JPH05502443A - 幹細胞の成長阻害法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 幹細胞の成長阻害法 この発明は広義に、化学療法剤、放射線照射、またはその他周期内幹細胞を修復 不可能に損傷する物質に曝されることが予想されるヒトまたは動物の対象の処置 およびそのために有用な幹細胞阻害組成物に関するものである。

［関連出願の参照］ この出願は、１９８９年、９月２５日に登録された米国特許出願第０７／４１２ ３０３号の一部継続出願である。

［発明の背景］ 癌をもつ対象の処置において、従来の化学療法は、分裂している正常な細胞と癌 細胞の両方を殺すかまたは修復不能に損傷するという副作用をもつ、１つ以上の 細胞周期特異的細胞傷害性剤の適用を含んでいる。例えばントンン・アラビノン ド（アラ−Ｃ）などのこのような化学療法剤の目的は、癌細胞を破壊するかまた は癌細胞の分裂を不能にして癌細胞の成長を妨げることである。しかし１、現在 不可避である化学療法の副作用は、他の正常な分裂細胞、特に造血幹細胞組織の 幹細胞および頭皮および消化管に並ぶ上皮幹細胞の破壌である。化学療法剤の投 与によって起る幹細胞損傷は１、脱毛、胃腸の損傷、皮膚の損傷、骨髄抑圧、貧 血、免疫機能または反応低下およびその結果起る感染に対する感受性の増大など の通常にみられる副作用をもたらす。

幹細胞の代表的な属性は、細胞周期内でそれらが静止性であることである。薬剤 処置、放射線、重度の失血、炎症反応、または感染などによるような骨髄に対す る「損傷」がある場合、幹細胞はフィードバック機構に反応して、より成熟した 前駆細胞を補給するために周期を開始し、それが今度は造血幹細胞、免疫または 上皮組織の必要な成熟細胞へと分化する。

造血幹細胞は造血および免疫組織の全ての成熟細胞の発達に必要であるので、そ れらが生存していることは、化学療法で処理される対象中に十分に機能する宿主 防御組織を再確立するために必要である。同様に、と皮幹細胞の生存も、皮膚を 含む器官の上皮内面の修復に必要である。アラ−Ｃなどの高い用量の周期特異的 化学療法剤が造血幹細胞および上皮組織の幹細胞を効率よく殺すので、そのよう な薬剤を投与されている患者は重篤な１Ｗ１１作用に苦しみ、重い感染症の危機 にさらされることがしばしばである。

同じ様な幹細胞の破壊は、放射線照射を治療に使用したときであれ、例えば電力 会社や原子力潜水艦の核事故の現場にいたことや後片付けに伴うなどの偶発的な または不可避の照射の結果であれ、様々なｌの放射線を浴びた時に起る。放射線 に曝された対象は、彼らの造血幹細胞の破壊と其の結果おこる造血および免疫組 織の不全または重度の損傷を経験する。放射はまた、分裂上皮細胞を殺し、その 結果多くの上皮組織に損傷を与える。

例えばＭ−Ｃ８Ｆ、Ｃ３Ｆ−１、ＧＭ−Ｃ３Ｆ、その他などののコロニー刺激因 子などの薬剤は、現在、化学療法または放射線に曝される対象における一定の造 血細胞系統の発達を刺激するのに使用されているが、このような薬剤は１、：れ らの療法を受けた後の対象中に十分な量の幹細胞が存在していない場合、造血組 織を回復させることができるとは思われない。

従って、当技術において、化学療法または放射線の不利な副作用から幹細胞を守 ることができる他の治療剤が必要になりでいる。

［発明の要約コ この発明は、分裂中または周期内輪細胞を殺す可能性のある薬剤にさらされるこ とが予期される対象を、この対象に十分な量の幹細胞阻害組成物を投与すること によって処置する方法を提供することによって、当技術におけるこの要望に応え るものである。この方法によって保護される幹細胞は通常骨髄に存在し、分裂し ている造血幹細胞であり得る。他に幹細胞は例えば身体の腸または頭皮その他の 場所にある上皮細胞で有り得る。動物の処置も、二の方法に含まれるが、この発 明の方法は望ましくはヒトに使用され得る。

、二の発明に有用な幹細胞阻害組成物は、この明細書で幹細胞阻害因子（ステム ・セル・イン）＝ビター・ファクター）（ＳＣＩＦ）と呼ばれ、下記に特異性が 述べられているタンパク質のポリペプチドまたはフラグメントの有効量を含む。

もう１つの態様において、この発明は、患者に有効量の５ＣＩＦを投与すること を含む、化学療法を受けている患者の造血、骨髄および免疫組織を保護し回復す る方法を提供する。５ＣＩＦは化学療法の前に投与され得る。別法として５ＣＩ Ｆは化学療法中に投与され得る。もう１つの方法は、化学療法処方計画後の期間 ５ＣＩＦを投与することである。化学療法の後、患者を、幹細胞の分裂を促し、 造血系統のより成熟した細胞の産生を刺激するコロニー刺激因子またはその他の リンフ才力インなどの治療因子で処理し得る。

なお他の態様において、この発明は、癌を持つ、患者に、骨髄の造血幹細胞を保 護するのに有効な量の５ＣＩＦを投与し、それによってより多くの用量の化学療 法剤または放射線が癌の処置に使用されるようにすることによって、固相腫瘍を 特徴とするものを含む癌を補助的に処置する方法を付加的に含む。

またこの発明のもう１つの態様は、増殖性白血病細胞をもつ骨髄細胞を正常な幹 細胞の増殖を阻害するのに有効な量の５ＣＩＦで処置することおよび骨髄を、白 血病細胞を破壊する細胞傷害性剤で処置することを含む白血病の処置を含む。こ の方法は、リンフ才力インなど、増殖を刺激する他の物質による骨髄の追跡処！ により強化される。この方法はインビボで行われ得る。別法として、この方法は エクスビポで行なわれ、生成した骨髄は化学療法によって白血病細胞を取り除か れる。次に骨髄を患者に再注入する。

さらにもう１つの態様において、この方法は、幹細胞を増殖させることによって 起るなんらかの障害をもつ対象を処置することを含む。乾せんなどのこのような 障害を、対象に問題の幹細胞の増殖を完全にまたは一部阻害するのに有効な量の ５ＣＩＦを投与することによって処置する。

