CN108101975A

CN108101975A - 一种森林山蛭抗血栓多肽Sylvestin及其体外表达制备方法和应用

Info

Publication number: CN108101975A
Application number: CN201711340940.5A
Authority: CN
Inventors: 赖仞; 方鸣谦; 韩亚君
Original assignee: Kunming Institute of Zoology of CAS
Current assignee: Kunming Institute of Zoology of CAS
Priority date: 2017-12-14
Filing date: 2017-12-14
Publication date: 2018-06-01
Anticipated expiration: 2037-12-14
Also published as: CN108101975B

Abstract

本发明提供了一种森林山蛭抗血栓多肽Sylvestin及其体外表达制备方法，属于多肽合成表达技术领域，所述多肽Sylvsetin的氨基酸序列如Seq ID No.1所示。本发明还提供了所述多肽Sylvestin的改造肽，所述改造肽的氨基酸序列如Seq ID No.5、Seq ID No.6、Seq ID No.7或Seq ID No.8所示。所述多肽Sylvestin及其改造肽具有FXIIa抑制活性，以及抗血栓和治疗中风的功效。本发明所述的体外表达制备方法，实现了山蛭Sylvestin多肽在原核生物体内的规模化、低成本生产，通过纯化应用于生物功能药物的制备。

Description

一种森林山蛭抗血栓多肽Sylvestin及其体外表达制备方法和应用

技术领域

本发明属于多肽合成表达技术领域，具体涉及一种森林山蛭抗血栓多肽Sylvestin及其体外表达制备方法和应用。

背景技术

血栓是导致心血管疾病发病和致死的主要原因，发病率与年龄增长成正相关。我国正在步入老龄化的国家，心血管疾病成为一个沉重的社会负担。长期以来，针对血液凝固、血小板激活与聚集和血栓溶解等生理机制开发出了大量的抗血栓药物。但是，许多抗血栓药物因具有出血活性、导致低血压等全身性副作用而受到限制。因此，挖掘新的、特异的抗血栓药物一直以来是研究的热点。

近年来，大鼠实验模型和临床研究表明FXI(血浆凝血激酶前质)或FXII(接触因子)对于血栓的形成和稳定有重要的作用，尤其它们对止血有较小的影响，即FXI或FXII的抑制剂具有抗血栓的作用，而不会有出血副作用。目前研究的FXI或FXII的抑制剂包括单克隆抗体、反义寡核苷酸，多肽、化学小分子等，其中单克隆抗体、反义寡核苷酸存在价格昂贵、起效慢、可能不易控制等问题，相比之下，多肽作为FXI或FXII的抑制剂更适合实际应用。而目前研究的多肽存在种类少，活性低，不稳定的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种活性高、稳定性好，适合于工业生产的森林山蛭抗血栓多肽Sylvestin及其体外表达制备方法和应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：一种森林山蛭抗血栓多肽Sylvestin，所述多肽Sylvsetin的氨基酸序列如Seq IDNo.1所示。

本发明提供了编码所述的多肽Sylvestin的核苷酸，所述核苷酸序列如SeqIDNo.2所示。

本发明还提供了一种森林山蛭抗血栓重组多肽Sylvestin，所述重组多肽Sylvestin包括多肽Sylvestin和肠激酶酶切位点片段，所述重组多肽Sylvestin的序列如Seq IDNo.3所示。

本发明提供了所述的重组多肽Sylvestin的核苷酸，所述核苷酸序列如SeqIDNo.4所示。

本发明还提供了一种多肽Sylvestin的重组表达载体，所述表达载体包括如SeqIDNo.2所示核苷酸序列。

本发明提供了一种包括多肽Sylvestin的重组表达载体的重组表达菌株。

本发明还提供了多肽Sylvestin定点突变获得的改造肽，所述改造肽的氨基酸序列如Seq IDNo.5、Seq IDNo.6、Seq IDNo.7或Seq IDNo.8所示。

本发明还提供了所述多肽Sylvestin的体外表达制备方法，包括以下步骤：1)构建权利要求6所述的重组表达菌株；2)诱导所述重组菌株表达获得含重组多肽Sylvestin的菌液；所述诱导的温度为16～30℃，所述诱导的IPTG浓度为0.05～0.55mmol/L，所述诱导的时间为1～18h；3)从所述菌液中分离纯化获得重组多肽Sylvestin；4)用肠激酶酶切所述重组多肽Sylvestin获得多肽Sylvestin。

