KR0167344B1

KR0167344B1 - 프로테아제 억제제

Info

Publication number: KR0167344B1
Application number: KR1019910701325A
Authority: KR
Inventors: 안토니 아트킨슨; 애스가 일렉트릭월러; 로이 토마스 소이어; 시카드 닐스 폰; 게라르트 보어만
Original assignee: 게라르트 보어만; 유로-바이오팜 테크놀로지 비.브이.
Priority date: 1989-04-14
Filing date: 1990-04-12
Publication date: 1999-01-15
Also published as: WO1990012808A1; JPH04507238A; CA2053242C; KR920701247A; EP0466833A1; AU5549290A; DE69031424T2; AU648252B2; NL8900943A; EP0466833B1; ATE157989T1; DK0466833T3; CA2053242A1; US5397694A; JP3101629B2; DE69031424D1; ES2108694T3

Abstract

본 발명은 겔린(Gelin)이라고 불리우는 신규한 프로테아제 억제제와 이 화합물을 함유하는 그의 약제학적 및 향장 제제에 관한 것이다.

겔린은 인간과 돼지의 백혈구-엘라스타제(Elastase) 및 키모트립신의 억제제이다. 겔린은 특이한 항생작용을 가진다. 본 발명은 또한 향장 제제에 있어서 다른 종류의 키모트립신-억제제인 에글린(Eglin)의 신규한 용도에 관한 것이다.

Description

[발명의 명칭]

프로테아제 억제제

[발명의 상세한 설명]

본 발명은 겔린(Gelin)이라고 불리우는 신규한 프로테아제 억제제와 이 화합물을 함유하는 그의 약제학적 및 향장(香粧) 제제에 관한 것이다.

기종이나 관절염, 치은염, 치근막염, 그외의 염증 등과 같은 질환은 엘라스타제에 의한 조직파괴 때문에 발생한다. 엘라스타제는 엘라스틴과 콜라겐 같은 섬유단백질을 녹일 수 있는 세린 프로테아제이다. 이들은 주로 췌장과 호중구성 백혈구의 호아주르성 그래뉼에 존재한다. 정상적인 생리학적 조건하에서, 상기 효소의 단백질 분해력은 플라스마와 다른 분비물에 있는 억제제의 과량에 의해 억제된다. 그러나, 병리 상태에서는 억제제의 국소적 결함이 다양한 염증을 유발하는 근본원인인 조직파괴를 일으키는 불균형을 유발한다.

상기와 같은 상황의 일예로 치은염을 기재하였다. 호중구 기능의 병변, 예를 들면, 진성 당뇨병, 다운스(Down's)증후군, 어린선, 류마치스성 관절염, 주기성 호중구감소증, 무과립구증, 체디아크-히가시(Chediak-Higashi) 증후군 등은 대개 숙주의 비정상성 및 숙주 상태와 결부되어 있다(1, 2). 다형핵(PMN) 유도성 중성 프로테아제 및/또는 박테이아성 독소는 염증성 변화를 유발하여 치은 부위의 지지조직에 직접 또는 간접으로 해를 끼친다(3∼7). 염증이 있는 치은 조직의 치육구액은 고농도의 가수분해효소를 함유한다(8). 산소 래디칼은 조직 파괴력 뿐만 아니라 제균력도 가지는데(9) 이 조직파괴능은 논의중에 있다(4, 5, 10). 염소화된 산화제는 강력한 살균력을 나타내며(11) 단순한 시험관내 완충액계에서만 인간조직에 독성을 나타낸다(12, 13). 1917년에 이미 합성 클로라민의 용도로 상처세정이 권장되었으나 아직까지 최종 산화매개체가 HOCl인지 아니면 클로라민 유도체인지가 의문으로 남아 있다(14). 가수분해되는 동안, PMN 과립감소에서 유도된 리소짐은 다양한 조직성분들에 위협이 되는 것으로 생각되며(4, 6), 천연 세럼 프로테이나제-억제제(알파 1 프로테이나제 억제제 및 알파 2 마크로글로부린)는 대부분 그것의 골수 퍼옥시다제-산화 시스템에 의해 활성을 잃는다(4, 15). 박테리아성 독소들(저분자량 대사생성물, 당단백질, 리포폴리사카라이드, 프로테아제)은 면역세포를 활성화할 뿐 아니라 숙주의 조직 및 세포파괴를 초기화한다고 알려졌다(8, 16∼18). 미생물의 일부도 인간 세럼 프로테이나제-억제제를 비활성화할 수 있다(19, 20). 결과적으로, 엘라스타제에 대해 강력한 억제제는 그러한 종류의 질병 퇴치용으로 유용한 치료학적 기재임이 증명되었다.

거머리의 타액선은 엘라스타제에 대한 강력한 억제제를 함유한다고 알려져 있다. 거머리 종인 Hirudo medicinalis에서 트롬빈 억제제 히루딘과는 별개로 키모트립신과 엘라스타제 억제제가 관찰되었다. 이 물질은 에글린(Eglin)이라고 명명되었으며 정제되어 특성화되었다(21). Goldstein 등은 3종의 서로 다른 북아메리카 거머리에 에글린이 있음을 발표하였다(22). 그러나, 이제까지 연구되어 온 다른 종류의 거머리들의 엘라스타제 억제제들은 서로 비슷한 생화학적 작용이 있는 것으로 보인다.