この発明の他の態様および利点は、その好ましい具体例の下記の詳述を考慮すれ ば明かであろう。

［発明の詳細な記述］ この発明は、幹細胞を、分裂している幹細胞を殺すことができる細胞傷害性剤に よる損傷から可逆的に保護する方法を提供する。この方法は、このような薬剤に さらされることが予期される対象に、有効な量の幹細胞阻害因子（ステム・セル ・インヒビトリー・ファクター）（ＳＣＩＦ）を投与することを含む。この方法 はまた、細胞傷害処置の間中５ＣＩＦ処買を延ばすことにより幹細胞保護効果を 強化することを含む。

５ＣＩＦはヒトの身体中の様々な幹細胞の分裂を可逆的に阻害することができる 。具体的には５Ｃ１Ｆは造血幹細胞の細胞分裂を一時的に阻害するのに有効であ る。さらに、５ＣＩＦはまた、全身の上皮幹細胞の周期または分裂を阻害するた めに働く。５ＣＩＦが可逆的に活性の阻害を行なう他の幹細胞集団には男女の胚 細胞が含まれている。そのため５ＣＩＦを、男女の患者を化学療法後の胚アプラ シアから保護するのに使用する事ができる。さらに、化学療法剤は一般に円形脱 毛症や結膜炎をおこすので、５ＣＩＦは毛嚢および口腔胃腸上皮幹細胞を、化学 療法または放射線の副作用から可逆的に保護するのに使用され得る。

したがって、この発明の方法は、癌細胞を破壊するのに通常使用される細胞傷害 性剤または放射線量などの化学療法剤から受ける損傷から幹細胞を保護すること によって患者の造血、骨髄および免疫組織への化学療法の副作用を軽減するのに 使用され得る。ＳＩＦのこのような適用はまた、化学治療中の上皮幹細胞を保護 するのに役立つ。５ＣＩＦは、化学療法剤が働くのに十分な時間、幹細胞の分裂 を阻害するのに十分な用量で患者に投与され得る。化学療法剤がその機能を果た した後、５ＣＩＦに阻害された幹細胞は、其れ以上処置されることがなくても分 裂細胞に戻る。造血幹細胞の復帰を増大することが望まれるならば、患者は造血 細胞の成長および発達を刺激するのに使用される造血成長因子またはサイトカイ ンの投薬を受ける。

癌の化学療法に使用される化学療法剤の大半は、通常２４時間以下の比較的短い インビボ半減期をもつ。この発明の５ＣＩＦ阻害効果は、少なくとも化学療法剤 がインビボで活性である有効時間をほぼカバーする時間保たれる。長い半減期（ 例えば２４時間より大きい）をもつ細胞傷害性剤に対して、５ＣＩＦによる、よ り遷延した処置を要することが予期される。対象中の正常な生理的機構は、周期 幹細胞に関する５ＣＩＦの活性の有効期間を制限する。

さらにこの方法は、対象が、対象の骨髄細胞を損傷する放射線照射を受けること に対する保護を提供するのに有用である。危険な水準の放射線に意に反してまた は偶発的に被曝する場合、その人は５ＣＩＦを投与され得る。例えば、放射能の 流出した場所に入ることになっている個人、危険な水準の放射能漏れの後の原子 力発電所または原子力潜水艦を点検し片付けるのに責任のある人々などは、短期 間の放射線被曝に備えて幹細胞分裂の再生を阻害するためにこの方法によって処 置され得る。放射線被曝中および前の５ＣＩＦ投与は、保護を強化する。さらに 、５ＣＩＦは、癌を処置する化学療法の補助処置としてこの方法の中で使用され 得る。骨髄は、患者に適用され得る放射線の量または細胞傷害性薬剤の用量を測 る際の限定器官であるので、５ＣＩＦは、放射線または化学療法から骨髄造血細 胞を保護するのに使用さね得、そねによってより多量の放射線または薬剤を、通 常は照射にも化学療法１こも耐えられない癌を処置するのに使うことができるよ うにする。細胞傷害性剤の骨髄傷害もまた、化学療法中それらの用量を制限する ので、患者への５ＣＩＦ投与は、通電このような用量の増加６二伴う重大ノー副 作用なしに患者に与えられる薬剤の用量を増やすことを可能にするものと思われ る。

この方法はまた、化学療法中に上皮幹細胞の分裂を阻害することによって固相腫 瘍を処置するのに使用され得る。

５ＣＩＦはまた、移植のために自己の骨髄を用意する方法にも使用され得る。骨 髄は、エクスビボで幹細胞分裂を阻害するのに有効な量の５ＣＩＦによって処置 され、次に有効な量の化学療法剤または放射線を投与することによって癌の細胞 を一掃し得る。このように処！された骨髄を自己ドナーに再注入し得る。所望に より患者を造血機能を刺激することが知られる薬剤で処置し得る。

５ＣＩＦはまた、白血病の処置の補助療法としてこの発明の方法の中で使用され 得る。例えば、白血病細胞が５ＣＩＦに応答しない場合、白血病の骨髄細胞はエ クスビボで５ＣＩＦにより処置される。

正常幹細胞の増殖は５ＣＩＦの投与により妨げられる。したがって、増殖白血病 細胞が細胞傷害性剤で処置される時間中、多くの正常な幹細胞が損傷から保護さ れる。さらに、ＩＬ−３または０Ｍ＝Ｃ３Ｆなどの刺激性サイトカインは、正常 な幹細胞が５ＣＩＦで保護されたまま薬剤または照射処置中の白血病細胞中の周 期を誘因するために投与され得る。

エクスビボでの使用の場合、骨髄を幹細胞分裂を阻害するため５ＣＩＦで処置し 、それによって幹細胞を、白血病細胞などの周期内細胞を破壊するように企画さ れた化学療法の、骨髄またはその他の癌の病巣への後続適用による破壊から保護 する。、二うして清められた骨髄を患者に再注入すると、その中で幹細胞は正常 に分裂し始める。造血幹細胞の細胞分裂を強化するために、前記で同定されたリ ンフ才力インおよびサイトカインもまた投与され得る。同様な方法を患者のイン ビボで５ＣＩＦを投与することによって遂行することができる。

この発明の方法はまた、過増殖性幹細胞に関連する障害を処置するのに使用され 得る。例えば、乾せんは皮膚の上皮細胞が過増殖することによっておこる障害で あり、細胞傷害性薬剤によって処置されることがある。同様に、子宮けい部の上 皮組轍のもとの位置の形成不良の状態が認められるとそれは、処置されなければ 子宮けい部の癌に進行する。これらの過渡期の状態はともに、５ＣＴＦで予防的 に処置され得る。幹細胞の増殖が含まれる他の前悪性腫瘍性病変もまた、幹細胞 の増殖を完全にまたは一部阻害するのに使用されるのに有効な量の５ＣＩＦに耐 え得る。これらの用途については、５ＣＩＦを含む局所または経皮組成物および ５ＣＩＦを投与する他の非経口的手段を使用することが出来る。

