JP2865345B2 - 抗トロンビン - Google Patents
抗トロンビンInfo
- Publication number
- JP2865345B2 JP2865345B2 JP1511701A JP51170189A JP2865345B2 JP 2865345 B2 JP2865345 B2 JP 2865345B2 JP 1511701 A JP1511701 A JP 1511701A JP 51170189 A JP51170189 A JP 51170189A JP 2865345 B2 JP2865345 B2 JP 2865345B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- glu
- asp
- antithrombin
- gly
- cys
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/655—Somatostatins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Hematology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、新規な抗トロンビン、そして特に、ヒル
（lee ch）組織及びヒル分泌由来の抗トロンビンに関
する。
（lee ch）組織及びヒル分泌由来の抗トロンビンに関
する。
ヒルジンは、良く知られそして十分に特性の分かった
ポリペプチドであり、トロンビンに対し特異的であるこ
とが分かっており、ヒルド メジシナリス（Hirudo me
dicinalis）の一種のヒル由来の抽出物である。このポ
リペプチドは、やや低分子量（約7000）であり、65アミ
ノ酸で構成されている。ヒルジンの第１のアイソホーム
（isoform）の配列は、ドット、ミュラー、シーミュラ
ー、及びチャン（Dodt,Muller,seemuller、and Chang）
［ヒルジン、「トロンビン−特異的阻害剤の完全アミノ
酸配列」（“The complete amino acid sequence of hi
rudin,a thrombin−specific inhibitor"）、FEBS 165
（1984）:pp180−184）によって、次のとおり決定され
た。
ポリペプチドであり、トロンビンに対し特異的であるこ
とが分かっており、ヒルド メジシナリス（Hirudo me
dicinalis）の一種のヒル由来の抽出物である。このポ
リペプチドは、やや低分子量（約7000）であり、65アミ
ノ酸で構成されている。ヒルジンの第１のアイソホーム
（isoform）の配列は、ドット、ミュラー、シーミュラ
ー、及びチャン（Dodt,Muller,seemuller、and Chang）
［ヒルジン、「トロンビン−特異的阻害剤の完全アミノ
酸配列」（“The complete amino acid sequence of hi
rudin,a thrombin−specific inhibitor"）、FEBS 165
（1984）:pp180−184）によって、次のとおり決定され
た。
２つのヒルジンの変種も又特性が決定され、アミノ酸
配列が決定された。第１の変種は、ドット、マチレイ
ト、シーミュラー、マシェラー、及びフリッツ（Dodt,M
achleidt,Seemuller,Maschler and Fritz）［「ヒルジ
ン、アイソインヒビターの単離及び特性並にヒルジンPA
の配列分析」（“Isolation and characterisation
of hirudin isoinhibitors and sequence analysi
s of hirudin PA"）、バイオロ・ケミ・ホッペザイ
ラーBiol.chem.Hoppe−Seyler）,367（1986）pp803−81
1］に述べられている。この変種は、上記のものと次の
点で異なる： 1.位置１の−val−に替えて、−Ile− 2.位置２の−val−に替えて、−thr− 3.位置24の−gln−に替えて、−lys− 4.位置33の−asp−に替えて、−asn− 5.位置35の−glu−に替えて、−lys− 6.位置36の−lys−に替えて、−gly− 7.位置47の−lys−に替えて、−asn− 8.位置49の−gln−に替えて、−glu− 9.位置53の−asp−に替えて、−asn− 第２の変種は、ハーベイ、デグリセ、ステファニ、シ
ャンバー等（Harvey,Degryse,Stefani,Schamber等、
［「吸血ヒル、ヒルド メジシナリスからの抗凝固ヒル
ジンをコードするcDNAのクローニング及び発現」（“Cl
oning and expression of a cDNA coding for the anti
−coagulant hirudin from the bloodsucking leech,Hi
rudo medicinalis"）、プロ．ナショ．アカデ．サイエ
ン（Proc.Nat.Acad.Sci.）U.S.A.（1986）,pp1084−108
8］に述べられている。これは、位置１から32までは、
最初に述べた変種と同一であり、最初に述べたヒルジン
とは、次の相違がある。
配列が決定された。第１の変種は、ドット、マチレイ
ト、シーミュラー、マシェラー、及びフリッツ（Dodt,M
achleidt,Seemuller,Maschler and Fritz）［「ヒルジ
ン、アイソインヒビターの単離及び特性並にヒルジンPA
の配列分析」（“Isolation and characterisation
of hirudin isoinhibitors and sequence analysi