본 발명에서는 Hirudinaria manillensis에서 항트롬빈제를 정제하는 동안 강력한 항키모트립신 작용 및 항엘라스타제 작용을 가지는 신규한 억제제를 분리하게 되었다. 이제까지 얻어진 결과는 이 억제제가 에들린과는 상당히 다른 것으로 나타나서 이를 겔린(Gelin)으로 명명하였다.

겔린은 Hirudinaria manillensis의 단백질을 정제하는 과정에서 발견되었다. 이들 단백질을 정제하는 동안, 어떤 분획에서 키모트립신과 엘라스타제에 대한 억제작용이 관찰되었으며, 이들을 에글린 및 히루딘과 비교하여 연구하였다. 본 발명의 일부 및 그것으로 부터 추정될 수 있거나 펩티드-유사 동족류를 유도할 수 있는 해당 DNA 시퀀스에 따르는, 거머리에서 유도된 엘라스타제/키모트립신 억제제는 의약용 거머리 Hirudo medicinalis에 존재하는 것으로 알려져 있으며, Seemuller et al. Eglin, elastase-catheps in G-inhibitor from leeches, 1981, Meth. Enzymol. ; 80 ; 804-816에 기재된 엘라스타제/키모트립신 억제제로 이미 알려진 에글린과는 다른 것이다.

또한, 히루딘(Dodt et al., FEBS 165, 180-184)과 다른 알려진 구조물과 비교할 때 겔린의 구조가 독특하며 에글린의 구조와는 상당히 다른 것으로 나타났다.

본 발명에 따른 엘라스타제/키모트립신 억제제는 일반적으로 용매 추출법에 의해 거머리 조직에서 분리하는데, 거머리 타액 등의 거머리 분비물에서도 분리될 수 있다.

본 발명의 또 다른 영역은 구강세정제, 치약, 스킨크림 등에 속하는 향장 제제로서의 에글린의 신규한 용도에 관한 것이다.

[정제]

Hirudinaria manillensis 7kg을 96% 에탄올로 실온에서 탈수하고 이를 4,000㎖로 4회 반복하였다. 탈수된 몸체를 제거하고 개시물질인 에탄올 추출액을 c-HCl로 pH 3.5로 조절하였다. 이 용액을 1,000rpm에서 10분 동안 원심분리하고 0.1M NaOH로 상징액의 pH를 7.0으로 조절하였다. 상징액을 증류수로 50%로 희석하여 Millipore Pellicon Ultrafilter System에서 분자량 10,000 노미날 필터를 써서 800㎖를 농축하였다.

[CM-세파로스 크로마토그래피]

농축물을 CM-세파로스 컬럼에 적재하고, pH 6.0, 50mM 소디움 아세테이트로 평형시켰다. 컬럼에 결합되지 않은 통과물질은 하나의 분획으로 모아 항키모트립신/항엘라스타제 활성을 분석하였다. 활성성분을 포함한 통과물질은 분자량 10,000인 물질에 사용하는 필터를 써서 한외거르기하여 400㎖로 농축하였다.

[DEAE-세파로스 크로마토그래피]

생성물을 필터하여 여과액을 pH 5.5, 20mM 피페라진-HCl 완충액으로 미리 평형시킨 DEAE-세파로스 패츠-플로우 컬럼에 적재하였다. 컬럼을 유속 10㎖/분으로 전개하여 용출액의 흡광도 및 pH, 전도도를 기록하였다.

세척한 후, 결합되어 있는 물질들을 평형시킨 완충액에서 0.1 내지 0.4M NaCl의 단계적인 그래디언트로 용출시켜 용출피크의 각각을 항키모트립신/항엘라스타제 활성을 측정하기 위한 분획으로 수집하였다. 활성이 있는 피크는 증류수로 하룻밤동안 투석하여 탈염하였다.

[Q-세파로스 크로마토그래피]

부분적으로 정제된 생성물은 pH 7.5, 20mM 트리스-HCl 완충액으로 미리 평형시킨 Q-세파로스 음이온 교환 크로마토그래피로 다시 정제하였다. 컬럼을 유속 20㎖/분으로 전개하고 결합된 물질을 평형 완충액하에서 0 내지 1M NaCl의 연속적인 그래디언트로 용출하였다. 용출액의 흡광도 및 엘라스타제 억제 활성을 기록하였다. 활성분획을 모아 분자량 10,000에 해당하는 필터로 한외거리기하여 농축하였다.

[수퍼덱스 200 크로마토그래피]

농축된 물질을 pH 7.5, 50mM 트리스-HCl 0.1M NaCl 완충액으로 평형시킨 수퍼덱스 200 컬럼으로 겔여과하였다. 활성이 있는 피크부분을 모아 동결 건조하였다.

[HPLC]

부분적으로 정제된 시료를 재구성하여 0.1% TEA로 평형시킨 가역상 마이크로 포어 Aquapore C₈컬럼에 분취하여 적재하였다. 결합된 물질을 60% CH₃CN + 0.09% TEA 용액의 0 내지 40%의 연속 그래디언트로 10분 동안, 40 내지 100%의 연속 그래디언트로 20분 동안 용출하였다. 각각의 피크를 분취하여 항엘라스타제 활성을 확인하였다(제4도). 활성이 있는 피크분획을 모아 동결건조하여 다음 연구에 사용하였다.

시료의 순도를 유사한 조건하에서 HPLC 및 N-터미널 시퀀스 분석에 의해 측정하였다. 겔린의 정제를 제2도에 나타내었다.