５ＣＩＦポリペプチド類もまた、この発明の他の方法中で使用され得る。モノク ローナルまたはポリクローナル抗体を標準技法によって５ＣＩＦポリペプチド類 に対して発生させ得る。これらの抗体または５ＣＩＦポリペプチド類を、当業界 で既知の多くの型の検出可能な標識によって標識化し得る。次に標識５ＣＩＦま たは抗５ＣＩＦ抗体を、診断目的のために直接患者に投与することによって、幹 細胞を同定し単離するための幹細胞マーカーとじそ使用し得る。別法として、こ れらの標識ポリペプチド類または抗体を、骨髄製品中の幹細胞を同定し、隔清術 に先だってそれらの除去を可能にするためにエクスビボで使用し得る。同様にこ のような標識ポリペプチド類または抗体を、上皮または他の幹細胞を単離または 同定するのに使用し得る。

この発明の発明者は、下記の方法および実施例で使用される５ＣＩＦがすでに同 定されたタンパク質因子のネズミ相同体であることを発見した。Ｋ、オオバルら 、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー、９９巻、８８５−８９４頁（１９８ ６年）は、ヒト扁桃腺リンパ球中のホルボールエステルなどの発ガン促進因子に より誘導され得ることが発見された遺伝子のアミノ酸およびＤＮＡ配列を同定し た。著者はこの遺伝子がＴ細胞の増殖を知らせるタンパク質を製造することを予 言した。より最近、Ｐ、Ｆ、ジップフヱルら、ジャー六ル・オブ・イムノロジー 、１４２巻、１５８２−１５９０頁（１９８９年）は同じタンパク質がヒＩ−Ｔ 細胞のミトゲンの活性化によって製造されたことを報告し、それがリンフ才力イ ンまたはサイトカインとして機能し得ることを示唆した。

したがって、この発明の方法は望ましくはヒトの治療においてヒト５ＣＩＦ因子 を使用する。この５ＣＩＦ因子は、これら公知技術の配列によって情報伝達され るヒトポリペプチドであり得る。オオバル／ジップフェル５ＣＩＦ配列は下表Ｉ で報告される。別法として、この因子を下記の実施例１で記載されているように して得ることができる。５Ｃ１Ｆのヒト類似体を上記のオオバルらの公開された ＬＤ７８配列に基づくオリゴヌクレオチドを使ってヒトＴ細胞系統から得た。ヒ ト５ＣＩＦは下記の５ＣＩＦ検定法におけるネズミタンパク質と同じヒト活性を 示す。

実施例１のヒト５ＣＩＦクローンは実質的に配列決定された。要求される活性を 示すが、この配列は公開された配列とヌクレオチドおよびアミノ酸配列の両方に おいて異なることがわかっている。実施何重の別のヒト５ＣｒＦ　ＤＮＡおよび アミノ酸配列が下記の表ＩＩに報告されている。ブラケット内の配列はまだ決定 されていない。表ＩＩ上のブラケットの中に存在する配列はオオバルらの公開さ れたＬＤ７８配列から誘導され、ヒｌ−５ＣＩＦクローンと同じであるかも知れ ないし、ないかも知れない。実施例１のクローン化された５ＣＩＦ配列と公開さ れたオオバル配列のヌクレオチド配列の相違は、表ＩＩ中、変形または追加され たアミノ酸の上および変形ヌク１／オチドの下の里印によって示されている。ダ ッシュは実施例１の配列中に見られない非コード配列を示す。２つの５ＣＩＦ配 列間には１８偲のヌクレオチド相違と４つのアミノ酸の相違がある。

さらに、ヒトクローンは公開された配列に対して３つ多いヌクレオチドおよび１ つ多いアミノ酸を含む。

しかしながら、公知技術文献のものと同じでない他のＤＮＡ配列によってコード 化された他のタンパク質もまたこの発明で５ＣＩＦ分子として有用なのである。

このようなりＮＡ配列は、ヒト５ＣＩＦ（またはオオバルら）ＤＮＡ配列に対す る厳密なハイブリダイゼーション条件ＵＴ、マニアチスら、モルキュラー・クロ ーニング（ア・ラボラトリ−・マニュアル）、コールド・スプリング・ハーバ− ・ラボラ１リ−（１９８２年）　、３８７頁から３８９頁参照コの下でハイブリ ダイズすることおよび発現に際しこの明細書に記載されている５ＣＩＦ活性を示 すことのできるポリペプチドまたはタンパク質をコード化することができること を特徴とする。このような厳密なハイブリダイゼーション条件の一例は、６５℃ で４ＸＳＳＣでのハイブリダイゼーシヨンの後、６５℃で１時間、ｏ、１ｘｓｓ ｃ中での洗浄をするものである。別法として厳密なハイブリダイゼーション条件 の例は、４２℃で４ＸＳＳＣの５０％のホルムアミド中にあることである。

他のヒト５ＣＩＦタンパク賀またはポリペプチドは、緩和なハイブリダイゼーシ ョン条件の下でヒト５ＣＩＦの配列（オオバルらの配列および実施令１のクロー ンから得る配列）に対してハイブリダイズし、発現に際し５Ｃ１Ｆの生物学的属 性をもつペプチドをコードする他のＤＮＡ配列によってコード化され得る。この ような非厳密なハイブリダイゼーション条件の例は５０℃で４ＸＳＳＣまたは４ ２℃で３０−４０％でのハイブリダイゼーションである。例えば、ヒトＭＩＰベ ータとしてこれまでに同定された分子は、検定により下記のように定義された幹 細胞阻害活性を示すことができるならば、この発明の方法中で使用することがで きる。

同様な方法で、他の５ＣＩＦポリペプチドは、オオバルらの配列または対ユ遺伝 子の変形（アミノ酸の変化をもたらし得るかまたは得ない種の集団における天然 の塩基の変化）による実施例１のクローンから得られる配列と異なるアミノ酸配 列を特徴とし得る。遺伝コードの退縮または対立遺伝子の変形によりコドン配列 において異なるＤＮＡによりコード化される５ＣＩＦポリペプチドもまた、この 発明の方法において有用であることが期待される。点突然変異によるかまたは、 それによりコード化されたポリペプチドの活性、半減期または産生を強化するた めに誘導された変形により起こる５ＣｆＦのＤＮＡ配列における変種もまたこの 発明に含まれ、開示される方法において有用であることが期待される。

