist, selektiv eine Reagenzspezies der vorliegenden Erfindung zu binden, aber nicht selbst ein Antikörpermolekül der vorliegenden Verbindung ist. Beispielhafte spezifische Bindungsagenzien sind Antikörpermoleküle, Komplementproteine oder Fragmente davon, Protein A und ähnliche, die mit einem Antikörpermolekül dieser Erfindung eine Immunreaktion eingehen, wenn dieses als Teil eines Komplexes vorhanden ist.
In bevorzugten Ausführungsformen ist das spezifische Bindungsagens markiert. Wenn das diagnostische System jedoch ein spezifisches Bindungsagens einschließt, das nicht markiert ist, wird das Agens typischerweise als ein Verstärkungsmittel oder Reagenz benutzt. In diesen Ausführungsformen ist das markierte spezifische Bindungsagens in der Lage, das Verstärkungsmittel spezifisch zu binden, wenn das Verstärkungsmittel an einen Komplex gebünden ist, der eines der vorliegenden Reagenzien enthält.
Zum Beispiel können die diagnostischen Kits der vorliegenden Erfindung in einem "ELISA"-Format benutzt werden, um die Anwesenheit oder Quantität an Fibrinogen gebundenen Blutplättchen in einer Blutflüssigkeitsprobe wie Serum, Plasma oder Urin zu detektieren. "ELISA" bezieht sich auf einen Enzym-gekoppelten Immunsorbenztest, der einen Antikörper oder Antigen gebunden an eine Festphase und ein Enzym-Antigen- oder Enzym-Antikörperkonjugat einsetzt, um die Menge eines Antigens oder eines Antikörpers, die in einer Probe vorhanden sind, zu detektieren und zu quantifizieren. Eine Beschreibung des ELISA-Verfahrens kann in Kapitel 22 der 4. Ausgabe von Basic and Clinical Immunology von D. P. Sites et al., veröffentlicht bei Lange Medical Publications in Los Altos, CA in 1982 und in U. S. Patenten Nummer 3,654,090; Nummer 3,850,752 und Nummer 4,016,043 gefunden werden, die alle durch Referenz hier miteingeschlossen sind.
In bevorzugten Ausführungsformen kann die Antikörper- oder Antigenreagenzkomponente an einer festen Matrix angebracht werden, um einen festen Halt zu bilden, der in den betrachteten diagnostischen Systemen getrennt verpackt ist. Das Reagenz wird typischerweise durch Adsorption aus einem wäßrigen Medium an der festen Matrix angebracht, obwohl andere Möglichkeiten des Anbringens, die dem Fachmann bekannt sind, benutzt werden können. Nützliche feste Träger sind in Fachkreisen bekannt. Solche Materialien schließen vernetztes Dextran ein, das unter der Handelsmarke SEPHADEX von Pharmacia Fine Chemicals (Piscataway, NJ) erhältlich ist, Agarose, Polystyrolkügelchen von ungefähr 1 Mikron bis ungefähr 5 Millimeter Durchmesser, erhältlich von Abbott Laboratories in North Chicago, IL, Polyvinylchlorid, Polystyren, vernetzte Polyacrylamide, auf Nitrocellulose- oder Nylon-basierende Gewebe wie Blätter, Streifen, oder Stäben (engl.: paddle) oder Röhrchen, Schalen oder Vertiefungen einer Microtiterplatte wie solche, die aus Polystyrol oder Polyvinylchlorid hergestellt werden. Die Reagenzart, markiertes spezifisches Bindungsreagenz oder Amplifizierungsreagenz eines jeden diagnostischen Systems, das hier beschrieben ist, kann in Lösung, als eine flüssige Dispersion oder als ein im wesentlichen trockenes Pulver, z. B. in lyophilisierter Form zur Verfügung gestellt werden. Wo das anzeigende Mittel ein Enzym ist, kann das Enzymsubstrat ebenfalls in einer getrennten Verpackung eines Systems zur Verfügung gestellt werden. Ein fester Halt wie die vorher beschriebene Microtiterplatte und ein oder mehrere Puffer können ebenfalls als getrennt verpackte Elemente in dieses diagnostische Testsystem miteingeschlossen sein.
Die hier besprochenen Verpackungen im Bezug auf diagnostische Systeme sind solche, die üblicherweise in diagnostischen Systemen benutzt werden. Solche Verpackungen schließen Glas und Plastik (z. B. Polyethylen, Polypropylen und Polycarbonat), Flaschen, Fläschchen, Plastik und Plastikfolien-laminierte Umschläge und ähnliche ein. Gewöhnlicherweise werden die Reagenzien unter einer inerten Atmosphäre verpackt.

D. Testverfahren

Die vorliegende Erfindung zieht jedes Verfahren in Betracht, das in der Detektierung eines ASL oder einer LIBS auf einem Komplex aus Zelloberflächenrezeptor und Ligand resultiert. Vorzugsweise bindet der ASL an aktiviertes GPIIb-IIIa und die LIBS wird als Antwort auf die Bindung eines Liganden an GPIIb-IIIa exprimiert.
Die relative Bindungsaffinität eines Reagenzmoleküls für seine Zielart wird praktischerweise wie hier beschrieben unter Verwendung des Verfahrens der fluoreszenzaktivierten Flußzytometrie bestimmt. Ein Aktivierungsdefekt wird daher angezeigt, wann immer die durchschnittliche Zellfluoreszenzintensität (MCFI) einer Blutplättchen enthaltenen Probe von einem Patienten, von dem vermutet wird, daß er den Defekt trägt, weniger als ungefähr 50 % und vorzugsweise weniger als 10 % der MCFI einer normalen Blutplättchenprobe ist.
Das Verfahren zum Detektieren einer LIBS umfaßt die Bildung eines Immunreaktionsproduktes zwischen einer LIBS und einem Anti-LIBS Antikörpermolekül, wie hier beschrieben, und der anschließenden Detektion des so gebildeten Immunreaktionsproduktes. Die zu detektierende LIBS kann in einer Vaskularflüssigkeitsprobe enthalten sein, wie eine Blutplättchen enthaltende Blutprobe oder kann in einem Körpergewebe vorhanden sein. Ein Fachmann versteht, daß es vielzählige bekannte, klinische, diagnostische Chemieverfahren gibt, die benutzt werden können, um nachweisbare Immunkomplexe zu bilden. Daher ist, während beispielhafte Testverfahren hierin beschrieben sind, die Erfindung in dieser Weise nicht limitiert.
Ein besonders bevorzugtes Testverfahren setzt fluoreszenzaktivierte Flußzytometrie zum Detektieren einer LIBS ein. Demgemäß wird ein Liganden-Bindungsdefekt angezeigt, wenn immer die MCFI einer Blutplättchen enthaltenen Probe eines Patienten, von dem vermutet wird, daß er den Defekt trägt, weniger als 50 % und vorzugsweise weniger als 10 % der MCFI einer normalen Blutplättchenprobe ist, unter Verwendung der hier beschriebenen Testverfahren.
Verschiedene heterogene und homogene Testverfahren können, entweder kompetitiv oder nichtkompetitiv zum Detektieren der Anwesenheit und vorzugsweise der Menge an Fibrinogen-gebundenen Blutplättchen in einer Blutplättchen enthaltenden Körperprobe eingesetzt werden, vorzugsweise einer Körperflüssigkeitsprobe, besonders bevorzugt einer vaskulären Flüssigkeitsprobe wie Blut oder ein Blutplättchen enthaltender Teil des Blutes. Das Verfahren schließt das Mischen einer Blutplättchen enthaltenden Blutprobe mit Antikörpermolekülen, die mit Blutplättchen GPIIb-IIIa eine Immunreaktion eingehen, ein. Die so gebildete Immunreaktionsmischung wird unter biologischen Testbedingungen für eine Zeitspanne erhalten, die allen Fibrinogen-gebundenen Blutplättchen ausreicht, um mit den markierten Antikörpern eine Immunreaktion einzugehen und ein markiertes Immunreaktionsprodukt zu bilden. Die markierten Immunreaktionsprodukte werden dann von den nicht reagierten markierten Antikörpern getrennt, typischerweise durch Zentrifugation, welche ausreicht, um alle Blutplättchen, die in der Probe vorhanden sind, zu sedimentieren. Die Menge an gebildetem markiertem Immunreaktionsprodukt wird dann getestet.
Biologische Testbedingungen sind solche, die die biologische Aktivität der Antikörpermoleküle und Polypeptidmoleküle dieser Erfindung und die Fibrinogen-gebundenen Blutplättchen, die getestet werden sollen, erhält. Solche Konditionen schließen einen Temperaturbereich von ungefähr 4 Grad Celsius (4ºC) bis ungefähr 45ºC, vorzugsweise ungefähr 37ºC bei einem pH-Wert-Bereich von ungefähr 5 bis ungefähr 9, vorzugsweise ungefähr 7 und einer Ionenstärke, die von der Ionenstärke von destilliertem Wasser zu der Ionenstärke von ungefähr ein molarem Natriumchlorid variiert, vorzugsweise ungefähr der Ionenstärke von physiologischer Kochsalzlösung ein. Verfahren zum Optimieren solcher Bedingungen sind in Fachkreisen bekannt.
Insoweit als verschiedene Medikamente, wie das synthetische Peptid GRGDSP oder das Schlangengiftpeptid Trigramin benutzt werden können, um Blutplättchenfunktion durch Komplexieren von GPIIb-IIIa via der Bindungsstelle für RGD-enthaltende Liganden zu modulieren, zieht die vorliegende Erfindung ebenfalls Verfahren in Betracht, um den Grad der Bindung an der Liganden-Bindungsstelle durch das Medikament an GPIIb-IIIa zu detektieren. Das Verfahren wird im wesentlichen wie oben für die Detektion von Fibrinogen-gebundenen Blutplattchen praktiziert, außer daß ein RGD-enthaltendes Ligandenanalog und nicht Fibrinogen an die Blutplättchen gebunden hat. Das Verfahren wird praktiziert, um die Menge von gebundenem Analog (Arzneimittel) zu quantifizieren, d.h. den Grad der Bindung der RGD-Liganden-Bindungsstelle zu quantifizieren.
Die Fähigkeit der Blutplättchen Fibrinogen zu binden und/oder eine LIBS zu exprimieren, kann in einem diagnostischen Verfahren der vorliegenden Erfindung überwacht werden. Eine Blutplättchen enthaltende Körperflüssigkeitsprobe wird gemischt und mit einem GPIIb-IIIa spezifischen Liganden, wie Fibrinogen, oder einem synthetischen Peptid, wie GRGDSP oder mit anderen GPIIb-IIIa spezifischen Liganden, wie dem Fibrinogengamma-Ketten-Polypeptid (Fb gamma 400-411) für eine Zeitspanne inkubiert, die dem Liganden ausreicht, zu binden und einen Komplex mit GPIIb-IIIa enthaltendem Rezeptor auf der Blutplättchenoberfläche zu bilden. Die Menge an zugemischtem Ligand ist eine Menge, die ausreicht, die GPIIb-IIIa spezifischen LIBS, die auf den Blutplättchen in der Körperprobe vorhanden sind, zu saturieren. Die Bildung des GPIIb-IIIa-Komplexes resultiert in der Expression von LIBS auf GPIIIa in normalen Blutplättchen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine zu analysierende Blutprobe von einem Patienten entnommen und in gleiche Teile portioniert. Mindestens ein Teil wird zur Bestimmung von Aktivierungskompetenz benutzt und mindestens ein Teil wird zur Liganden-Bindungskompetenzanalyse benutzt. Die Analysen können gleichzeitig durchgeführt werden, aber werden normalerweise nacheinander durchgeführt. Wenn die Analysen nacheinander durchgeführt werden, kann die Liganden-Bindungskompetenzmessung vor oder anschließend an die Aktivierungskompetenzanalyse durchgeführt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Daten, die in der vorliegenden Aktivierungs- und Liganden-Bindungskompetenzanalyse erhalten werden, durch ein greifbares Medium, z. B. Computerspeicherung oder Festkopieversionen, aufgezeichnet. Die Daten können automatisch eingegeben und durch Standard ND-Instrumentation, die kommerziell erhältlich ist, gelagert werden. Die Daten können ebenfalls wieder aufgerufen und berichtet oder zur besten Präsentation der vorliegenden Korrelationen der Daten wie gewünscht vorgeführt werden. Entsprechend werden Instrumentation und Software, die zum Gebrauch mit den vorliegenden Verfahren geeignet sind, als im Schutzbereich der vorliegenden Erfindung liegend betrachtet.
Die vorliegende Erfindung wird umfassender durch die spezifischen Beispiele, die im nachfolgenden beschrieben sind, und die nachstehenden Ansprüche verstanden.

