JP3101629B2 - プロテアーゼインヒビター - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、本発明者らがゲリン（Gelin）と呼称する
新規なプロテアーゼインヒビター及びこの新規な化合物
を含有する医薬組成物及び化粧品組成物に関する。

ゲリンは人間ならびに豚の白血球エラスターゼ及びキ
モトリプシンのインヒビターであり、固有の抗生物質特
性を有している。本発明はまた、別のキモトリプシンイ
ンヒビターであるエグリン（Eglin）の化粧品組成物へ
の新規な用途に関するものである。

肺気腫、関節炎、歯肉炎、歯周疾患や他の炎症性疾患
のようないくつかの疾患は酵素エラスターゼによる組織
破壊に起因して生じる。エラスターゼ類は、エラスチン
やコラーゲンのような繊維状蛋白質を可溶化することが
できる唯一のセリンプロテアーゼであり、主として膵臓
や好中球のアズール顆粒中に存在する。正常な生理条件
下では、エラスターゼ類の蛋白質分解活性は血漿ならび
に他の分泌液中に存在する過剰のインヒビターにより活
性が抑制されている。しかしながら疾病状態では、イン
ヒビターの局部的な不足により、平衡に異常を来し、結
果として多様な炎症性疾患の原因である組織破壊が生じ
る。

この状況を歯肉炎を例として詳述する。好中球の作用
の変調はその生体の異常や疾病、例えば糖尿病、ダウン
症候群、盾形魚鱗癬、リューマチ性関節炎、環状好中球
減少症、無顆粒球症、チェディアック東症候群等にしば
しば関連している（文献１、２）。多形核白血球（PM
N）由来中性プロテアーゼ及び／又は細菌性毒素は炎症
状態を生じることにより歯肉領域の支持組織を直接的又
は間接的に破壊する（文献３−７）。炎症を生じた歯肉
組織から得られる歯肉間隙液は加水分解酵素を高レベル
で含んでいる（文献８）。酸素遊離基は組織破壊活性と
ともに静菌作用を示し（文献９）、この組織破壊活性に
ついては詳述されている（文献４、５、10）。塩素化オ
キシダントは強力な殺菌活性を示し（文献11）、単純な
試験管内緩衝系においてのみ人体組織に毒性を示す（文
献12、13）。1917年にはすでに合成クロラミン類の使用
が傷口の洗浄剤として推奨されていた。最終的な酸化媒
体がHOClか、あるいはクロラミン誘導体であるかは今で
もなお未解決である（文献14）。PMN脱顆粒由来の加水
分解酵素であるリソゾーム酵素類は多様な組織構成物質
にとっては脅威と考えられ（文献４、６）一方、天然血
清プロテイナーゼーインヒビター（アルファ１プロテイ
ナーゼインヒビター及びアルファ２マグログロブリン）
はミエロペルオキシダーゼの酸化システムによって大半
は不活化される（文献４、15）。細菌由来の毒素類（低
分子量代謝産物類、糖蛋白質類、リポ多糖類及びプロテ
アーゼ類）は免疫細胞活性化と同時に生体組織及び細胞
の破壊を開始すると報告されている（文献８、16から1
8）。いくつかの微生物は人間の血清プロテイナーゼイ
ンヒビター類を不活化できる（文献19、20）。従ってエ
ラスターゼに対する有効なインヒビターはこのような疾
患と戦うための有用な治療手段となることがわかる。

ヒルの唾液腺は酵素エラスターゼに対する有効なイン
ヒビターを含有しているということが研究から判明して
いる。又、ヒル類の“ヒルド メディシナリス（Hirudo
medicinalis）”において、トロンビン インヒビター
であるヒルジン（hirudin）とは別に、酵素キモトリプ
シン及びエラスターゼに対するインヒビターも観察され
ている。これはエグリン（Eglin）と名付けられ、精製
され、詳細に特徴づけられている（文献21）。ゴールド
ステインら（Goldstein et al）（文献22）は北アメリ
カの３種のヒルにエグリンが存在することを報告してい
る。しかしながら、我々の知る限りでは、今までに研究
された他種のヒル由来のエラスターゼインヒビターは類
似の生化学的性質を有する。

本研究において、本発明者らはヒル種ヒルジナリア
マニレンシス（Hirudinaria manillensis）由来の抗ト
ロンビンを精製しているうちに、思いがけなく強力な抗
キモトリプシン及び抗エステラーゼ活性を有する新規な
インヒビターを単離した。これまで得られた結果による
と、このインヒビターはエグリンとは非常に異なってお
り、“ゲリン”と命名された。

ゲリンはヒル種ヒルジナリア マニレンシス由来の蛋
白質を精製する実験を行っているうちに発見された。こ
れらの蛋白質を精製しているうちに、キモトリプシン及
びエラスターゼに対する阻害活性がいくつかの画分で観
察され、これらの画分についてエグリン及びヒルジンと
の比較研究を行った。このヒル由来のエラスターゼ／キ
モトリプシンインヒビターは、本発明の一つの態様（及
び、それから誘導される対応DNA配列あるいはその対応D
NA配列から推定されうるアナログペプチド）を構成して
おり、既知のエラスターゼ／キモトリプシンインヒビタ
ーであるエグリンとは非同族である。エグリンについて
は薬効のあるヒルのヒルド メディシナリス（Hirudo m
edicinalis）に存在することが知られており、それにつ
いてはシーミュラー（Seemller et al）により詳述さ
れている（Eglin:“elastase−cathepsin G−inhibitor
from leeches".,1981:Meth.Enzymol.:80:804−816） 更に、ヒルジン（Dodt et al;FEBS 165,180−184）及
び他の既知の構造のものとの比較により、ゲリンの構造
はユニークかつエグリンの構造とは非常に異なるという
結論に至った。