[생리학적 연구]

겔린의 억제활성도는 췌장 엘라스타제에 의해 촉매되어지는 합성 기질 N-숙시닐(Ala)3-p-니트로아닐리드(SAAAP)에서 p-니트로아닐린의 방출억제를 분광학적으로 측정하여 계산한다. 활성도 1억제 단위는 pH 8.3, 25℃에서 1마이크로몰 SAAAP/분의 가수분해를 억제하는데 필요한 겔린량으로 정의된다.

분석은 pH 8.3, 0.1M 트리스/HCl 완충액에 용해된 1M NaCl을 함유하는 기지량의 췌장 엘라스타제와 서로 다른 량의 겔린을 25℃에서 5분 동안 항온처리하여 실시한다. 이 반응은 색소를 생성하는 기질을 첨가하여 시작하고 405nm에서 시간에 따른 흡광도를 측정한다. 겔린이 없는 대조반응을 동일한 조건에서 실시한다. 분당 흡광도 변화와 물 흡광계수 10,500m^-1cm^-1으로 부터 겔린의 활성도를 계산할 수 있다.

[단백질 정량]

정제된 겔린의 단백질 농도는 로우리(Lowry)와 브래드포드(Bradford)법에 의해 측정되었다. 이들 두 방법에 의해 얻어진 값 간에는 커다란 차이가 있음이 발견되었다. 특정한 일군의 시료에 대해 로우리법으로는 0.38㎎/㎖를 얻은 반면, 브래드포드의 방법으로는 측정한계(2㎍/㎖미만)이하의 값을 얻는다. 그러나, 로우리법으로 얻어진 값은 1% 용액을 흡광계수를 10으로 하여 280nm에서 측정한 흡광도에 의해 얻어진 값과 거의 일치한다. 로우리법으로 측정된 단백질값을 이용하여 계산된 정제된 겔린의 고유활성도는 약 40∼80mIU/㎎이었다.

[동전점]

겔린의 pI는 Pharmacia Phast system 으로 pH 3 내지 9 범위의 이소일렉트릭 포커싱 겔을 사용하여 측정하였다. 겔린을 겔 중앙에 적재하였다. 동일한 조건하에 사용된 IEF 마커는 아밀글루코시다제(3.5), 트립신 억제제(4.6), B-락토글로부린(5.1), 탄산탈수효소 Ⅰ과 Ⅱ(5.9, 6.6), 미오글로부린(6.7), 락트산 탈수소효소(8.5) 및 트립시노겐(9.0) 등이었다. 포커싱한 후에 겔을 전해하여 은염색법으로 생성된 띠들을 가시화하였다(제6도).

겔린의 등전점은 에글린 C가 6.45이고 에글린 B가 6.6인 것과 비교하여 약 4.6으로 나타났다(두개의 에글린은 하나의 아미노산이 서로 다른데 즉, 에글린 B에는 히스티딘이 있으나 에글린 C에는 티로신이 있다).

[분자량]

겔린의 분자량은 Laemlli의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 측정하였다. 16%와 20% 균질겔에서 정제된 겔린은 환원 조건하에서 14.4kDa 바로 아래의 띠로 이동하였다(제7도). 동일 조건하에 사용된 분자량 마커는 포스포릴라제 B(94kDa), 소의 세럼 알부민(67kDa), 오브알부민(43kDa), 탄산탈수효소(30kDa), 트립신 억제제(20kDa) 및 락트알부민(14.4kDa)등이었다. 그러나, 겔린을 8M 우레아 존재하에 Swank와 Munkres(24)법에 따라 SDS-PAGE를 실시하였을 때 시료가 쿠마시 블루로 염색하였을 때와 은염색하였을 때 가시화된 것이 다른 것이 발견되었으며, 겔린은 약 21 내지 25kDa의 분자량에 해당하는 이동성을 나타냈다. 제7도에 보이는 바와 같이, Swank와 Munkres 방법에 의해 저분자량의 단백질과 펩티드의 분자량을 측정하는데 적절한 저분자량인 Electran을 기준 물질로 사용하였다. 두가지의 서로 다른 방법에 의해 측정된 분자량의 이러한 차이를 현재로는 설명할 수 없다(에글린은 분자량 8.1kDa를 가진다).

[특이성]

겔린의 억제활성도는 색소생성기질에 의한 분석을 이용하여 엘라스타제, 카텝신 G, 키모트립신, 트립신과 트롬번 등의 세린 프로테아제들에 대한 비교를 실시하였다. 각 효소에 대한 상세한 분석 조건은 표1에 기재하였다. 간단히 말하면, 일정량의 효소를 적절한 완충액에 용해시킨 서로 다른 농도의 겔린과 37℃에서 5분 동안 항온처리하였다. 기질을 첨가하여 반응을 시작하고 405nm에서 흡광도의 증가를 관찰하였다. 억제제가 없는 대조군의 초기 속도가 각 효소에 대해 100%로 주어졌다. 얻어진 결과들로부터 효소의 활성(IC⁵⁰)을 50% 억제하는데 필요한 겔린의 몰농도가 계산되었다. 그 결과, 겔린이 키모트립신, 카텝신 G와 엘라스타제의 강력한 억제제이며, 트립신과 트롬빈에는 약간의 활성을 가지는 것이 나타났다. 계산된 IC⁵⁰값은 키모트립신, 카텝신 G, 엘라스타제, 트립신 각각에 대해 0.13, 0.25, 0.32 및 20.4몰 겔린/몰이었다.