Beispiele

Die folgenden Beispiele illustrieren die vorliegende Erfindung, limitieren sie jedoch nicht. Basierend auf dem in Fig. 1 dargestellten Modell, kann abnormale Blutplättchen-Aggregation aus einem Defekt in der Aktivierung von Blutplättchen-Fibrinogen-Rezeptoren, einem Defekt in Fibrinogen-Bindung per se oder einem Defekt in Post-Bindungsabläufen, die für optimale Aggregation benötigt werden, entstehen. Die potentielle Nützlichkeit dieses Modelles wurde durch Studieren zweier Patienten mit anhaltenden und schweren Defekten in der Blutplättchenaggregation getestet. Um Fibrinogen-Rezeptoraktivierung und Ligandenbindung zu quantifizieren, wurde ein Fluoreszin-markierter MoAb (PAC1), der spezifisch die aktivierte Form von GPIIb-IIIa erkennt, eingesetzt (Shattil et al., J. Biol. Chem., 260:11107 (1985)). Antikörperbindung wurde in kleinen (5µl) Proben von blutplättchenreichem Plasma durch Flußzytometrie gemessen.

1. Antikörper der vorliegenden Erfindung.

Herstellung und Charakterisierung der hier benutzten Antikörper sind im Detail an anderer Stelle beschrieben und ihre Eigenschaften sind in Tabelle 1 aufgeführt. Verfahren zum Herstellen und Screenen der Antikörper, die in Tabelle 1 aufgeführt sind, sind in den folgenden Referenzen beschrieben: PAC-1: Shattil et al., J. Biol. Chem., 260:11107 (1985); PMI-1: Frelinger et al., J. Biol. Chem., 263:12397 (1988), Loftus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 840:7114 (1987); Anti-LIBS 1 und Ab15: Frelinger et al., J. Biol. Chem., 265:6346 (1990); Tab: Mcever et al., J. Biol. Chem., 258:5269 (1983); 4F10: Woods et al., J. Biol. Chem., 261:15242 (1986); 10E5: Coller et al., J. Clin. Invest., 72:325(1983); 7E3: Coller et al., J. Clin Invest., 76:901 (1985); A&sub2;A&sub9;: Gartner et al., Blood. 66:305a (1985), Bennett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80:2417 (1983); TSPI-1: Aiken et al., Blood. 69:58 (1987). Fluoreszinisothiocyanat-gekoppelte Antikörper wurden wie beschrieben hergestellt, um ein Fluoreszin/Protein molares Verhältnis von 3:6 zu erzielen (Shattil et al., Blood. 70:307 (1987)). Tabelle 1 EINGESETZTE MONOCLONALE ANTIKÖRPER
a GPIIb-IIIa Komplex
b Effekt von Antikörper auf Fibrinogen-Bindung an Blutplättchen
c Effekt von RGD oder Fibrinogen-gamma-Kette, C-terminale Peptide auf Antikörperbindung
d N. D. = Nicht bestimmt.

2. Peptide der vorliegenden Erfindung.

Peptide wurden unter Verwendung eines Applied Biosystems (Mountain View, CA) Peptidsynthetisierers und vom Hersteller empfohlenen Verfahren synthetisiert. Peptide waren mehr als 90 % homogen, gemessen durch HPLC, und Aminosaurezusammensetzungen stimmten mit der gewünschten Sequenz überein. Die Peptide waren Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro (GRGDSP), Fibrinogen gamma (402-411) = Leu-Gly-Gly-Ala- Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val (LGGAKQAGDV), Lys-Tyr-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser (KYGRGDS) und Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val (KQAGDV).

3. Analyse von Blutplättchenoberflachen GPIIb-IIIa durch Flußzytometrie.

Durch Abnahme venösen Blutes von Patienten und Kontrollen, die für mindestens 10 Tage keine Medikamente zu sich genommen hatten, wurde blutplättchenreiches Plasma erhalten, welches mit 1/10 Volumen 3,8 % Natriumcitrat antikoaguliert wurde und rote und weiße Blutzellen wurden bei 180 x g für 20 Minuten bei Raumtemperatur sedimentiert. Sofort danach wurden 5 µl-Anteile an blutplättchenreichem Plasma zur Polypropylenreaktionsgefäßen zugesetzt, die einen Fluoreszinisothiocyanat-gekoppelten monoclonalen Antikörper (10&supmin;&sup9; bis 10&supmin;&sup6; mol/l) in Tyrode's Puffer (1 % Rinderserumalbumin, 2 mmol/l MgCl&sub2;, 137,5 mmol/l NaCl, 12 mmol/l NaHCO&sub3;, 2,6 mmol/l KCl, pH 7,4) enthielten. Siehe Fig. 2. Proben wurden ohne Rühren in einem Gesamtvolumen von 50µl für 15 Minuten bei Raumtemperatur mit Agonisten und Peptiden, wie angezeigt, inkubiert. Proben wurden dann auf 0,5 ml mit Tyrode's Puffer verdünnt und auf einem FACStar Flußzytometer (Becton-Dickinson Immunocytometry Systems, Mountain View, CA) analysiert. Lichtstreuung und Fluoreszenzsignale wurden mit logarithmischem Zuwachs erhalten und 10.000 Blutplattchen in jeder Probe wurden analysiert. Die Ergebnisse sind als durchschnittliche Blutplattchen-Fluoreszenzintensität in willkürlichen Fluoreszenzeinheiten oder als Histogramme der log Blutplättchen-Fluoreszenzintensität in willkürlichen Einheiten auf der Absisse und Blutplättchenzahl auf der Ordinate dargestellt.

Die Cam-Variante von Thrombozytenschwäche ist auf einen Defekt in der Lipanden-Erkennung zurückzuführen.