本发明还提供了所述的森林山蛭抗血栓多肽Sylvestin或所述的改造肽在制备抗血栓药物中的应用。

本发明还提供了所述的森林山蛭抗血栓多肽Sylvestin或所述的改造肽在制备治疗中风药物中的应用。

本发明的有益效果：本发明所提供的多肽Sylvestin是从森林山蛭分离获得，森林山蛭是一种吸血性环节动物，为了成功地吸食猎物的血液，山蛭在长期的进化过程中产生了很多抗凝血的物质抵制猎物本身血液的凝固，是抗凝血物质天然来源。所述多肽Sylvestin具有FXIIa抑制活性，具有抗血栓及中风治疗功效。

本发明所提供的森林山蛭抗血栓重组多肽Sylvestin在多肽Sylvestin的序列上连接肠激酶酶切位点，利于体外表达制备过程中多肽Sylvestin于载体的连接和多肽Sylvestin的分离纯化。

本发明提供的改造肽，是在多肽Sylvestin的基础上进行定点突变获得的多肽，具有与多肽Sylvestin类似的FXIIa抑制活性，以及抗血栓和治疗中风的功效，丰富了抗血栓药物及治疗中风药物可选择多肽的种类。

本发明提供的所述多肽Sylvestin的体外表达制备方法，能够制备获得高纯度，高稳定性，构象均一的多肽Sylvestin，所述方法能够使多肽Sylvestin能够在重组表达菌株中高水平表达，并且所述方法中的肠激酶切效率高，对多肽Sylvestin产业化生产及其应用具有重要意义。所述方法实现了山蛭Sylvestin多肽在原核生物体内的规模化、低成本生产，通过纯化应用于生物功能药物的制备。

附图说明

图1为森林山蛭Sylvestin重组多肽Sylvestin的表达与纯化的SDS-PAGE凝胶电泳图；

图2为森林山蛭抗血栓重组多肽Sylvestin的不同条件下肠激酶切的SDS-PAGE凝胶电泳图；

图3为森林山蛭重组多肽Sylvestin肠激酶酶切后质谱分析图；

图4为森林山蛭重组多肽Sylvestin肠激酶切后FXIIa抑制活性；

图5为森林山蛭重组多肽Sylvestin肠激酶切后Sephadex-G50凝胶层析图；

图6为森林山蛭多肽Sylvestin纯化后质谱分析图；

图7为森林山蛭多肽Sylvestin与改造肽对KLK抑制活性的结果对比图；

图8为森林山蛭多肽Sylvestin与改造肽对FXIIa抑制活性的结果对比图。

具体实施方式

本发明提供了一种森林山蛭抗血栓多肽Sylvestin，所述多肽Sylvsetin的氨基酸序列如SeqIDNo.1所示，具体为：

TSEPVCACPKMLFWVCGKDGETYTHPCIAKCHNVEVEHDGKCK。

本发明中所述多肽Sylvestin来源于云南森林山蛭，本发明在具体实施过程中优选的从云南森林山蛭的全体匀浆液中分离纯化获得多肽Sylvestin；所述多肽Sylvestin可延长血浆复钙时间。本发明中所述从云南森林山蛭的全体匀浆液中分离纯化多肽的方法采用本领域常规的天然多肽分离纯化方法即可，在具体的实施过程中优选的采用分子筛凝胶过滤、反相高压液相色谱等分离纯化方法。

本发明还提供了编码所述的多肽Sylvestin的核苷酸，所述核苷酸序列如SeqIDNo.2所示，具体为：

acctcggaaccggtatgtgcatgcccaaaaatgctattttgggtttgtggtaaagatggtgagacttacacccatccttgcattgcaaaatgccataatgttgaagttgaacatgatgggaagtgcaaataa。

本发明中所述编码所述的多肽Sylvestin的核苷酸的获得方法优选的以所述多肽Sylvestin的氨基酸序列的核苷酸序列为模板设计引物，然后从森林山蛭头部的cDNA文库中扩增获得。本发明中所述特异性引物序列包括正向引物序列和反向引物序列；所述正向引物序列优选的如Seq ID No.13所示，具体为AAACCGAACCGTCGGTATGT，所述反向引物序列优选的如Seq ID No.14所示，具体为GTTCGGTTTGGTGGCTCATT。