本発明の一つの態様によるエラスターゼ／キモトリプ
シンインヒビターは典型的には溶媒抽出技術によりヒル
組織から単離され、あるいはヒルの分泌液（例えば唾
液）からも単離できる。

本発明の他の態様は、特に、口腔洗浄、歯磨ペースト
剤及びスキンクリームのような化粧品組成物へのエグリ
ンの新規な用途に関するものである。

精製 7kgのヒルジナリア マニレンシスを室温で96％エタ
ノール4,000mlを４回換えて脱水した。脱水された体部
を除去し、出発物質であるエタノール抽出物を濃HClでp
H3.5に調整した。得られた溶液を1,000rpmで10分間遠心
分離し、上清のpHを0.1M NaOHでpH7.0に再調整した。該
上清を蒸留水で50％に稀釈し、次に公称分画分子量10,0
00のフィルターを用いるミリポア ペリコン ウルトラ
フィルター システム（Millipore pellicon Ultrtafil
ter System）より800mlに濃縮した。

CM−セファロース（CM−Sepharose）によるクロマトグ
ラフィー 濃縮された産物を50mMの酢酸ナトリウムpH6.0で平衡
化したCMセファロースカラムに通した。カラムを通過し
た液（カラムに結合しなかった物質）は一つの大きな画
分として集められキモトリプシン及び抗エラスターゼ活
性を分析した。活性成分を含むカラム通過液は、分画分
子量10.000のフィルターを用いる限外濾過により400ml
に濃縮した。

DEAE−セファロース（DEAE−Sepharose）によるクロマ
トグラフィー 生成物を濾過し、濾液をpH5.5の20mMピペラジン−HC1
緩衝液で前もって平衡化したDEAE−セファロース高流速
カラムに通した。カラムを10ml/分の流速で展開し、溶
出液の吸光度、pH及び導電率を記録した。

水洗後、カラム結合物質は、平衡化に用いた緩衝液中
に食塩を0.1Mから0.4Mの範囲で段階的に濃度を変えた溶
解液で溶出し、各溶出液ピークを抗キモトリプシン及び
抗エラスターゼ活性を測定する目的で別々の画分として
採集した。活性ピークは蒸留水に対し一晩透析して脱塩
した。

Ｑ−セファロース（Ｑ−Sepharose）によるクロマトグ
ラフィー 部分的に精製された生成物を、前もって20mMトリス−
HCl緩衝液pH7.5の平衡化したＱ−セファロースを用いる
陰イオン交換クロマトグラフィーによって更に精製し
た。カラムを20ml/分の流速で展開し、結合物質を平衡
化に用いた緩衝液中で0Mから1Mの食塩を直線濃度勾配に
なるように加えた溶液で溶出した。溶出液の吸光度、エ
ラスターゼ阻害活性を記録した。活性画分をプールし分
画分子量10,000のフィルターを用いる限外濾過により濃
縮した。

スーパーデックス200（Superdex 200）によるクロマト
グラフィー 濃縮された物質を、50mMトリス−HClと0.1M NaClを含
む緩衝液pH7.5に平衡化したスーパーデックス200カラム
でゲル濾過を行なった。活性ピークをプールし、凍結乾
燥した。

高速液体クロマトグラフィー 部分的に精製された試料に水を加えて、0.1％TFAで平
衡化した逆相ミクロボアアクアポアC8カラム（revered
phase microbore Aquapore C8 column）に均等に分けた
試料を別々に通した。結合物質は0.09％TFAに60％CH₃CN
を０から40％の範囲で直線濃度勾配がつくようにした溶
液で10分以上溶出し、更に60％CH₃CNを40〜100％の範囲
で濃度勾配をつけた溶液で20分以上溶出した。各ピーク
を別々画分として採集し抗エラスターゼ活性を調べた
（図２）。活性ピークは凍結乾燥し後の研究の為に使用
した。

試料の純度を同様の条件下でHPLCを繰り返すこと、及
びＮ末端配列分析により評価した（ゲリン精製のスキー
ムＡを参照）。

生化学的研究 膵臓エラスターゼによって触媒される合成基質Ｎ−ス
クシニル（アラニン）_３−ｐ−ニトロアニリド（SAAA
P）からｐ−ニトロアニリン基の遊離の阻害を測定する
ことによってゲリンのエラスターゼ阻害活性を分光光度
法的に測定した。活性の阻害単位（IU）はpH8.3、25℃
で毎分１μモルSAAAPの加水分解を阻害するのに必要な
ゲリン量として定義した。

検定法は種々の異なる量のゲリンを既知量の膵臓エラ
スターゼと1M NaClを含むpH8.3の0.1Mトリス−HCl緩衝
液中で５分間25℃でインキュベートすることからなる。
色素性基質を添加して反応を開始させ、405nmの吸光度
を時間とともに測定する。ゲリンを除外したコントロー
ル反応を同一条件下で行った。分当りの吸光度変化およ
びモル吸光係数Ｅ＝10,5000M^-1cm^-1を用いてゲリンの活
性を計算できる。

蛋白質評価 精製されたゲリンの蛋白質濃度をローリー（Lowry）
法及びブラッドフォード（Bardford）法によって評価し
たところ、この２つの方法によって得られる値には大き
な差があることがわかった。ある特別なバッチについ
て、ローリー法では0.38mg/mlの値が得られたが、ブラ
ットフォード法によると検出限界（＜２μg/ml）以下で
あった。しかしながら、ローリー法で得られた値は１％
溶液に対するＥ＝10の値を用いて280nmにおける吸光度
から得られた値とよく一致している。ローリー法によっ
て評価された蛋白質の値を用いて、精製されたゲリンの
特異的な活性が約40〜80mIU/mgであることがわかった。