Die Cam-Variante von Glanzmann's Thrombozytenschwäche ist durch erheblich reduzierte Fibrinogen-Bindung an Blutplattchen charakterisiert, die annähernd normale Mengen von GPIIb-IIIa enthalten (Ginsberg et al., J. Clin. Invest. 78:1103 (1986)). Die Anwesenheit von GPIIb-IIIa auf der Cam-Blutplättchenoberfläche wurde durch Flußzytometrie bestätigt, in der vergleichbare Bindungen eines Anti-GPIIb MoAb (Tab) und eines Anti- GPIIIa MoAb (Ab-15) an Cam und normalen Blutplättchen gefunden wurde. Zusätzlich banden ebenfalls vier MoAbs, die spezifisch für den GPIIb-IIIa-Komplex (A&sub2;A&sub9;, 7E13, 10E5, 4F10) sind, welche alle die nicht aktivierte Form von GPIIb-IIIa in einer 1:1 Stoichiometrie erkennen und Fibrinogen-Bindung an Blutplättchen inhibieren, in vergleichbaren Mengen an die Cam und normale Blutplättchen (Fig. 2); McEver et al., J. Biol. Chem., 258:5269 (1983; Woods et al., J. Biol. Chem., 258:5269 (1983); Coller et al., J. Clin. Invest. 73:325 (1983); Coller et al., J. Clin. Invest. 76:101(1985); Gartner et al., Blood. 66:305a (1985). In scharfem Kontrast dazu gab es einen vollständigen Mangel an Bindung des aktivierungsspezifischen MoAb PAC1 an ADP-aktivierte Cam Blutplättchen (Fig. 2). Dieser Defekt war nicht spezifisch für ADP-Stimulierung, da Cam Blutplättchen, die mit 50 nmol/l Phorbolmyristatacetat (PMA) aktiviert wurden, ebenfalls keinen Anstieg in PAC1 Fluoreszenz zeigten (nicht gezeigt).
Da PAC1 die Liganden-Bindungsstelle in GPIIb-IIIa erkennen kann, könnte die Abwesenheit von PAC1-Bindung auf einen Mangel an GPIIb-IIIa-Aktivierung, einen Defekt in Liganden-Bindung oder auf beides zurückzuführen sein (Shattil et al., J. Biol. Chem., 260:11107 (1985); Shattil et al., Blood, 68:1224 (1986); Taub et al., J. Biol. Chem., 264:259 (1989)). Um diese Möglichkeiten zu unterscheiden, wurde die Beobachtung ausgenutzt, daß kleine Fibrinogen-mimetische Peptide in einer aktivierungsunabhängigen Weise an GPIIb-IIIa binden (Lam et al., J. Biol. Chem., 262:947 (1987); Frelinger et al., J. Biol. Chem., 263:12397 (1988)). Die Bindung eines solchen Peptids (GRGDSP) wurde unter Gebrauch von PMI-1 und Anti-LIBS1 MoAbs getestet, welche vorzugsweise GPIIb-IIIa in einer 1:1 Stoichiometrie nach der Bindung von entweder Fibrinogen oder kleinen Peptidliganden erkennen (Frelinger et al., J. Biol. Chem., 263:12397 (1988)). Blutplättchen eines normalen Individuums zeigten einen 2,5fachen Anstieg in PMI-1- Bindung in der Gegenwart von 200 µmol/l GRGDSP (durchschnittliche Fluoreszenzintensität von unbehandelten Blutplättchen = 60 willkürliche Fluoreszenzeinheiten; GRGDSP-behandelte Blutplättchen = 151 Fluoreszenzeinheiten). Cam-Blutplättchen zeigten im Gegensatz dazu keinen Anstieg in PMI-1-Bindung als Antwort auf GRGDSP (durchschnittliche Fluoreszenzintensität von nicht behandelten Blutplättchen = 102 Fluoreszenzeinheiten; GRGDSP-behandelte Blutplättchen = 107 Fluoreszenzeinheiten) (Fig. 2).
Es sollte erwähnt werden, daß PMI-1-Bindung an nicht behandelte Cam-Blutplättchen höher war als normal, was andeutet, daß die Bindung von PMI-1 nicht als ein verläßlicher Indikator für die Bindung von GRGDSP an Cam-Blutplättchen benutzt werden konnte. Der Anti-LIBSI Antikörper war in dieser Beziehung jedoch informativer. Wie in Fig. 2 gezeigt, banden nicht behandelte Cam-Blutplättchen weniger Anti-LIBS1 als Kontrollblutplättchen (jeweils durchschnittliche Fluoreszenz von 27 und 58 Einheiten). Das Fibrinogen-mimetische Peptid GRGDSP verursachte einen vierfachen Anstieg in Anti- LIBS1-Bindung an normale Blutplättchen (durchschnittliche Fluoreszenz 205 Einheiten); jedoch wurde kein Anstieg in Antikörperbindung in Cam-Blutplättchen beobachtet (durchschnittliche Fluoreszenz 25 Einheiten). Anti-LIBS1-Bindung an Cam-Blutplättchen versagte ebenfalls anzusteigen, wenn Blutplättchen mit einem anderen Fibrinogenmimetischen Peptid gamma (402-411) (400 µmol/l) anstelle von GRGDSP (Kontrollblutplättchen 201 Fluoreszenzeinheiten; Cam-Blutplättchen 31 Einheiten) behandelt wurden (Kloczewiak et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 107:181(1982); Plow et al., J. Biol. Chem., 259:5388 (1984)).
Wenn Anti-LIBS1-Bindung über einen Bereich von GRGDSP-Peptidkonzentration untersucht wurde, zeigten Kontrollblutplättchen einen saturierbaren Anstieg in Antikörperbindung, so daß halb maximale Expressionen des LIBS1 Epitopes auf GPIIIa bei 20 µmol/l Peptid beobachtet wurde. Dies ist ähnlich der IC&sub5;&sub0; dieses Peptides für Fibrinogen- Bindung an aktivierte Blutplättchen (Plow et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82:8057 (1985)). Im Gegensatz dazu war Anti-LIBS1-Bindung an Cam-Blutplättchen bei 200 µmol/l GRGDSP geringer als die, die mit Kontroliblutplättchen in der Gegenwart von 1 µmol/l Peptid beobachtet wurde, was andeutet, daß die Affinität von Cam GPIIb-IIIa für dieses Peptid mindestens 200fach kleiner als für normales GPII-IIIa war. Siehe Tabelle 2. Tabelle 2 VERHÄLTNIS ZWISCHEN GRGDSP PEPTIDDOSIS UND LIBS-1 EXPRESSION IN NORMALEN UND CAM BLUTPLÄTTCHEN*
* Anti-LIBS-1-Bindung wurde in der Gegenwart der angegebenen Konzentrationen des GRGDSP-Peptides bestimmt.

4. Isolierung und Oberflächeniodisierung von Blutplättchen.

Die vorhergehenden Daten zeigen durch den Gebrauch von konformationsspezifischen Antikörpern und intakten Zeilen an, daß die Cam-Variante zumindest teilweise auf ein Defizit in Liganden-Erkennung durch GPIIb-IIIa zurückzuführen war. Um die Liganden- Bindungsfunktion von Cam GPIIb-IIIa direkt zu untersuchen, wurden Extrakte von ¹²&sup5;I oberflächenmarkierten Blutplättchen einer Affinitätschromatographie, unter Verwendung von immobilisiertem RGD-Peptid, unterzogen.
Blutplättchen wurden aus mit saurer Citratdextrose anticoaguliertem menschlichen Blut durch differenzielle Zentrifugation, gefolgt von Gelfiltration auf Sepharose 28, isoliert (Ginsberg et al., Blood. 69:58 (1987)). Lysate von oberflächenmarkierten Blutplättchen wurden durch KYGRGDS Affinitätschromatographie, wie von Lam et al., J. Biol. Chem., 262:947 (1987) beschrieben, analysiert. Kurz, intakte Blutplättchen wurden durch das Lactoperoxidase-H&sub2;O&sub2;-Verfahren radioiodisiert, dann auf 2 x 10&sup8; Blutplättchen/ml resuspendiert und in einem Lysispuffer, der 10 mmol/l N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure (HEPES), pH 7,5, 0,15 µmol/l NaCl, 1 mmol/l CaCl&sub2;, 1 mmol/l MgCl&sub2;, 0,1 mmol/l Leupeptin, 1 mmol/l Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF), 10 mmol/l N-Ethylmaleimid (engl.: N-ethylmaleimide) und 50 mmol/l Octylglucosid solubilisiert. Die Lysate wurden bei 4ºC für 12 Stunden mit KYGRGDS gekoppelt an CNBr-aktivierte Sepharose, inkubiert, gewaschen und mit 1 mmol/l GRGDSP eluiert. Unter diesen Bedingungen wird ungefähr 10 % des normalen GPIIb-IIIa gebunden und eluiert. Eine vergleichbare Menge wird in der Durchflußfraktion bei Re-Chromatographie gebunden, was anzeigt, daß eine weniger als 100 %ige Bindung vielmehr auf die niedrige Affinität der Interaktion zurückzuführen ist, als auf eine inaktive Subpopulation von GPIIb-IIIa.
Wenn oberflächenmarkierte normale Blutplättchen über einen KYGRGDS-Peptidträger geleitet wurden, gefolgt von dem GRGDSP-Peptid, wurden GPIIb und GPIIa gebunden und eluiert. Im Gegensatz dazu wurde mit Cam-Blutplättchen kein solches GPIIb-IIIa eluiert, selbst wenn das Ausgangsextrakt vergleichbare Mengen oberflächenmarkiertes GPIIb-IIIa enthielt. Der GPIIb-IIIa Gehalt in dem Ausgangsmaterial und in den Säulenfraktionen wurde unter Verwendung eines polydonalen Anti-GPIIb-IIIa Antikörpers in einem ELISA-Test quantifiziert. Das Kontrollextrakt enthielt 332 pg; das Cam Individuum enthielt 240 µg in dem Ausgangsextrakt. Die eluierten Fraktionen des Kontrollextraktes enthielten 20 µg GPIIb-IIIa. Im Gegensatz dazu enthielten diejenigen des Cam Extraktes 2,6 µg. Daher hat Cam GPIIb-IIIa eine Defizienz in der Erkennung von Liganden wie RGD-Peptiden.

5. Patienten.

Die Cam Variante von Glanzmann's Thrombozytenschwäche wurde im Detail beschrieben (Ginsberg et al., J. Clin. Invest. 78:1103 (1986)). Patienten mit dieser Variante haben annähernd normale Mengen an GPIIb-IIIa, nicht nachweisbare Fibrinogen-Bindung an Blutplättchen und keine Blutplättchenaggregation. Die vorliegenden Resultate wurden von zwei betroffenen männlichen Geschwistern mit identischen Resultaten erhalten. Eine 58 Jahre alte Frau, die 1984 verstärkt erhöhte Neigung zu Blutergüssen (engl.: bruising) beobachtete, wurde als von der myeloproliferativer Krankheit (MPD) befallen identifiziert. Untersuchungen zeigten eine Blutplättchenzahl von 1.500.000/µl und ein Knochenmark mit megakariozytärer Hyperplasie und Myelofibrosis. Seit der Diagnose war ihre erhöhte Neigung zu Blutergüssen konstant, welches vorwiegend ihre Extremitäten und die vordere Brust betraf und sie beobachtete gelegentliche Epistaxie. Sie hatte viermaliges Auftreten von gastromtenstinalen Blutungen, welche jeweils eine Transfusion von jeweils 2 bis 4 Einheiten (E) an RBCs benötigten. Vor dem Beginn der erhöhten Neigung zu Blutergüssen hat sie mehreren hämostatischen Herausforderungen widerstanden, einschließlich Tonsillectomie, Hämorrhoidectomie und Coccyxectomie sowie dreier unkomplizierter Vaginalgeburten. Eine übliche physische Untersuchung verlief normal außer für Hepatospienomegalie und allgemeine erhöhte Neigung zu Blutergüssen. Kürzliche Laborkenntnisse: Hämatokrit 33, weiße Blutzellzahl 29.600/µl mit 27 Neutrophilen, 18 stabkernige Granulocyten, 12 Metamyelocyten, 11 Myelocyten, 8 Blastenzellen, 2 Monocyten, 21 Lymphocyten, 7 Basophile und 6 kemhaltige RBCs. Der Patient hatte eine abnormale Blutungszeit von > 20 Minuten und ein normales Gerinnungsprofil (Prothrombinzeit, aktivierte partielle Thromboplastinzeit, Thrombinzeit und Fibrinspaltprodukte) und von Willebrand Gruppe (engl.: panel) (von Willebrand Antigen und Ristocetin Cofaktoraktivität und normale von Willebrand Multimerverteilung). Blutplättchenaggregationsuntersuchungen, die durchgeführt wurden, während keine Medikamente eingenommen wurden, zeigten keine Aggregation bei 10 und 100 µmol/l Adenosindiphosphat (ADP), 50 µmol/l Epinephrin und Collagen.

Reduzierte Blutdlättchenaggregation in einem Patienten mit Myelofibrosis wird durch einen Defekt in der Aktivierung von GPIIb-IIIa verursacht.

