CN112759632B - Sylvestin的制备方法 - Google Patents

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CN112759632B CN202110136257.XA CN202110136257A CN112759632B CN 112759632 B CN112759632 B CN 112759632B CN 202110136257 A CN202110136257 A CN 202110136257A CN 112759632 B CN112759632 B CN 112759632B
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Abstract

本发明属于多肽药物制备方法技术领域，特别涉及Sylvestin的制备方法。该方法采用固相合成方式，分段合成Sylvestin；所述分段的数量为2～4段，其中N末端的片段至少含有12个氨基酸残基。本发明提供的方案显著提高了粗品纯度和产品总收率，具有广泛的实用价值和应用前景。

Description

Sylvestin的制备方法
技术领域
本发明属于多肽药物制备方法技术领域，特别涉及Sylvestin的制备方法。
背景技术
森林山蛭抗血栓肽Sylvestin是森林山蛭镇痛肽基因编码的一种单链多肽，分子量4790.5道尔顿，等电点6.28。Sylvestin的肽序为：Thr-Ser-Glu-Pro-Val-Cys-Ala-Cys-Pro-Lys-Met-Leu-Phe-Trp-Val-Cys-Gly-Lys-Asp-Gly-Glu-Thr-Tyr-Thr-His-Pro-Cys-Ile-Ala-Lys-Cys-His-Asn-Val-Glu-Val-Glu-His-Asp-Gly-Lys-Cys-Lys-OH。
研究表明，Sylvestin能够抑制FXIIa和kallikrein，有极显著的抗血栓和抑制急性脑出血的作用；可作为制备FXIIa、kallikrein抑制剂和抗血栓和抑制急性脑出血药物应用。
目前，Sylvestin的制备通常采用基因工程的手段，化学合成不仅成本更低，且反应条件也相对更简单。但目前尚未见，Sylvestin的化学合成方法的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供Sylvestin的制备方法。
本发明提供的Sylvestin的制备方法，其采用固相合成方式，分段合成Sylvestin；所述分段的数量为2～4段，其中N末端的片段至少含有12个氨基酸残基。
一些实施例中，所述分段的数量是4段，其中：
片段a的序列为Thr-Ser-Glu-Pro-Val-Cys-Ala-Cys-Pro-Lys-Met-Leu-Phe，
片段b的序列为-Trp-Val-Cys-Gly-Lys-Asp-Gly-Glu，
片段c的序列为-Thr-Tyr-Thr-His-Pro-Cys-Ile-Ala-Lys-Cys，
片段d的序列为-His-Asn-Val-Glu-Val-Glu-His-Asp-Gly-Lys-Cys-Lys。
另一些实施例中，所述分段的数量是2段，其中：
片段a的序列为Thr-Ser-Glu-Pro-Val-Cys-Ala-Cys-Pro-Lys-Met-Leu，
片段b的序列为-Phe-Trp-Val-Cys-Gly-Lys-Asp-Gly-Glu-Thr-Tyr-Thr-His-Pro-Cys-Ile-Ala-Lys-Cys-His-Asn-Val-Glu-Val-Glu-His-Asp-Gly-Lys-Cys-Lys。
本发明实施例中，对Sylvestin的制备采用逐一接入的方式或分段接入的方式进行，结果表明，分段接入的方式更有利于提高合成产物的收率和纯度。在分段接入的方案中，分段方式和保护基团的选择都会影响合成效果。
在本发明中，Thr、Ser、Tyr的侧链保护基为tBu；Glu、Asp的侧链保护基为OtBu；Cys、His、Asn的侧链保护基为Trt；Lys、Trp的侧链保护基为Boc。
在本发明中，对第一位氨基酸Thr的保护，可仅采用tBu对侧链进行保护，也可在N端添加Boc保护基。
因此，一些实施例中，所述分段的数量是2段，
所述片段a为X-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Pro-Val-Cys(Trt)-Ala-Cys(Trt)-Pro-Lys(Boc)-Met-Leu-OH，其中，X为Fmoc或Boc；
所述片段b为Fmoc-Phe-Trp(Boc)-Val-Cys(Trt)-Gly-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Gly-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-His(Trt)-Pro-Cys(Trt)-Ile-Ala-Lys(Boc)-Cys(Trt)-His(Trt)-Asn(Trt)-Val-Glu(OtBu)-Val-Glu(OtBu)-His(Trt)-Asp(OtBu)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-树脂。