本发明中所述编码多肽Sylvestin的核苷酸序列编码的多肽由43个氨基酸组成，含六个半胱氨酸，分子量为4795.4Da，比天然多肽的分子量大6Da，这说明天然多肽形成了三对分子内二硫键。在NCBI数据库中经过BLAST比对发现，所述多肽Sylvestin属于Kazal家族的丝氨酸蛋白酶抑制剂。

本发明在获得所述多肽Sylvestin的氨基酸序列后，采用原核表达系统，对其重组蛋白进行表达，肠激酶切后，得到Sylvestin纯化蛋白，经活性测定APTT(活化部分凝血酶时间)和PT(凝血酶时间)实验、发色底物检测确定了所述多肽Sylvestin对FXIIa的抑制活性。

本发明提供了一种森林山蛭抗血栓重组多肽Sylvestin，所述重组多肽Sylvestin包括多肽Sylvestin和肠激酶酶切位点片段，所述重组多肽Sylvestin的序列如Seq IDNo.3所示，具体为：

MIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSK

GQLKEFLDANLAGSGSGHMHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDDD

KAMADIGSTSEPVCACPKMLFWVCGKDGETYTHPCIAKCHNVEVEHDGKCK*。

本发明中所述重组多肽Sylvestin是在多肽Sylvestin的序列上连接肠激酶酶切位点，利于体外表达制备过程中多肽Sylvestin于载体的连接和多肽Sylvestin的分离纯化。

本发明提供了编码所述的重组多肽Sylvestin的核苷酸，所述核苷酸序列如SeqIDNo.4所示，具体为

atgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaatatcagggcaaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggtatcccgactctgctgctgttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttgaaagagttcctcgacgctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtgccacgcggttctggtatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgacgacgacgacaaggccatggctgatatcggatccacctcggaaccggtatgtgcatgcccaaaaatgctattttgggtttgtggtaaagatggtgagacttacacccatccttgcattgcaaaatgccataatgttgaagttgaacatgatgggaagtgcaaataa。

本发明还提供了一种多肽Sylvestin的重组表达载体，所述表达载体包括如SeqIDNo.2所示核苷酸序列。在本发明中所述重组表达载体优选的包括上述重组多肽的核苷酸序列；所述重组表达载体优选的还包括商品化的表达载体，所述商品化的表达载体优选的为原核表达载体PET32a，所述原核表达载体PET32a优选的购自Slvestin。

本发明提供了一种包括多肽Sylvestin的重组表达载体的重组表达菌株。本发明所述的重组表达菌株的制备方法优选的为将所述重组表达载体转化到表达菌株种获得，本发明中所述表达菌株优选的为BL21(DE3)pLysS菌株。

本发明还提供了多肽Sylvestin定点突变获得的改造肽，所述改造肽的氨基酸序列如Seq IDNo.5、Seq IDNo.6、Seq IDNo.7或Seq IDNo.8所示。在本发明对所述定点突变的方法没有特殊限定，采用本领域常规的定点突变方法即可。本发明中，编码所述改造肽的核苷酸序列如Seq IDNo.9、Seq IDNo.10、Seq IDNo.11或Seq IDNo.12所示。本发明所述的改造肽具有与多肽Sylvestin类似的FXIIa抑制活性，以及抗血栓和治疗中风的功效，丰富了抗血栓药物及治疗中风药物可选择多肽的种类。

在本发明中，所述重组表达菌株的构建方法包括以下步骤：a，将肠激酶酶切位点与编码多肽Sylvestin的核苷酸序列连接获得编码重组多肽Sylvestin的核苷酸序列；b，将所述编码重组多肽Sylvestin的核苷酸序列与表达载体连接获得重组表达载体；c，将所述重组表达载体转化到表达菌株中获得重组表达菌株。

本发明将质粒PET32a(+)中酶切位点BamH1和Xhol与编码多肽Sylvestin的核苷酸序列连接，获得编码重组多肽Sylvestin的核苷酸序列；本发明对所述连接方法没有特殊限定，采用本领域常规的核苷酸连接方法即可。本发明将所述肠激酶酶切位点与编码多肽Sylvestin的核苷酸序列连接的目的在于方便后续的重组表达载体的构建和多肽Sylvestin的纯化。