Als nächstes wurde diese Strategie auf die Charakterisierung eines Patienten mit Myelofibrose und einem erworbenen schweren Defekt in der Blutplättchenaggregation angewendet. Blutplättchen von diesem Patienten (MPD) exprimierten keine PAC1-Bindungsstellen, wenn sie mit 10 µm ADP (Fig. 3) oder 50 µmol/l Epinephrin (nicht gezeigt) stimuliert wurden, was einen Defekt entweder in der GPIIb-IIIa-Aktivierung oder Liganden-Bindung anzeigt.
Im Gegensatz zu dem Cam Patienten waren Anti-LIBS1 und PMI-1 Signale in der Anwesenheit und Abwesenheit von GRGDSP ähnlich zu der normalen Kontrolle (Fig. 3), was intakte Liganden-Bindungsfunktion andeutet. Weiterhin band PAC1 an die MPD-Blutplättchen als Antwort auf PMA, welches normale Rezeptor vermittelte Wege durch direkte Aktivierung von Proteinkinase C umgeht. Die Blutplättchen des Patienten zeigten ebenfalls normale α-Granulum Sekretion als Antwort auf PMA, wie durch Obertlächenexpression des α-Granulum Proteins-Thrombospondin nachgewiesen. Der Aggregationsdefekt in den Blutplättchen des Patienten konnte durch Suspendieren ihrer Blutplättchen in normalem Plasma nicht umgekehrt werden und der Effekt konnte in normalen Blutplättchen nicht durch inkubation mit dem Plasma des Patienten induziert werden. Daher hat das GPIIb-IIIa dieses Patienten das Potential RGD-Liganden zu binden, jedoch scheint ein intrinsischer zellulärer Defekt in Rezeptor-vermittelter Aktivierung von GPIIb-IIIa aufzutreten.

6. Diskussion der Beispiele 1 - 5

Seit zwei Jahrzehnten wurden Untersuchungen der Blutplättchenaggregation in vitro routinemäßig in der Charakterisierung von Patienten mit verlängerter Blutungszeit oder einer Blutungsdiathese bedingt durch Blutplättchendysfunktion benutzt. Die Ergebnisse von kürzlichen Untersuchungen haben gezeigt, daß normale Aggregation die Bindung von Fibrinogen an Blutplättchen GPIIb-IIIa benötigt. Weiterhin kann der Aggregationsprozeß als eine Serie von notwendigen zellulären Abläufen gesehen werden: (a) Agonisteninduzierte Aktivierung von GPIIb-IIIa, welche in der Exposition der Fibrinogen-Bindungsstelle resultiert; (b) Fibrinogen-Bindung; und (c) Post-Bindungsabläufe, die auf Liganden-Bindung folgen (Fig. 1). Basierend auf dem Flußzytometrieversuch, wie oben beschrieben, ist es möglich, Störungen der Blutplättchenaggregation in Bezug auf diese Serie von Abläufen zu klassifizieren. Das hier benutzte flußzytometrische Verfahren ist schnell und kann an blutplättchenreichem Plasma oder am Gesamtblut durchgeführt werden. Dieser Ansatz wurde durch das zur Verfügung stehen von MoAbs, die zwischen ruhenden, aktivierten und Liganden-gebundenen Formen von GPIIb-IIIa unterscheiden können, möglich gemacht. Diese drei Typen von Blutplättchendysfunktionen, die zu reduzierter Blutplättchenaggregation und den vorhergesagten flußzytrometrischen Ergebnissen führen können, sind in Tabelle 3 zusammengefaßt. Tabelle 3 FLUSSZYTROMETRISCHE ANALYSE VON BLUTPLÄTTCHENAGGREGATIONSDYSFUNKTIONEN
Positive (+) oder vernachlässigbare (-) Antwort.
a Agonistenstimulierte Blutplättchenaggregation
b + = Verstärkte Bindung von aktivierungsabhängigem Liganden (PAC 1 Antikörper) als Antwort auf Agonisten
+ = Verstärkte Bindung von bindungsabhängigem Antikörper (Anti-LIBS 1) in der Gegenwart von aktivierungsunabhängigem Liganden GRGDSP.
Unter Verwendung dieses Ansatzes wurde gefunden, daß eine Variante der Glanzmann's Thrombozytenschwäche auf einen Defekt in der Liganden-Bindungsfunktion von GPIIb-IIIa zurückzuführen ist und daß die erheblich reduzierte Aggregation in einem Patienten mit Myelofibrose auf einen Defekt in agonistenspezifischer Aktivierung von GPIIb-IIIa zurückzuführen ist.
Während ein Patient, der Post-Bindungsdysfunktionen hat, hier nicht identifiziert ist, könnten Patienten mit solch einem Leiden später identifiziert werden. Post-Bindungsdefekte könnten den Prozeß der agonisteninduzierten Blutplättchen Desensibilisierung erklären. Zum Beispiel zeigen nicht gerührte Blutplättchen, die für mehr als 10 Minuten mit ADP oder Epinephrin in der Gegenwart von Fibrinogen aktiviert werden, eine deutliche Reduzierung in der nachfolgenden Aggregationsantwort, wenn sie mit den selben Blutplättchen verglichen werden, die ohne Fibrinogen inkubiert wurden (Peerschke et al., Blood. 57:663 (1981); Shattil et al., Blood, 68:1224(1986)). Dies kann nicht durch eine Reduktion in Fibrinogen-Bindung erklärt werden. Es werden viele Patienten in der klinischen Praxis mit einer erhöhte Neigung zu Blutergüssen, einer verlängerten Blutungszeit und einer verringerten Blutplättchenaggregation als Antwort auf einen oder mehrere Agonisten angetroffen. Nach Ausschluß von Aspirineinnahme und Speicherkrankheit (engl.: storage pool disease) ist die zugrundeliegende Ursache gewöhnlicherweise nicht offensichtlich. Diese Gruppe von Individuen wird oft bezeichnet als habe sie "Aspirin ähnliche" Defekte und einige können angeborene oder erworbene metabolische Blutplättchendefekte haben, die zu Abnormalitäten der GPIIb-IIIa-Aktivierung führen. Es scheint wahrscheinlich, daß in dieser heterogenen Gruppe von Patienten ebenfalls Individuen mit dem Post-Bindungsdysfunktionsphänomen identifiziert werden.
Die Cam Variante der Thrombozytenschwäche scheint in erster Linie auf einen Defekt in der Ligandenerkennung durch GPIIb-IIIa zurückzuführen zu sein. Diese Schlußfolgerung basiert auf (1) dem Fehlschlag von Cam GPIIb-IIIa an ein insolubilisiertes RGD-Peptid zu binden und (2) einer mehr als 200fachen Reduktion der Fähigkeit von aktivierungsunabhängigen Peptidliganden die Bindung des bindungsabhängigen Anti-LIBS1 Antikörpers zu steigern. Vorherige Untersuchungen mit proteolytischen Fragmenten von Fibrinogen und Fibrinogen-verwandten Peptiden implizieren die Erkennung von RGD und Fibrinogen-gamma-Kettenpeptidsequenzen in Fibrinogenbindung (Kloczewiak et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 107:181 (1982); Plow et al., J. Biol. Chem., 259:5388 (1984); Plow et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82:8057 (1985); Ginsberg et al., J. Biol. Chem., 260:3931 (1985)). In der vorliegenden Studie fehlte GPIIb-IIIa, welches nicht in der Lage war, diese Peptidsequenzen zu binden, die Fähigkeit, Fibrinogen-Bindung und Blutplättchenaggregation zu unterstützen. Im Hinblick auf die apparente autosomal-rezessive Vererbung der Cam Variante und des schweren funktionellen Defektes in GPIIb-IIIa und des unmittelbaren funktionellen Defektes der Eltern, ist es wahrscheinlich, daß der grundlegende Cam Defekt durch eine Punktmutation in GPIIb-IIIa bedingt ist (Ginsberg et al., J. Clin. Invest., 78:1103 (1986)). Solch eine Punktmutation wurde kürzlich in einem Cam Patienten identifiziert (Loftus et al., Blood. 74:58A, Ergänzung 1 (1989)). Die Beobachtung, daß dieser einzelne Aminosäureaustausch zum Verlust der Bindung von sowohl der RGD- und der gamma-Ketten-Peptidsequenz führt, favorisiert die Möglichkeit, daß beide Peptidsequenzen durch eine gemeinsame Bindungsstelle erkannt werden (Lam et al., J. Biol. Chem., 263:12397 (1988)).
Der PAC1 Antikörper wurde benutzt, um GPIIb-IIIa-Aktivierung zu überwachen, da er selektiv und mit hoher Affinität an stimulierte Blutplättchen bindet (Plow et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82:8057 (1985)). Weiterhin, basierend auf der Inhibition von PAC1- Bindung durch Fibrinogen und Fibrinogen-mimetische Peptide und die Kapazität von Peptiden, die aus der hypervariablen Region von PAC1 abstammen, Fibrinogen-Bindung zu inhibieren, scheint es wahrscheinlich, daß dieser Antikörper die Liganden-Bindungsstelle in GPIIb-IIIa erkennt (Shattil et al., Blood. 73:150 (1989); Bennet et al., J. Biol. Chem., 263:12948 (1988); Taub et al., J. Biol. Chem., 264:259 (1989)). Diese Hypothese wird stark gestützt durch die Erkenntnis, daß PAC1 versagt die Cam Mutante GPIIb-IIIa zu erkennen, welche die Liganden-Bindungsfunktionen nicht besitzt. Das Versagen von PAC1 mit Cam Blutplättchen zu interagieren ist wahrscheinlich nicht auf die Brutto-Denaturierung (engl.: gross denaturation) von GPIIb-IIIa zurückzuführen, da vier andere komplexspezifische Anti-GPIIb-IIIa-Antikörper im selben Maße wie Anti-GPIIb oder Anti-GPIIIa Antikörper zu binden scheinen. Von diesen vier Antikörpern bindet 7E3 schneller an aktivierte Zellen und A&sub2;A&sub9; wird durch synthetische Peptide, die von der Fibrinogen-gamma-Kette abgeleitet sind, inhibiert (Coller et al., J. Clin. Invest., 76:101 (1985); Bennett et al., J. Biol. Chem., 263:12948 (1988)). Da Cam GPIIb-IIIa die Fähigkeit fehlt, Fibrinogen oder die Peptid-Liganden zu erkennen, erscheint es wahrscheinlich, daß diese vorherigen Erkenntnisse auf eine indirekte Beziehung zwischen den 7E3 und A&sub2;A&sub9; Epitopen und der Liganden-Bindungsstelle von GPIIb-IIIa zurückzuführen sind. GPIIb-IIIa ist ein Mitglied der Integrinfamilie von strukturell verwandten Adhäsenrezeptoren (Hynes et al., Cell, 48:549(1987); Pytela et al., Science. 231:1559 (1986); Ginsberg et al., J. Biol. Chem., 262:5437 (1987); Charo et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 83:8351 (1986)). In dieser Familie sind ein Blutplättchencollagenrezeptor, Leukozytenrezeptoren, die in Entzündung und Abwehr gegen pyogenetische Infektionen beteiligt sind und Rezeptoren, die in Lymphozyten Homing beteiligt sind, eingeschlossen (Staatz et al., J. Cell Biol., 108:1917 (1989); Anderson et al., Annu. Rev. Med., 38:175 (1987); Holzmann et al., Cell 56:37 (1989)). Im Falle der Leukozytenrezeptoren haben kürzliche Untersuchungen berichtet, daß Aktivierung dieser Rezeptoren Leukozytenaggregation und Adhärenz von Endothelialzellen induziert (Harlan et al., Blood. 66:167 (1985)). Weiterhin wurden bindungsabhängige MoAbs, die gegen ein Endothelialzellintegrin gerichtet sind, hergestellt (Frelinger et al., J. Biol. Chem., 265:6346 (1990)). Dies läßt vermuten, daß aktivierungsspezifische und bindungsabhängige Antikörper gegen andere Integrine hergestellt werden können wie angezeigt und benutzt werden können, um Leukozytendysfunktion in einer analogen Weise zu der hier für GPIIb-IIIa beschriebenen Weise zu analysieren. In der Tat sollten diese Strategien ebenfalls schnelle Analyse der Bindungsfunktionen von nicht Integrin-Rezeptoren erlauben.