この発明の方法はまた、ネズミ因子（マクロファージ炎症性タンパク３ｉ′Ｔ− アルファ、ＭＩＰ−１アルフアとしても知られている）を使用し得る。ネズミＭ ＩＰ−１ベータは、幹細胞阻害活性を持たない。本明細書でネズミ５ＣＩＦとし て同定されている分子の配列は、ダバテリスら、ジャーナル・オブ・エクスバリ メンタル・メディンン、１６７巻、１９３９−１９４４頁（１９８８年）の中に 報告されており、これを引用して本明細書の一部とする。この分子の幹細胞阻害 機能は、その文献では認められなかった。ネズミ因子もまた、ヒト免疫系からの 抗体生成を促す場合、この発明の方法中に使用され得る。

明かに５ＣＩＦの類似体の他の種は、前記で同定された方法の様々な家畜に対し ても用いられ得る。

表工 ＭＧＧＡＣＡＣＧＧ　ＧＣＡＧＣＡＧＡＣＡ　ＧＴＧＧＴＣＡＴＧＣＣＴＴＴＣ ＴＩ’ＧＧＣＴＣＴＧＣＴＧＡＣＡ　ＣＴＣＧＡＧＣＣＣＡ　ＣＡＴＴＣＣＧＴ ＣＡ　ＣＣＴＧＣＴＣＡＧＡ　ＡＴＣＧＣＣＴＧＡ　ＧＧＧＧＴＣＣＡＧＡ　Ａ ＧＣＴＴＣＧＡＧＧ　ＣＣＣＡＧＣＧＡＣＣＡｌａ　Ｅｎｄ ＴＣＧＧＴＧＧＧＣＣＡＧＴＧｃＧＧＡ、ＧＧ　ＡＧＣＡＧＧＡＧＣＣＴＧＡＧ ＣＣＴＴＧＧ　ＧＡＡＡＣＡＴＧＣＧＴＧＴＧＡＣＣＴＣＣＡＣＡＧＣＴＡＣＣ Ｔ　ＣＴＴＣＴＡＴＧＧＡ　ＣＴＧＧＴＴＧＴＴＧ　ｃｃＡＡＡｃＡｃｃｃＡＣ ＡＣＴＧＲＧＧＧ　ＡＣ′１’ＣＴＴＣ′ＩＴＡ　ＡＣＴＴＡＡＡＴＴＴ　ＴＡ ＡＴＴＴＡＴＴＴ　ＡＴＴｒＡＴＡＣＴＡＡＡＡＡＡ 表Ｉ１ ＣＴｒＣＴＡＴＧＧＡ　ＣＴＧＧＴＴＧＴＴＧ　ＣＣＡＭＣＡＧＣＣＡＣＡＣＴ ＧＲＧＧＧ　ＡＣＴＣＴＴＣＴＴＡＡ、ＣＴＴＡＡＡＴＴＴ　ＴＭＴＴｒＡＴ’ ｒＴ　ＡＴＴｒＡＴＡＣＴＡ　ＴＴＴＡＧＴＴＴＴＩ’　ＧＴＭＴｒＴＡＴＴＣ ＣＣＴＣＣＣＣＣＴ　ＴＣＣＣＴＣＡＣＡＣＣＧＣＧＴＣＴＧＧＴ　ＧＡＣＡＡ ＣＣ’ｌＧＡ　ＧＴＧＧＣＴＧＴＣＡＴＣＧＧＣＣＴＧＴＧ　ＴＡＧＧＣＡＧＴ ＣＡ　ＴＧＧＣＡＣＣＡＡＡ　ＧＣＣＡＣＣＡＧＡＣＴＧＡＣＡＡＡＴＧＴＧＴ ＡＴＣＡＧＡＴＧ　ＣＴＴＴＴＧＴｒＣＡ　ＧＧＧＣＴＧＴＧＡＴ　ＣＧＧＣＣ ＴＧＧＧＧ　ＡＡＡＴＡＡＴＡＡＡＧＡＴＧＴＴＣＴＴＴ　ＴＡＡＡＣＧＧＴＡ Ａ　ＭＡ−−−−−−−−−−−−−−−前記の事項で同定されたＬＤ７８また はネズミＭＩＰアルファのこの幹細胞阻害機能はこれまで、この因子についての 研究者の多くの研究にも係わらずこのタンパク質の機能として同定されていない 。

例えば、前記オオバルらおよびジブフェルらを参照されたい。

幹細胞阻害因子は周期内輪細胞に、それらを分裂していない「休止」態に可逆的 に置くことによって、働きかける。幹細胞を最初にこのように処理する場合、細 胞が分裂していないので、続いて化学療法または照射を適用しても、幹細胞を殺 さない。したがって、化学療法または照射を受けた後、５ＣＩＦの投与を休止す ることによって、幹細胞を分裂前駆細胞を生じるために「再活性化」し得る。

休止幹細胞を刺激して分裂させるもう１つの方法はまた、化学療法または照射の 後にＭ−Ｃ８ＦＸＣ３Ｆ−１、ＧＭ−Ｃ３Ｆ、Ｇ−Ｃ８Ｆ、Ｍｅｇ−Ｃ３Ｆなど の池のコロニー刺激因子またはＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ −５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１１およびエリトロポイエチンな どのサイトカイン類を対象に投与することであり得る。

幹細胞阻害活性をもつ５ＣＩＦポリペプチドまたは活性フラグメントを、既知の 慣用の化学合成または前記表Ｉまたは表ＩＩのアミノ酸配列を使った組み換え技 術により生成し得る。例えば、５ＣＩＦポリペプチドを、既知の調節配列の制御 の下で、発現に際し５ＣＩＦポリペプチドまたはそれの活性フラグメントをコー ドしたＤＮＡ配列で修飾された適当な細胞または細胞系統を培養することによっ て生成し得る。生成したタンパク質を常法で細胞、溶菌液、または培地から単離 することができる。組み換え５ＣＩＦのこのような製造の好ましい技術は、例え ばＴ、マニアチスら、モルキュラー・クローニングーア・ラボラドツー・マニュ アル、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、コールド・スプリング ・ハーバ−、ニューヨーク（１９８２年）に記載されている。