等電点 ゲリンの等電点（pI）を、ファルマシア ファスト
システム（Pharmacia Phast system）を使用して、pHが
３から９の範囲の等電点電気泳動ゲルを用いて製造者の
使用説明書に従って測定した。ゲリンをゲルの中央に供
した。同一条件下で使用される等電点電気泳動マーカー
はアミログルコシダーゼ（pI＝3.5）、トリプシンイン
ヒビター（pI＝4.6）、Ｂ−ラクトグロブリン（pI＝5.
1）、炭酸脱水酵素Ｉ及びII（pI＝5.9及び6.6）、ミオ
グロブブリン（pI＝6.7）、乳酸デヒドロゲナーゼ（pI
＝8.5）及びトリプシノーゲン（pI＝9.0）であった。フ
ォーカシング（focusing）後、ゲルを展開し、生じたバ
ンドは銀染色（図３）により可視化した。

ゲリンの等電点は、エグリンＣが6.45またエグリンＢ
が6.6という公開レポートと比較して、約4.6であること
がわかった。（この２つのエグリンは１つのアミノ酸が
異なり、エグリンＢのヒスチジンがエグリンＣではチロ
シンになっている。） 分子量 ゲリンの分子量はレムリ（Laemlli）（文献23）によ
る記載の通りSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
より測定された。16％と20％の同種ゲルにおいて、精製
されたゲリンは還元条件下で14.4キロダルトンの丁度下
部のバンドとして移動した（図４）。同一条件下で使用
される、分子量マーカーはフォスフォリラーゼＢ（94キ
ロダルトン）、ウシの血清アルブミン（67キロダルト
ン）、卵白アルブミン（43キロダルトン）、炭酸脱水酵
素（30キロダルトン）、トリプシンインヒビター（20キ
ロダルトン）及びラクトアルブミン（14.4キロダルト
ン）である。しかしながら、ゲリンが8M尿素の存在下で
SDS−PAGEによりスウォンクとムンクレス（Swank ＆ Mu
nkres）（文献24）の方法に従って分析された時、この
試料をクーマシーブルー染色により可視化するのは難し
いことがわかったが、銀染色すると、ゲリンは分子量が
約21から25キロダルトンに相当する移動性を有すること
のある示唆が得られた。スウォンクとムンクレスの方法
による低分子量蛋白質類およびペプチド類の分子量決定
に適した低分子試料“エレクトラン（Electran）”を図
４に示すように引用した。これら２つの方法による分子
量の差異は現在説明できない。（エグリンの分子量は8.
1キロダルトンである） 特異性 色素性基質を用いる分析方法により、ゲリンの阻害活
性と、エラスターゼ、カテプシン、キモトリプシン、ト
リプシン及びトロンビンのようなセリンプロテアーゼと
の比較を行った。各酵素について用いられた詳細な分析
条件を表１に示す。要約すると酵素の一定量を５分間、
37℃で適切な緩衝液中で異なる濃度のゲリンとインキュ
ベートした。まず、色素性基質を加えて反応を開始し、
405nmでの吸光度増加を追跡した。インヒビターを除い
たコントロール分析の初期速度を各酵素について100％
とした。得られたデータから、各酵素の活性を50％阻害
するのに必要なゲリンのモル濃度（IC⁵⁰）を計算した。
この結果、ゲリンはキモトリプシン、カテプシンＧ及び
エラスターゼに対して有効なインヒビターとなるが、ト
リプシンやトロンビンに対してはほとんど活性がないと
いうことがわかる。各酵素について計算されたIC⁵⁰値
は、キモトリプシン、カテプシンＧ、エラスターゼ及び
トリプシンの１モル当り、それぞれゲリン0.13、0.25、
0.32及び20.4モルであった。

アミノ酸組成 精製されたゲリンをガス状のアリスター（ARISTAR）H
Clで、減圧下110℃、24時間と48時間で加水分解した。
加水分解された混合物はアミノ クロム システム（Am
ino Chrome System）でアミノ酸組成を分析した。エグ
リンＣと比較して、遊離アミノ酸の定量分析を行うため
に8100ダルトンの分子量をゲリンに対して使用した。表
２に示す結果から、２つのインヒビターのアミノ酸組成
は全く違っていることがわかる。特に、ゲリンはエグリ
ンＣと比較して、アスパラギン酸（＋アスパラギン）及
びアラニンの量が非常に多く、ヒスチジンを含まず、イ
ソロイシンを含む。

円偏向二色性 抗エラスターゼの円偏光二色性スペクトルを、0.1％T
FA中の0.02cmセル長のセルを使用して得た。このスペク
トルをレク−エグリン（rec−eglin）（図８）を使用し
て得たスペクトルと比較した（図８）。レク−エグリン
はベーゼルのチバガイギー社（Ciba Geigy,Basel）から
の提供品である。このデータをコンティン（CONTIN）分
析法によって評価するとゲリンの三次構造はヘリックス
構造を持たず、58％はベータシートで42％が無秩序な構
造であり、これに比較してエグリンＣでは19％がヘリッ
クス構造であり、56％がベータシートであり25％が無秩
序な構造である。このように異なる二種のヒル由来のエ
ラスターゼインヒビターは著しく異なり、Ｎ末端アミノ
酸配列においても差異が見られる（以下参照）。

