NL8900943A - Protease inhibitor. - Google Patents

Description

Titel: Protease inhibitor

Deze uitvinding betreft een nieuwe protease-inhibitor (verder aangeduid als GELIN), die gewonnen kan worden uit bloedzuigers van de soort Hirudinaria manillensis, en betreft farmaceutische, cosmetische en andere preparaten, die deze stof bevatten.

GELIN is een inhibitor van menselijke en varkens-polymorphonucleaire leucocyten-elastase en -chymotrypsine.

GELIN is gevonden tijdens experimenten met zuiveringen van eiwitten, afkomstig van bloedzuigers van de soort Hirudinaria manillensis. Tijdens de opzuivering van andere eiwitten werd bij toeval inhibitoire werking met betrekking tot chymotrypsine en elastase gevonden in bepaalde fracties, en deze werden bestudeerd in vergelijking met eglin en hirudin. Voorlopige resultaten van het onderzoek naar de aminozuur-sequentie geven de eerste aminozuren weer vanaf de N-terminal en zijn weergegeven in Tabel A.

De elastase/chymotrypsine inhibitor, afkomstig van de genoemde bloedzuiger, is (evenals de corresponderende DNA-sequenties die daaruit kunnen worden geëxtrapoleerd) volgens deze vinding niet-homoloog met eglin, een bekende elastase/chymotrypsin inhibitor, waarvan bekend is dat deze aanwezig is in de medicinale bloedzuiger: Hirudo Medicinalis, en is beschreven door: Seemüller et all, "Eglin: Elastase/Cathepsin G inhibitor from leeches"; 1981, Meth. Enzymol.;vol.80, pp 804-816.

Verder laten vergelijkingen met hirudin (Dodt et al., 1984; FEBS 165; pp.180-184) en andere bekende structuren zien dat de structuur van GELIN uniek is.

De elastase/chymotrypsine inhibitor volgens deze vinding is typisch geëxtraheerd vanuit de bloedzuigerweefsels door vloeistof extractietechnieken; alternatief kan het worden geïsoleerd uit de secreties van de bovengenoemde bloedzuiger (zoals b.v. uit speeksel).

Een beschrijving van het proces van de isolatie van GELIN vanuit het bloedzuigerweefsel zal nu worden beschreven als voorbeeld in de volgende gedetailleerde gevallen.

Qpzuivering en partiele karakterisatie van de nieuwe elastase: skymgfc.rypsine inhibitor.

Yoorireglifl.1

De nieuwe protease inhibitor werd als volgt verkregen:

Eerste opzuiverings-stap: 600 gram bloedzuigers van de soort Hirudinaria manillensis werden gedehydrateerd in ongeveer 2 liter ethanol van 96% gedurende 24 uur. De voorste gedeelten van de dieren werden gescheiden van de rest van hun lichamen en werden vervolgens gedehydrateerd in ongeveer 200 ml ethanol van 96% gedurende nog eens 24 uur.

Deze gedehydrateerde bloedzuigerkoppen werden fijngehakt in kleine stukjes en een mengsel van 40 ml aceton en 60 ml water werd daaraan toegevoegd. Het mengsel werd gedurende 30 minuten op kamertemperatuur geroerd.

Het mengsel werd vervolgens gecentrifugeerd gedurende 15 minuten met 2.700 t/min. en het uitleksel (supernatant) afgegoten en bewaard.

Het vastestof-restant (pellet) werd opnieuw opgelost in een 100 ml volume van een aceton-water mengsel in de verhouding 40:60; aansluitend werd geroerd gedurende 30 minuten op kamertemperatuur. Het mengsel werd vervolgens gecentrifugeerd gedurende 15 minuten met 2.700 t/min. en het uitleksel ervan afgegoten en tezamen met het uitleksel van de eerste centrifugering bewaard.