[아미노산 조성]

정제된 겔린은 110℃에서 24시간과 48시간 동안 진공으로 기체상태의 ARISTAR HCl로 가수분해되었다. 가수분해된 혼합물의 아미노산 조성을 Amino Chrome system으로 분석하였다. 에글린 C와 비교하여 분자량 8100달톤을 유리된 아미노산의 정량을 위해 겔린에 사용하였다. 그 결과, 표2에 나타난 바와 같이, 두 억제제의 조성이 매우 다른 것으로 나타났다. 특히, 겔린 중 상당량의 아스파르트산(+아스파라긴)과 알라닌의 존재, 히스티딘의 결핍 및 이소루이신의 존재가 에글린 C와 비교되었다.

[원편광이색성]

항엘라스타제의 CD 스펙트럼을 실온에서 0.1% TEA로 통과길이 0.02cm셀을 사용하여 얻었다. 이 스펙트럼을 에글린(시비-가이기사, Basel)으로 얻어진 스펙트럼과 비교하였다(제11도). CONTIN 분석으로 얻어진 자료들은 19%의 헬릭스와 56%의 β-시이트, 25%의 부정형 구조를 가진 에글린 C와 비교하여 겔린의 3차 구조는 헬릭스는 없으며 58%의 β-시이트와 42%의 부정형 구조를 가지는 것으로 나타났다. 그러므로, 두 종류의 거머리에서 얻어진 엘라스타제 억제제는 명백히 다른 것이며, 이하에 나타낸 바와 같은 이들의 N-터미널 아미노산 시퀀스는 관찰된 차이를 뒷받침한다.

[구조연구]

정제된 항엘라스타제의 N-터미널 아미노산의 시퀀스를 측정한 결과, 잔기 29까지가 단일 시퀀스인 것으로 나타났다. 시퀀스내에 시스테인 잔기를 확인하기 위해서, 정제된 시료를 디티오트레이톨로 환원하였고 시스테인이 4-비닐피리딘과 반응하여 피리딜에틸 시스테인으로 유도되었다. 유도된 시료의 아미노 터미널 시퀀스 분석을 반복하여 얻어진 결과를 표3에 나타내었다. 이 부분적인 시퀀스와 에글린에 대해 공개된 자료의 비교는 이 억제제가 그것의 일차 구조와는 명백히 다른 것임을 나타낸다.

겔린의 완전한 1차 시퀀스를 결정하기 위해서, 정제된 물질을 환원하여 상기에서와 같이 유도하고 다음과 같은 조건에서 TPCK-트립신, TLCK-키모트립신 또는 V8 프로테아제로 분해하였다.

겔린 대 트립신의 비율을 50:1(중량/중량)로 하여 겔린을 TPCK 처리된 트립신으로 분해하였다. 상기 반응을 pH 8.0, 0.05M 중탄산 암모니움 완충액 0.1㎖로 37℃에서 4시간 동안 실시하였다. 냉동 건조하여 상기 반응을 중단하고 HPLC로 트립신에 의한 펩티드를 분리하였다(제8도).

상기에 기재한 바와 유사한 조건에서 TLCK로 처리된 키모트립신에 의한 분해를 실시하였다. 생성된 펩티드 절편을 HPLC로 분리하였다(제9도). 프로테아제 V8에 의한 분해에 있어서는 정제된 겔린을 pH 7.9, 0.05M 중탄산암모니움 완충액에 녹인 5㎍의 효소와 혼합하였다. 이 혼합물을 생성된 절편을 HPLC로 분리하기 전에 실온에서 24시간 동안 항온 처리하였다(제10도).

[용해도와 안정성]

겔린의 등분량을 진공에서 실리카겔로 탈수하였다. 각각의 등분량을 아세트산이나 에탄올, 부탄올, 아세톤(모두 분석용 사용), 또는 증류수에 녹여 실온에서 10분 동안 교반하였다. 각 시료의 용매를 깨끗한 바이알에 옮겨 동결건조하였다. 겔린의 총량은 색소생성 분석법에 의해 억제단위(IU)로 측정되었다.

얻어진 결과는 겔린이 상기 조건에서 시험된 모든 용매에 안정한 것으로 나타났으며 용해도는 다음과 같다:

물 아세트산 에탄올 아세톤 부탄올

[온도에 대한 안전성]

독립적인 실험에서 겔린은 100℃에서 30분까지는 억제활성을 거의 잃지 않는, 높은 온도에 대한 안정성을 나타내었다.

[분석원리]

겔린은 거머리에서 유도된 신규한 프로테아제 억제제이다. 분석 근거는 합성된 색소생성기질 S-2586에 대한 α-키모트립신 활성의 억제를 포함한다. α-키모트립신 활성은 기질을 분해하는 동안 생성되는 색깔을 띤 p-니트로아닐린기의 방출을 관찰하여 405nm에서 분광학적으로 측정할 수 있다.

겔린 존재하에서 α-키모트립신 활성의 감소는 억제활성과 관련된 것이다.

[단위의 정의]

α-키모트립신 활성 1단위(U)는 pH 8.3, 25℃에서 분당 1마이크로몰의 S-2586을 가수분해하는 것이다. 1단위의 억제활성(IU)은 pH8.3, 25℃에서 상기 효소에 의해 촉매되는 가수분해를 분당 S-2586 1 마이크로 몰 감소시킬 것이다.