構造的研究 精製された抗エラスターゼのＮ末端アミノ酸配列を決
定し、この結果としてアミノ酸残基29番目までの一本鎖
配列を得た。配列中にシステイン残基の存在を確認する
ため、精製された試料をジチオスレイトールにて還元
し、そしてシステインを４−ビニルピリジンと反応させ
てピリジルエチルシステインへと誘導した。この誘導し
た試料のアミノ末端配列分析を繰り返し得られた結果を
表３に示す。この部分配列とエグリンについて公開され
ているデータを比べると、このインヒビターがその一次
構造において著しく異なることが認められる。

ゲリンの完全なＮ末端の配列を求めるため、精製され
た物質を前と同様に還元し、誘導体化した後、次の条件
下TPCK−トリプシン、TLCK−キモトリプシンあるいはV8
プロテアーゼにて消化する。

ゲリンをTPCK処理トリプシンにて、ゲリン：トリプシ
ンが50:1（wt/wt）の割合で消化した。反応は0.1mlの0.
05M重炭酸アンモニウム緩衝液（pH8.0）中にて37℃で４
時間行った。反応は反応液を凍結乾燥することで停止
し、トリプシンによるペプチドをHPLCにて分離した（図
５）。

TLCK処理キモトリプシンによる消化を上記と同様の条
件下実施した。生じたペプチド断片をHPLCにて分画した
（図６）。プロテアーゼV8での消化については、精製さ
れたゲリンを0.05M重炭酸アンモニウム緩衝液（pH7.9）
中にて５μｇの酵素と混合した。混合物を室温にて24時
間インキュベートした後生じた断片をHPLCにより分離し
た（図７）。

溶解性と安定性 等量のゲリンをシリカゲル共存減圧化にて脱水した。
各試料を次いで酢酸、エタノール、ブタノール、アセト
ン［以上全てアナラー（Analar）級試薬］のいずれか、
あるいは蒸留水に溶解させ、10分間室温にて撹拌する。
次いで各試料から溶媒を傾斜法にて新しい別の容器に入
れ、凍結乾燥する。色素を用いる分析によりゲリンの全
量を阻害単位（IU）にて決定した。

得られた結果からゲリンは上記条件下検討した全ての
溶媒中で安定であり、溶解性の順序は水＞酢酸＞エタノ
ール＞アセトン＞ブタノールであることが示される。

温度安定性 別の実験において、ゲリンは100℃の高温で30分まで
は安定であり、阻害活性の損失は無視できる程度である
ことが判明した。

検定の原理 ゲリンはヒルに由来する新規なプロテアーゼインヒビ
ターである。検定の原理は合成色素性基質Ｓ−2586に対
するα−キモトリプシン活性の阻害を測定することであ
る。α−キモトリプシン活性は基質の消化により遊離す
る着色性ｐ−ニトロアニリン基を405nmにおいて分光光
度的に追跡することで測定できる。ゲリンの存在に基づ
くα−キモトリプシン活性の低下が阻害活性に関連して
いる。

単位の定義 α−キモトリプシン活性（Ｕ）の１ユニットはpH8.
3、25℃にて基質Ｓ−2586を毎分1u moleの割合で加水分
解する。

阻害活性（IU）の１ユニットはpH8.3、25℃にて基質
Ｓ−2586を毎分1u moleの割合で、酵素触媒による加水
分解反応を低下させる。

物質試薬 供給メーカー α−キモトリプシン シグマ c2419 Ｓ−2586 カビ ヴィトラム 820894 氷酢酸 BDH 10001 食塩 シグマ S9625 トリス シグマ T1503 塩酸 BDH 10307 ゲリン 自家調製 装置 96‘U'ウエル マイクロ ミッドランド ラボラト
リーズ タイタープレート タイターテック フロー ラボラトリーズ ユニスカンII マイクロタイタープレート リーダー （405nmのフィルターを装着） 溶液の調製 1.検定用緩衝液 0.1Mトリス／塩酸pH8.3、1M食塩 2.キモトリプシン溶液 4ug/ml α−キモトリプシン水溶液 3.色素性基質 1.0mM S−2586水溶液 4.50％氷酢酸 氷酢酸を水と1:1に混合稀釈する 検定法 1.検定はマイクロタイタープレートのウェル中にて実施
する。

各ウェルには次のものが含まれる。

100ul 検定用緩衝液 50ul 被検プロテアーゼインヒビター 50ul キモトリプシン溶液 2.混合物を25℃にて５分間インキュベートする。

3.反応は25ulの色素性基質溶液（Ｓ−2856 1mM）を加え
ることで開始する。反応開始時間（ｔ）を記録し、反応
混合物を25℃にて５分間インキュベートする。この条件
下で基質濃度に制限はない。

4.反応は50％酢酸を25ul加えて停止される。

5.遊離したｐ−ニトロアニリンの吸光度をマイクロプレ
ートリーダー上で405nmにて測定する。

ノート 405nmに固有の吸收を示す試料に対しては対照ブラン
クを置き試料のみによる吸光度変化量を除外する必要が
ある。ブランクはＳ−2586の添加を除いて同一の検定条
件下に反応を行ったものを用いる必要がある。

検定法を標準化する目的で、阻害活性既知の自家調製
したゲリン標準品を被検試料と同一条件下で用いること
が必要である。

阻害活性の測定 1.被検試料の阻害活性は阻害活性度既知の自家調製ゲリ
ン標準品との直接比較により測定される。活性の定量化
は被検試料と標準品から得られる稀釈曲線のコンピュー
ターによる投与量割合分析（dose ratio analysis）に
より行う。