80 ml aceton en 20 ml water werden toegevoegd aan de beide samengevoegde uitleksels en de pH ervan werd verlaagd met ijsazijn tot een waarde van 4,4. Dit mengsel werd gecentrifugeerd gedurende 15 minuten bij 2.700 t/min. en het uitleksel afgegoten en bewaard. De pH van deze oplossing werd vervolgens ingesteld op 6,0 door 30%-ig ammonia toe te voegen.

Het volume werd verkleind tot ongeveer 30 ml door gebruik te maken van een roterende verdamper bij 35°C.

Trichloro-azijnzuur kristallen werden toegevoegd om de pH van deze oplossing te verlagen tot 1,8. Het volume van deze oplossing werd genoteerd. De "grove" protease-inhibitor werd neergeslagen door gebruik van aceton (een 9-voudige overmaat aceton).

Het mengsel werd gecentrifugeerd gedurende 15 minuten bij 2.700 t/min. en het uitleksel verwijderd. De pellet werd opnieuw opgelost in 50 ml aceton en gecentrifugeerd gedurende 10 minuten met 2.700 t/min. De vloeistof ervan werd verwijderd :het neerslag gedroogd in een vacuumdroger gedurende 1 uur. De "ruwe" protease-inhibitor werd opnieuw in 4,0 ml water gebracht. Eiwit werd volgens absorptie bij 280 nm vastgesteld op 78 mg/ml.

Tweede opzuiverings-stap:

Gelyophiliseerd "ruw" bloedzuiger-extract, zoals beschreven in de eerste opzuiverings-stap, werd opnieuw samengesteld met 10 mM TrisrHCl buffer bij een pH van 7,5 en geladen en bekeken op een DEAE-Sephadex Ά-25 kolom (0,9 x 7 cm), van te voren in evenwicht gebracht met dezelfde buffer. De kolom werd ontwikkeld bij een stromingssnelheid van 15 ml/uur totdat de absorptie van de uitstroom bij 234 nm lager werd dan 0,15. Het gebonden materiaal werd daarna uitgewassen (geëlueerd) met een lineaire gradient van 0 - 1 M NaCl in de evenwichtsbuffer (60 ml) in elk reservoir. De uitstroom werd opgevangen in 2 ml porties ten behoeve van het meten van absorptie en inhibitoire activiteit.

De fracties die de meerderheid van de anti-elastase/anti-chymotrypsine activiteit bevatten werden samengevoegd, geconcentreerd en ontzilt met Sephadex G-25 alvorens verder op te zuiveren.

De gedeeltelijk gezuiverde stof werd verder gefrac-tioneerd door reverse phase HPLC. 50 microliter van de geconcentreerde stof werd toegevoegd aan een Micro-bore RP-3Q0 C-8 kolom (3 cm x 0,21 cm), van te voren in evenwicht gebracht met 0,1% TFA bij kamertemperatuur. Het gebonden materiaal werd geëlueerd met 0 - 100% lineaire gradient van 60% acetonitrile, bevattende 0,09% TFA,in 35 minuten bij een stroomsnelheid van 0,25 ml min. De absorptie van de uitstroom werd gevolgd bij 215 nm. Elke piek, of gedeeltelijk uitgewassen piek, werd verzameld als een afzonderlijke fractie voor de bepaling van de inhibitoire-activiteit.

Anti-elastase/anti-chymotrypsine activiteit werd hoofdzakelijk vast gesteld in één bepaalde piek.

In twee aparte experimenten werd de piek, die de anti-elastase en anti-chymotrypsine activiteit vertoonde, gedroogd onder vacuum en geanalyseerd voor de aminozuur-seguentie vanaf de N-terminal op een automatische Applied Biosystems gas phase sequencer (model 470A), verbonden aan een on-line analyser (model 120) voor het identificeren van PTH aminozuren. Voorlopige resultaten die de eerste 27 aminozuren vanaf de N-terminal aangeven zijn weergegeven in Tabel A en vergeleken met de bekende sequentie van eglin.

Voorbeeld. 2

Een alternatieve methode voor het opzuiveren van de nieuwe protease inhibitor is als volgt.