另一些实施例中，所述分段的数量是4段，
所述片段a为Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Pro-Val-Cys(Trt)-Ala-
Cys(Trt)-Pro-Lys(Boc)-Met-Leu-Phe-OH；
所述片段b为Fmoc-Trp(Boc)-Val-Cys(Trt)-Gly-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Gly-Glu(OtBu)-OH；
所述片段c为Fmoc-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-His(Trt)-Pro-Cys(Trt)-Ile-Ala-Lys(Boc)-Cys(Trt)-OH；
所述片段d为Fmoc-His(Trt)-Asn(Trt)-Val-Glu(OtBu)-Val-Glu(OtBu)-His(Trt)-Asp(OtBu)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-树脂。
本发明研究结果表明，分段的数量与收率并不呈正相关。在所有的分段方案中，将Sylvestin在第12位氨基酸与第13位氨基酸之间进行分段，能够获得最高的收率和纯度。而以Boc对N端进行保护的方案不及以Fmoc对N端进行保护的方案。
树脂的选择对于收率也存在影响。本发明的方案中，所述树脂为羟基树脂。本发明实施例中，所述树脂选自Wang树脂或HMP Linker树脂。一些具体实施例中，所述树脂为HMPLinker树脂。在逐个偶联的方案中，或者分段偶联的方案中，对于C端的起始原料为Fmoc-Lys(Boc)-HMP Linker树脂。在本发明实施例中，所述树脂的氨基取代值为0.2mmol/g～0.8mmol/g；一些实施例中，所述树脂的取代值为0.3mmol/g～0.5mmol/g；一些具体实施例中，所述树脂的取代值为0.3mmol/g。
在本发明中，所述分段合成包括：制备片段、偶联、酸解、环化、纯化和脱盐的步骤。
在制备片段的步骤中，片段的制备采用逐个偶联的方式，具体的采用Fmoc固相多肽合成策略。
在偶联的步骤中：
所述偶联的偶联剂包括HOBt和DIC；所述偶联剂中HOBt和DIC的摩尔比为(1～2)：1，一些实施例中，HOBt和DIC的摩尔比为1:1。
所述偶联步骤中，Fmoc-保护氨基酸或保护氨基酸片段与树脂的摩尔比为(1.2～6):1，优选为(2.5～3.5)：1；一些实施例中，所述Fmoc-保护氨基酸或保护氨基酸片段与树脂的摩尔比为3:1。
所述偶联步骤在DMF溶液中进行，偶联温度为室温，时间为120～300min。
在所述酸解的步骤中：
Sylvestin树脂经酸解同时脱去树脂及侧链保护基，经氧化环化得到Sylvestin粗品。
本发明中，所述酸解的酸解剂包括三氟醋酸、1,2-乙二硫醇和水；本发明实施例中，所述酸解的酸解剂中三氟醋酸、1,2-乙二硫醇和水的体积比为(80～95)：(1～10)：(1～10)。一些实施例中，所述酸解的酸解剂中三氟醋酸、1,2-乙二硫醇和水的体积比为(89～91)：(4～6)：(4～6)。一些具体实施例中，所述酸解剂中三氟醋酸、1,2-乙二硫醇和水的体积比为95:5:5。
所述酸解的步骤包括：将Sylvestin树脂与酸化剂混合反应，获得直链Sylvestin肽。优选的，反应后产物经TFA洗涤。
本发明酸解步骤中，Sylvestin树脂与酸解剂的质量-体积比为1g：4ml～15ml；一些实施例中，Sylvestin树脂与酸解剂的质量-体积比为1g：9ml～11ml；一些具体实施例中，Sylvestin树脂与酸解剂的质量-体积比为1g：10ml。
本发明所述酸解的条件为：室温条件下酸解1～5小时，优选条件为室温下酸解2小时。
在本发明的环化步骤中：
在所述环化的步骤中，以碘、H2O2或DMSO中至少一种为氧化剂，使Sylvestin肽序中6个半胱氨酸的巯基氧化配对，形成稳定的三环肽。所述环化的氧化剂为碘、H2O2或DMSO，优选为DMSO。在本发明实施例中，氧化剂采用DMSO。所述环化的步骤包括：将直链Sylvestin肽，以缓冲液重悬至浓度为1.5mg/ml，调节pH值为7.5，氧化反应过夜，获得环化的Sylvestin粗品。所述缓冲液由水、1mmol/L半胱氨酸盐酸盐和15vol％的DMSO组成。
在本发明的纯化步骤中：
所述纯化采用高效液相色谱法；色谱柱为反相C18色谱柱，填料直径为填料为10μm，色谱柱尺寸为77mm×250mm。
流动相a为100mmol/LNH4AC.H2O PH＝7.0±0.2，
流动相b为乙腈。
流动相流速为90mL/min，纯化色谱的洗脱程序为：
序号 时间(min) B％
1 0.00 8％
2 10.00 8％
3 25.00 14±2％
4 40.00 14±2％
5 45.00 17±2％
6 55.00 17±2％
7 60.00 27±2％
8 70.00 27±2％
9 70.50 80％
10 73.50 80％
11 74.00 5％
12 86.00 5％
在本发明的脱盐步骤中：