[실험재료]

[용액의 제조]

1. 분석용 완충액

pH 8.3, 0.1M 트리스/HCl, 1M NaCl

2. 키모트립신 용액

물에 용해된 α-키모트립신 4㎍/㎖

3. 색소생성기질

물에 용해된 1.0mM S-2586

4. 50% 아세트산(glacial)

물로 1:1로 희석된 아세트산(glacial)

[분석방법]

1. 마이크로타이트레 플레이트 웰에서 분석을 실시한다.

각각의 웰은 다음을 함유한다.

2. 상기 내용물들을 25℃에서 5분 동안 항온처리한다.

3. 색소생성기질 용액(S-2856 1mM)25㎕를 첨가하여 반응을 시작한다. 시작시간을 기록하고 반응 혼합물을 25℃에서 5분 동안 항온처리한다. 이러한 조건에서 기질의 농도는 제한되지 않는다.

4. 50% 아세트산 25㎕를 첨가하여 반응을 중단한다.

5. 마이크로플레이트 리더로 405nm에서 방출된 p-니트로아닐린의 흡광도를 읽는다.

주

405nm에서 고유한 흡광도를 가지는 시료를 얻기 위해 공액은 시료만의 흡광도 변화를 제거해야만 한다. 공액은 S-2586이 첨가되지 않은 동등한 분석 조건으로 실시되어야 한다.

분석방법을 표준화하기 위해서, 기지의 억제활성을 가진 자체 제조한 대조용 겔린은 시험용 시료와 동일한 조건으로 분석되어야 한다.

[억제활성의 정량]

1. 시료의 억제활성은 기지의 자체 제조한 표준 겔린의 억제활성과 직접 비교하여 결정한다. 시료와 표준물질의 희석곡선에서 투여비율을 분석하는 컴퓨터로 활성을 정량한다.

2. 시료의 억제활성은 선택적으로 다음식에 의해 계산될 수 있다.

색깔을 띤 생성물에 대한 몰흡광계수는 기지량의 기질과 α-키모트립신을 반응이 완결된 때까지 즉, 더 이상 색변화가 없을 때까지 항온처리하여 실험적으로 결정할 수 있다.

405nm에서의 흡광도에 대한 E값은 10,500M^-1cm^-1로 결정되었다.

억제 및 비억제 조건에서 분당 생성된 생성물의 온도차는 시료의 억제 활성을 결정한다.

[분석원리]

겔린은 거머리에서 유도된 신규한 프로테아제 억제제이다. 분석 근거는 합성된 색소생성기질 SAAAP에 대한 엘라스타제 활성의 억제를 포함한다. 엘라스타제 활성은 기질을 분해하는 동안 생성되는 색깔을 띤 p-니트로아닐린기의 방출을 관찰하여 405nm에서 분광학적으로 측정할 수 있다.

겔린 존재하에서 엘라스타제 활성의 감소는 억제활성과 관련된 것이다.

[단위의 정의]

엘라스타제 활성 1단위(U)는 pH 8.3, 25℃에서 분당 1마이크로몰의 SAAAP를 가수분해하는 것이다. 1단위의 억제활성(IU)은 pH8.3, 25℃에서 상기 효소에 의해 촉매되는 가수분해를 분당 SAAAP 1 마이크로몰 감소시킬 것이다.

[실험재료]

[용액의 제조]

1. 분석용 완충액

pH 8.3, 0.1M 트리스/HCl, 1M NaCl

2. 엘라스타제 용액

물에 용해된 엘라스타제 40㎍/㎖

3. 색소생성기질

물에 용해된 1.0mM SAAAP

4. 50% 아세트산(glacial)

물로 1:1로 희석된 아세트산(glacial)

[분석방법]

1. 마이크로타이트레 플레이트 웰에서 분석을 실시한다.

각각의 웰은 다음을 함유한다.

2. 상기 내용물들을 25℃에서 5분 동안 항온처리한다.

3. 색소생성기질 용액(SAAAP 1mM)25㎕를 첨가하여 반응을 시작한다. 시작시간을 기록하고 반응 혼합물을 25℃에서 30분 동안 항온처리한다. 이러한 조건에서 기질의 농도는 제한되지 않는다.

4. 50% 아세트산 25㎕를 첨가하여 반응을 중단한다.

주

405nm에서 고유한 흡광도를 가지는 시료를 얻기 위해 공액은 시료만의 흡광도 변화를 제거해야만 한다. 공액은 SAAAP가 첨가되지 않은 동등한 분석 조건으로 실시되어야 한다.

[억제활성의 정량]

색깔을 띤 생성물에 대한 몰흡광계수는 기지량의 기질과 엘라스타제를 반응이 완결될 때까지 즉, 더 이상 색변화가 없을 때까지 항온처리하여 실험적으로 결정할 수 있다.

405nm에서의 흡광도에 대한 E값은 10,500M^-1cm^-1로 결정되었다.

[분석원리]

겔린은 거머리에서 유도된 신규한 프로테아제 억제제이다. 분석 근거는 합성된 색소생성기질 S-2238에 대한 트립신 활성의 억제를 포함한다. 트립신 활성은 기질을 분해하는 동안 생성되는 색깔을 띤 p-니트로아닐린기의 방출을 관찰하여 405nm에서 분광학적으로 측정할 수 있다.

겔린 존재하에서 트립신 활성의 감소는 억제활성과 관련된 것이다.