2.別に、被検試料の阻害活性は次式を用いて計算により
求められる Ａ＝Ecl Ａ＝吸光度 Ｅ＝モル吸光係数（M^-1cm^-1） ｃ＝産生物濃度（Ｍ） ｌ＝セル長（cm） 着色産生物のモル吸光係数は含量既知の基質とα−キモ
トリプシンとの反応が完了するまで（即ち色の変化が見
られなくなるまで）インキュベートすることで実験的に
求められる。

このＥ値は405nmの吸光度として10,500M^-1cm^-1と決定
された。

阻害条件及び非阻害条件下での毎分当り作られる産生
物の濃度の差を測定することで被検試料の阻害活性が求
められる。

検定の原理 ゲリンはヒルに由来する新規なプロテアーゼインヒビ
ターである。検定の原理は合成色素性基質SAAAPに対す
るエラスターゼ活性の阻害を測定することである。

エラスターゼ活性は基質の消化により遊離する着色性
ｐ−ニトロアニリン基を405nmにおいて分光光度的に追
跡することで測定できる。ゲリンの存在に基づくエラス
ターゼ活性の低下が阻害活性に関連している。

単位の定義 エラスターゼ活性（Ｕ）の１ユニットはpH8.3、25℃
にて基質SAAAPを毎分1u moleの割合で加水分解する。

阻害活性（IU）の１ユニットはpH8.3、25℃にて基質S
AAAPを毎分1u moleの割合で、酵素触媒による加水分解
反応を低下させる。

物質試薬 供給メーカー エラスターゼ シグマ E1250 SAAAP:N−サクシニル カルバイオケム 573459 −Ｌ−（アラニン）_３ −Ｐ−ニトロアニリド 氷酢酸 BDH 10001 食塩 シグマ S9625 トリス シグマ T1503 塩酸 BHD 10307
ゲリン 自家調製 装置 96‘U'ウエル マイクロ ミッドランド ラボラトリ
ーズ タイタープレート タイターテック フロー ラボラトリーズ ユニスカンII マイクロタイタープレート リーダー （405nmのフィルターを装着） 溶液の調製 1.検定用緩衝液 0.1Mトリス／塩酸pH8.3、1M食塩 2.エラスターゼ溶液 40ug/ml エラスターゼ水溶液 3.色素性基質 1.0mM SAAAP水溶液 4.50％氷酢酸 氷酢酸を水と1:1に混合稀釈する 検定法 1.検定はマイクロタイタープレートのウェル中にて実施
する。

各ウェルには次のものが含まれる。

100ul 検定用緩衝液 50ul 被検プロテアーゼインヒビター 50ul エラスターゼ溶液 2.混合物を25℃にて５分間インキュベートする。

3.反応は25ulの色素性基質溶液（SAAAP 1mM）を加える
ことで開始する。反応開始時間（ｔ）を記録し、反応混
合物を25℃にて30分間インキュベートする。この条件下
で基質濃度に制限はない。

4.反応は50％酢酸を25ul加えて停止される。

5.遊離したｐ−ニトロアニリンの吸光度をマイクロプレ
ートリーダー上で405nmにて測定する。

ノート 405nmに固有の吸收を示す試料に対しては対照ブラン
クを置き試料のみによる吸光度変化量を除外する必要が
ある。ブランクはSAAAPの添加を除いて同一の検定条件
下に反応を行ったものを用いる必要がある。

検定法を標準化する目的で、阻害活性既知の自家調製
したゲリン標準品を被検試料と同一条件下で用いること
が必要である。

阻害活性の測定 1.被検試料の阻害活性は阻害活性度既知の自家調製ゲリ
ン標準品との直接比較により測定される。活性の定量化
は被検試料と標準品から得られる稀釈曲線のコンピュー
ターによる投与量割合分析（dose ratio analysis）に
より行う。

2.別に、被検試料の阻害活性は次式を用いて計算により
求められる Ａ＝Ecl Ａ＝吸光度 Ｅ＝モル吸光係数（M^-1cm^-1） ｃ＝産生物濃度（Ｍ） ｌ＝セル長（cm） 着色産生物のモル吸光係数は含量既知の基質とエラスタ
ーゼとの反応が完了するまで（即ち色の変化が見られな
くなるまで）インキュベートすることで実験的に求めら
れる。

このＥ値は405nmの吸光度として10,500M^-1cm^-1と決定さ
れた。阻害条件及び非阻害条件下での毎分当り作られる
産生物の濃度の差を測定することで被検試料の阻害活性
が求められる。

検定の原理 ゲリンはヒルに由来する新規なプロテアーゼインヒビ
ターである。検定の原理は合成色素性基質Ｓ−2238に対
するトリプシン活性の阻害を測定することである。

トリプシン活性は基質の消化により遊離する着色性ｐ
−ニトロアニリン基を450nmにおいて分光光度的に追跡
することで測定できる。ゲリンの存在に基づくトリプシ
ン活性の低下が阻害活性に関連している。

単位の定義 トリプシン活性（Ｕ）の１ユニットはpH8.3、25℃に
て基質Ｓ−2283を毎分1u moleの割合で加水分解する。

阻害活性（IU）の１ユニットはpH8.3、25℃にて基質
Ｓ−2283を毎分1u moleの割合で、酵素触媒による加水
分解反応を低下させる。

物質試薬 供給メーカー トリプシン シグマ T8253 Ｓ−2238 カビ ヴィトラム 820324 氷酢酸 BDH 10001 食塩 シグマ S9625 トリス シグマ T1503 塩酸 BDH 10307 ゲリン 自家調製 装置 96‘U'ウエル ミッドランド ラボラトリーズ マイクロタイタープレート タイターテック フロー ラボラトリーズ ユニスカンII マイクロタイタープレート リーダー （405nmのフィルターを装着） 溶液の調製 1.検定用緩衝液 0.1Mトリス／塩酸pH8.3、1M食塩 2.エラスターゼ溶液 40ug/ml トリプシン水溶液 3.色素性基質 1.0mM S−2238水溶液 4.50％氷酢酸 氷酢酸を水と1:1に混合稀釈する 検定法 1.検定はマイクロタイタープレートのウェル中にて実施
する。