s of hirudin PA"）、バイオロ・ケミ・ホッペザイ
ラーBiol.chem.Hoppe−Seyler）,367（1986）pp803−81
1］に述べられている。この変種は、上記のものと次の
点で異なる： 1.位置１の−val−に替えて、−Ile− 2.位置２の−val−に替えて、−thr− 3.位置24の−gln−に替えて、−lys− 4.位置33の−asp−に替えて、−asn− 5.位置35の−glu−に替えて、−lys− 6.位置36の−lys−に替えて、−gly− 7.位置47の−lys−に替えて、−asn− 8.位置49の−gln−に替えて、−glu− 9.位置53の−asp−に替えて、−asn− 第２の変種は、ハーベイ、デグリセ、ステファニ、シ
ャンバー等（Harvey,Degryse,Stefani,Schamber等、
［「吸血ヒル、ヒルド メジシナリスからの抗凝固ヒル
ジンをコードするcDNAのクローニング及び発現」（“Cl
oning and expression of a cDNA coding for the anti
−coagulant hirudin from the bloodsucking leech,Hi
rudo medicinalis"）、プロ．ナショ．アカデ．サイエ
ン（Proc.Nat.Acad.Sci.）U.S.A.（1986）,pp1084−108
8］に述べられている。これは、位置１から32までは、
最初に述べた変種と同一であり、最初に述べたヒルジン
とは、次の相違がある。
1.位置33の−asp−に替えて、−gln− 2.位置35の−glu−に替えて、−lys− 3.位置36の−lys−に替えて、−asp− 4.位置53の−asp−に替えて、−gln− 5.位置58の−glu−に替えて、−pro− 6.位置62の−glu−に替えて、−asp− 7.位置64の−leu−に替えて、−asp− 8.位置65の−gln−に替えて、−glu− 上記したように、ヒルジンは、ヒルド メジシナリス
Hirude medicinalis）種のヒル由来であった。ヒルディ
ナリア マニレンシス（Hirudinaria manillensis）と
ヒルド メジシナリスとは、これらが共に両生網及び哺
乳網の血液で育つことができる点において類似してい
る。しかし、ヒルディナリアは、ヒルド メディシナリ
スよりも進化論的により進んでいる。ヒルの最初の種の
分泌物中に存在する活性物質が、他の種で見出されそう
かどうか、又、（もし類似の活性の物質が見つかったと
したら）、それらが、実質的に同一のアミノ酸配列を持
つか又は、極立った異なるアミノ酸配列を持つかという
ことをある確率で予測することはできない。
Hirude medicinalis）種のヒル由来であった。ヒルディ
ナリア マニレンシス（Hirudinaria manillensis）と
ヒルド メジシナリスとは、これらが共に両生網及び哺
乳網の血液で育つことができる点において類似してい
る。しかし、ヒルディナリアは、ヒルド メディシナリ
スよりも進化論的により進んでいる。ヒルの最初の種の
分泌物中に存在する活性物質が、他の種で見出されそう
かどうか、又、（もし類似の活性の物質が見つかったと
したら）、それらが、実質的に同一のアミノ酸配列を持
つか又は、極立った異なるアミノ酸配列を持つかという
ことをある確率で予測することはできない。
我々は、ここに、次のアミノ酸配列を有する抗トロン
ビン、ヒルディナリア マニレンシス（Hirudinaria m
anillensis）由来の新規抗トロンビンを単離した。
ビン、ヒルディナリア マニレンシス（Hirudinaria m
anillensis）由来の新規抗トロンビンを単離した。
ここで、Ｘ、Ｙ及びＺの各々は、どのようなアミノ配
残基を示し、Ｄは、cys又はproを示し、Ｅは、glu又はa
sp又はhisを示し、Ｆは、asp、trp又はlysを示し、そし
て★は、前記した第１のヒルジン変種のものと異なる抗
トロンビン分子中の位置を示す）。
残基を示し、Ｄは、cys又はproを示し、Ｅは、glu又はa
sp又はhisを示し、Ｆは、asp、trp又はlysを示し、そし
て★は、前記した第１のヒルジン変種のものと異なる抗
トロンビン分子中の位置を示す）。
ヒルジン配列と比較して約62％ホモロジーを示し（即
ち、38％相違）、これは驚くべき実質的な相違である。
特に、重要なＣ−末端において非常に相違し、そして次
の明らかな相違がある。
ち、38％相違）、これは驚くべき実質的な相違である。
特に、重要なＣ−末端において非常に相違し、そして次
の明らかな相違がある。
位置13（−leu−に替えて−tyr−） 位置17（−glu−に替えて−val−） 位置24（−gln−に替えて−glu−） 位置26（−asn−に替えて−asp−） 位置27（−lys−に替えて−asn−） 位置29（−ile−に替えて−asn−） 位置30（−leu−に替えて−pro−又は−cys−） 位置31（−gly−に替えて−gln−） 位置32（−ser−に替えて−leu−） 位置33（−asp−に替えて−ser−） 位置34（−gly−に替えて−ser−） 位置35（−glu−に替えて−ser−） 位置36（−lys−に替えて−gly−） 位置41（−thr−に替えて−glu−又は−sap−又は、−h
is−） 位置47（−pro−に替えて、−asp−、−lys−又は−trp
−） 位置51（−his−に替えて−gln−） 位置52（−asp−に替えて−thr−） 位置53（−asp−に替えて−glu−） 位置61（−glu−に替えて−asp−） 位置64（−leu−に替えて−ile−）及び 位置65（−gln−に替えて−lys−） 位置61（グルタメートに替えてアスパルテート）、64