本发明在获得编码重组多肽Sylvestin的核苷酸序列后，将所述的编码重组多肽Sylvestin的核苷酸序列与表达载体连接，获得重组表达载体，所述表达载体优选的为原核表达载体，更优选的为PET32a。本发明对所述连接的方法没有特殊限定采用本领域常规的连接方法即可，具体实施过程中可选用载体连接试剂盒。

本发明在获得重组表达载体后，将所述重组表达载体转化到表达菌株中获得重组表达菌株。本发明中所述表达菌株优选的为大肠杆菌菌株，更优选的为BL21(DE3)pLysS菌株。

本发明在获得重组表达菌株后，诱导所述重组菌株表达获得含重组多肽Sylvestin的菌液；所述诱导的温度为16～30℃，优选的为20～29℃，更优选的为28℃；所述诱导的IPTG浓度为0.05～0.55mmol/L，优选的为0.48～0.52mmol/L，更优选的为0.5mmol/L；所述诱导的时间为1～18h，优选的为4～12h，更优选的为8h。

本发明中所述诱导前优选的还包括重组表达菌株的扩大培养，本发明中所述扩大培养具体的为将所述重组表达菌株的阳性单克隆接种于含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，并按接种量比例为1：100扩大培养至菌液OD₆₀₀值为0.6～0.7。本发明中所述重组表达菌株的阳性单克隆的获得方法采用本领域常规的重组表达菌株的阳性单克隆方法即可，无其他特殊要求。

本发明在获得含重组多肽Sylvestin的菌液后，从所述菌液中分离纯化获得重组多肽Sylvestin。所述分离纯化重组多肽的方法优选的为：收集所述的含重组多肽Sylvestin的菌液中的菌体，将收集到的菌体破碎，收集含重组多肽蛋白的上清液，然后经微滤、Ni²⁺-NTA亲和层析柱分离获得重组多肽Sylvestin。

在本发明中所述菌体破碎的方法优选的为反复冻融法，在本发明具体实施过程中优选的每g菌体中加入结合缓冲液15ml重悬菌体，在-80℃条件下反复冻融菌液3次，然后在冰浴的同时进行超声破碎后固液分离获得上清液。在本发明中所述结合缓冲液优选的为包括20mmol/L Na₃PO₄、0.5mol/L NaCl和20mmol/L咪唑的水溶液；所述超声的功率优选的为600～1000w，更优选的为800w；所述超声采用间歇式超声，具体为5s超声，5s间隔，所述超声的总时间优选的25～35min，更优选的为30min。

本发明在获得上清液后，微滤所述上清液，所述微滤用微滤膜优选的为0.8μm和0.45μm微孔滤膜。所述微滤优选的先过0.8μm微孔滤膜然后再过0.45μm微孔滤膜。

本发明在所述上清液过滤后，将得到的微滤液经Ni²⁺-NTA亲和层析柱分离获得重组多肽Sylvestin；所述重组多肽Sylvestin的相对分子质量约为18.36KDa，符合预期计算值。本发明中所述亲和层析柱分离的具体条件优选的为：

Wash buffer:20mM Tris-HCl buffer,100mM NaCl,10％(v/v)glycerol,7mM 2-ME,20mM imidazole,pH8.0.

Elution buffer:20mM Tris-HCl buffer,100mM NaCl,10％(v/v)glycerol,7mM2-ME,250mM imidazole,pH8.0.

Savingbuffer:20mM Tris-HCl buffer,100mM NaCl,10％(v/v)glycerol,7mM 2-ME,pH8.0.

所述亲和层析柱分离的具体步骤优选的为：1.待样品上清液大致流净，加入washbuffer洗杂蛋白，一般需要10～15倍柱床体积的Wash buffer，用Coomassie G250检测杂蛋白是否洗干净。2.如Coomassie G250不变色表示杂蛋白已经洗干净(一定要接最新流出的液体检测)，加入2～3倍elution buffer洗脱目的蛋白，此时开始收集目的蛋白，并用Coomassie G250监测收集。3.将收集的蛋白溶液转移到透析袋中，透析袋扎紧，放置1～2Lsaving buffer中透析蛋白。如加搅拌，透析约2～3hr完成。透析需在4℃完成。4.收集透析后的蛋白，进行SDS-PAGE检测纯化蛋白的纯度，并用Bradford方法测定蛋白质浓度。5.进行酶活实验。