各ウェルには次のものが含まれる。

100ul 検定用緩衝液 50ul 被検プロテアーゼインヒビター 50ul トリプシン溶液 2.混合物を25℃にて５分間インキュベートする。

3.反応は25ulの色素性基質溶液（Ｓ−2238 1mM）を加え
ることで開始する。反応開始時間（ｔ）を記録し、反応
混合物を25℃にて５分間インキュベートする。この条件
下で基質濃度に制限はない。

4.反応は50％酢酸を25ul加えて停止される。

5.遊離したｐ−ニトロアニリンの吸光度をマイクロプレ
ートリーダー上で405nmにて測定する。

ノート 405nmに固有の吸收を示す試料に対しては対照ブラン
クを置き試料のみによる吸光度変化量を除外する必要が
ある。ブランクはＳ−2238の添加を除いて同一の検定条
件下に反応を行ったものを用いる必要がある。

検定法を標準化する目的で、阻害活性既知の自家調製
したゲリン標準品を被検試料と同一条件下で用いること
が必要である。

阻害活性の測定 1.被検試料の阻害活性は阻害活性度既知の自家調製ゲリ
ン標準品との直接比較により測定される。活性の定量化
は被検試料と標準品から得られる稀釈曲線のコンピュー
ターによる投与量割合分析（dose ratio analysis）に
より行う。

2.別に、被検試料の阻害活性は次式を用いて計算により
求められる Ａ＝Ecl Ａ＝吸光度 Ｅ＝モル吸光係数（M^-1cm^-1） ｃ＝産生物濃度（Ｍ） ｌ＝セル長（cm） 着色産生物のモル吸光係数は含量既知の基質とトリプシ
ンとの反応が完了するまで（即ち色の変化が見られなく
なるまで）インキュベートすることで実験的に求められ
る。

このＥ値は405nmの吸光度として10,500M^-1cm^-1と決定さ
れた。阻害条件及び非阻害条件下での毎分当り作られる
産生物の濃度の差を測定することで被検試料の阻害活性
が求められる。

歯肉炎に関する予備試験的な研究 本研究のために８名のボランティア患者を選別した。
選別の基準は：文献（ ）に記載の標準法に基づき
測定した場合、少くとも４本の歯に３〜5mmの深さの小
溝ポケットを有し、探針時出血し、開口した虫歯や著し
い歯周疾患はなく、他の健康状態は良好で、最近治療歴
のない目視で確認できる歯垢を蓄積している慢性歯肉炎
患者である。被検患者は年齢23〜46歳の男性と女性であ
った。

実験は通常の治療法として行われる歯肉下の灌注を４
本の被治療歯に６日間毎日行うことで実施した。各種測
定を基準日及び６日目に行った。被検患者には彼らの通
常の口腔清浄方法を変更しないよう注意を与えた。実施
した測定項目として:PI［シルネスとロー（SilnessとLo
e）（Acta.Odont.Scand.1964;22:121）に基づく歯垢指
数（Plaque Index）］とPBI［H.R.ムールマン（H.R.Mu
hlemann、:J.Prev.Dent.1977;4:6）に基づく乳頭出血指
数（Papillary Bleeding Index）］を採用した。全て
の被検患者は同様な治療を受け、負のコントロール患者
は置かず、６名には試験物質を、２名には偽薬を投与し
た。凍結乾燥した粉末状ゲリン20mgを8mlの標準溶液に
溶解した。この標準溶液は２重量％のカルボキシメチル
セルロースナトリウムを加え、ゲル化するまで撹拌した
等張水／グリセロール（60％:40％）の滅菌混合物であ
る。

次いでこのゲルを中空針を有する滅菌済マイクロ注射
器に入れ、各被検患者に投与した。

各歯肉下灌注はゲリンを含有する標準ゲル化溶液の0.
05mlを被検歯の周囲の各歯周ポケット内へ注入すること
で行った。

結果 基準日におけるゲリン投与群のPI:2.2±0.7 基準日におけるゲリン投与群のPBI:2.3±0.8 実験の終了時xPIは1.0±0.6へ、一方xPBIは0.6±0.3
へ減少した。

偽薬投与群のPBIは2.0±0.6、PBIは2.4±1.0であ
った。

実験の終了時の偽薬投与群のPIは1.7±0.7へ減少
し、PBIは1.9±0.6であった。

ゲリン投与群のPI低下率は基準日の値と比べて55％、
偽薬投与群と比べて42％であった。

ゲリン投与群のPBI低下率は基準日の値と比べて74
％、偽薬投与群と比べて65％であった。

考察： テスト結果に見られるように臨床上有意な著しいPBI
の低下はPMN由来中性プロテアーゼ（エラスターゼ、カ
テプシンＧ）を阻害することで歯肉基質を蛋白質分解す
ることを抑制するプロテアーゼ阻害機構を示唆する。重
要性は小さいが、有意な歯垢蓄積の低下は歓迎される
し、おどろくべきことである。この効果は支持組織の蛋
白質分解の阻害により歯垢における歯周疾患微生物の生
育に必要な栄養素量が減少するという事実に従うと考え
られる。