所述脱盐采用高效液相色谱法，色谱柱为反相C18色谱柱，填料直径为填料为10μm，色谱柱尺寸为77mm×250mm。
流动相A为1wt％的醋酸水溶液，流动相B为乙腈。
流动相流速为90mL/min，脱盐色谱的洗脱程序为：
经过脱盐步骤后，所得洗脱液经减压浓缩、冷冻干燥获得Sylvestin纯品粉末。
本发明提供的Sylvestin的制备方法采用固相合成方式，分段合成Sylvestin；所述分段的数量为2～4段，其中N末端的片段至少含有12个氨基酸残基。本发明提供的方案显著提高了粗品纯度和产品总收率，具有广泛的实用价值和应用前景。
具体实施方式
本发明提供了Sylvestin的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明所述N末端片段是指分段合成的几个片段中，最靠近N末端的片段。例如将Sylvestin的肽链分为2段，这两个片段分别为N末端片段和C末端片段。将Sylvestin的肽链分为3段，则分别为N末端片段、中间片段、C末端片段。将Sylvestin的肽链分为4段，则分别为N末端片段、中间片段1、中间片段2、C末端片段。
本发明所述“保护基团”或“保护基”具有其在本领域中的普通含义。保护基团包括连接至或被配置成连接至分子(例如，肽)内的反应性基团(即，受保护的基团)以使得所述保护基团阻止或以其他方式抑制受保护的基团参与反应的化学部分。可通过将保护基团连接至分子来进行保护。当将保护基团从分子中除去时，例如，通过除去保护基团的化学转化，可发生去保护。
本发明中，所述“多肽”或“肽”具有其在本领域中的普通含义并且可指通过由一个氨基羧酸分子的羰基碳与另一个氨基羧酸分子的氮原子形式上失去水而形成共价键之来自两个或更多个氨基羧酸分子(相同或不同)的酰胺。“氨基酸残基”也具有其在本领域中的普通含义并且指氨基酸(作为单个氨基酸或作为肽的一部分)在其与肽、另一个氨基酸或氨基酸残基组合之后的组合物。通常，当氨基酸与另一个氨基酸或氨基酸残基组合时，除去水，并且保留下来的氨基酸被称为氨基酸残基。术语“氨基酸”也具有其在本领域中的普通含义并且可包括蛋白质氨基酸和非蛋白质氨基酸。本发明中氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。
本发明中所述“偶联”或“接入”是指将新的氨基酸或肽片段添加至结合的氨基酸或肽的过程。本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。在本发明具体实施方式中，申请文件中所用英文缩写对应的中文含义如下表。
英文缩写 中文名称 英文缩写 中文名称
Fmoc 9-芴甲氧羰基 OtBu 叔丁氧基
tBu 叔丁基 Boc 叔丁氧羰酰基
Trt 三苯甲基 Leu 亮氨酸
Ser 丝氨酸 Phe 苯丙氨酸
Glu 谷氨酸 Thr 苏氨酸
Trp 色氨酸 Arg 精氨酸
Asp 天冬氨酸 Gln 谷氨酰胺
Ala 丙氨酸 Ile 异亮氨酸
Tyr 酪氨酸 His 组氨酸
Gly 甘氨酸 Lys 赖氨酸
Val 缬氨酸 Pro 脯氨酸
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1片段接入法合成Sylvestin肽树脂
一、制备片段
片段a(1-12位氨基酸)：
Boc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Pro-Val-Cys(Trt)-Ala-Cys(Trt)-Pro-Lys(Boc)-Met-Leu-OH
其制备方法采用Fmoc固相多肽合成策略，方法包括：
取0.09mol Fmoc-Met-OH和0.09mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.09mol DIC，搅拌下慢慢加入至DMF溶液中，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的Fmoc-Met-OH，备用。
取0.03mol Fmoc-Leu-2-Cl-Trt树脂，用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤，得到去Fmoc的Leu-2-Cl-Trt树脂。
将活化后的Fmoc-Met-OH溶液加入到已去Fmoc的Leu-2-Cl-Trt树脂中(摩尔比3:1)，偶联反应120～300分钟，过滤洗涤，得含Fmoc-Met-Leu-2-Cl-Trt树脂。
按照如上反应条件，依次以Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Boc-Thr(tBu)-OH为原料进行偶联，制备获得片段A树脂。
片段a树脂用1％TFA/DCM溶液(10ml/g树脂)在室温下裂解，收集裂解液，减压浓缩所得沉淀用水洗涤5次，在35℃下减压干燥得片段a。纯度80.9％，质谱应为1156.4。
片段b(13-43位氨基酸)：