[단위의 정의]

트립신 활성 1단위(U)는 pH 8.3, 25℃에서 분당 1마이크로몰의 S-2238을 가수분해하는 것이다. 1단위의 억제활성(IU)은 pH8.3, 25℃에서 상기 효소에 의해 촉매되는 가수분해를 분당 S-2238 1 마이크로몰 감소시킬 것이다.

[실험재료]

[용액의 제조]

1. 분석용 완충액

pH 8.3, 0.1M 트리스/HCl, 1M NaCl

2. 엘라스타제 용액

물에 용해된 트립신 40㎍/㎖

3. 색소생성기질

물에 용해된 1.0mM S-2238

4. 40% 아세트산(glacial)

물로 1:1로 희석된 아세트산(glacial)

[분석방법]

1. 마이크로타이트레 플레이트 웰에서 분석을 실시한다.

각각의 웰은 다음을 함유한다.

2. 상기 내용물들을 25℃에서 5분 동안 항온처리한다.

3. 색소생성기질 용액(S-2238 1mM)25㎕를 첨가하여 반응을 시작한다. 시작시간을 기록하고 반응 혼합물을 25℃에서 5분 동안 항온처리한다. 이러한 조건에서 기질의 농도는 제한되지 않는다.

4. 50% 아세트산 25㎕를 첨가하여 반응을 중단한다.

5. 마이크로폴레이트 리더로 405nm에서 방출된 p-니트로아닐린의 흡광도를 읽는다.

주

405nm에서 고유한 흡광도를 가지는 시료를 얻기 위해 공액은 시료만의 흡광도 변화를 제거해야만 한다. 공액은 S-2238이 첨가되지 않은 동등한 분석 조건으로 실시되어야 한다.

[억제활성의 정량]

색깔을 띤 생성물에 대한 몰흡광계수는 기지량의 기질과 트립신을 반응이 완결될 때까지 즉, 더 이상 색변화가 없을 때까지 항온처리하여 실험적으로 결정할 수 있다.

405nm에서의 흡광도에 대한 E값은 10,500M^-1cm^-1로 결정되었다.

[차은염에 대한 예비조사]

이 조사를 위해 8명의 지원자를 뽑았다. 선택기준은 눈에 보일만한 플라크의 축적이 있고 인용자료에 기재된 표준방법에 따라 측정된 3 내지 5㎜의 소구낭 깊이를 가진 적어도 4개의 치아가 만성 치은염이고 조사중에 출혈이 있었으며 개방성 충치와 심각한 치근막염이 없고 최근에 투약 기록이 없는 일반적으로 양호한 건강의 소유자였다. 대상은 23 내지 46세의 남녀였다.

일반 개업의들에 의해 6일 동안 매일 4개 치아의 치육하 세정이 실시되었다. 6일에 기준선에서 측정이 실시되었다. 조사대상자들에게는 그들의 일상적인 구강위생습관을 변화시키지 말도록 지시되었다. 측정 방법은 PI(Plaque Index, Silness and Loe, Acata. Odont, Scand. 1964;22:121)와 PBI(Papillary Bleeding Index, Muhlemann, H.R; J. Prev. Dent. 1977;4;6)가 실시되었다. 모든 대상자에게 동등한 처치가 실시되었으며 음성적인 관리는 없었다. 6명에게는 시험물질이 주어졌고 2명에게는 위약(僞藥)이 주어졌다. 겔린의 냉동건조 분말은 겔린 20㎎을 8㎖의 표준용액에 녹인 것이다. 상기 표준용액은 등장수/글리세롤(60%/40%)에 2중량%의 소디움 카르복시-메틸 셀룰로스를 가한 멸균 혼합액인 것으로 겔화될 때까지 교반하였다.

이 겔을 멸균된 마이크로주사기로 대상자 각각에게 나누어 주사하였다.

매번의 치육하 세정은 지정된 치아 주위의 각각의 치근막낭에 겔린을 함유하는 겔화 표준용액 0.05㎖를 주사하는 것으로 이루어졌다.

[결과]

기준선에서 시험군에 대한 x PI는 2.2±0.7이었다.

기준선에서 시험군에 대한 x PBI는 2.3±0.8이었다.

실험말기에 xPI는 1.0±0.6으로 감소된 반면, x PBI는 0.6±0.3으로 감소되었다.

위약 대상자들에 대한 기준선 자료는 x PBI = 2.0±0.6이었고, x PBI=2.4±1.0이었다.

실험말기에 위약 대상자들의 x PI는 1.7±0.7로 감소되었고 x PBI는 1.9±0.6으로 감소되었다.

시험군에 대한 PI의 감소는 기준선과 비교하여 55%였으며 위약 대상자들과 비교하여 42%였다.

시험군에 대한 PBI의 감소는 기준선과 비교하여 74%였으며 위약 대상자들과 비교하여 65%였다.

[검토]

PBI의 상당한 감소는 치육질의 단백질을 가수분해하는 엘라스타제, 카텝신 G 등의 PMN-유도 중성 프로테아제를 억제하는 프로테아제 억제 메카니즘에 대한 시험점으로 임상적으로 중요하다. 덜 중요하기는 하나 플라크 축적의 상당한 감소는 반길만한 것일지라도 놀라운 것이다. 이러한 효과는 아마도 지지조직의 단백질 가수분해의 억제가 치구의 치근막 병리 미생물의 생존에 필요한 영양분을 감소시키기 때문인 것으로 보인다.