プラスミンに対する効果 ゲリンのプラスミン阻害活性の測定実験を実施した。
プラスミン活性は色素性基質Ｓ−2288（Ｈ−DlIle−Pro
−Arg−pNA）の消化によるｐ−ニトロアニリドの放出を
測定することで行った。プラスミン（50μl,40μg/ml）
を種々の濃度のゲリン（50μl,10μg/ml,5μg/ml,2.5μ
g/mlと1.25μg/ml）とインキュベートした。結果として
は、最高濃度のゲリン（10μg/ml）でもプラスミンの阻
害は起こらないことが示されている。

ペプシンに対する効果 酸性プロテアーゼ ペプシンに対するゲリンの阻害活
性の測定実験を実施した。ペプシン活性はpH2.0でのヘ
モグロビンの蛋白質分解を測定することで行った。ペプ
シン（25μl,8mg/ml脱ミネラル水）を60分、37℃にてゲ
リンインヒビターの存在または非存在下ヘモグロビン基
質（100μl,10mg/ml 20％酢酸,pH2.0）とインキュベー
トした。未消化のヘモグロビンをトリクロロ酢酸（100
μl,10％w/v）にて沈殿化し、上清の加水分解された蛋
白質を280nmにて測定した。結果からゲリンの最高濃度
（75μg/ml）においてさえペプシンの阻害は起こってい
ない。加えて、予備的な実験からゲリンはペプシンによ
り分解されないことが示唆されている。

ゲリンの分泌源（１） ヒル種ヒルジナリア マニレンシスを注意して３つ：
頭部、体部と消化管内層部、に切断する。各部を蒸留水
にて良く洗浄し、不純物（例えば血液）を除去する。各
部をエタノールで脱水し、抽出液をエラスターゼ阻害活
性測定に供する。大半の活性（75％以上）は体部からの
抽出液に存在した。

ゲリンの分泌源（２） 個々のヒルを８％エタノールに浸漬することで粘液を
分泌せしめた。粘液を集め、５回蒸留水で抽出した。抽
出物を合わせ標準検定法を用いて阻害活性を測定した。
予備的な検討の結果、阻害活性は粘液抽出物に存在する
ことが示されている。粘液分泌物に存在する全ゲリン活
性はゲリンの部分的精製のためにスキームで集めたエタ
ノール抽出物について測定した値よりも小さい。

長期インキュベーション ゲリンを等量ずつ、室温での長期間の安定性（即ちシ
ェルフライフ）を求めるため種々の口腔洗浄液や歯磨ペ
ーストゲル剤に加えインキュベートした。100日間にわ
たる温度の変動は17℃〜36℃の間であった。

キモトリプシンに対するゲリンの阻害活性は全てのテ
ストした口腔洗浄液やゲル剤中で保持された。スキーム
Ｂに0.5gのゲリン（10μg/mlの50μｌ）の存在及び非存
在下におけるゲル剤と口腔洗浄液についての典型的な経
時プロフィルを示す。

酸化に対する安定性 ゲリンの酸化安定性を求めるための２種の実験を実施
した。

実験１ ゲリン（50μl,10μg/ml脱イオン水）を過酸化水素
（30％,50μｌ脱イオン水）とラクトペルオキシダーゼ
（50μl, １μg/ml 50μＭ酢酸ナトリウム溶液、pH6.
0）とともに１時間、37℃でインキュベートした。等量
の検液（50μｌ）を採取し、キモトリプシンに対する阻
害活性を測定した。

結果を次表に示す。

結果： 結論 上記条件下ではゲリンは酸化に対して安定であり阻害
活性を保持する。

実験２ ゲリンまたはエグリン（50μl,10μg/ml脱イオン水）
を過酸化水素（30％,50μｌ脱イオン水）とともに５分
間37℃にてインキュベートする。等量の検液（50μｌ）
を採取し、キモトリプシンに対する阻害活性を測定し
た。

結果を次表に示す。

結果： 結論 記載した条件下、エグリンの阻害活性は影響されな
い。ゲリンに対しては阻害活性は最小限度（８％に相
当）にて影響されていると考えられる（チューブ１と２
を比較せよ）。

抗菌活性に対する予備的実験 アエロモナス ハイドロフィラ（Aeromonas hydroph
ila）の分離物をエサを充分食べたヒルから回収した。
プロテアーゼプロフィルを次に同定することで、回収物
がショッツらにより記載されている検定法［Shotts et
al,1985年、（25）］にてエラスターゼ陽性であるこ
とが判明した。容器内のゲリン1mgを1mlにもどし、次い
で10^-1〜10^-6の範囲で希釈した。A.ハイドロフィラの選
定した培養物を前記した検定培地に接種して「場所（la
wn）」を作る。「ペニシリン」用検定シリンダーをプレ
ートの中央に置く。希釈したゲリンの10分の1ml（0.1m
l）をそれぞれのシリンダー中に入れ、プレートを25℃
にて10日間インキュベートする。実験結果からゲリンの
拡散ゾーン内ではエラスターゼ活性は阻害されており、
エラスターゼ活性の見られるゾーンはわずかであること
がわかる。このことは未希釈、10^-1、10^-2、10^-3希釈の
もので起こることが判明した。

10^-1、10^-2、10^-3の上記希釈の結果から抗エラスター
ゼ阻害単位（IU）はそれぞれ2IU,0.2IU,及び0.2IUと計
算される。ゲリン活性図を参照。