7. Herstellung von Anti-LIBS Antikörpern

A. Isolierung von GPIIb-IIIa

(1) Blutplättchenisolierung

60 Milliliter (ml) von menschlichem Gesamtblut wurde in 5 ml von ACD (0,065 M Zitronensäure, 0,085 M Natriumcitrat, 2 % Dextrose) gesammelt, welches Hirudin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) in einer Endkonzentration von 0,06 Einheiten pro Milliliter (E/ml) enthielt und für 15 Minuten bei 120 x g zentrifugiert. Der resultierende Überstand, designiertes Blutplättchen reiches Plasma (PRP) wurde wiedergewonnen, isoliert und weiter für 15 Minuten bei 1.200 x g zentrifugiert, um ein Sediment von insolierten Blutplättchen zu bilden. Der gebildete Überstand wird gesammelt und als blutplättchenarmes Plasma in anderen Tests benutzt.

(2) GPIIb-IIIa-Isolierung von Blutplättchen

Ein wie in Beispiel 7A(1) hergestelltes Sediment aus Blutplättchen wurde in 5 ml TBS (0,15 M NaCl, 0,2 M Tris, pH 7,4, 0,5 mM CaCl&sub2;, 0,01 mM Leupeptin) resuspendiert und für 10 Minuten auf Eis bei einer maximalen Einstellung unter Verwendung des Sonicators Modell W-375 (Heat Systems Ultrasonics, Plainview, NY) sonifiziert. Die sonifizierte Suspension wurde zweimal unter Verwendung eines Trockeneismethanoleisbades eingefroren und aufgetaut und bei -20ºC gelagert. Das gefroren/aufgetaute Blutplättchensonikat wurde auf 5 ml einer Sucroselösung geschichtet (40 % v/v in TBS) und bei 4ºC für 1 Stunde bei 38.000 Rotationen pro Minute (RPM) in einem SW41 Zentrifugenrotor (Beckmann Instruments, Fullerton, CA) zentrifugiert, um einen milchig-gefärbten Zwischenüberstand (engl.: infranatant) zu bilden. Der milchige Zwischenüberstand wurde dann wiedergewonnen und bei 43.000 RPM in einem SW50.1 Zentrifugenrotor (Beckman) bei 4ºC für 1 Stunde zentrifugiert. Das resultierende Sediment wurde typischerweise in 1-2 ml TBS resuspendiert, um eine Blutplättchenmembranlösung zu bilden, dessen Proteinkonzentration bestimmt wurde in einem Bereich von 10-25 mg/ml zu liegen, unter Verwendung des Bio-Rad Proteintestkits (Bio-Rad Richmond, CA) gemäß den Instruktionen des Herstellers.
Die Blutplättchenmembranlösung wurde wiederum in einem SW50.1 Zentrifugenrotor wie oben zentrifugiert und das resultierende Sediment in 2 ml eines Extraktionspuffers (0,03 M Tris, pH 7,4, 0,01 mM Leupeptin, 200 mM n-Octyl-beta-D-glucopyranosid; Calbiochem-Behring, La Jolla, CA) resuspendiert. Das so gebildete Blutplättchenmembranextrakt wurde durch steriles Schütteln gründlich gemischt und dann bei Raumtemperatur für 30 Minuten erhalten. Das Extrakt wurde danach bei 45.000 RPM in einem SW50.1 Zentrifugenrotor für 1 Stunde bei 4ºC zentrifugiert und der so geformte Überstand des Blutplättchenmembranextraktes wurde wiedergewonnen.
Der wiedergewonnene Überstand wurde auf eine LKB Ultrogel Aca 34 Gelfiltrationssäule (3 x 97 cm, LKB Instruments, Gaithersburg, MD) geladen, welche mit einem Liter Säulenpuffer (0,03 M Tris, pH 7,4, 0,1 mM CaCl&sub2;, 0,1 % n-Octyl-beta-D-glucopyranosid) equilibriert worden war und 5ml Fraktionen wurden von dem resultierenden Säulenausfluß gesammelt. Die optische Dichte jeder Fraktion bei 280 Nanometer wurde bestimmt und Fraktionen um die mehreren Säulenmaxima (engl.: peak) wurden kombiniert, um einen Pool für jedes Säulenmaximum zu bilden. Proben von jedem Säulenmaximum wurden durch Elektrophorese in 6 % Polyacrylamid Flachgelen unter Verwendung des reduzierenden Puffers und Verfahren, die von Laemmli, Nature (London), 227:680-685 (1970) beschrieben wurden und Proteinstandards mit geringem Molekulargewicht (Bio- Rad, Richmond, CA), die von einer Größe von 14,4 Kilodalton (KDa) bis 92,5 KDa reichten, analysiert. Der Pool, der vorwiegend 2 Proteinarten mit Molekulargewichten, die GPIIb und GPIIIa entsprachen, enthielt, d.h. jeweils 120 KDa und 100 KDa, wurde wiedergewonnen. Die Proteinkonzentration der so hergestellten isolierten GPIIb-IIIa Präparation wurde typischerweise unter Verwendung des Bio-Rad Proteintestkits als im Bereich von 0,3 bis 0,8 mg/ml liegend bestimmt.

(3) Polypeptidaffinität

Isolierung von GPIIb-IIIa

Synthese eines Peptids mit der Formel Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys wurde unter Verwendung des Verfahrens von Merrifield, J. Am. Chem. Soc.. 85:2149-54 (1963) erreicht oder von Peninsula Laboratories (Belmont, CA) gekauft. Alle Peptide waren mehr als 90 % homogen, wenn sie durch "high performance liquid chromatography" (HPLC) unter Verwendung einer C&sub1;&sub8; Bondapaksäule und einem 0-60 % linearen Gradienten von Acetonitril in 0,1 % Trifluoressigsaure analysiert wurden. Affinitätsträger, die das immobilisierte Peptid Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys enthielten, wurden durch Kopplung des Peptids an Cyanbromid-aktivierte Sepharose 48 (Pharmacia P-L Biochemicals, Piscatawai, NJ) gemäß den Instruktionen des Herstellers hergestellt. Der Affinitätsträger, der das immobilisierte Peptid enthielt, wurde in Säulen (0,7 x 15 cm) geladen und mit PBS bei pH 7,5, welches 50 mM Octylglucosid, 1 mM Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF), 1 mM CaCl&sub2; und 1 mM MgCl&sub2; bei 4ºC enthielt, equilibriert. Der Überstand aus Blutplättchenmembranextrakt, der gemäß Beispiel 7A (2) hergestellt wurde, wurde auf den Affinitätsträger, der Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys enthielt, geladen. Nicht gebundene Proteine wurden mit 100 ml PBS, welches 25 mM Octylglucosid, 1 mM PMSF, 1 mM CaCl&sub2; und 1 mM MGCl&sub2; (Säulenpuffer) enthielt, geladen. Gebundenes GPIIb-IIIa wurde dann durch Waschen der Säule mit 10 ml Säulenpuffer, der das designierte Peptid in einer Konzentration von 1,7 mM enthielt, eluiert, gefolgt von einem anderen Waschschritt mit 10 ml des Säulenpuffers. Fraktionen von jeweils 2,5 ml wurden gesammelt und die Proteine in jeder Fraktion durch Elektrophorese auf Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelen (7,5 %) nach Reduktion mit 10 % 2-Mercaptoethanol analysiert. Die Proteinbanden wurden durch Farbung mit Coomassie Blue gemäß den in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley and Sons, NY, 1987 beschriebenen Verfahren, visualisiert.

(4) Immunaffinitätsisolierung von GPIIb-IIIa

Durch Kopplung des Antikörpers PMI-1 (der an GPIIb bindet, ATCC, Rockville, MD) an Affi-Gel 10 (Biorad, Richmond, CA) bei 4 mg Antikörper pro ml an die Matrix unter Verwendung der Instruktionen, die vom Hersteller der aktivierten Matrix zur Verfügung gestellt wurde, wurde eine Immunaffinitätssäule hergestellt. Blutplättchen, die gemäß Beispiel 1A (6 x 10¹&sup0;) hergestellt wurden, wurden in 1 ml an 50 mM Octylglucosid in einem Säulenpuffer, der aus 10 mM N-(2-Hydroxyethyl]piperazin-N-[2'ethansulfonsäure] (HEPES), 1 mM CaCl&sub2;, 1 mM MgCl&sub2;, 0,15 M NaCl, 1 mg/ml Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF), 1,25 mg/ml N-Ethylmaleimid und 0,1 mg/ml Leupeptin bestand, lysiert. Das unlösliche Material wurde durch Zentrifugation bei 45.000 RPM in einem SW 50.1 Rotor für eine Stunde bei 4ºC entfernt. Der Überstand, der als Blutplättchenlysat bezeichnet wurde, wurde gesammelt, das Peptid Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro (GRGDSP) in einer Konzentration von 1 mM zugemischt und danach mit 2 ml Antikörper-Affi-Gel 10 gemischt und für 12 bis 18 Stunden bei 4ºC erhalten. Die Mischung wurde dann in eine Säule gegeben und mit 10 Säulenvolumen des Säulenpuffers, der 1 mM des Peptids Gly-Arg-Gly-Asp- Ser-Pro und 25 mM Octylglucosid enthielt, gewaschen und mit 5 Säulenvolumen des Säulenpuffers bei pH 5, der 25 mM Octylglucosid und kein Peptid enthielt, eluiert. Die eluierten Fraktionen wurden sofort zu pH 7,2 neutralisiert, vereinigt und gegen Säulenpuffer, der 5 mM Octylglucosid enthielt, dialysiert. Die Proteinkonzentration der so hergestellten isolierten GPIIb-IIIa-Präparation wurde unter Verwendung des Bio-Rad Proteintestkits bestimmt.