[플라스민에 대한 효과]

플라스민에 대한 겔린의 억제 활성을 결정하는 실험을 실시하였다. 색소생성기질 S-2288(H-DlIle-Pro-Arg-pNA)에서 p-니트로아닐리드의 분해와 방출을 측정하여 플라스민 활성을 기록하였다. 40㎍/㎖의 플라스민 50㎕를 다양한 농도(10㎍/㎖, 5㎍/㎖, 2.5㎍/㎖ 및 1.25㎍/㎖)의 겔린 50㎕와 항온처리하였다. 그 결과, 가장 높은 농도의 겔린(10㎍/㎖)에서도 플라스민에 대한 억제는 일어나지 않은 것으로 나타났다.

[펩신에 대한 효과]

산성 프로테아제 펩신에 대한 겔린의 억제 활성을 결정하는 실험을 실시하였다. pH2.0,에서 헤모글로빈의 단백질 가수분해를 측정하여 펩신 활성을 기록하였다. 겔린 억제제가 있는 조건 및 결핍된 조건하에서 증류수에 녹인 8㎎/㎖의 펩신 25㎕를 20% 아세트산에 녹인 10㎎/㎖의 헤모글로빈 100㎕와 37℃에서 60분 동안 항온처리하였다. 분해되지 않은 헤모글로빈 10% w/v 트리클로로아세트산 100㎕로 침전시키고 상징액 중의 가수분해된 단백질을 280nm에서 측정하였다. 그 결과, 고농도의 겔린(75㎍/㎖)하에서도 펩신에 대한 억제 효과는 없는 것으로 나타났다. 또한, 예비실험에서 겔린은 펩신에 의해 분해되지 않는 것으로 나타났다.

[겔린 분비기관(1)]

Hirudinaria manillensis를 머리와 몸통, 내장 등 세부분으로 주의 깊게 나누었다. 각 부분을 증류수로 잘 씻어서 피 등의 이물질을 제거 하였다. 각 부분을 에탄올로 탈수하고 추출물은 엘라스타제 억제에 대해 분석하였다.

대부분(75%)의 활성이 몸통 추출물에 있었다.

[겔린 분비기관(2)]

각각의 거머리들은 8% 에탄올에 담갔을 때 점액을 분비하였다. 점액을 모아 증류수로 5회 추출하고 추출물을 합하여 표준방법으로 억제활성을 분석하였다.

예비 결과는 억제활성이 점액추출물에 있는 것으로 나타났다. 점액 분비물에 있는 겔린의 총활성은 겔린의 부분적인 정제에 대한 제2도로 얻어진 에탄올 추출물에 대해 결정된 총활성 보다 작다.

[장기간의 항온처리]

겔린을 일부 취하여 실온에서 장기간 두었을 때의 안정성 즉, 저장 수명을 측정하기 위해 다양한 종류의 치약 및 구강세정제와 항온처리하였다.

100일이 경과 되었을 때 17。내지 36℃ 사이의 온도변화가 기록되었다.

겔린은 구강세정제뿐만 아니라 모든 종류의 치약에서도 키모트립신에 대한 억제활성을 유지하였다. 제3도는 겔린(10㎍/㎖중의 50㎕) 0.5g 존재하에 또는 결핍된 상태에서 치약과 구강세정제의 시간에 따른 변화를 나타낸 것이다.

[산화에 대한 안정성]

산화에 대한 겔린의 안정성을 측정하기 위해 두가지의 실험이 실시되었다.

[실험 1]

물에 용해할 10㎍/㎖의 겔린 50㎕를 물로 희석한 30% 과산화수소 50㎕ 및 pH6.0, 50㎛ 소디움 아세테이트에 녹인 1㎍/㎖의 락토퍼옥시다제 50㎕와 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 50㎕를 분취하여 키모트립신에 대한 억제활성을 분석하였다.

결과는 다음 표와 같다.

[결론]

상기 조건하에서 겔린은 산화에 안정하였으며 억제활성도 유지되었다.

[실험 2]

물에 용해한 10㎍/㎖의 겔린 또는 에글린 50㎕를 물로 희석한 30% 과산화수소 50㎕와 37℃에서 5분동안 항온처리하였다. 50㎕를 분취하여 키모트립신에 대한 억제활성을 분석하였다.

결과는 다음 표와 같다.

[결론]

상기 조건하에서 에글린의 억제확성은 영향이 없었다. 겔린의 억제 작용은 미소한 변화를 보였는데 시험관 1과 2를 비교하였을 때 8%에 해당하였다.

[항균작용에 대한 예비실험]

충혈된 거머리에서 Aeromonas hydrophila를 회수하였다. Shotts etal. (1985) (25)의 분석 방법을 이용하여 수반된 프로테아제 프로필의 동일성은 이들이 엘라스타제에 대해 양성임을 나타내었다. 1㎎의 겔린 바이알을 1㎖로 다시 제조하여 10^-1내지 10^-6으로 희석하였다. A. hydrophila의 선택된 배양체를 로온(lawn)을 얻기 위해 앞에서 기재한 분석 배지에 접종하였다. 페니실린 분석 실린더를 평판 중앙에 배치하였다. 희석 겔린 0.1㎖를 각각의 실린더에 삽입하고 이평판을 25℃에서 10일 동안 항온처리하였다. 그 결과, 엘라스타제 활성이 있는 적은 부위로 보아 겔린의 확산 부위내에 엘라스타제 활성에 대한 장해가 있음이 나타났다. 이것은 희석되지 않은 부위와 10^-1, 10^-2및 10^-3부위에서 발생한 것으로 기록되었다.