本发明在获得重组多肽Sylvestin后，用肠激酶酶切所述重组多肽Sylvestin获得多肽Sylvestin。本发明中所述酶切条件优选的为：重组多肽Sylvestin浓度为1～20mg/ml，酶量0.3～3U/50μl，酶切温度22～22℃，酶切时间为14～18h；更优选的为蛋白浓度10mg/ml，酶量为3U/50μl，酶切温度21℃，酶切时间16h。

本发明在获得所述多肽Sylvestin后，优选的还包括对所述多肽Sylvestin的纯化过程，所述多肽Sylvestin的纯化优选的采用Sephadex-G50凝胶层析和RP-HPLC方法；本发明中所述Sephadex-G50凝胶层析和RP-HPLC方法过程中的条件参数采用本领域常规的条件参数即可。

本发明还提供了所述的森林山蛭抗血栓多肽Sylvestin或所述的改造肽在制备抗血栓药物中的应用；所述森林山蛭抗血栓多肽Sylvestin或所述的改造肽作为药物的有效剂量为0.1～20mg/Kg。

本发明还提供了所述的森林山蛭抗血栓多肽Sylvestin或所述的改造肽在制备治疗中风药物中的应用。所述森林山蛭抗血栓多肽Sylvestin或所述的改造肽作为药物的有效剂量为0.1-20mg/Kg。

下面结合实施例对本发明提供的一种森林山蛭抗血栓多肽Sylvestin及其体外表达制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

天然森林山蛭抗血栓多肽Sylvestin的获得

从采用分子筛凝胶过滤和反相高压液相色谱法从云南森林山蛭的全体匀浆液中分离纯化获得多肽Sylvestin。用Edman降解法测定了所述多肽Sylvestin的N端12个氨基酸序列，并从云南森林山蛭转录组中筛选得到编码该多肽的同源序列，以所述同源核苷酸序列为模板设计特异性引物，正向引物为AAACCGAACCGTCGGTATGT，反向引物序列为

GTTCGGTTTGGTGGCTCATT。然后从构建的山蛭头部cDNA文库中扩增得到了编码多肽Sylvestin的核苷酸序列。

所述核苷酸序列编码的成熟肽由43个氨基酸组成，含六个半胱氨酸，分子量为4795.4Da，比天然多肽的分子量大6Da，这说明天然多肽形成了三对分子内二硫键。

实施例2

一种森林山蛭抗血栓重组多肽Sylvestin，包括多肽Sylvestin和肠激酶酶切位点片段，序列如Seq IDNo.3所示，具体为MKLLVVLLIVSLVGMSHQTSEPVCACPKMLFWVCGKDGETYTHPCIAKCHNVEVEHDGKCK。本发明中所述重组多肽Sylvestin是在多肽Sylvestin的序列上连接肠激酶酶切位点，利于体外表达制备过程中多肽Sylvestin于载体的连接和多肽Sylvestin的分离纯化。

实施例3

多肽Sylvestin定点突变获得的改造肽，所述改造肽的氨基酸序列如Seq IDNo.5、Seq IDNo.6、Seq IDNo.7或Seq IDNo.8所示。编码所述改造肽的核苷酸序列如Seq IDNo.9、Seq IDNo.10、SeqIDNo.11或Seq IDNo.12所示。

实施例4

一种多肽Sylvestin的重组表达载体，所述重组表达载体为向原核表达载体PET32a转入重组多肽Sylvestin的核苷酸序列。用相同的酶同时酶切原核表达载体PET32a和重组多肽Sylvestin，酶切后连接即获得肽Sylvestin的重组表达载体。

实施例5

一种包括多肽Sylvestin的重组表达载体的重组表达菌株，将实施例4中的表达载体转入到BL21(DE3)pLysS菌株中获得。本实施例中采用热激法，在42℃热激条件下将所述的重组表达载体转入BL21(DE3)pLysS菌株中获得重组表达菌株。

实施例6

多肽Sylvestin的体外表达制备方法

将肠激酶酶切位点与编码多肽Sylvestin的核苷酸序列连接获得编码重组多肽Sylvestin的核苷酸序列；将所述编码重组多肽Sylvestin的核苷酸序列与表达载体连接获得重组表达载体；