B. Herstellung von monoclonalen Antikörperzusammensetzungen

Monoclonale Antikörper, die GPIIb-IIIa aktivieren und mit einer Liganden-induzierten Bindungsstelle auf GPIIb-IIIa eine Immunreaktion eingehen, werden unter Verwendung von Standardhybridomtechnologie mit den erwähnten Ausnahmen hergestellt. Kurz, zwei Balb/c-Mäuse wurden jeweils 4 mal in einwöchigen Intervallen mit ansteigenden Dosen (1 µg, 10 µg, 25 µg, 50 µg und 100 µg) intraperitoneal mit Immunogen immunisiert, welches aus dem Rezeptor-Ligandenkomplex, dem affinitätsisolierten GPIIb-IIIa (1,25 mg/ml) und dem Peptid Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro mit 3 mg/ml bestand, wie in Beispiel 7A (3) hergestellt. Das Immunogen wurde 1:1 in vollständigem Freund's Adjuvans für die erste Immunisierung verdünnt, die zweite und dritte Immunisierung in unvollständigem Freund's Adjuvans verdünnt und für die vierte Immunisierung in normaler Kochsalzlösung verdünnt. Drei Tage nach der vierten Immunisierung wurden ungefähr 1 x 10&sup8; Lymphocyten aus den Milzorganen beider Mäuse isoliert, einer Suspension beigemischt und mit 5 x 10&sup7; P3X63AG8.053 Mausmyelomzellen unter Verwendung von 50 % PEG 1500 als Zellfusionspromoter fusioniert. Die resultierenden transformierten (fusionierten) Antikörper herstellenden Zellen (Hybridome) wurden zuerst in eine Microtiterplatte mit 96 Vertiefungen bei einer Dichte von ungefähr 1 x 10&sup6; Zellen pro Vertiefung übertragen und in selektivem HAT-Medium kultiviert.
Zellkulturüberstände von ungefähr 2000 Vertiefungen schienen lebensfähige HAT- resistente Hybridomzellen nach 8 Tagen Kultivierung zu enthalten und wurden in dem in Beispiel 7C (1) beschriebenen ELISA-Test auf die Anwesenheit von Antikörpermolekülen, die mit Plastik immobilisiertem GPIIb-IIIa eine Immunreaktion eingehen, gescreent. Ungefähr 44 Hybridomkulturen wurden identifiziert, die GPIIb-IIIa immunreaktive Antikörpermoleküle herstellen. Die isolierten Hybridome wurden dann zweimal durch limitierende Verdünnungen subkloniert, um ungefähr 1 Zelle pro Vertiefung zu erhalten. Es wurde demonstriert, daß 24 der resultierenden Hybridomkulturen auf der Basis von 3 Kriterien monoclonalen Ursprungs waren: (1) Jeder Überstand war von dem Focus einer einzigen Zelle und ging mit GPIIb-IIIa in dem ELISA-Screen eine Immunreaktion ein, (2) jeder Überstand zeigte eine einzige homogene Bande, wenn er mit Celluloseacetatgelelektrophorese gemäß dem in Monoclonal Antibodies: Principles and Practice. J. W. Goding, ed., Academic Press, Inc., Orlando, Florida, 1983 beschriebenen Verfahren analysiert wurde, und (3) jeder Überstand enthielt einen einzigen Isotyp an Immunglobulin, wenn er unter Verwendung des Maus Ig Screening und Isotypenkits gemäß den vom Hersteller, Boehringer-Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana zur Verfügung gestellten Instruktionen analysiert wurden. Ergebnisse der Isotypenanalyse einiger charakterisierter Hybridomüberstände sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4 GRGDSP Modulierung von LIBS Epitopexpression in ELISAs, um Anti-LIBS monoclonale Antikörper zu identifizieren
a Untereinheitenspezifität wurde durch Wester blotting, wie in Beispiel 7B beschrieben, bestimmt.
b B/B&sub0; zeigt das Verhältnis der gemessenen Absorption bei A490 in der Gegenwart (B) von Blutplättchenlysat (äquivalent zu 5 x 10&sup8; Blutplättchen/ml) zu der gemessenen Absorption bei A490 in der Abwesenheit (B&sub0;) des Lysates an. Das Verhältnis B/B&sub0; wurde jeweils in der Anwesenheit (+) von GRGDSP (1 mM) und in der Abwesenheit (-) von GRGDSP bestimmt.
c Eine Veränderung in B/B&sub0; nach Zusetzen von GRGDSP zeigt die Anwesenheit einer LIBS an. Es wurde angenommen, daß Antikörper Anti-LIBS-Antikörper sind, wenn die prozentuale Änderung in B/B&sub0; größer als 20 % war.
d ND = nicht bestimmt
e PMI-1 und PMI-2 wurden in einer getrennten Immunisierung und Fusion unter Verwendung von Blutplättchenmembranen als Immunogen wie bei Schadle et al., J. Cell Biol., 99:2056-60 (1984) beschrieben, erzeugt und nach Anti-LIBS-Aktivität wie hierin beschrieben gescreent.
Das oben beschriebene Screening-Verfahren resultierte in der Identifizierung von 22 Hybridomen, die Antikörpermoleküle produzieren, welche mit Plastik immobilisiertem GPIIb-IIIa eine Immunreaktion eingehen.
Um Hybridome zu identifizieren, die Antikörpermoleküle herstellen, welche mit einer Liganden-induzierten Bindungsstelle (LIBS) auf GPIIb-IIIa (d.h. ein GPIIb-IIIa-LIBS) eine Immunreaktion eingehen, wurde ein Kompetitions-ELISA Screen, wie in Beispiel 7C (2) beschrieben und im folgenden erläutert, durchgeführt, in welchem die Immunreaktionsmischung in der Gegenwart und Abwesenheit eines GPIIb-IIIa-spezifischen Liganden erhalten wurde, um eine GPIIb-IIIa-LIBS zu exprimieren. Anti-GPIIb-IIIa LIBS Antikörpermoleküle sind solche, die eine größere Affinität einer Immunreaktion mit GPIIb-IIIa zeigen, als wenn sie in der Gegenwart eines GPIIb-IIIa spezifischen Liganden im Vergleich zu der Messung in der Abwesenheit eines spezifischen Liganden gemessen werden, so daß die größere Affinität eine Änderung in dem Verhältnis der Absorption bei 490 nm (B/B&sub0;) von größer als 20 % darstellt, wenn in der Gegenwart (im Vergleich zu der Abwesenheit) von GPIIb-IIIa spezifischem Liganden gemessen.
Zwölf Hybridome wurden aus der Gruppe von 22 Hybridomen in Tabelle 4 identifiziert, die Antikörpermoleküle herstellen, welche mit GPIIb-IIIa LIBS eine Immunreaktion eingehen und welche Hybridome hier, wie in Tabelle 4 gezeigt, als LIBSa-LIBSm bezeichnet werden.
Zusätzlich ist ersichtlich, daß andere Anti-LIBS-Antikörpermoleküle durch die offenbarten Verfahren isoliert wurden, wie in Tabelle 4 gezeigt, welche mit anderen LIBS-Epitopen, die auf den GPIIb oder GPIIIa Untereinheiten der Blutplättchenrezeptoren vorhanden sind, eine Immunreaktion eingehen.
Besonders bevorzugt sind die Antikörper, die verstärkte Affinität für eine Immunreaktion mit einem LIBS-Epitop, wie in Tabelle 4 detektiert, zeigen. Dies sind Antikörper, die nach Zusetzen des spezifischen Liganden eine Änderung in B/B&sub0; von mehr als 25 %, bevorzugt 30 % und besonders bevorzugt von 40 %, zeigen.
Die Lokalisierung der jeweils detektierten GPIIb-IIIa-LIBS durch die in Tabelle 4 gezeigten monoclonalen Antikörper, wurden den Untereinheitsregionen des Blutplättchenrezeptors durch Western Immunblotting gemäß der allgemeinen Methoden beschrieben von Tobwin et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 76:4350-54 (1979), zugeordnet. Kurz, in Beispiel 7A (2) isoliertes GPIIb-IIIa wurde einer Elektrophorese auf 7,5 %igen SDS Polyacrylamidgelen (SDS-PAGE) unter reduzierenden Bedingungen unterworfen, auf eine Membran transferiert und mit Überständen aus den in Tabelle 4 gezeigten Hybridomen einer Immunreaktion ausgesetzt. Die gebildeten Immunreaktionsprodukte aus den in den Hybridomüberständen zur Verfügung gestellten monoclonalen Antikörpern und den GPIIb-IIIa Proteinuntereinheiten auf den Membranen wurden unter Verwendung von biotinyliertem sekundären Antikörper und Avidin-gekoppelter Peroxidase gemäß den Instruktionen des Herstellers (Vectastain ABC Method, Vector Laboratories, Burlingame, CA) detektiert.
Die Ergebnisse des Zuordnens durch Western Immunoblot (engl.: mapping) zeigte, daß die meisten Hybridomüberstände Antikörpermoleküle enthielten, die mit einem Protein, das ein apparentes Molekulargewicht von 120 Kilodaltons (KDa) 20 KDa oder 100 KDa in SDS-PAGE hatte, was jeweils der GPIIb schweren Kette (hGPIIb), der GPIIb leichten Kette (IGPIIb) oder GPIIIa entspricht, eine Immunreaktion eingingen. In wenigen Fällen reagierten die Antikörpermoleküle mit keinem der isolierten GPIIb-IIIa Untereinheiten, was ihre Untereinheitenspezifität uncharakterisiert beläßt. Die bestimmten Untereinheitspezifitäten sind in Tabelle 4 gezeigt.
So ist ersichtlich, daß das z. B. von Hybridom LIBSa hergestellte monoclonale Antikörpermolekül, welches hier ebenfalls als LIBSa oder als LIBS1 bezeichnet wird, mit der GPIIIa Untereinheit des GPIIb-IIIa Blutplättchenrezeptors eine Immunreaktion eingeht. Zusätzlich geht das LIBSa Antikörpermolekül eine Immunreaktion mit dem LIBS1 Epitop, das auf einem Rezeptor-Ligandenkomplex, umfassend GPIIb-IIIa und einen GPIIb-IIIa spezifischen Liganden, vorhanden ist, ein.
Es wurden ebenfalls monoclonale Antikörperzusammensetzungen, umfassend isolierte Antikörpermoleküle, durch Isolierung der Antikörpermoleküle aus der Bauchhöhlenflüssigkeit einer Maus, die eine der in Tabelle 4 gezeigten Hybridomzellinien enthält, hergestellt unter Verwendung von Protein A-Sepharose, die typischerweise von Pharmacia Inc. (Piscatawai, NJ) erhalten wurde, und gemäß den Instruktionen des Herstellers benutzt wurde.
Die benötigte Proteinkonzentration von isolierten Antikörpermolekülzusammensetzungen wurde unter Verwendung des Bio-Rad Proteintestkits (Bio-Rad, Richmond, CA) gemäß den Instruktionen des Herstellers bestimmt.
Um eine monoclonale Antikörperzusammensetzung, die ¹²&sup5;I-markierte Antikörpermoleküle enthalt, herzustellen, wurden 350 Mikroliter (µl) an PBS (0,15 M NaCl, 0,01 M Natriumphosphat, pH 7,09), welches 1 Milligramm pro Milliliter (mg/ml) der oben isolierten Antikörpermoleküle enthielt, mit 40 Mikrogram (pg) an Chloramin-T und 1 Millicurie (mCi) an trägerfreiem Na¹²&sup5;I (Amersham, Arlington Heights, IL) gemischt. Die resultierende Mischung wurde für 5 Minuten bei 20ºC erhalten und dann mit 20 µl einer 2 mg/ml Natriummetabisulfitlösung (2 mg/ml) und 20 µl einer Kaliumiodidlösung gemischt. Danach wurden 800 µl an PBS, welches 1 % BSA enthielt, beigemischt, gefolgt von weiterem Mischen mit Diisopropylfluorphosphat bis zu einer Endkonzentration von 10 mM. Die resultierende Mischung wurde für 60 Minuten bei 22º0 erhalten und dann gegen PBS dialysiert. Die spezifische Aktivität der resultierenden ¹²&sup5;I-markierten Antikörpermoleküle war ungefähr 4,5 Microcurie (µCi) pro µg.
Zusammensetzungen, die Fab-Fragmente aus den oben isolierten Antikörpermolekülen enthielten, wurden durch Verdau mit Papain (200:1 Gewicht pro Gewicht von Ig zu Papain) für 6 Stunden bei 37ºC gemäß dem Verfahren von Mage et al., Methods in Enzymology, 70:142-150 (1980) hergestellt. Nicht verdaute Ig und Fc-Fragmente wurden durch Chromatographie auf Protein A-Sepharose entfernt. Die resultierenden Fab- Fragment enthaltenden Zusammensetzungen waren gebrauchsfertig oder wurden ¹²&sup5;I-markiert, wie benötigt, unter Verwendung derselben Verfahren wie oben für monoclonale Antikörperzusammensetzungen beschrieben.