상기의 10^-1, 10^-2및 10^-3의 희석부위에서 항엘라스타제 억제단위(IU)는 각각 2 IU, 0.2IU 및 0.02IU로 계산되었다(제1도의 겔린 활성 다이아그램 참조).

[제조예]

겔린을 첨가한 치약은 다음과 같이 제조되었다.

[실시예 1]

디칼슘 포스페이트를 기재로 한 활성 치약 조성물.

치약을 제조하는데 있어서, 겔린 용액은 다른 성분들이 모두 첨가된 후, 향미제가 첨가되기 전에 혼합되는 것이 바람직하다.

[실시예 2]

실리카를 기재로 한 활성 치약 조성물.

구강세정제 실시예 :

세정액 실시예 :

상기 실시예에 기재된 용액은 pH 5 내지 pH 8.5 사이의 완충액에 냉동건조된 겔린을 용해하여 얻어진다. p-벤조산 메틸에스테르 또는 프로필에스테르는 저장을 위해 0.1 중량% 정도 투여할 수 있다.

용액 중의 겔린 농도는 0.2 내지 5㎎, 바람직하기로는 용액 10㎖중에 0.2 내지 2㎎을 함유하는 것이다.

[겔린을 함유하는 수성 약제 조성물]

1. 겔린을 pH 5 내지 pH 8.5의 수성 완충용액에 0.5㎎/10㎖의 농도로 용해시킨다.

2. p-히드록시벤조산 메틸에스테르 0.1중량%를 가한다.

상기 제제는 한외거르기로 멸균한 후에

a. 정맥내 투여;

b. 흡입용 분무기로 사용될 수 있다.

[겔린을 함유하는 지방 연고로서의 약제 조성물]

1. 적당한 지방 기재에 겔린을 현탁한다.

2. 글리세롤 모노스테아레이트 등의 표면 활성성분을 가한다.

3. p-히드록시벤조산 메틸에스테르 0.1중량%를 가한다.

상기 실시예들의 약제 조성물은 기재의 안정화를 위한 성분들을 함유할 수 있다.

[치약 등의 향장 제제로서 에글린의 용도]

겔린을 에글린으로 대체한 것을 제외하고는 구강 제제 및 치약 제제에 대해 언급한 상기 실시예들과 유사하다.

향장용 크림에 에글린을 사용하는 것은 겔린을 에글린으로 대체한 것을 제외하고, 상기에서 언급한 약제 조성물의 제법과 유사하다. 또한, 이 제제는 현행법 하에서 향장 용도로 독특하게 사용된다.

Claims

(ⅰ)알코올과 같은 유기용매로 거머리종의 조직 또는 분비물을 추출하고, 산 침전 및 한외 거르기를 실시하는 단계; (ⅱ)아가로오즈 흡착제에 결합되어 있는 카르복시 메틸 잔기로 양이온 교환 크로마토그래피를 하고, 한외 거르기를 실시하는 단계; (ⅲ)셀룰로오즈 흡착제에 결합되어 있는 DEAE로 음이온 교환 크로마토그래피를 실시하는 단계; (ⅳ)아가로오즈 흡착제에 결합되어 있는 4급 암모늄 잔기로 음이온 교환 크로마토그래피를 실시하고, 한외 거르기를 실시하는 단계; (ⅴ)아가로오즈 흡착제에 결합되어 있는 덱스트란으로 겔 여과하는 단계; 및 (ⅵ)C8에서 역상 고성능 액체 그로마토그래피를 실시하는 단계로 이루어진 단리 및 정제 단계에 의해 얻어질 수 있는 항엘라스타제 활성과 항키모트립신 활성을 갖는 거머리종로부터 유도된 다음의 N-터미널 시퀀스를 갖는 것을 특징으로 하는 정제 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 등전점이 약4.6인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드의 항엘라스타제 활성은 보온 처리후 30분 동안 100℃에서 유지 시켜서 된 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항 내지 제3항에 따른 다음의 N-터미널 시퀀스를 갖는 폴리펩티드로, 엘라스타제 활성 증가에 의해 야기되는 염증 질환 및 치근막 질환, 특히 치은염의 치료에 적합한 의약을 제조하는 방법.
제1항 내지 제3항에 따른 다음의 N-터미널 시퀀스를 갖는 폴리펩티드, 향장용으로 허용가능한 담체 및 부형제로 이루어진 향장 조성물.
(ⅰ)유기용매인 에탄올로 거머리종의 조직 또는 분비물을 추출하고, 산 침전 및 한외 거르기를 실시하는 단계; (ⅱ)아가로오즈 흡착제에 결합되어 있는 카르복시 메틸 잔기로 양이온 교환 크로마토그래피를 하고, 한외 거르기를 실시하는 단계; (ⅲ)셀룰로오즈 흡착제에 결합되어 있는 DEAE로 음이온 교환 크로마토그래피를 실시하는 단계; (ⅳ)아가로오즈 흡착제에 결합되어 있는 4급 암모늄 잔기로 음이온 교환 크로마토그래피를 실시하고, 한외 거르기를 실시하는 단계; (ⅴ)아가로오즈 흡착제에 결합되어 있는 덱스트란으로 겔 여과하는 단계; 및 (ⅵ)C8에서 역상 고성능 액체 그로마토그래피를 실시하는 단계로 이루어진 제1항 내지 제3항에 따른 다음의 N-터미널 시퀀스를 갖는폴리펩티드의 제조방법.