Stap 1, zoals beschreven voor voorbeeld 1, werd geheel herhaald, en werd gevolgd door de volgende stap:

Stap 2: (tweede opzuiverings-stap) "Ruwe" protease inhibitor werd opnieuw samengesteld in 10 ml ammoniumacetaat-azijnzuur met pH 4,0 en gefiltreerd om onoplosbare delen te verwijderen. Een carboxymethyl cellulose gel, verkrijgbaar onder de handelsnaam CM Sephadex C 50, werd van te voren gegeleerd in een buffer (10 mM ammoniumacetaat-azijnzuur, pH 4,0) en geplaatst in een 30 cm lange kolom van 2,6 cm diameter. De stof werd op de kolom geladen.

100 ml buffer werd door de kolom gevoerd en als afval weggenomen. De buffer werd vervolgens veranderd tot 10 mM ammoniumacetaat met pH 4,2. Vervolgens werden 10 ml fracties van het testmateriaal getest voor anti-elastase/anti- chymotrypsine activiteit en eiwit inhoud. De specifieke activiteit van elke fractie werd berekend en fracties, die een specifieke activiteit boven een zekere drempelwaarde hadden, werden tezamen genomen, bevroren en gevriesdroogd. Dit gedeeltelijk opgezuiverde testmateriaal werd verder gefrac-tioneerd door middel van Reverse phase HPLC zoals beschreven bij voorbeeld 1.

Assay voor inhibitoire activiteit

Anti-elastase activiteit ten opzichte van menselijk leucocyt elastase werd als volgt bepaald. Elastase (Sigma E-1508, EC 3.4.21.37.) werd tezamen met de inhibitor op diverse concentraties in een buffer met pH 8 bij 37°C gedurende 10 minuten geincubeerd. De overblijvende elastase activiteit werd daarna gemeten gebruik makend van een chromogeen substraat (methoxy-succinyl-ala-ala-pro-val-pNA) op 405 nm en vergeleken met een controle voorbeeld.

Anti-chymotrypsine activiteit werd als volgt gemeten. Chymotrypsine werkt in op chromogeen substraat S-2586 (Kabi) door een gekleurde groep (paranitroanilide) los te laten welke er voor zorgt dat de absorptie gemeten met een spectrometer verandert. De nieuwe inhibitor remt chymotrypsine waardoor de verandering in de absorptie wordt verminderd.

(Ref: Goldstein,A.M, Murer,E.H., Weinbaum,G.,: Comp. Biochem. Physiol. 1986: 117-124)

Assay procedure op het reactiemengsel: 425 μΐ 0,1 M Tris HC1 pH 8,3 bevattende 0,96 M NaCl.

100 μΐ H2O (controle) of het monster protease inhibitor.

50 μΐ Chymotrypsine (0,8 μg/ml) in 0,0025 N HC1.

25 μΐ S-2586 (2,4 mM) in H2O.

Het assay mengsel bevat het volgende in de preparatie: 425 μΐ Tris HC1 zoals hierboven 100 μΐ H2O of het monster 50 μΐ Chymotrypsine

Dit wordt gemengd en dan in een waterbad gedaan bij 37°C gedurende 5 minuten. De reactie wordt gestart door er 25 μΐ S-2586 (2,4 mM) aan toe te voegen en te schudden, om het te mengen.

De tijd (t) wordt genoteerd als nul - het reactiemengsel wordt dan gedurende 1 a 2 uur in een waterbad op 25°C gehouden. Op diverse tijdstippen wordt de reactie gestopt door de toevoeging van 200 ml van 50% ijsazijn en de absorptie afgelezen bij 410 nm.

Oplossingen

Prepareer alle oplossingen door gebruik te maken van uitsluitend gefiltreerd steriel gedestilleerd water.

0,1 M Tris-HCl pH 8,3 bevattende 0,96 M NaCl.

Chymotrypsine 0,8 ng/ml in 0,0025 N HC1.