C. ELISA Tests

(1) ELISA zum Screenen monoclonaler Antikörper

Antikörpermoleküle, die in Hybridomkulturüberständen enthalten waren, wurden auf ihre Fähigkeit getestet mit auf Plastik immobilisiertem GPIIb-IIIa eine Immunreaktion einzugehen. 50 Mikroliter (µl) an Benetzungslösung (0,1 M NaHCO&sub3;, pH 8,0, 0,1 % NaN&sub3;), welche 10 µg/ml an wie in Beispiel 7A (1) hergestelltem isoliertem GPIIb-IIIa enthielt, wurde in die Vertiefungen von Flachbodenmicrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Immulon 2; Dynatech Laboratories, Chantilly, VA) zugemischt. Die Platten wurden für 60 Minuten bei 37ºC erhalten, um dem GPIIb-IIIa zu erlauben, an die Wände der Vertiefungen zu adsorbieren. Die Benetzungslösung wurde durch Schütteln entfernt, die Vertiefungen zweimal mit Waschpuffer (10 mM Tris bei pH 7,4, 0,05 % (v/v) TWEEN-20, 0,15 M NaCl und 200 mg/ml Merthiolat) gewaschen und 200 µl Blockierlösung (5 % Rinderserumalbumin (BSA; w/v) in Benetzungslösung) wurden jeder Vertiefung (fester Halt) zugesetzt, um überzählige Proteinstellen zu blockieren.
Die Vertiefungen wurden für 60 Minuten bei 37ºC erhalten und dann die Blockierlösung entfernt. Ungefähr 50 µl Hybridomkulturüberstand, 1:1 verdünnt in Verdünnungspuffer bestehend aus 0,1 % (w/v) BSA in Waschpuffer, wurde jeder Vertiefung zugesetzt, um eine Immunreaktionsmischung zu bilden. Die resultierenden Fest/Flüssigphasenimmunreaktionsmischungen wurden bei Raumtemperatur für 60 Minuten erhalten, um die Bildung eines ersten Festphasen gebundenen Immunreaktionsproduktes zwischen dem Festphasen gebundenen GPIIb-IIIa Ligandenkomplex und beigemischten Antikörpern zu erlauben. Die Fest- und Flüssigphasen wurden dann getrennt, die Vertiefungen zweimal mit Waschpuffer ausgewaschen und überschüssige Flüssigkeit durch Schütteln entfernt. 50 µl einer Lösung, die Meerrettichperoxidase markiertes Ziegen Anti-Maus IgG (Tago Inc., Burlingame, CA), verdünnt 1:1000 in Verdünnungspuffer, wurden jeder Vertiefung zugesetzt, um eine zweite Fest/Flüssigphasenimmunreaktionsmischung (markierende Immunreaktionsmischung) zu bilden. Die Vertiefungen wurden für 60 Minuten bei Raumtemperatur erhalten, um die Bildung eines zweiten Immunreaktionsproduktes zwischen dem markierten Antikörper und jedem Festphasen gebundenen Antikörper des ersten Immunreaktionsproduktes zu erlauben und dann zweimal mit Waschpuffer gewaschen, um die Festphasen gebundenen markierungsenthaltenden Immunreaktionsprodukte zu isolieren. Überschüssige Flüssigkeit wurde aus den Vertiefungen entfernt. 50 µl frisch hergestellte chromogene Substratlösung, die 4,0 mg/ml 0-Phenylendiamin und 0,012 % (v/v) Wasserstoffperoxid in CP-Puffer (243 ml an 0,1 M Zitronensäure und 250 ml an 0,2 M dibasischem Natriumphosphat pro Liter H&sub2;O, pH 5,0) enthielt, wurde jeder Vertiefung zugemischt, um eine farbentwickelnde Reaktionsmischung zu bilden. Nach Erhalten der farbentwickelnden Reaktionsmischung für 10 Minuten bei ungefähr 20ºC wurden jeder Vertiefung 50 µl an 2 N H&sub2;SO&sub4; beigemischt, um die Entwicklungsreaktion zu stoppen und die resultierenden Lösungen wurden auf Absorption bei 490 Nanometern (nm) Lichtwellen unter Verwendung eines Model 310 ELISA Plattenlesers (Bio-Tek Instruments, Winnoski, VT) getestet.
Es wurde angenommen, daß Antikörpermolekülzusammensetzungen Anti-GPIIb-IIIa immunreaktive Antikörpermoleküle enthalten, falls die gemessene Absorption bei 490 nm (A490) mindestens 6 mal höher als der Hintergrund war, d.h. über ungefähr 0,3 optischer Dichteeinheiten lag, wenn bei A490 gemessen.

(2) Kompetitions-ELISA um Anti-LIBS Antikörper zu detektieren

Antikörpermoleküle, die in Antikörperzusammensetzungen enthalten waren, wurden auf ihre Fähigkeit getestet, mit GPIIb-IIIa LIBS in einem Kompetitions-ELISA, durchgeführt ähnlich dem in Beispiel 7C (1) beschriebenen ELISA, eine Immunreaktion einzugehen, mit den folgenden angemerkten Ausnahmen.
Bevor eine Antikörperverbindung zu GPIIb-IIIa benetzten Mikrotitervertiefungen zugesetzt wurden, wurden 20 µl an ELISA-Testpuffer, bestehend aus 10 mM TRIS-HCl bei pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,05 % (v/v) TWEEN-20, 0,02 % (w/v) Natriummerthiolat, 5 mM CaCl&sub2;, 5 mM MgCl&sub2; und 0,1 % (w/v) BSA, jeder Mikrotitervertiefung zugesetzt. Dann wurden 10 µl einer Lösung, die Blutplättchenlysat in einer Konzentration von 2 x 10&sup7; pro ml enthielt, hergestellt, wie in Beispiel 7A (4), einem Satz an Vertiefungen zugesetzt und Blutplättchenlysat einem zweiten Satz Vertiefungen nicht zugesetzt. Zu beiden Sätzen, mit oder ohne Blutplättchenlysat, wurden 10 µl einer zweiten Lösung zugesetzt, die entweder 0 oder 5 mM des RGD-enthaltenden Polypeptidliganden GRGDSP in ELISA Testpuffern enthielt. Danach wurden 10 µl der Antikörperzusammensetzung bei 0,3 µl/ml beiden Sätzen an Vertiefungen zugesetzt, bei einer Antikörperkonzentration, die in ELISA Testpuffer verdünnt war, so daß sie die limitierende Komponente in der ELISA Immunreaktionsmischung ist. Antikörperkonzentrationen liegen als limitierende Komponente vor, wenn sie in ELISA Testpuffer verdünnt wurden, um eine optische Dichte bei A490 von ungefähr 1,0 zu erzeugen, wenn unter Verwendung des ELISA Tests aus Beispiel 7C (1) gemessen, mit der Ausnahme, daß ELISA Testpuffer anstelle von Verdünnungspuffer benutzt wird.
Die in jeder Immunreaktionsmischung erhaltenen Ergebnisse wurden in der Gegenwart einer entwickelten Farbreaktion wie oben gemessen. Absorption, die in Vertiefungen gemessen wurde, welche kein Blutplättchenlysat enthielten, wird als B&sub0; bezeichnet und Absorption, die in Vertiefungen gemessen wurde, welche Blutplättchenlysat enthielten, wird als B bezeichnet. Das Verhältnis der Absorptionen wird aus B/B&sub0; errechnet und wie gemessen, entweder in der Gegenwart (+) oder Abwesenheit (-) von RGD-enthaltenden Liganden (GRGDSP) ausgedrückt. Die Expression einer LIBS cryptischen Antigendeterminante wird durch Errechnung der prozentualen Abnahme bestimmt, welche in B/B&sub0; beobachtet wurde, wenn Ligand zu dem GPIIb-IIIa zugesetzt wird, welches im Blutplättchenlysat einer Immunreaktionsmischung enthalten ist. Eine Abnahme in B/B&sub0; nach Zusetzen von Ligand, welche 20 % übersteigt, weist auf ein Antikörpermolekül hin, das mit einem LIBS Epitop eine Immunreaktion eingeht. Tabelle 4 zeigt die Ergebnisse des Kompetitions-ELISA für in Beispiel 7B hergestellte monoclonale Antikörpermoleküle, die mit GPIIb-IIIa eine Immunreaktion eingehen.