Fmoc-Phe-Trp(Boc)-Val-Cys(Trt)-Gly-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Gly-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-His(Trt)-Pro-Cys(Trt)-Ile-Ala-Lys(Boc)-Cys(Trt)-His(Trt)-Asn(Trt)-Val-Glu(OtBu)-Val-Glu(OtBu)-His(Trt)-Asp(OtBu)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-HMP Linker树脂
其制备方法采用Fmoc固相多肽合成策略，方法包括：
取0.03mol Fmoc-Cys(Trt)-OH和0.03mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.03molDIC，搅拌下慢慢加入至DMF溶液中，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的Fmoc-Cys(Trt)-OH，备用。
取0.01mol的Fmoc-Lys(Boc)-HMP Linker树脂(取代值约0.3mmol/g)，采用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤得到去Fmoc的树脂。
将活化后的Fmoc-Cys(Trt)-OH溶液加入到已去Fmoc的树脂中(摩尔比3:1)，偶联反应120～300分钟，过滤洗涤，得含Fmoc-Cys(Trt)-Lys(Boc)-HMP Linker树脂。
按照如上反应条件，依次以Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Phe-OH为原料进行偶联，制备获得片段b树脂。
二、片段偶联
取0.03mol片段a和0.03mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.03mol DIC，搅拌下慢慢加入至保护氨基酸DMF溶液中，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的片段a，备用。
取0.01mol的片段b(取代值约0.3mmol/g)，采用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤得到去Fmoc的片段b树脂。
将活化后的片段a溶液加入到片段b树脂中(片段a与片段b的摩尔比为3:1)，偶联反应120～300分钟，过滤洗涤，得到Sylvestin肽树脂：Boc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Pro-Val-Cys(Trt)-Ala-Cys(Trt)-Pro-Lys(Boc)-Met-Leu-Phe-Trp(Boc)-Val-Cys(Trt)-Gly-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Gly-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-His(Trt)-Pro-Cys(Trt)-Ile-Ala-Lys(Boc)-Cys(Trt)-His(Trt)-Asn(Trt)-Val-Glu(OtBu)-Val-Glu(OtBu)-His(Trt)-Asp(OtBu)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-HMP Linker树脂。
实施例2片段接入法合成Sylvestin肽树脂
一、制备片段
片段a(1-12位氨基酸)：
Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Pro-Val-Cys(Trt)-Ala-Cys(Trt)-Pro-Lys(Boc)-Met-Leu-OH
其制备方法同实施例1，纯度85.0％，质谱应为1278.6。
片段b的制备方法同实施例1，
制备获得Fmoc-Phe-Trp(Boc)-Val-Cys(Trt)-Gly-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Gly-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-His(Trt)-Pro-Cys(Trt)-Ile-Ala-Lys(Boc)-Cys(Trt)-His(Trt)-Asn(Trt)-Val-Glu(OtBu)-Val-Glu(OtBu)-His(Trt)-Asp(OtBu)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-HMP Linker树脂
二、片段偶联
取0.03mol片段a和0.03mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.03mol DIC，搅拌下慢慢加入至保护氨基酸DMF溶液中，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的片段a，备用。