（ロイシンに替えてイソロイシン）、及び65（グルタミ
ンに替えてリジン）での相違は、特に重要であると考え
られている。即ち、55−64配列が、ヒルジンの阻害活性
の重要なドメインであると考えられる［オーエン（Owe
n）等、「ヒルジンに基ずく小ペプチド抗凝固剤のＮ−
末端変換」（“Ｎ−terminal replacement of small pe
ptido anti−coagulants based on hirudin",1988、ジ
ャーナルメディカルケミストリー（J.Med.Chem.31:pp10
09−1011）］。本発明による抗トロンビン中のアスパラ
テート（−asp−）、イソロイシン（−ile−）及びリジ
ン（−lys−）の存在は、新規なトロンビン阻害領域を
もたらし、配列54−65のみが、それ自体で新規であると
考えられ、新規な抗トロンビン特性を有するものと考え
られる。従って、本発明は、上記したアミノ酸配列54−
65を有する小ペプチドを含む。
is−） 位置47（−pro−に替えて、−asp−、−lys−又は−trp
−） 位置51（−his−に替えて−gln−） 位置52（−asp−に替えて−thr−） 位置53（−asp−に替えて−glu−） 位置61（−glu−に替えて−asp−） 位置64（−leu−に替えて−ile−）及び 位置65（−gln−に替えて−lys−） 位置61（グルタメートに替えてアスパルテート）、64
（ロイシンに替えてイソロイシン）、及び65（グルタミ
ンに替えてリジン）での相違は、特に重要であると考え
られている。即ち、55−64配列が、ヒルジンの阻害活性
の重要なドメインであると考えられる［オーエン（Owe
n）等、「ヒルジンに基ずく小ペプチド抗凝固剤のＮ−
末端変換」（“Ｎ−terminal replacement of small pe
ptido anti−coagulants based on hirudin",1988、ジ
ャーナルメディカルケミストリー（J.Med.Chem.31:pp10
09−1011）］。本発明による抗トロンビン中のアスパラ
テート（−asp−）、イソロイシン（−ile−）及びリジ
ン（−lys−）の存在は、新規なトロンビン阻害領域を
もたらし、配列54−65のみが、それ自体で新規であると
考えられ、新規な抗トロンビン特性を有するものと考え
られる。従って、本発明は、上記したアミノ酸配列54−
65を有する小ペプチドを含む。
位置63のアミノ酸（上記式においてＺで表わされる）
は、通常硫酸塩化されたチロシン（tyr）であっても良
い（反対に、組換えヒルジンは一般的には、この位置で
は硫酸塩化されていない）。
は、通常硫酸塩化されたチロシン（tyr）であっても良
い（反対に、組換えヒルジンは一般的には、この位置で
は硫酸塩化されていない）。
本発明に基ずくヒル由来抗トロンビン（及びそれから
推測されうる対応DNA配列）は、メジシナルリーチ ヒ
ルド メジシナリス中に存在することが分かっている公
知のエラスターゼ／キモトリプシン阻害剤であり、シー
ミュラー（seemuller）等、「エグリン：リーチ由来エ
ラスターゼ−カテプシンＧ阻害剤」、1981、Meth.Enzym
ol.80:pp804−816記述のエグリンとは非同種（non−hom
ologous）である。
推測されうる対応DNA配列）は、メジシナルリーチ ヒ
ルド メジシナリス中に存在することが分かっている公
知のエラスターゼ／キモトリプシン阻害剤であり、シー
ミュラー（seemuller）等、「エグリン：リーチ由来エ
ラスターゼ−カテプシンＧ阻害剤」、1981、Meth.Enzym
ol.80:pp804−816記述のエグリンとは非同種（non−hom
ologous）である。
本発明に基ずく抗トロンビンは、通常、溶媒抽出及び
それに引き続くクロマトグラフー法による分画を含む方
法によって、ヒルジナリア マニレンシス種の組織から
か又は類似のものから単離する。又はヒルジナリア マ
ニレンシスの分泌物（例えばサリバ）から類似の方法で
単離しても良い。
それに引き続くクロマトグラフー法による分画を含む方
法によって、ヒルジナリア マニレンシス種の組織から
か又は類似のものから単離する。又はヒルジナリア マ
ニレンシスの分泌物（例えばサリバ）から類似の方法で
単離しても良い。
本発明の別の面によれば、従って、ヒルジナリア マ
ニレンシス種のヒルの組織又は分泌物由来の抗トロンビ
ンが与えられる。この抗トロンビンはトロンビンに特異
活性的である。
ニレンシス種のヒルの組織又は分泌物由来の抗トロンビ
ンが与えられる。この抗トロンビンはトロンビンに特異
活性的である。
本発明は、更に上記した式のポリペプチドに対するリ
コンビナント又は蛋白工学的同等物を含む。
コンビナント又は蛋白工学的同等物を含む。
本発明の抗トロンビンは、薬学上容認しうるキャリア
又は賦形剤を有する薬剤において使用しうる。このよう
な薬剤は、普通静脈投与する（この場合、キャリアは、
一般的には、許容しうる純度の殺菌食塩水又は水であ
る）。
又は賦形剤を有する薬剤において使用しうる。このよう
な薬剤は、普通静脈投与する（この場合、キャリアは、
一般的には、許容しうる純度の殺菌食塩水又は水であ
る）。
本発明の抗トロンビンは、血栓塞栓、例えば血液の凝
固の処置に適している。本発明の一例では、抗トロンビ
ンは、組織プラスミノーゲンアクチベーターのようなプ
ラスミノゲーンアクチベーターとともに投与する。本発
明の抗トロンビンは、後者とコンパチブルであることが
分かった。
固の処置に適している。本発明の一例では、抗トロンビ
ンは、組織プラスミノーゲンアクチベーターのようなプ
ラスミノゲーンアクチベーターとともに投与する。本発
明の抗トロンビンは、後者とコンパチブルであることが
分かった。