化学合成法によるこの発明の方法で有用な５ＣＩＦポリペプチドを構成する方法 もまた、当業界の熟練書違に知られている。例えば、ジャーナル・オブ・アメリ カン・ケミカル・ソサエテイ、８５巻、２１４９−２１！５４頁（１９６３年） のメリフィールド、ボーダンズキーらによる、“ペプチド・シンセシス”、２版 、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ、１９７６年、参照。

組み換えまたは合成で構成された５ＣＩＦポリペプチド配列は、５ＣＩＦポリペ プチドと第一、箪二、第三次の構造および配置特性を共有するために、前記表１ または表ＩＩで同定されたヒト因子と共通の幹細胞分裂を阻害するという同じ生 物学的特性をもち得る。

ポリペプチドまたは５ＣｒＦをコード化するＤＮＡ配列またはその活性フラグメ ントにおける変更もまたなされ得、この発明の方法で有用であると考えられてい るが、その場合、変更された５ＣＩＦペプチドまたはそのフラグメントは、目的 の幹細胞阻害生物学的活性をもつ。５ＣＩＦ配列の関係の変更は、コード化した 配列中の選択されたアミノ酸残基の置換、挿入または欠失を含み得る。このよう な置換、挿入または欠失といった突然変異誘発法は、当業界の熟練者にはよく知 られている。［例えば、米国特許第４５１８５８４号参照〕 ５ＣＩＦポリペプチドの配列の特異的な突然変異は、Ｘがどのアミノ酸でもあり 得るＡｓｐ−Ｘ−ＴｈｒまたはＡｓｐ　Ｘ−３ｅｒのアスパラギン結合グリコリ ル化位置を、配列または酸素結合炭水化物の付加によって修正された分子の何れ かの位置での配列修正に挿入することを含み得る。

全部または部分的に５ＣＩＦ活性を保持することが期待される５ＣＩＦの配列の 他の類似体または誘導体もまた、当業界の技術の１つにより簡単に作ることがで き、この発明の方法中で有用であり得る。

５ＣＩＦの組み換え生成が現在好ましい。ヒトｃＤＮＡを単離し、適切な調節配 列の制御の下で好ましい細胞または細胞系に挿入し得る。タンパク質の生成のた めの宿主細胞は、チャイニーズ・／１ムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ）または３Ｔ ３細胞などのは乳類の細胞であり得る。好ましいは乳類宿主細胞の選択および形 質転換、培養、増幅、スクリーニングの方法および生成物の製造および精製法は 、当技術で知られている。例えばゲッチングとサムプルツク、ネーチャ−１２９ ３巻、６２０−６２５頁（１９８１年）、または他に、カウフマンら、モルキュ ラー・セルラー・バイオロジー、５（７）巻：１ア５０−１７５９頁（１９８５ 年）またはハウジーら、米国特許第４４１９４４６号を参照。池の好ましいは乳 類細胞系は、サルＣＯ３−１細胞系、およびＣＶ−１細胞系である。

同様に、この発明に使用される５ＣＩＦの製造のために好ましい宿主細胞として 有用なものは、細菌細胞である。例えば、大腸菌（例えば、下記の実施例で使用 されるＨＢＩＯＩ、ＭＣ１０６１および菌株）は、バイオテクノロジーの分野で 宿主細胞としてよく知られている。Ｂ、スブチリス、プソイドモナス、その他の かん菌などの様々な菌株もまた、この方法で使用され得る。

当業界の熟練者に知られている酵母菌細胞の多くの菌株は、この発明のポリペプ チド類の発現のための宿主細胞として利用できる。

さらに、望まれる場合、昆虫細胞をこの発明の方法における宿主細胞として利用 し得る。例えば、ミラーら、ジエネテイ、ンク・エンジニアリング、８巻　２７ ７−２９８頁（プ１ノナム・プレス　１９８６年）およびそれに引用されている 参考文献を参照されたい。

無傷の５Ｃ１Ｆ分子の幹細胞阻害活性を保持する、５Ｃ１Ｆの１つ以上のフラグ メンＩ・を、患者の幹細胞が分裂している幹細胞を殺すことのできる薬剤に曝さ れることによる破壊から保護するこの発明の方法に使用するために使うことがで きる。

この発明の幹細胞を保護するための方法で使用するために、治療上有効な量の５ ＣＩＦタンパク質または治療上有効なそのフラグメントを医薬的に許容できる担 体との混合物に使用し得る。望ましい場合、この５ＣＩＦ組成物を全身に経口で 投与し得る。臨床での適用において、骨髄などの造血組織を５ＣＩＦの標的とし 得る。この標的化は、通常注入または丸薬の静脈投与により、５ＣＩＦを注射す ることによって得られ得る。別法として、例えば５ＣＩＦを骨髄を標的とするこ とが知られてきた薬剤に結合させるなど、薬剤の医薬的製剤を変化させることに よって、５ＣＩＦを標的に攻撃させることができる。この製剤を静脈注射で投与 することができる。、望まれるなら、組成物を皮下注射で投与し得る。

全身に投与される場合５この発明に使用される治療組成物は、発熱物質を加えな い、経口的に受容され得る水溶液の形である。正当なｐＨ，等張性、安定性など をもつ、このような医薬的に許容され得るタンパク質溶液は、当技術の範囲内に ある。過増殖幹細胞の処置のための方法での投与のために、５ＣＩＦを含む組成 物を、過増殖箇所にその効力を集中するために局所または経皮による貼付けによ り投与し得る。

このような細胞障害性剤の投与または過増殖幹細胞の処置を受けることを予期さ れる対象を処置する方法中の処方計画は、症状、体重、性および患者の食事、感 染の重篤度、投与時間および他の臨床要因などの様々な要因を考慮して担当の医 師によって決定される。

一般に、−日の処方は、体重１キログラム当り１−１０００マイクログラムの範 囲の５ＣＩＦタンパク質またはそのフラグメントである。

患者を細胞障害性剤または放射線に暴露させた後、この発明の治療法は、患者に １種以上のリンフ才力イン類、コロニー刺激因子または他のサイトカイン類、造 血剤、インターロイキン類、通常、これに先立つ５ＣＩＦによる処置により阻害 された成長および幹細胞の分裂を刺激する成長因子を投与することを含む。造血 を促すこのヨウナ治療薬剤ハ、Ｉ　Ｌ　−１、ｉ　Ｌ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４ 、■Ｌ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｍｅｇ−ＣＳＦＳＭ−Ｃ３ＦＸＣ３Ｆ−１、 ＧＭ−Ｃ８Ｆ、、Ｇ−Ｃ３Ｆまたは工１月・ロポエチンを含む。