将验证正确的重组表达载体转化到表达菌株BL21(DE3)pLysS中，挑取阳性单克隆接种于含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，并按1：100扩大培养至OD600值为0.6～0.7后，分别设置不同的诱导培养时间培养温度和IPTG浓度，诱导Sylvestin在表达菌株中的表达，获得最佳的表达条件为温度为28℃，IPTG浓度为0.5mmol/L，诱导时间为8h。

将重组Sylvestin菌种接种到500ml LB培养基中(含有100μg/ml氨苄霉素)，27℃条件下IPTG(0.5mmol/L)诱导重组菌8h后，4℃、12000r/min离心10min收集菌体，每g菌体加入结合缓冲液(20mmol/L Na3PO4，0.5mol/L NaCl，20mmol/L咪唑)15ml重悬菌体。在-80℃条件下反复冻融菌液3次，冰浴进行超声破碎(800W)，5s超声，5s间隔，破碎30min。破碎后用4℃、12000r/min离心30min收集上清液与沉淀，通过SDS-PAGE凝胶电泳证明，其目的蛋白是在上清液中，结果如图1所示，箭头标出的为重组蛋白Sylvestin，表明重组蛋白在上清大量表达。将上清先后用0.8μm和0.45μm微孔滤膜过滤，然后经Ni²⁺-NTA亲和层析柱分离、纯化目的蛋白，得到的纯化Sylvestin重组蛋白相对分子质量约为23KDa，如图2，所示，符合预期计算值。

使用肠激酶来切割重组多肽，酶切条件：蛋白浓度为20，10mg/ml，1mg多肽Sylvestin，酶切体积为50μl，加入酶量分别为3U，1U，0.3U来探究最适使用酶量。酶切温度为21℃，时间为16h。最终探究得出10mg/ml Sylvestin，3U/50μl，21℃，16h的酶切效果最好，结果如图2所示：50μl的酶切反应体系中，设定两个浓度的重组蛋白Sylvestin(20mg/ml,10mg/ml),加入不同活力单位的肠激酶(3U,1U,0.3U)。根据如上16％SDS-PAGE电泳图为肠激酶切His-Sylvestin后的蛋白，每孔上样量都为15μg，可看出，当使用10mg/mlSylvestin，酶量3U/50ul，21℃，16h时，Sylvestin的条带最为明显，表明此为最优酶切条件。0U表示经过Ni²⁺-NTA亲和层析柱分离纯化后，不加肠激酶的蛋白。

肠激酶酶切后的蛋白，将酶切后的蛋白通过质谱分析，结果如图3所示，箭头所指为酶切成功的Sylvestin蛋白的峰，其分子量为4789.7，与目的蛋白分子量大小几乎一致，表明酶切成功。测定酶切后的多肽Sylvestin的FXIIa抑制活性，结果如图4所示，酶切后的Sylvestin，具有酶抑制活性，进一步验证了酶切成功，并且具有活性。

酶切后，对酶切获得的多肽Sylvestin进行纯化。采用10Kda的超滤管初步分离目的蛋白Sylvestin与融合头His-tag后，使用Sephadex-G50凝胶层析分离纯化Sylvestin，结果如图5所示，箭头所指为Sylvestin峰，总纯化率为10％(10mg的His-sylvestin能得到1mg的多肽Sylvestin)。然后将Sephadex-G50凝胶层析分离纯化的多肽Sylvestin通过质谱分析，结果如图6所示，分子量与目的蛋白一致。

实施例7

实施例1中所述的森林山蛭Sylvestin多肽以及实施例3中所述的改造肽的KLK，FXIIa抑制活性测定

HFXIIa：在96孔板中10μL不同浓度的Sylvestin与10μL终浓度为0.2μM的FXIIa混合于40μL缓冲液(100mMNacl、50mMTris-HCl，pH8.0、5mMCaCl2)中。室温放置5分钟后，加入30μL缓冲液与10μL终浓度为0.04mMS2302(CHROMOGENIX,H-D-Pro-Arg-pNA·2HCl)的混合液，终体积为100μL。反应的动力学使用Epoch(BioTek)酶标仪、GENCHS1.09软件检测OD405nm，20min，间隔47s。