ヒル組織からの本発明の抗トロンビンの単離方法の例
を、以下の詳細な実施例で述べる。
を、以下の詳細な実施例で述べる。
実施例１ ステップ−アセトン抽出 600gのヒルジナリア マニレンシス リーチを約２リ
ッターの96％エタノール中で24時間脱水した。動物の前
部を体部から切断し、更に約200mlの96％エタノール中
で更に24時間脱水した。
ッターの96％エタノール中で24時間脱水した。動物の前
部を体部から切断し、更に約200mlの96％エタノール中
で更に24時間脱水した。
脱水したヒル頭部を微小片に切断し、40mlのアセトン
と60mlの水の混合物を添加した。
と60mlの水の混合物を添加した。
混合物を室温で30分間攪拌し、2,700rpmで15分間スピ
ンし、上澄液をデカントした。
ンし、上澄液をデカントした。
ペレットを更に100mlの40:60アセトン：水混合物に再
懸濁し、室温で30分間攪拌した。
懸濁し、室温で30分間攪拌した。
混合液を2,700rpmで15分間スピンし、上澄液をデカン
トし、最初の上澄液でプールした。
トし、最初の上澄液でプールした。
80mlアセトン及び20ml水を、プールした上澄液に添加
し、氷酢酸によりpHを4.4に低げた。
し、氷酢酸によりpHを4.4に低げた。
混合物を2,700rpmで15分間スピンし、上澄液をデカン
トした。溶液のpHを30％アンモニアを用いて6.0に調節
した。35℃でロータリーエバポレーションにより容量を
約30mlに低下させた。
トした。溶液のpHを30％アンモニアを用いて6.0に調節
した。35℃でロータリーエバポレーションにより容量を
約30mlに低下させた。
結晶トリクロロ酢酸を加え、溶液のpHを1.8に低げ、
その後遠心分離して沈殿物を除去した。原料抗トロンビ
ンを９倍量のアセトンを用いて溶液から沈殿させた。
その後遠心分離して沈殿物を除去した。原料抗トロンビ
ンを９倍量のアセトンを用いて溶液から沈殿させた。
混合物を2,700rpmで15分間スピンし、上澄液を捨て
た。ペレットを50mlアセトン中で再懸濁し、2,700rpmで
10分間スピンした。洗液を捨て、沈殿物を真空デシケー
タ中で１時間乾燥した。原料抗トロンビンを4.0mlの水
で再構成した。
た。ペレットを50mlアセトン中で再懸濁し、2,700rpmで
10分間スピンした。洗液を捨て、沈殿物を真空デシケー
タ中で１時間乾燥した。原料抗トロンビンを4.0mlの水
で再構成した。
蛋白質は、280mmでの吸収により、78mg/mlと評価し
た。活性は、トロンビン／フィブリノーゲンクロットの
阻止により2400抗トロンビン単位/ml（又は、約10,000
抗トロンビン単位/200gの頭片）と評価した。トータル
活性は9600抗トロンビン単位であった。特異的活性は、
30.7抗トロンビン単位/mg蛋白と計算された。
た。活性は、トロンビン／フィブリノーゲンクロットの
阻止により2400抗トロンビン単位/ml（又は、約10,000
抗トロンビン単位/200gの頭片）と評価した。トータル
活性は9600抗トロンビン単位であった。特異的活性は、
30.7抗トロンビン単位/mg蛋白と計算された。
ステップ２ エタノール抽出 原料抗トロンビン溶液を冷却して３℃とした。氷冷96
％エタノールの1.2mlアリコートを６回５分間隔で添加
した。混合物をそれから３℃10分間放置し、2,400rpmで
10分間遠心分離した。上澄液をデカントして保持した。
％エタノールの1.2mlアリコートを６回５分間隔で添加
した。混合物をそれから３℃10分間放置し、2,400rpmで
10分間遠心分離した。上澄液をデカントして保持した。
ペレットを4ml氷冷蒸留水中に再懸濁し、7.2ml氷冷96
％エタノールで混合した。これを３℃30分間静置し、そ
の後2,400rpmで10分間遠心分離した。上澄液をデカント
して除き、最初の上澄液でプールした。
％エタノールで混合した。これを３℃30分間静置し、そ
の後2,400rpmで10分間遠心分離した。上澄液をデカント
して除き、最初の上澄液でプールした。
ペレットを4mlの氷冷96％エタノールの混合物中で再
懸濁し、30分間３℃に静置した。これを、その後2,400r
pmで10分間スピンし、上澄液をデカントし、プールし
た。
懸濁し、30分間３℃に静置した。これを、その後2,400r
pmで10分間スピンし、上澄液をデカントし、プールし
た。
プールを氷で０℃に冷やし、その後−10℃で、0.5％
酢酸アンモニウムを含む50.7mlのエタノールを加えた。
これを30分間放置し、その後2,400rpmで10分間スピンし
た。
酢酸アンモニウムを含む50.7mlのエタノールを加えた。
これを30分間放置し、その後2,400rpmで10分間スピンし
た。
上澄液を捨て、沈殿物を50mlの氷冷エタノールで洗條
した。上澄液をその後真空デシケータで１時間乾燥し
た。
した。上澄液をその後真空デシケータで１時間乾燥し
た。
これをその後、水で再構成し、抗トロンビン活性、蛋
白量を試験し、バイアルし、凍結乾燥した。結果の容量
は、1.5mlであった。
白量を試験し、バイアルし、凍結乾燥した。結果の容量
は、1.5mlであった。
蛋白は、280nmでの吸収を用いて19mg/mlで評価した。
活性は、トロンビン／フィブリノーゲンクロッティン
グアッシーによって、1000抗トロンビン単位と評価し
た。特異的活性を52.6ATU/mg蛋白で計算した。
グアッシーによって、1000抗トロンビン単位と評価し
た。特異的活性を52.6ATU/mg蛋白で計算した。
実施例２ 実施例１のステップ１を反覆し、その後、ステップ２
及び３を以下のとおり行なった。
及び３を以下のとおり行なった。
ステップ２−陽イオン交換クロマトグラフィー 原料抗トロンビンを10mM酢酸アンモニウム−酢酸pH4.