取0.01mol的片段b(取代值约0.3mmol/g)，采用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤得到去Fmoc的片段B树脂。
将活化后的片段a溶液加入到片段b树脂中(片段a与片段b的摩尔比为3:1)，偶联反应120～300分钟，过滤洗涤，得到Fmoc-Sylvestin肽树脂。
最后，采用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤得到Sylvestin肽树脂。
实施例3片段接入法合成Sylvestin肽树脂
一、制备片段
片段a(1-13位氨基酸)：Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Pro-Val-
Cys(Trt)-Ala-Cys(Trt)-Pro-Lys(Boc)-Met-Leu-Phe-OH
片段b(14-21位氨基酸)：Fmoc-Trp(Boc)-Val-Cys(Trt)-Gly-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Gly-Glu(OtBu)-OH
片段c(22-31位氨基酸)：Fmoc-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-His(Trt)-Pro-Cys(Trt)-Ile-Ala-Lys(Boc)-Cys(Trt)-OH
片段d(32-43位氨基酸)：Fmoc-His(Trt)-Asn(Trt)-Val-Glu(OtBu)-Val-Glu(OtBu)-His(Trt)-Asp(OtBu)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-HMP Linker树脂
其中片段a、b、c的制备方法与实施例1中片段A的制备方法相同，片段d的制备方法，与实施例1中片段B的制备方法相同。
二、片段偶联
取0.03mol片段c和0.03mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.03mol DIC，搅拌下慢慢加入至保护氨基酸DMF溶液中，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的片段c，备用。
取0.01mol的片段d(取代值约0.3mmol/g)，采用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤得到去Fmoc的片段d树脂。
将活化后的片段c溶液加入到片段d树脂中(片段A与片段B的摩尔比为3:1)，偶联反应120～300分钟，过滤洗涤，然后再按照相同的方法偶联片段b和片段a，得到Fmoc-Sylvestin肽树脂。
最后，采用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤得到Sylvestin肽树脂。
实施例4逐个接入法合成Sylvestin肽树脂
使用Fmoc-Lys(Boc)-HMP Linker树脂为起始树脂，与Fmoc-Cys(Trt)-OH进行偶联，方法包括：
取0.03mol Fmoc-Cys(Trt)-OH和0.03mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.03molDIC，搅拌下慢慢加入至DMF溶液中，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的Fmoc-Cys(Trt)-OH，备用。
取0.01mol的Fmoc-Lys(Boc)-HMP Linker树脂(取代值约0.3mmol/g)，采用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤得到去Fmoc的树脂。
将活化后的Fmoc-Cys(Trt)-OH溶液加入到已去Fmoc的树脂中，偶联反应120～300分钟，过滤洗涤，得含Fmoc-Cys(Trt)-Lys(Boc)-HMP Linker树脂。
按照如上条件，依次以Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH.H2O、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Boc-Thr(tBu)-OH为原料进行偶联，制得Sylvestin肽树脂。
实施例5 Sylvestin粗品的制备
取实施例1制得的Sylvestin肽树脂，加入体积比为TFA∶水∶EDT＝95∶5∶5的裂解试剂(裂解试剂10mL/克树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，25～35℃减压干燥6小时，沉淀用1mmol/L半胱氨酸盐酸盐15％DMSO缓冲溶液溶解并稀释至1.5mg/ml的溶液，用氨水调pH7.5，搅拌反应过夜，
得Sylvestin粗品溶液，粗品纯度为58.5％。
实施例6 Sylvestin粗品的制备