これらの薬剤の用量は、前記で詳述された５ＣＩＦの用量と同じ範囲にあるもの を使用し得る。同様に、これらの用量は、患者の身体の症状、患者が受ける化学 療法剤または放射線の量と型の違いを補うよう調整する。処置される患者におけ る５ＣＩＦ投与によって起る幹細胞の阻害の逆転過程を常法でモニターする。

白血病の処置において正常幹細胞周期を阻害する５ＣＩＦとＩＬ−３またはＧＭ −Ｃ８Ｆなどの白血病細胞成長の促進剤の両方を、細胞障害性薬剤処置と同時に または放射線の照射中に投与することが有利になることがわかった。この実験計 画により、正常細胞と白血病細胞の間の周期状態の最大の差異を得ることが可能 になる。

下記の実施例はインビトロでの幹細胞検定法におけるネズミ５ＣＩＦの使用を記 載している。これらの実施例は、説明のためのものであって、この発明の範囲を 制限するものではない。

実施例１−ヒト５ＣｒＦ　ｃＤＮＡの取得ヒトＴ細胞系ＣＩＯ−ＭＪ２から単離 したポリアデニル化したＲＮＡを１、標準方法による一本鎖相補性ＤＮＡの合成 のための鋳型として使用した［前記、マニアチスら、参照コ。ピｌ−５ＣＩＦを コード化するｃＤＮＡの存在を、表■の配列に基づく下記のオリゴヌクレオチド 類を使った緊縮条件ＣＲ，Ｋ　サイキら、サイエンス、２３０巻１３５０頁（１ ９８５年）コを用いたポリメラーゼ連鎖応（ＰＣＲ）によって証明した。

５’　ＡＧＣＴＣＧＡＧＡＴ　ＣＡＴＧＣＡＧＧＴＣＴＣＣＡＣＴＧ　３’ ５°ＧＣＧＡＡＴＴＣＣＣＴＣＡＧＧＣＡＣＴＣＡＧＣＴＣＣＡ　３’ ＰＣＲの生成物として得、ランダムプライミングにより（アルファ３２Ｐ）ｄＣ ＴＰで標識された２本鎖５ＣＩＦ　ＤＮＡを１、前もって作られたＣＩＯ−ＭＪ ２　ｃＤＮＡ発現ライブラリー［Ｊ、Ｆ、モロ−ら、ネーチャー、３３６巻、６ ９０頁（１９８８年）コの中で５ＣＩＦ　ｃＤＮＡ類を同定するのに使用した。

適切な配向の全長の５ＣＩＦ　ｃＤＮＡで形質変換されたＣＯ８細胞から得た条 件培地を実施例３に記載された検定法によって分析した。ｐ　ＸＭＴ　２Ａ１、 ｐＸＭＴ２．　Ａｉ、ｐＸＭＴ２．Ａ、３からｐＸＭＴ２．Ａ９まで名付けられ た選択されたクローンの配列決定を継続する。

表ＩＩのヒト５ＣＩＦ配列は、オリゴヌクレオチド類が誘導される表工のオオバ ルらＬＤ７８配列とは実質的に異なる。１８塩基の変化、４つのアミノ酸の変化 および３つの付加塩基と１つの付加アミノ酸がある。

実施例２−インビトロでの幹細胞検定法インビトロでの幹細胞検索のために、２ ５％の胎児ウソまたはウマ血清および０３％の寒天を含む、４ｍｌの補足された アルファ修飾最少必須培地中のネズミマクロファージセルライン、Ｊ７７４２　 ［Ｐ　ラルフら、ジャーナル・オブ・イムノロジー、１１４巻、８９８−９０５ 頁（１９７５年）］の１０４ネズミ骨髄細胞を、６ｃｍのベトリ皿中の寒天、１ ０％のＬ９２９細胞条件培地（Ｌ９２９ＣＭ、成長因子Ｃ３Ｆ−１のソース）お よび１０％ＡＦ−１９Ｔ細胞条件培地（Ａ、Ｆｌ−１９Ｔ　ＣＭ）（成長因子Ｇ Ｍ−ＣＳＦおよび他の未確認幹細胞成長因子のソース）を含む同じ培地の下地の 表面に置いた。培養物を、３７℃で、１０％Ｃ○２．５％０２．８５％Ｎ２の完 全に加湿されたガス体中で１１日間インキュベートした。

コロニーを、１晩１ＮＴ−２（ｐ−ヨードフェニル）−３−（ｐ−二トロフェニ ル）−５−フェニル−テトラゾリウム塩化水和物処理で染色し得る。

２１Ｉｌｌ以下の直径のいくつかのコロニーがＣＦＵ検定中に存在するが、この 値を、予備実験をシトシンアラビノシドを使って行なった後の有用なカットオフ 点として選択した。各皿内で、２ｍ１１以下の直径をもつコロニーはおもに周期 的細胞から誘導され、２ｍｍ以上のコロニーは最小増殖細胞から誘導されるのが みられた。２ｍｍ以上の直径をもつコロニーのみがこれらの検定中に記録された 。

ＩＢ、プラグネルら、ブラッド、７２巻、１９６−２０１頁（１９８８年）にも 記載されている、これらのアッセイは、周期内輪細抱が５ＣＩＦによる処置後シ トシン　アラビノンドの作用に耐性となるのに対して、より成熟した親細胞が５ ＣＩＦで処置されることによって影響を受けないことを示している。次に処置さ れた幹細胞を、細胞障害性薬剤と５ＣＩＦを除去するためにＮ！衝食塩水で洗浄 すると、生存幹細胞は通常下記で説明されるように培養物中で増殖する。

実施例３−ＣＦＵ−Ａへの５ＣＩＦの影響の証明骨髄細胞を、２０％のウマ血清 を補った１ｍｌのフィッシャー培地中に５Ｘ１０°細胞を入れた対チューブにイ ンキュベートした。

５ＣＩＦまたはアルファＭＥＭを各チューブに加え、フィッシャー培地を対照チ ューブに加えた。混合物を３７℃で５時間（阻害アッセイ）インキュベートした 。インキュベーションの最後の６０分間、１０−３モルのシトシンアラビノシト を１方のチューブに加え、同容量の培地をもう一方のチューブに加えた。