0中で再構成し、ろ過して、不溶物を除去した。
0中で再構成し、ろ過して、不溶物を除去した。
商業的に商標名CMセファデックスC50として入手しう
る。カルボキシメチルセルロースをバッファー（10mM酢
酸アンモニウム−酢酸;pH4.0）中で事前膨潤し、2.6cm
径の30cm長カラムにパックした。サンプルをカラムにロ
ードした。
る。カルボキシメチルセルロースをバッファー（10mM酢
酸アンモニウム−酢酸;pH4.0）中で事前膨潤し、2.6cm
径の30cm長カラムにパックした。サンプルをカラムにロ
ードした。
100mlバッファーをカラムに通し、廃棄物として収集
した。バッファーをその後10mM酢酸アンモニウムpH4.2
に変えた。10mlフラクションをその後集め、抗トロンビ
ン活性及び蛋白量を試験した。各フラクションの特異的
活性を計算し、特異的活性の閾値以上のフラクションを
プールし、凍結し、そして凍結乾燥した。
した。バッファーをその後10mM酢酸アンモニウムpH4.2
に変えた。10mlフラクションをその後集め、抗トロンビ
ン活性及び蛋白量を試験した。各フラクションの特異的
活性を計算し、特異的活性の閾値以上のフラクションを
プールし、凍結し、そして凍結乾燥した。
ステップ３ 陰イオン交換クロマトグラフィー エタノール抽出又はCMセファデックス抽出のいずれか
により作られた凍結乾燥粗抽出物を10mM Tris/HClバッ
ファー、pH7.5で再構成し、DEAE−セファデックスＡ−2
5カラム（0.9×7cm）上でクロマトグラフし、同バッフ
ァーで、事前平衡した。流出液の234nmでの吸収が0.15
より小さくなるまで流速15ml/時間でカラムをディベロ
ップした。結合物質をそれから平衡バッファー（各リザ
ーバー中60ml）中で直線勾配０−1M NaClで溶出した。
溶出液を2mlフラクションに集め、吸収及び阻害活性測
定用とした。溶出プロフィールをエタノール抽出物質
（図１）及びCMセファデックス抽出物質（図２）で示
す。
により作られた凍結乾燥粗抽出物を10mM Tris/HClバッ
ファー、pH7.5で再構成し、DEAE−セファデックスＡ−2
5カラム（0.9×7cm）上でクロマトグラフし、同バッフ
ァーで、事前平衡した。流出液の234nmでの吸収が0.15
より小さくなるまで流速15ml/時間でカラムをディベロ
ップした。結合物質をそれから平衡バッファー（各リザ
ーバー中60ml）中で直線勾配０−1M NaClで溶出した。
溶出液を2mlフラクションに集め、吸収及び阻害活性測
定用とした。溶出プロフィールをエタノール抽出物質
（図１）及びCMセファデックス抽出物質（図２）で示
す。
抗トロンビン活性を有するフラクションをプールし、
濃縮しそして、その後の精製の前にセファデックスＧ−
25上で脱塩した。部分的精製サンプルをトロンビンセフ
ァロール上のアフィニティクロマトグラフィーで更に分
画した。カラムを平衡バッファー（0.1M Tris/HCl、pH
8.0）で洗條し、そしてその結合した抗−トロンビンを1
Mベンズアミジンで溶出した。溶出した物質を凍結乾燥
し、前と同様に脱塩した。この物質をその後高速液体ク
ロマトグラフィーで精製した。50マイクロリッターの濃
縮サンプルを、室温で0.1％TFAで事前平衡したマイクロ
ボアRP−300 Ｃ−８カラムに適用した。結合した物質
は、35分間、流速0.25ml/分で、0.09％TFAを含む60％ア
セトニトリルの０−100％直線勾配で溶出した。
濃縮しそして、その後の精製の前にセファデックスＧ−
25上で脱塩した。部分的精製サンプルをトロンビンセフ
ァロール上のアフィニティクロマトグラフィーで更に分
画した。カラムを平衡バッファー（0.1M Tris/HCl、pH
8.0）で洗條し、そしてその結合した抗−トロンビンを1
Mベンズアミジンで溶出した。溶出した物質を凍結乾燥
し、前と同様に脱塩した。この物質をその後高速液体ク
ロマトグラフィーで精製した。50マイクロリッターの濃
縮サンプルを、室温で0.1％TFAで事前平衡したマイクロ
ボアRP−300 Ｃ−８カラムに適用した。結合した物質
は、35分間、流速0.25ml/分で、0.09％TFAを含む60％ア
セトニトリルの０−100％直線勾配で溶出した。
溶出液の吸収を215nmでモニターした。各ピーク、又
は部分的にリゾルブしたピークを、阻害活性の測定用に
別々のフラクションとして集めた。得られた溶出プロフ
ィールを図３に示す。そして抗トロンビン活性を含むピ
ーク（ピーク５、６、７）が、他のピークとは別れてい
ることを示している。
は部分的にリゾルブしたピークを、阻害活性の測定用に
別々のフラクションとして集めた。得られた溶出プロフ
ィールを図３に示す。そして抗トロンビン活性を含むピ
ーク（ピーク５、６、７）が、他のピークとは別れてい
ることを示している。
配列化 抗トロンビン活性を含む主なピーク（図３のピーク
５、６及び７に等しい）を真空乾燥し、PTHアミノ酸同
定用自動アプライドバイオシステムズ気相シーケンサー
（モデル470A）、オン−ライン分析器（モデル120）と
リンク、によりＮ−末端アミノ酸配列を分析した。
５、６及び７に等しい）を真空乾燥し、PTHアミノ酸同
定用自動アプライドバイオシステムズ気相シーケンサー
（モデル470A）、オン−ライン分析器（モデル120）と
リンク、によりＮ−末端アミノ酸配列を分析した。
精製抗トロンビンサンプルをシーケンス用フィルター
に直接負荷した。配列中のシステイン残基は、精製サン
プルをジチオスレイトール及び４−ビニルピリジンに反
応させてピリジルエチルシステインに誘導化後決定し
た。
に直接負荷した。配列中のシステイン残基は、精製サン
プルをジチオスレイトール及び４−ビニルピリジンに反
応させてピリジルエチルシステインに誘導化後決定し
た。
還元及びピリジルエチル化抗トロンビンのトリプティ
クダイジェスト（tryptic digests）をTPCK−トリプシ
ンで得た。この反応は、37℃、４時間、0.05M二炭酸ア
ンモニウム塩バッファー中で行ない、凍結乾燥により反
応を停止させ、そして0.1％TFA中で再懸濁した。以下の
実施例３、ステップ５に述べたのと類似の条件下で逆相
HPLCによりフラグメントを分離した。
クダイジェスト（tryptic digests）をTPCK−トリプシ
ンで得た。この反応は、37℃、４時間、0.05M二炭酸ア
ンモニウム塩バッファー中で行ない、凍結乾燥により反
応を停止させ、そして0.1％TFA中で再懸濁した。以下の
実施例３、ステップ５に述べたのと類似の条件下で逆相
HPLCによりフラグメントを分離した。
Ｃ−末端配列を、チャン（Chang）FEBS letts（198
3）、164 pp307−313に記述されたカルボキシペプチダ
ーゼＹダイジェスチョン及びDABS−C1法の組合せにより
実施した。決定された配列は前記のとおりであった。
3）、164 pp307−313に記述されたカルボキシペプチダ
ーゼＹダイジェスチョン及びDABS−C1法の組合せにより
実施した。決定された配列は前記のとおりであった。
実施例３ 実施例２のステップ１及び２を反覆し、その後ステッ
プ３及び４を以下のとおり行なった。
プ３及び４を以下のとおり行なった。
ステップ３ 陰イオン交換クロマトグラフィー ステップ２からの溶液を、0.1M NaOHでpH7.0に調整
し、20mM Tris HCl、pH7.0バッファーで平衡化され
た。商標名Ｑ−セファロースで商業的に利用できる陰イ
オンクロマトグラフィーを含むカラムにかけた。未結合
蛋白（280nmの吸収で検出）が除去される迄バッファー
をカラムにポンプし、その後塩（同じバッファー中のNa
Cl）の勾配を、直線状または段階状にかけて、結合した
抗トロンビンを溶出した。典型的なクロマトグラフィー
プロフィールを図４に示す。
し、20mM Tris HCl、pH7.0バッファーで平衡化され
た。商標名Ｑ−セファロースで商業的に利用できる陰イ
オンクロマトグラフィーを含むカラムにかけた。未結合
蛋白（280nmの吸収で検出）が除去される迄バッファー
をカラムにポンプし、その後塩（同じバッファー中のNa
Cl）の勾配を、直線状または段階状にかけて、結合した
抗トロンビンを溶出した。典型的なクロマトグラフィー