8. Fibrinogen-Bindung an aktivierte Blutplättchen

Fibrinogen wird durch Standardverfahren, wie von Marguerie et al., J. Biol. Chem., 255:154-161(1980) beschrieben, isoliert und mit ¹²&sup5;I markiert, um ¹²&sup5;I-Fg zu bilden. Danach wird die Bindung von ¹²&sup5;I-Fg an Blutplättchen, wie vorher beschrieben, getestet. Marguerie et al., J. Biol. Chem., 255:154-161(1980). Bindung wurde durch Zumischung von einer Million ruhenden Blutplättchen in der Gegenwart oder Abwesenheit von 10 micromolar Adenosindiphosphat (ADP) zu radiomarkiertem Fibrinogen bei verschiedenen Konzentrationen von 0,01 bis 1 nanomolar (nM) und Inkubation bei 37º C für 30 Minuten initiiert. Gebundenes Fibrinogen wurde durch Zentrifugation der Blutplättchen-Fibrinogenmischung durch 0,3 ml an 20 % Sucrose getrennt und die Menge an radiomarkierten Fibrinogen, das mit dem Zellsediment assoziiert war, durch gamma- Detektion bestimmt.
Es wurde beobachtet, daß das Zusetzen von 10 µM ADP zu den Blutplättchen einen mindestens 3fachen Anstieg in der Anzahl von ¹²&sup5;I-Fg Molekülen stimulierte, die Blutplättchen banden. Nicht stimulierte Blutplättchen zeigten keinen Anstieg in Bindung an ¹²&sup5;I-Fg höher als der Hintergrund. Daher wird Aktivierung von Blutplättchen detektiert, wo die Menge an gebundenem Fibrinogen mindestens dreimal größer ist als die gebundene Menge, wenn Blutplättchen nicht mit ADP stimuliert werden.
Obwohl die vorliegende Erfindung recht detailliert durch Illustration und Beispiele zum Zweck der Klarheit und des Verständnisses beschrieben wurde, ist es offensichtlich, daß bestimmte Modifikationen im Bereich der anhängigen Ansprüche praktiziert werden können.

Claims

1. Verfahren zum Charakterisieren eines Blutplättchen-Aggregationsdefektes in einem Patienten, der diesen Defekt in Form eines Aktivierungs-, Ligandenbindungs-, oder post-Okkupations-Defektes besitzt, wobei das Verfahren umfaßt:

(a) das Bestimmen des Vorhandenseins von aktivierungskompetenten Blutplättchen in einer ersten, Blutplättchen enthaltenden Probe des Patienten;

(b) das Bestimmen des Vorhandenseins von Liganden-okkupationskompetenten Blutplättchen in einer zweiten, Blutplättchen enthaltenden Probe des Patienten; und

(c) das Korrelieren der Ergebnisse in Schritt (a) und (b) zum Charakterisieren von Blutplättchen-Aggregations-Defekten mit vorher bestimmten Kriterien, wobei (i) Aktivierungs-Defekte identifiziert werden, wenn unter Verwendung der vorher bestimmten Kriterien die Anwesenheit von aktivierungskompetenten Blutplättchen geringer ist als ein vorher bestimmter Aktivierungswert, (ii) Ligandbindungs-Defekte identifiziert werden, wenn die Anwesenheit von Ligand-okkupationskompetenten Blutplättchen geringer ist als ein vorher bestimmter Liganden-Okkupationswert unter Verwendung der vorher bestimmten Kriterien und (iii) post-Okkupations-Defekte identifiziert werden, wenn die Anwesenheit von aktivierungskompetenten Blutplättchen den vorher bestimmten Aktivierungswert überschreitet und die Anwesenheit von Ligandenokkupationskompetenten Blutplättchen den vorher bestimmten Liganden- Okkupationswert überschreitet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritte (a) und (b) Fluoreszenz-aktivierte Flußcytometrie einsetzen, um das Vorhandensein von aktivierungskompetenten und Liganden-okkupationskompetenten Blutplättchen zu bestimmen.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt (a) umfaßt:

(i) das Mischen der ersten Probe mit einer vorher bestimmten Menge eines Agonisten für Blutplättchen, die ausreicht normale Blutplättchen zu aktivieren und mit einem aktivierungsspezifischen Liganden (ASL), der bevorzugt aktivierte Blutplättchen bindet, um eine Reaktionsmischung zu bilden;

(ii) das Erhalten der Reaktionsmischung unter vorher bestimmten biologischen Testbedingungen für eine Zeitspanne, die für normale aktivierte Blutplättchen ausreicht, um ein Reaktionsprodukt mit dem ASL zu bilden; und

(iii) das Bestimmen der Menge des in Schritt (ii) gebildeten Reaktionsproduktes, wobei dadurch das Vohandensein von aktivierungskompetenten Blutplättchen in der Probe bestimmt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der aktivierungsspezifische Ligand ein monoklonaler Antikörper ist.

5. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der aktivierungsspezifische Ligand Fibrinogen ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt (b) umfaßt:

(i) das Mischen der zweiten Probe mit einer vorher bestimmten Menge eines aktivierungsunabhängigen Liganden (AIL), der eine Liganden-induzierte Bindungsstelle (LIBS) auf normalen Blutplättchen bildet und mit einem anti-LIBS- Antikörper, der vorzugsweise an die LIBS bindet, um eine Immunreaktionsmischung zu bilden;

(ii) das Erhalten der Immunreaktionsmischung unter vorher bestimmten biologischen Testbedingungen für eine Zeitspanne, die dem anti-LIBS-Antikörper ausreicht, um mit der LIBS eine Immunreaktion einzugehen, um ein Immunreaktionsprodukt zu bilden; und

(iii) das Bestimmen der Menge an in Schritt (ii) gebildetem Immunreaktionsprodukt, wobei dadurch das Vorhandensein von Liganden-okkupationskompetenten Blutplattchen in der Probe bestimmt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der anti-LIBS-Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der monoklonale Antikörper der Antikörper ist, der durch Hybridom PMI-1, das die ATCC-Hinterlegungsnummer HB 9476 hat, hergestellt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der aktivierungsunabhängige Ligand aus der Gruppe RGD, LGGAKQAGDV, KYGRGDS, GRGDSP und KQAGDV ausgewählt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt (b) umfaßt:

(i) das Mischen der zweiten Probe mit einer vorher bestimmten Menge eines Agonisten für Blutplättchen, die ausreicht, um normale Blutplättchen zu aktivieren und mit einem aktivierungsspezifischen Liganden (ASL), der vorzugsweise aktivierte Blutplättchen bindet, um eine Liganden-induzierte Bindungsstelle (LIBS) zu bilden und mit einem anti-LIBS-Antikörper, der vorzugsweise die LIBS bindet, um eine Reaktionsmischung damit zu bilden

(ii) das Erhalten der Reaktionsmischung unter vorher bestimmten biologischen Testbedingungen für eine Zeitspanne, die dem anti-LIBS-Antikörper ausreicht, um mit der LIBS eine Immunreaktion einzugehen und ein Immunreaktionsprodukt zu bilden; und

(iii) das Bestimmen der in Schritt (ii) gebildeten Menge des Immunreaktionsproduktes, wobei dadurch die Anwesenheit von Liganden-okkupationskompetenten Blutplättchen in der Probe bestimmt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei der aktivierungsspezifische Ligand Fibrinogen ist.

12. Verfahren nach Anspruch 10, wobei der anti-LIBS-Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei der monklonale Antikörper der Antikörper ist, der durch Hybridom PMI-1, das die ATCC-Hinterlegungsnummer HB 9476 hat, hergestellt wird.

14. Ein Diagnose-Kit zum Charakterisieren eines Blutplättchen-Aggregationsdefektes in einem Patienten, der diesen Defekt in Form eines Aktivierungs-, Ligandenbindungs-, oder post-Okkupations-Defektes besitzt, wobei der Kit eine abgeschlossene Einheit umfaßt, die enthält:

(a) ein erstes Behältnis, das Komponenten beherbergt, die nützlich bei der Charakterisierung von Aktivierungs- und post-Okkupations-Defekten sind, wobei jede Komponente in einem getrennten Behälter enthalten ist und in einer Menge zur Verfügung gestellt wird, die ausreicht mindestens einen Test durchzuführen;

(b) ein zweites Behältnis, das Komponenten beherbergt, die bei der Charakterisierung von Liganden-Bindungs- und post-Okkupations-Defekten nützlich sind, wobei jede Komponente in einem getrennten Behälter enthalten ist und in einer Menge zur Verfügung gestellt wird, die ausreicht mindestens einen Test durchzuführen; und

(c) Anweisungen zum Gebrauch, wobei die Anweisungen die genauen Funktionen und Zusammenhänge der Komponenten spezifizieren, die zur Charakterisierung des Blutplättchen-Adhäsions-Defektes benutzt werden, bei

(i) dem Bestimmen der Anwesenheit von aktivierungskompetenten Blutplättchen in einer ersten, Blutplättchen enthaltenden Probe, unter Verwendung der Komponenten in dem ersten Behältnis;

(ii) dem Bestimmen der Anwesenheit von Liganden-okkupationskompetenten Plättchen in einer zweiten, Plättchen enthaltenen Blutprobe, unter Verwendung der Komponenten des zweiten Behältnisses; und

(iii) dem Korrelieren der Ergebnisse, die in Schritten (i) und (ii) erhalten wurden mit vorher bestimmten Kriterien zum Charakterisieren von Blutplättchen- Adhäsions-Defekten.

15. Diagnose-Kit nach Anspruch 14, wobei die Komponenten des ersten Behältnisses einen aktivierungspezifischen Liganden (ASL), der aktivierte Blutplättchen bindet umfaßt und einen Agonisten für Blutplättchen.

16. Diagnose-Kit nach Anspruch 15, wobei der ASL Fibrinogen ist.

17. Diagnose-Kit nach Anspruch 14, wobei die Komponenten in dem zweiten Behältnis einen aktivierungsunabhängigen Liganden (AIL) umfassen, der eine Liganden-induzierte Bindungsstelle (LIBS) auf normalen Plättchen bildet und einen anti-LIBS-Antikörper.

18. Diagnose-Kit nach Anspruch 17, wobei der AIL eine Peptidsequenz von weniger als 40 Aminosäureresten umfaßt, die eine Aminosäurerestsequenz einschließen, die aus der Gruppe, bestehend aus RGD, LGGAKQAGDV, KYGRGDS, GRGDSP und KQAGDV besteht, ausgewählt ist.

19. Diagnose-Kit nach Anspruch 17, wobei der anti-LIBS-Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.

20. Diagnose-Kit nach Anspruch 19, wobei der monoklonale Antikörper durch Hybridom PMI-1, das die ATCC-Hinterlegungsnummer HB 9476 hat, hergestellt wird.