Plasmakallikrein(KLK)：在96孔板中不同浓度的Sylvestin与0.26μM的KLK混合于40μLTris-HCl缓冲液(20mM，pH7.4)中。室温放置5分钟后，加入30μL缓冲液与10μL发色底物(Gly-Arg-p-nitroanilidedihydrochloride)的混合液，终体积为100μL。反应的动力学使用Epoch(BioTek)酶标仪、GENCHS1.09软件检测OD405nm，20min，间隔30s，两个重复。

结果如图7和图8所示，加入的浓度都为300μg/ml，Sylvestin天然肽的FXIIa，Kallikrein抑制活性最高，故能预测Sylvestin天然肽抗凝血活性最强。

由上述实施例可知，本发明所提供的多肽Sylvestin以及改造肽，具有FXIIa抑制活性，具有抗凝血作用，同时具备抗血栓和治疗中风的功效，丰富了抗血栓药物及治疗中风药物可选择多肽的种类。

本发明提供的所述多肽Sylvestin的体外表达制备方法，能够制备获得高纯度，高稳定性，构象均一的多肽Sylvestin，实现了山蛭Sylvestin多肽在原核生物体内的规模化、低成本生产，通过纯化应用于生物功能药物的制备。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国科学院昆明动物研究所

<120> 一种森林山蛭抗血栓多肽Sylvestin及其体外表达制备方法和应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 43

<212> PRT

<213> Haemadipsa sylvestris

<400> 1

Thr Ser Glu Pro Val Cys Ala Cys Pro Lys Met Leu Phe Trp Val Cys

1 5 10 15

Gly Lys Asp Gly Glu Thr Tyr Thr His Pro Cys Ile Ala Lys Cys His

20 25 30

Asn Val Glu Val Glu His Asp Gly Lys Cys Lys

35 40

<210> 2

<211> 132

<212> DNA

<213> Haemadipsa sylvestris

<400> 2

acctcggaac cggtatgtgc atgcccaaaa atgctatttt gggtttgtgg taaagatggt 60

gagacttaca cccatccttg cattgcaaaa tgccataatg ttgaagttga acatgatggg 120

aagtgcaaat aa 132

<210> 3

<211> 171

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp Glu Tyr Gln Gly Lys

1 5 10 15

Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn Pro Gly Thr Ala Pro

20 25 30

Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu Leu Phe Lys Asn Gly

35 40 45

Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser Lys Gly Gln Leu Lys

50 55 60

Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly Ser Gly His Met His

65 70 75 80

His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Met

85 90 95

Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp Ser Pro

100 105 110

Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met Ala Asp Ile Gly Ser

115 120 125

Thr Ser Glu Pro Val Cys Ala Cys Pro Lys Met Leu Phe Trp Val Cys

130 135 140

Gly Lys Asp Gly Glu Thr Tyr Thr His Pro Cys Ile Ala Lys Cys His

145 150 155 160

Asn Val Glu Val Glu His Asp Gly Lys Cys Lys

165 170

<210> 4

<211> 516

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgatcgccc cgattctgga tgaaatcgct gacgaatatc agggcaaact gaccgttgca 60

aaactgaaca tcgatcaaaa ccctggcact gcgccgaaat atggcatccg tggtatcccg 120

actctgctgc tgttcaaaaa cggtgaagtg gcggcaacca aagtgggtgc actgtctaaa 180

ggtcagttga aagagttcct cgacgctaac ctggccggtt ctggttctgg ccatatgcac 240

catcatcatc atcattcttc tggtctggtg ccacgcggtt ctggtatgaa agaaaccgct 300

gctgctaaat tcgaacgcca gcacatggac agcccagatc tgggtaccga cgacgacgac 360

aaggccatgg ctgatatcgg atccacctcg gaaccggtat gtgcatgccc aaaaatgcta 420

ttttgggttt gtggtaaaga tggtgagact tacacccatc cttgcattgc aaaatgccat 480

aatgttgaag ttgaacatga tgggaagtgc aaataa 516

<210> 5

<211> 43

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Thr Ser Glu Pro Val Cys Ala Cys Pro Lys Met Tyr Phe Trp Val Cys

1 5 10 15

Gly Lys Asp Gly Glu Thr Tyr Thr His Pro Cys Ile Ala Lys Cys His

20 25 30

Asn Val Glu Val Glu His Asp Gly Lys Cys Lys

35 40

<210> 6

<211> 43

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Thr Ser Glu Pro Val Cys Ala Cys Pro Lys Met Leu Val Trp Val Cys