プロフィールを図４に示す。
抗トロンビン活性を含むフラクションをプールし、ウ
ルトラフィルトレーションにより濃縮して容量を25−50
mlとした。この段階で、抗トロンビンプレパレーション
は、100−400抗トロンビン単位/mg蛋白の特異的活性を
有していた。
ルトラフィルトレーションにより濃縮して容量を25−50
mlとした。この段階で、抗トロンビンプレパレーション
は、100−400抗トロンビン単位/mg蛋白の特異的活性を
有していた。
ステップ４ ゲル濾過 ステップ３からの溶液をスーパーデックス200として
商業的に入手できるゲル濾過カラムにかけ、平衡化し、
50mM Tris HCl、0.1M NaCl、pH7.5で溶出した。典型
的なクロマトグラフプロフィールを図５に示す。
商業的に入手できるゲル濾過カラムにかけ、平衡化し、
50mM Tris HCl、0.1M NaCl、pH7.5で溶出した。典型
的なクロマトグラフプロフィールを図５に示す。
抗トロンビン活性を含むフラクションを集め、プール
し、凍結乾燥した。この時点で、抗トロンビンプレパレ
ーションは、普通1000−4000抗トロンビン単位/mg蛋白
の範囲で特異的活性を有していた。
し、凍結乾燥した。この時点で、抗トロンビンプレパレ
ーションは、普通1000−4000抗トロンビン単位/mg蛋白
の範囲で特異的活性を有していた。
ステップ５ 最終精製 ステップ４からの物質を、0.1M Tris HCl、pH8.0中
に平衡化されたトロンビン−セファロースのアフィニテ
ィカラムにかけた。そして未結合物質を同じバッファー
で溶出した。結合した抗トロンビンを0.1Mベンズアミジ
ンでカラムから溶出し、凍結乾燥し、その後セファデッ
クスG25カラムを用いて脱塩した。
に平衡化されたトロンビン−セファロースのアフィニテ
ィカラムにかけた。そして未結合物質を同じバッファー
で溶出した。結合した抗トロンビンを0.1Mベンズアミジ
ンでカラムから溶出し、凍結乾燥し、その後セファデッ
クスG25カラムを用いて脱塩した。
アフィニティクロマトグラフィーにより精製された物
質を更に、逆相カラム（RP−300 Ｃ−８）を用いたHPL
C（高速液体クロマトグラフィー）により精製した。典
型的な例では（図６）、室温で、0.1％トリフルオロ酢
酸（TFA）で平衡化されたカラムに、サンプルをかけ
た。そして結合した抗トロンビンを0.9％（TFA）を含む
60％アセトニトリルの直線勾配で溶出した。蛋白のピー
ク（215/280nmの吸収により検出）を集め、抗トロンビ
ンを含むものを真空下乾燥した。
質を更に、逆相カラム（RP−300 Ｃ−８）を用いたHPL
C（高速液体クロマトグラフィー）により精製した。典
型的な例では（図６）、室温で、0.1％トリフルオロ酢
酸（TFA）で平衡化されたカラムに、サンプルをかけ
た。そして結合した抗トロンビンを0.9％（TFA）を含む
60％アセトニトリルの直線勾配で溶出した。蛋白のピー
ク（215/280nmの吸収により検出）を集め、抗トロンビ
ンを含むものを真空下乾燥した。
抗トロンビン活性のアッセイ 本質的にマークワーツ（Markwardt）がメソッド イ
ン エンザイモロジー（Methods in Enzymology:XIX,pp
924;「トロンビンの阻害剤ヒルジン」“Hirudin as an
inhibitor of Thrombin"（1970）で述べたと同様のフィ
ブリノーゲン上のトロンビンのクロッティング活性の阻
害を測定することによるか、又は、特異的パラ−ニトロ
フェノール由来クロモジェニック物質、例えばＳ−238
（カビ社から商業的に入手可）のトロンビン開裂の阻害
を測定することによって、抗トロンビン活性を決定し
た。
ン エンザイモロジー（Methods in Enzymology:XIX,pp
924;「トロンビンの阻害剤ヒルジン」“Hirudin as an
inhibitor of Thrombin"（1970）で述べたと同様のフィ
ブリノーゲン上のトロンビンのクロッティング活性の阻
害を測定することによるか、又は、特異的パラ−ニトロ
フェノール由来クロモジェニック物質、例えばＳ−238
（カビ社から商業的に入手可）のトロンビン開裂の阻害
を測定することによって、抗トロンビン活性を決定し
た。
本発明による抗−トロンビンの活性は、ヒルジンに特
異的な中和モノクローナル抗体の高い濃度によっては中
和しなかった（このことは、本発明の抗トロンビンとヒ
ルジンが非類似であることの免疫学的な確認である）。
異的な中和モノクローナル抗体の高い濃度によっては中
和しなかった（このことは、本発明の抗トロンビンとヒ
ルジンが非類似であることの免疫学的な確認である）。
本発明の抗トロンビン及びヒルジンは、しかしなが
ら、同等の投与量で、類似の部分トロンボプラスチック
時間を持つ。このことは、それらは、ヒト血液に対する
類似の抗凝固特徴を有することを示唆している。
ら、同等の投与量で、類似の部分トロンボプラスチック
時間を持つ。このことは、それらは、ヒト血液に対する
類似の抗凝固特徴を有することを示唆している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ポウェル，ジョーンズ，クリストファー イギリス国エスエイ19 ６ユーエル ダ イフェッド，ランデイロ，フェアーファ ック，ヘオル セネン 47 (72)発明者 アトキンソン，アンソニー イギリス国 ウィルトシャー，サリスベ リィ ウィンターボーン グンナーミル コーナー，トウィグリィ（番地なし) (72)発明者 エレクトリックワラ，アスガー イギリス国ウィルトシャー，サリスベリ ィ，イースゴメルドン，レディスミス ６ (56)参考文献 特開 昭62−22799（ＪＰ，Ａ) 特表 昭62−501011（ＪＰ，Ａ) Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ ｉｏｌ．（1987）87Ｂ［３］Ｐ．567− 573 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07K 14/815 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (1)
- 【請求項１】次のアミノ酸配列： （ここで、１、２及び63位のXaaはいかなるアミノ酸残
基でも良く;30位のXaaはCysまたはProであり;41位のXaa
はGlu、AspまたはHisであり;47位のXaaはAsp、Lysまた
はTrpである）を有しかつ特異的にトロンビンを抑制す
るポリペプチド。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB888826428A GB8826428D0 (en) | 1988-11-11 | 1988-11-11 | Antithrombin |
| GB8826428.8 | 1988-11-11 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04502907A JPH04502907A (ja) | 1992-05-28 |
| JP2865345B2 true JP2865345B2 (ja) | 1999-03-08 |
Family
ID=10646705
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1511701A Expired - Lifetime JP2865345B2 (ja) | 1988-11-11 | 1989-11-13 | 抗トロンビン |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5472942A (ja) |
| EP (1) | EP0373767B1 (ja) |
| JP (1) | JP2865345B2 (ja) |
| KR (1) | KR0153774B1 (ja) |
| AT (1) | ATE111484T1 (ja) |
| AU (1) | AU636857B2 (ja) |
| CA (1) | CA2002924C (ja) |