次に細胞を、前記のＣＦＵアッセイで測定される前に、２回洗浄した。５ＣＩＦ は、周期内輪細胞数を平均３０％以上から平均１０％以下にまで減らすことがわ かった。阻害剤で処置された細胞と対照的に、処置されていない細胞は細胞障害 性剤装置により死滅した。

５ＣＩＦの純粋な薬剤は、前記で引用されたプラグネルらのものに記載されたＣ ＦＵ−Ｓアッセイ中でアラ−Ｃを使ってインビボで検査されたとき多能性幹細胞 を可逆的に周期の外に誘発する。

この発明の純化され配列決定された５ＣＩＦは、ＤＮＡ合成中の造血幹細胞の比 率を特異的に減少させ、それによってそれらを細胞周期特異的細胞障害性剤であ るシトシン　アラビノシトから保護する、サイトカインである。これと対照に、 ５ＣＩＦはより成熟した子孫の増殖に影響を与えず、故に幹細胞の画分の特異的 な調節剤であると思われる。５ＣＩＦは、ＣＦＵ−Ａ直接追加アッセイで測定さ れるように、２００−５００ｐＭの範囲で活性である。

実施例４−組み換え体ヒｌ−８ＣＩＦの発現５ＣＩＦを製造するため、それをコ ード化するｃＤＮＡを、は乳類、昆虫、酵母、菌および細菌の発現について多数 の型が標準分子生物学技法により当技術で知られている適切な発現ベクターに移 入する。例えばＹＣ，ヤンら、セル、４７巻、３−１０頁（１９８６年）参照。

１つのこのようなベクターは、ＳＶ４０エンハンサ−１主要なアデノウィルス後 期プロモーター、ＤＨＦＲコード化配列、ＳＶ４０後期メツセージポリＡ付加部 位およびＶａＩ遺伝子を含むＣＯ８細胞発現ベクター、ＰＸＭである。このベク ターをエンドヌクレアーゼ酵素Ｘｈｏｉで直線化し、相補的Ｘ　ｈ、　ｏ　Ｉ粘 着端を発生する合成オリゴヌクレオチド類の付加により前もって修飾された当モ ル量の５ＣＩＦｃＤＮＡに結合し得る。このようなオリゴヌク１ノオ千ド類は、 商業的に人手できる〔コラポレーテイブ・リサーチ、レキシンＩ・ン、ＭＡコ。

次にベクターを、慣用の遺伝子工学技法により適切な宿主細胞に導入する。

ａ、は乳類細胞発現 下記の検定法で用いる５ＣＩＦポリペプチドの発現を得るために、５ＣＩＦＤＮ Ａ配列を含むｐＸＭベクターを、例えばＣＯ８細胞上に形質導入する。形質転換 されたＣＯ３細胞のための条件培地は、実施例２に記載された検定法において計 測された５ＣＩＦ生物学活性を含む。

この明細書に記載されたは乳類細胞発現ベクターを、当技術の熟練書違によく知 られた技法により合成し得る。例えば１ノプリコン、選択遺伝子、エンハンサ− 、プロモーターなどのベクトルの成分を天然資源から得るかまたは既知の方法に より合成し得る。カウフマンら、ジャーナル・オブ・モルキュラー・バイオロジ ー、１５９巻、５１．１−５２１頁（１９８２年）およびカウフマン、プロン− ディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス、ＵＳＡ。

８２巻、６８９−６９３頁（１９８５年）参照。代表的なは乳類の宿主細胞は、 特に、形質転換されたセルラインを含む霊長動物セルラインおよびげっし類のセ ルラインである。正常倍数細胞、第一次組織のインビトロでの培養から誘導され た細胞株、および第一次組織片もまた好ましい。候補細胞は、選択遺伝子が優性 に働く限り、選択遺伝子において遺伝子型欠損である必要はない。共に常法によ るベクターＤＮＡの安定した組み込みとそれに続く組み込まれたベクターＤＮＡ の拡大のために、ＣＨ○細胞を使用し得る。別法として、ベクターＤＮＡは、ウ ソパピローマウィルスゲノムの全てまたは一部を含み［ラスキーら、セル、３６ 巻３９１−４０１頁（１９８４年）］、安定したエビソーム要素としてＣ１２７ マウス細胞などのセルライン中で実施し得る。他の好ましいは乳類セルラインは 、ＨｅＬａ、、Ｃ０８−１サル細胞、マウスＬ−９２９細胞、スイス、Ｂａ１ｂ −ＣまたはＮＩＨマウスから誘導された３Ｔ３ライン、ＢＨＫまたはＨａｋハム スターセルラインを含むが、これに限定されない。

次に安定した形質転換細胞を標準免疫学的または酵素検定法により生成物の発現 をスクリーンする。５ＣＩＦポリペプチド類を暗号化するＤＮＡの存在をサザン プロット法などの標準方法により検索し得る。発現ベクターＤＮＡの、Ｃ０８− １サル細胞などの好ましい宿主への導入後数日間の、ポリペプチドを暗号解読す るＤＮＡの中間発現を培養培地におけるタン／々り質の活性または免疫学的検定 法により選択なしに測定する。

当業界の技術者はまた、例えばＸｈｏｌにより各プラスミドからの５ＣＩＦのＤ ＮＡ配列を挿入し、既知の遺伝子工学技法および、ｐＪＬ３およびｐＪＬ４　［ グーら、ＥＭＢＯ，ンヤーナル、４巻、６４５−６５３頁（１９８５年）コおよ びｐＭＴ２　（ｐＭＴ２−ＶＷＦで出発、ＡＴＣＣ＃６７１２２、ＰＣＴ出願番 号Ｐ　ＣＴ／Ｕ　Ｓ８７１０００３３参照）などの他の既知のベクターを使うこ とにより、ｐＸＭ／５ＣＩＦベクトルと同種の他のは乳類表現ベクターを構築す る事ができる。これらのベクターの適切な宿主細胞への形質転換は、５ＣＩＦポ リペプチド類の発現をもたらし得る。

ｂ　細菌発現系 同様に、当業界の熟練者は、コード化配列に隣接するは乳類調節配列を取り除き 、細菌細胞によるこの発明の５ＣＩＦポリペプチドの細胞内または細胞外発現の ための細菌ベクターを創るために細菌配列を挿入することによって、５ＣＩＦの 配列を操作することができる。さらに因子を暗号化するＤＮＡを当技術で知られ る細菌発現のための異なるコドンを含むように変更し得る。好ましくは、配列を 細菌発現、当技術で知られる成熟変異タンパク質の分泌および処理を可能にする 分泌リーダーポリペプチドを暗号化するヌクレオチド配列と機能可能にインフル ームで結合する。次に細菌宿主細胞に発現された化合物を任意の既知の方法によ り、採取し精製し、およびまたは物理化学的、生化学的、および／または臨床的 なパラメーターについて特徴づけ得る。