Kabi substraat S-2586 2,4 mM in H2O.

IJsazijn: H2O als 1:1.

Los de hoeveelheid gevriesdroogd GELIN in het glas op in 2 ml gedestilleerd water, en gebruik 1:100 verdunning voor de assay.

Eenheid,definitie Eén inhibitoire eenheid IU reduceert de door het enzym gekatalyseerde hydrolyse met 1 μΜοΙ substraat/minuut bij 25°C.

Uitgaande van de nu bekende eigenschappen van GELIN, kan deze stof van grote betekenis zijn voor toepassing in zowel farmaceutische als ook cosmetische preparaten. Voorbeelden hiervan zijn:

Behandeling van huidaandoeningen en tandvleesziekten als een anti-ontstekingsmiddel; behandeling van emphyseem en arthritis en ziekten van het hart- en vaatstelsel.

Hij kan ook van belang zijn bij het bewaren van granen en zaden. De inhibitor zal het ontspruiten van de zaden en granen vertragen, indien daarop toegepast.

Het is de bedoeling van de huidige vinding om de protease inhibitor te leveren gebruik makend van de bloedzuiger Hirudinaria manillensis en verwante soorten van Hirudinariinae evenals het gebruik van de inhibitor in medicijnen, cosmetische producten en andere toepassingen.

TABEL A

Vergelijking van de N-terminale Aminozuurvolgorde van de Elastase/Chymotrypsine inhibitor GELIN en Eglin c.

Eerste 27 residuen 1 5 10 15 20 25

Eglin c: TEFGSELKSFPEVVGKTVDNAREYFTL GELIN : VDEKAEVTDGLCGDKTCSGAQVXQNDA

X is nog niet vastgesteld.

Claims (10)

1. Polypeptide, genaamde GELIN, dat gewonnen kan worden uit de bloedzuiger Hirudinaria manillensis, waarvan de primaire structuur, beginnende bij de N-terminus, als volgt is: (met 95% zekerheid) 5 10 15 20 25 VDEKAEVTDGLCGDK+TCSGAQVXQNDA -etc K+ met 90% zekerheid X nog vast te stellen.

2. Polypeptide volgens conclusie 1, een sterke anti-elastase/anti-chymotrypsine activiteit hebbende.

3. Farmaceutisch preparaat, een protease-inhibiterende hoeveelheid van de stof volgens conclusie 1 en/of 2 en een farmaceutisch geschikte drager bevattende.

4. Cosmetisch preparaat, een protease-inhibiterende hoeveelheid van de stof volgens conclusie 1 en/of 2 en een cosmetisch geschikte drager bevattende.

5. Preparaat, bevattende een protease-inhibiterende hoeveelheid van een stof volgens conclusie 1 en/of 2 en dat actief is in de preventie en genezing van tandvleesziekten.

6. Preparaat, bevattende een protease inhibiterende hoeveelheid van een stof volgens conclusie 1 en/of 2 en dat actief is in het remmen van het ontkiemen van granen en zaden.

7. Werkwijze van behandeling voor een ziekte bij zoogdieren en speciaal bij mensen, die gevoelig is voor GELIN, omvattende de toediening van een protease-inhibiterende hoeveelheid van een stof volgens conclusie 1 en/of 2.

8. Werkwijze van het remmen van een actie van een protease, omvattend het toepassen of toedienen van een protease inhibiterende hoeveelheid van een stof volgens conclusie 1 en/of 2 tegen een protease bevattende grootheid zodanig dat de enzymatische activiteit van genoemde protease is verminderd of verdwenen.

9. Polypeptide volgens conclusie 1 en/of 2, gewonnen vanuit nabije soortgenoten van Hirudinaria manillensis, zoals leden van de subfamilie "Hirudinariinae" (de Buffalo bloedzuigers).

10. Een DNA-sequentie, die kan worden geëxtrapoleerd vanuit de aminozuur volgorde van de stof volgens conclusie 1, 2 of 9.