| DE (1) | DE68918246T2 (ja) |
| DK (1) | DK173077B1 (ja) |
| FI (1) | FI912240A0 (ja) |
| GB (1) | GB8826428D0 (ja) |
| HU (1) | HUT62016A (ja) |
| IE (1) | IE64652B1 (ja) |
| RU (1) | RU2050160C1 (ja) |
| WO (1) | WO1990005143A1 (ja) |
| ZA (1) | ZA898655B (ja) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5721098A (en) * | 1986-01-16 | 1998-02-24 | The Regents Of The University Of California | Comparative genomic hybridization |
| US5268296A (en) * | 1988-06-11 | 1993-12-07 | Ciba-Geigy Corporation | DNA vector and recombinant host cell for production of hirullin P6 and P18 |
| DE4009268A1 (de) * | 1990-03-22 | 1991-09-26 | Consortium Elektrochem Ind | Sekretion von hirudinderivaten |
| GB9007879D0 (en) * | 1990-04-06 | 1990-06-06 | Biopharm Ltd | Treatment of thrombotic events |
| IL101062A0 (en) * | 1991-02-28 | 1992-11-15 | Erba Carlo Spa | Anti-thrombin polypeptides and their preparation |
| US6514730B1 (en) * | 1991-03-21 | 2003-02-04 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Secretion of hirudin derivatives |
| US7534567B2 (en) * | 1992-03-04 | 2009-05-19 | The Regents Of The University Of California | Detection of nucleic acid sequence differences by comparative genomic hybridization |
| GB9309509D0 (en) * | 1993-05-07 | 1993-06-23 | Merck Patent Gmbh | Thrombin inhibitors |
| IT1266561B1 (it) * | 1993-07-22 | 1997-01-09 | Mini Ricerca Scient Tecnolog | Analoghi di un polipeptide anti-trombinico e procedimento per la loro preparazione |
| US5510330A (en) * | 1994-03-25 | 1996-04-23 | Boehringer Mannheim Gmbh | Combinations of thrombolytically active proteins and non-heparin anticoagulants, and uses thereof. |
| US6008320A (en) * | 1995-04-27 | 1999-12-28 | Korea Advanced Institute Of Science And Technology | Elastase inhibitor and process for preparing the same |
| US6077825A (en) * | 1997-03-13 | 2000-06-20 | Auburn University | Antithrombin protein and DNA sequences from black fly |
| WO2005079474A2 (en) | 2004-02-17 | 2005-09-01 | The Regents Of The University Of California | Detection of nucleic acid sequence differences by comparative genomic hybridization |
| US8501241B1 (en) | 2012-09-17 | 2013-08-06 | Biopep Solutions, Inc. | Treating cancer with a whole, leech saliva extract |
| CN115572329B (zh) * | 2021-06-21 | 2024-02-06 | 王大勇 | 一组活性增强代谢较慢的菲牛蛭基因重组水蛭素及其制备方法 |
| CN115677850B (zh) * | 2021-07-24 | 2024-03-08 | 王大勇 | 具备较强抗凝血活性的医蛭基因突变水蛭素及其制备方法 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4390630A (en) * | 1980-10-28 | 1983-06-28 | The Regents Of The University Of California | Hementin--a fibrinolytic agent |
| DE3445532A1 (de) * | 1984-12-13 | 1986-06-19 | Plantorgan Werk Heinrich G.E. Christensen, KG, 2903 Bad Zwischenahn | Hirudin-pa, desulfatohirudine-pa, verfahren zur herstellung und pharmazeutische mittel, die diese wirkstoffe enthalten |
| GB8504025D0 (en) * | 1985-02-16 | 1985-03-20 | Biopharm Ltd | Hyaluronidase |
| DE3689525D1 (de) * | 1985-07-17 | 1994-02-24 | Hoechst Ag | Neue Polypeptide mit blutgerinnungshemmender Wirkung, Verfahren zu deren Herstellung bzw. Gewinnung, deren Verwendung und diese enthaltende Mittel. |
| US5139944A (en) * | 1985-08-10 | 1992-08-18 | Biophram (Uk) Limited | Collagen-specific enzyme with platelet aggregation inhibition properties |
| MY101203A (en) * | 1985-12-12 | 1991-08-17 | Ucp Gen Pharma Ag | Production of thrombin iinhibitors. |
| AU3098289A (en) * | 1988-03-04 | 1989-09-07 | Biogen, Inc. | Hirudin peptides |
| ES2052062T3 (es) * | 1988-06-11 | 1994-07-01 | Ciba Geigy Ag | Nuevos polipeptidos con actividad anticoagulante. |
-
1988
- 1988-11-11 GB GB888826428A patent/GB8826428D0/en active Pending