取实施例2制得的Sylvestin肽树脂，加入体积比为TFA∶水∶EDT＝95∶5∶5的裂解试剂(裂解试剂10mL/克树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，25～35℃减压干燥6小时，沉淀用1mmol/L半胱氨酸盐酸盐15％DMSO缓冲溶液溶解并稀释至1.5mg/ml的溶液，用氨水调pH7.5，搅拌反应过夜，得Sylvestin粗品溶液，粗品纯度为63.1％。
实施例7 Sylvestin粗品的制备
取实施例3制得的Sylvestin肽树脂，加入体积比为TFA∶水∶EDT＝95∶5∶5的裂解试剂(裂解试剂10mL/克树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，25～35℃减压干燥6小时，沉淀用1mmol/L半胱氨酸盐酸盐15％DMSO缓冲溶液溶解并稀释至1.5mg/ml的溶液，用氨水调pH7.5，搅拌反应过夜，得Sylvestin粗品溶液，粗品纯度为39.1％。
实施例8 Sylvestin粗品的制备
取实施例4制得的Sylvestin肽树脂，加入体积比为TFA∶水∶EDT＝95∶5∶5的裂解试剂(裂解试剂10mL/克树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，25～35℃减压干燥6小时，沉淀用1mmol/L半胱氨酸盐酸盐15％DMSO缓冲溶液溶解并稀释至1.5mg/ml的溶液，用氨水调pH7.5，搅拌反应过夜，得Sylvestin粗品溶液，粗品纯度为27.9％。
实施例9 Sylvestin粗品的纯化
取实施例5制得的Sylvestin粗品溶液，用0.45μm混合微孔滤膜过滤，纯化备用；
采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，采用的流动相为100mmol pH7.0醋酸铵/水溶液-乙腈。77mm×250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，用0.45μm滤膜滤过，得Sylvestin纯化中间体浓缩液，备脱盐用；纯化的梯度条件为：
采用高效液相色谱法进行脱盐，流动相系统为1％醋酸水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm×250mm的色谱柱流速为90mL/min；采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集脱盐主峰并用分析液相检测纯度，合并脱盐主峰溶液，减压浓缩，得到Sylvestin水溶液，冷冻干燥，得Sylvestin纯品10.5g，纯度为98.9％，最大单一杂质0.12％，总收率为21.9％，分子量为4789.5(100％M+H)。纯化的梯度条件为：
序号 时间(min) B％
1 0.00 5％
2 35.00 5％
3 36.00 40±2％
4 60.00 40±2％
5 60.50 80％
6 64.50 80％
7 65.00 5％
8 77.00 5％
实施例10 Sylvestin粗品的纯化
取实施例6制得的Sylvestin粗品溶液，用0.45μm混合微孔滤膜过滤，纯化备用；
采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，采用两种流动相系统交替纯化，第一种流动相系统为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA乙腈溶液，第二种流动相系统为50mmol醋酸铵/水溶液-乙腈。77mm×250mm的色谱柱流速为90mL/min，梯度系统同实施例9，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，用0.45μm滤膜滤过，得Sylvestin纯化中间体浓缩液，备脱盐用；
采用高效液相色谱法进行脱盐，流动相系统为1％醋酸水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm×250mm的色谱柱流速为90mL/min；梯度系统同实施例9，，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集脱盐主峰并用分析液相检测纯度，合并脱盐主峰溶液，减压浓缩，得到Sylvestin水溶液，冷冻干燥，得Sylvestin纯品11.6g，纯度为98.5％，最大单一杂质0.15％，总收率为24.2％，分子量为4789.5(100％M+H)。
实施例11 Sylvestin粗品的纯化
取实施例7制得的Sylvestin粗品溶液，用0.45μm混合微孔滤膜过滤，纯化备用；
采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，采用两种流动相系统交替纯化，第一种流动相系统为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，第二种流动相系统为50mmol醋酸铵/水溶液-乙腈。77mm×250mm的色谱柱流速为90mL/min，梯度系统同实施例9，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，用0.45μm滤膜滤过，得Sylvestin纯化中间体浓缩液，备脱盐用；