1 5 10 15

Gly Lys Asp Gly Glu Thr Tyr Thr His Pro Cys Ile Ala Lys Cys His

20 25 30

Asn Val Glu Val Glu His Asp Gly Lys Cys Lys

35 40

<210> 7

<211> 43

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Thr Ser Glu Pro Val Cys Ala Cys Pro Lys Met Leu Phe Pro Val Cys

1 5 10 15

Gly Lys Asp Gly Glu Thr Tyr Thr His Pro Cys Ile Ala Lys Cys His

20 25 30

Asn Val Glu Val Glu His Asp Gly Lys Cys Lys

35 40

<210> 8

<211> 43

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Thr Ser Glu Pro Val Cys Ala Cys Phe Arg Asn Leu Phe Trp Val Cys

1 5 10 15

Gly Lys Asp Gly Glu Thr Tyr Thr His Pro Cys Ile Ala Lys Cys His

20 25 30

Asn Val Glu Val Glu His Asp Gly Lys Cys Lys

35 40

<210> 9

<211> 129

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

accagcgagc ccgtgtgcgc ctgccccaag atgtacttct gggtgtgcgg caaggacggc 60

gagacctaca cccacccctg catcgccaag tgccacaacg tggaggtgga gcacgacggc 120

aagtgcaag 129

<210> 10

<211> 129

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

accagcgagc ccgtgtgcgc ctgccccaag atgctggtgt gggtgtgcgg caaggacggc 60

gagacctaca cccacccctg catcgccaag tgccacaacg tggaggtgga gcacgacggc 120

aagtgcaag 129

<210> 11

<211> 129

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

accagcgagc ccgtgtgcgc ctgccccaag atgctgttcc ccgtgtgcgg caaggacggc 60

gagacctaca cccacccctg catcgccaag tgccacaacg tggaggtgga gcacgacggc 120

aagtgcaag 129

<210> 12

<211> 129

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

accagcgagc ccgtgtgcgc ctgcttcagg aacctgttct gggtgtgcgg caaggacggc 60

gagacctaca cccacccctg catcgccaag tgccacaacg tggaggtgga gcacgacggc 120

aagtgcaag 129

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aaaccgaacc gtcggtatgt 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gttcggtttg gtggctcatt 20

Claims

1.一种森林山蛭抗血栓多肽Sylvestin，所述多肽Sylvsetin的氨基酸序列如Seq IDNo.1所示。

2.编码权利要求1所述的多肽Sylvestin的核苷酸，所述核苷酸序列如Seq ID No.2所示。

3.一种森林山蛭抗血栓重组多肽Sylvestin，其特征在于，所述重组多肽Sylvestin包括多肽Sylvestin和肠激酶酶切位点片段，所述重组多肽Sylvestin的序列如Seq ID No.3所示。

4.编码权利要求3所述的重组多肽Sylvestin的核苷酸，所述核苷酸序列如Seq IDNo.4所示。

5.一种多肽Sylvestin的重组表达载体，其特征在于，所述表达载体包括如Seq IDNo.2所示的核苷酸序列。

6.一种多肽Sylvestin的重组表达菌株，其特征在于，所述重组表达菌株包括权利要求5所述的重组表达载体。

7.权利要求1所述的多肽Sylvestin定点突变获得的改造肽，其特征在于，所述改造肽的氨基酸序列如Seq ID No.5、SeqID No.6、Seq ID No.7或Seq ID No.8所示。

8.权利要求1所述的多肽Sylvestin的体外表达制备方法，包括以下步骤：

1)构建权利要求6所述的重组表达菌株；

2)诱导所述重组菌株表达，获得含重组多肽Sylvestin的菌液；所述诱导的温度为16～30℃，所述诱导的IPTG浓度为0.05～0.55mmol/L，所述诱导的时间为1～18h；

3)从所述菌液中分离纯化获得Seq ID No.3所示氨基酸序列的重组多肽Sylvestin；

4)用肠激酶酶切所述重组多肽Sylvestin，获得多肽Sylvestin。

9.权利要求1所述的森林山蛭抗血栓多肽Sylvestin或权利要求7所述的改造肽在制备抗血栓药物中的应用。

10.权利要求1所述的森林山蛭抗血栓多肽Sylvestin或权利要求7所述的改造肽在制备治疗中风药物中的应用。