-
1989
- 1989-11-13 JP JP1511701A patent/JP2865345B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-11-13 KR KR1019900701389A patent/KR0153774B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1989-11-13 RU SU894895517A patent/RU2050160C1/ru active
- 1989-11-13 WO PCT/GB1989/001345 patent/WO1990005143A1/en active Application Filing
- 1989-11-13 IE IE363789A patent/IE64652B1/en not_active IP Right Cessation
- 1989-11-13 US US07/721,536 patent/US5472942A/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-11-13 HU HU896934A patent/HUT62016A/hu unknown
- 1989-11-13 ZA ZA898655A patent/ZA898655B/xx unknown
- 1989-11-13 EP EP89311739A patent/EP0373767B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-11-13 DE DE68918246T patent/DE68918246T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-11-13 AT AT89311739T patent/ATE111484T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-11-13 AU AU45225/89A patent/AU636857B2/en not_active Ceased
- 1989-11-14 CA CA002002924A patent/CA2002924C/en not_active Expired - Fee Related
-
1991
- 1991-05-09 FI FI912240A patent/FI912240A0/fi not_active Application Discontinuation
- 1991-05-10 DK DK199100878A patent/DK173077B1/da active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９８７）８７Ｂ［３］Ｐ．５６７−５７３ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04502907A (ja) | 1992-05-28 |
| CA2002924C (en) | 1999-08-03 |
| DE68918246T2 (de) | 1995-02-16 |
| KR0153774B1 (ko) | 1998-10-15 |
| DK173077B1 (da) | 1999-12-20 |
| DK87891A (da) | 1991-06-21 |
| ZA898655B (en) | 1990-08-29 |
| AU4522589A (en) | 1990-05-28 |
| HU896934D0 (en) | 1991-07-29 |
| GB8826428D0 (en) | 1988-12-14 |
| DE68918246D1 (de) | 1994-10-20 |
| EP0373767A1 (en) | 1990-06-20 |
| EP0373767B1 (en) | 1994-09-14 |
| AU636857B2 (en) | 1993-05-13 |
| FI912240A0 (fi) | 1991-05-09 |
| CA2002924A1 (en) | 1990-05-11 |
| RU2050160C1 (ru) | 1995-12-20 |
| DK87891D0 (da) | 1991-05-10 |
| IE64652B1 (en) | 1995-08-23 |
| ATE111484T1 (de) | 1994-09-15 |
| HUT62016A (en) | 1993-03-29 |
| KR900701832A (ko) | 1990-12-04 |
| WO1990005143A1 (en) | 1990-05-17 |
| US5472942A (en) | 1995-12-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2865345B2 (ja) | 抗トロンビン | |
| AU593820B2 (en) | Novel polypeptides with a blood coagulation-inhibiting action, processes for their preparation and isolation, their use and agents containing them | |
| US6090916A (en) | Nematode-extracted serine protease inhibitors and anticoagulant proteins | |
| JPS62502661A (ja) | 形質転換された酵母及びヒルジンの製造方法 | |
| Walsmann et al. | On the isolation of the thrombin inhibitor hirudin | |
| US5583111A (en) | Thrombin inhibitors | |
| US5945275A (en) | Nematode-extracted anticoagulant protein | |
| NL8900943A (nl) | Protease inhibitor. | |
| Fritz et al. | [70] Trypsin-plasmin inhibitors (Bdellins) from leeches | |
| JPH10509589A (ja) | プロテアーゼ阻害剤および他の生物活性物質の新しい系 | |
| US5955294A (en) | Nematode-extracted serine protease inhibitors and anticoagulant proteins | |
| JP3460851B2 (ja) | 新規システインプロテアーゼインヒビター | |
| US5322926A (en) | Isohirudins | |
| US5801017A (en) | Production of recombinant factor Xa inhibitor of leech Hirudo medicinalis | |
| IL93915A (en) | Peptides from hirudinaria manillensis having anti-thrombin activity and their use. | |
| JP2678152B2 (ja) | エラスターゼ抑制蛋白質およびその製造方法 | |
| US6184346B1 (en) | Protease inhibitors derived from guamerin | |
| MATSUDA et al. | Limited proteolysis of a chemically modified third component of human complement, C3, by cathepsin G of human leukocytes | |
| JPH05208999A (ja) | セリンプロテアーゼインヒビターおよびこれを含有する医薬組成物 | |
| JPH1080281A (ja) | 新規蛋白質及びその製造方法 |