采用高效液相色谱法进行脱盐，流动相系统为1％醋酸水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm×250mm的色谱柱流速为90mL/min；梯度系统同实施例9，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集脱盐主峰并用分析液相检测纯度，合并脱盐主峰溶液，减压浓缩，得到Sylvestin水溶液，冷冻干燥，得Sylvestin纯品3.2g，纯度为98.2％，最大单一杂质0.49％，总收率为6.7％，分子量为4789.6(100％M+H)。
实施例12 Sylvestin粗品的纯化
取实施例8制得的Sylvestin粗品溶液，溶液用0.45μm混合微孔滤膜过滤，纯化备用；
采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，采用两种流动相系统交替纯化，第一种流动相系统为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，第二种流动相系统为50mmol醋酸铵/水溶液-乙腈。77mm×250mm的色谱柱流速为90mL/min，采梯度系统同实施例9，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，用0.45μm滤膜滤过，得Sylvestin纯化中间体浓缩液，备脱盐用；
采用高效液相色谱法进行脱盐，流动相系统为1％醋酸水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm×250mm的色谱柱流速为90mL/min；梯度系统同实施例9，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集脱盐主峰并用分析液相检测纯度，合并脱盐主峰溶液，减压浓缩，得到Sylvestin水溶液，冷冻干燥，得Sylvestin纯品1.7g，纯度为97.3％，最大单一杂质1.53％，总收率为3.5％，分子量为4789.5(100％M+H)。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.Sylvestin的制备方法，其采用固相合成方式，分段接入制备Sylvestin；所述分段的数量是2段，其中：
片段a的序列为Thr-Ser-Glu-Pro-Val-Cys-Ala-Cys-Pro-Lys-Met-Leu，
片段b的序列为-Phe-Trp-Val-Cys-Gly-Lys-Asp-Gly-Glu-Thr-Tyr-Thr-His -Pro -Cys-Ile-Ala-Lys-Cys-His-Asn-Val-Glu-Val-Glu-His-Asp-Gly-Lys-Cys-Lys；
所述分段接入制备Sylvestin包括：制备片段、偶联、酸解、环化、纯化和脱盐的步骤。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
所述片段a为X-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Pro-Val-Cys(Trt)-Ala -Cys(Trt)-Pro-Lys(Boc)-Met-Leu-OH，其中，X为Fmoc或Boc；
所述片段b为Fmoc-Phe-Trp(Boc)-Val-Cys(Trt)-Gly-Lys(Boc)-Asp(OtBu) -Gly-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-His(Trt)-Pro-Cys(Trt)-Ile-Ala-Lys(Boc)-Cys(Trt)-His(Trt)-Asn(Trt)-Val-Glu(OtBu)-Val-Glu(OtBu)-His(Trt)-Asp(OtBu)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-树脂。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述树脂为羟基树脂，包括Wang树脂或HMP Linker树脂。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述树脂的氨基取代值为0.2 mmol/g~0.8mmol/g。
5.根据权利要求1~4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述分段接入制备Sylvestin包括：制备片段、偶联、酸解、环化、纯化和脱盐的步骤；
所述偶联的偶联剂包括HOBt和DIC；
所述酸解的酸解剂包括三氟醋酸、1,2-乙二硫醇和水；
所述环化的氧化剂为碘、H2O2或DMSO。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，
所述偶联剂中HOBt和DIC的摩尔比为（1~2）：1；
所述酸解的酸解剂中三氟醋酸、1,2-乙二硫醇和水的体积比为（80~95）：（1~10）：（1~10）。
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