Ｃ昆虫または酵母細胞発現 同様な操作を、昆虫細胞における発現のための昆虫のベクターの構築［例えば公 開されたヨーロッパ特許申請第１５５４７６号に記載された方法を参照］のため に行い得る。酵母ベクトルもまた、酵母細胞によるこの発明のタンパク質の細胞 内または細胞外の発現のために酵母調節配列を使って構築することができた。［ 例えば、公開されたＰＣＴ申請Ｗ○８６１０　Ｏ６３９号およびヨーロッパ特許 出願ＥＰ１２３２８９号に記載されている方法を参照〕実施例５−高レベルで５ ＣＩＦを発現するＣＨＯセルラインの構築は乳類細胞からこの発明の５ＣＩＦポ リペプチドを高濃度で製造する方法は、異種５ＣＩＦ遺伝子の多数の複写を含む 細胞の構築を含む。異種遺伝子を、上記のカウフマンとンヤープ、ジャーナル・ オブ・モルキュラー・バイオロジー、（１９８２年）の方法に従って、増加遺伝 子複製を含む細胞がメト］・レキセー１−　（ＭＴＸ）の濃度の増大のために選 択され得るンヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子などの増幅マーカーに結合 することができる。この方法を多数の異なる細胞型で使用することができる。

例えば、それの発現とＤＨＦＲ発現プラスミドｐＡｄＤ２６Ｖ（Ａ）３　（カウ フマンとシャープ、モルキュラー・セル・バイオロジー、３（９）巻、１５９８ −１６０８頁（１９８３年））を可能にする他のプラスミド配列と機能可能に連 関している５ＣＩＦ遺伝子を含むｐＸＭベクターを、燐酸カルシウム共沈および 形質転換によって、ＤＨＦＲ−欠損ＣＨＯ細抱、ＤＵＫＸ−ＢＩ　Ｉへと同時導 入することができる。別法として、５ＣＩＦ遺伝子を前記のようにｐＭＴ２へと 導入し、できたベクターをｐＸＭ／５ＣＩＦおよびｐＡｄＤ２６ＳＶ　（Ａ）３ の代わりに使用し得る。ＤＨＦＲを発現する形質転換体を透析された胎児ラン血 清を含むアルファ倍地中での生長について選択し、その後、カウフマンら、モル キュラー・セル・バイオロジー、５巻、１７５０頁（１９８３年）に記載されて いる濃度を増したＭＴＸ　（０，０２，０２，１，０および５ｕＭ　ＭＴＸの連 続段階）中での生長による増幅について選択する。形質転換体をクローン化し、 生物学的に活性な５Ｃ１Ｆポリペプチド発現を実施例２の検定法によりモニター する。５ＣＩＦポリペプチド発現は、ＭＴＸ耐性の１ノベルの増加につれて増加 することが期待される。

この発明の実施において多数の修正および変型が当技術の熟達者に発生すること が予期される。

国際調査報告 国際調査報告 ＵＳ　９００５４５１ Ｓ＾　４Ｉ４９２

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．他のヒトタンパク質性物質を実質的にもたず、表ＩＩのアミノ酸配列を含む 幹細胞阻害タンパク質。
2. ２．適当な担体との混合物中に有効量のヒト幹細胞阻害因子を含む、分裂中の幹 細胞を損傷するかまたは破壊することができる物質に暴露されているかまたは暴 露されることが予想されるヒト対象における幹細胞分裂を阻害するのに説明な医 薬組成物。
3. ３．幹細胞阻害剤が、表Ｉと同じかまたは実質的に同じアミノ酸配列、その対立 遺伝子の変異型、表ＩのＤＮＡ配列に対してハイブリダイズすることができるＤ ＮＡ配列をもち、幹細胞阻害活性をもつポリペプチド、またはその生物学的に活 性なフラグメントをもつヒトタンパク質の全て宏たは生物学的に活性なフラグメ ントである請求項２記載の組成物。
4. ４．幹細胞阻害剤が表ＩＩと同じかまたは案質的に同じアミノ酸配列、その対立 遺伝子の変異型、表ＩＩのＤＮＡ配列に対してハイブリダイズすることができる ＤＮＡ配列をもち、幹細胞阻害活性をもつポリペプチドまたはその生物学的に活 性なフラグメントをもつタンパク質の全てまたは生物学的に活性なフラグメント である請求項２記載の組成物。
5. ５．骨髄をエクス・ビボで、他のヒトタンパク質性物質を実質的にもたず表ＩＩ のアミノ酸配列を含むヒト幹細胞阻害因子の有効量で処置して幹細胞分裂を阻害 し、有効量の化学療法剤または放射線を投与することによって骨髄から癌細胞を 除くことを含む移植のための自己骨髄試料製造法。
6. ６．発現に際しヒトの乾細胞の生長を実質的に阻害することができる幹細胞阻害 タンパク質を暗号化するＤＮＡから基本的になるＤＮＡ配列であって、上記ＤＮ Ａ配列は表ＩＩのポリペプチドの成熟形およびヒトの幹細胞の生長を阻害するこ とができる対立遺伝子の変形を含むポプチド配列を暗号化するＤＮＡ配列。
7. ７．発現に際しヒトの幹細胞の生長を実質的に阻害することかできる幹細胞阻害 タンパク質を暗号化するＤＮＡから基本的になるＤＮＡ配列を含むベクターであ って、上記ＤＮＡ配列は宿主細胞中の複製および発現を指示することができる調 節制御配列と連携した表ＩＩのポリペプチドの成熟形およびその対立遺伝子の変 形を含むペプチドを暗号化するものであるベクター。
8. ８．他のヒトタンパク質性の物質を実質的にもたず表ＩＩのアミノ酸配列を含む 幹細胞阻害タンパク質の製造方法であって、前記のタンパク質を暗号化するＤＮ Ａ配列を形質導入した細胞を培養することを含み、上記ＤＮＡはこの細胞中での 複製とその発現を指示することのできる調節制御配列の制御の下にある方法。
9. ９．分裂幹細胞を損傷する薬剤に暴露されることが予期される対象の処置のため の医薬組成物における、他のヒトタンパク質性物質を実質的にもたず表ＩＩのア ミノ酸配列を含む幹細胞阻害タンパク質の使用。