組成物の例 ゲリンを添加した次の歯磨ペーストを調製した。

例1:リン酸二カルシウムをベースとする活性歯磨ペース
トの組成 グリセロール 86％ 20 g ソルビトール 70％ 10 g Na−CMC 2 g 脱イオン水 27.5g リン酸二カルシウム 35 g ドデシル硫酸ナトリウム 2 g サッカリンナトリウム .2g モノフルオロリン酸ナトリウム .2g 安息香酸メチルエステル .1g 安息香酸プロピルエステル .2g フレーバー 1.1g ゲリン溶液 1.8g 100 g 歯磨ペーストの調製中、ゲリン溶液はフレーバーを除く
他の全ての添加剤を混合した後に加えるのが好ましく、
フレーバーはその後に加える。

例2:シリカをベースとする活性歯磨ペーストの組成 シリカ、研磨用 8 g シリカ、増粘用 10 g ソルビトール 70％ 68 g フッ化ナトリウム .2g ラウリル硫酸ナトリウム 1 g CMC .4g ポリエチレングリコール 4 g ゲリン溶液 1.7g 保存剤、フレーバー 微量 水 100％にする量 口腔洗浄剤の例 エチルアルコール 4 g フレーバー 2 g ゲリン溶液 2.5g 脱イオン水 100％にする量 灌注溶液の例 エチルアルコール 5g ゲリン溶液 3g 陰イオン界面活性剤 1g 新たに煮沸した水 100％にする量 ここに述べた用途例の溶液は凍結乾燥した乾燥ゲリンを
pH5〜8.5の緩衝水溶液中に溶解することで得られる。0.
1重量％の量のｐ−安息香酸メチルエステル又はプロピ
ルエステルは保存用として添加することができる。

溶液中のゲリン濃度は10mlの溶液当り0.2〜5mgの間で
あり、好ましくは10mlの溶液当り0.2〜2mgの間である。

ゲリンを含有する水溶液の形の医薬組成物の例 1.ゲリンをpH5〜8.5の緩衝水溶液に溶解し、0.5mg/10ml
の濃度にする。

2.0.1重量％のｐパラ−ヒドロキシ安息香酸メチルエス
テルを加える。

この組成物は限外濾過法による減菌を行った後に、 a.静脈注射； b.吸入噴霧 に用いることができる。

ゲリンを含有する油脂性軟膏としての医薬組成物の例 1.ゲリンを適切な油脂性剤に懸濁し、 2.グリセロールモノステアレートのような界面活性剤を
加え、 3.0.1重量％パラ−ヒドロキシ安息香酸メチルエステル
を加える。

医薬組成物の両方の例は基本組成物の安定化用として
更に他の添加剤を加えることができる。

化粧品組成物及び他の歯磨ペーストへのエグリンの利用 口腔用組成物と同じく両方の歯磨ペースト組成物に対
して述べた例はゲリンをエグリンで代替しても同様であ
る。

化粧品クリームへのエグリンの化粧品的な応用は、ゲ
リンをエグリンへ置き換えれば医薬組成物の調製の記述
と同様である。更にエグリンは現行法規のもと化粧品用
途に特別に利用される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｐ 31/00 Ｃ１２Ｎ 9/99 // Ｃ１２Ｎ 9/99 Ａ６１Ｋ 37/64 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 ソイヤー ロイ トーマス 英国、エスエー19 ６ティーアール、エ ヌアール．リァンディロ、ダイフド、ト ラップ、ゴーウェリオン (72)発明者 フォン シィカード ニイルズ 英国、ウェールズ、スウォンシー、マエ ス イパーク フォレスタール、17 (72)発明者 ヴェーマン ゲラルド オランダ国、2985 エーアール リダー カーク カークベーク 217 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】等電点が約4.6であり、分子量が約21〜25k
   D（8M尿素の存在下でのSDS−PAGEにより測定）であり、
   プロテアーゼインヒビターの生物学的活性を有する、次
   式： （ただし、Xaaは任意のアミノ酸残基を表す）で表わさ
   れるＮ末端配列を含むポリペプチド。
2. 【請求項２】約4.6の等電点を有し、100℃で30分間のイ
   ンキュベーションの後でも抗エラスターゼ活性を実質的
   に保持している請求項１記載のポリペプチド。
3. 【請求項３】生物学的に有効量の請求項１又は２記載の
   ポリペプチドを薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦
   形剤とともに含む、増大したエラスターゼ活性によって
   ひきおこされる疾患の治療用医薬組成物。
4. 【請求項４】生物学的に有効量の請求項１又は２記載の
   ポリペプチドを薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦
   形剤とともに含む、細菌疾患、歯周疾患及び歯肉炎の治
   療用医薬組成物。
5. 【請求項５】請求項１又は２記載のポリペプチドを化粧
   品として許容される担体、希釈剤又は賦形剤とともに含
   む化粧品組成物。
6. 【請求項６】請求項１又は２記載のポリペプチドの製造
   方法であって、以下の工程からなる方法： （イ）ヒル種ヒルジナリア マニレンシス（Hirudinari
   a manillensis）の組織又は分泌物を有機溶媒で抽出
   し、次いで酸析及び限外濾過を行う； （ロ）アガロース吸着剤に結合したカルボキシメチル残
   基でカチオン交換クロマトグラフィーを行い、次いで限
   外濾過を行う； （ハ）セルロース吸着剤に結合したDEAEセルロースでア
   ニオン交換クロマトグラフィーを行う； （ニ）アガロース吸着剤に結合した四級アンモニウム残
   基でアニオン交換クロマトグラフィーを行い、次いで限
   外濾過を行う； （ホ）アガロース吸着剤に結合したデキストランでゲル
   濾過を行う；そして必要に応じて （ヘ）C8カラムで逆相高速液体クロマトグラフィーを行
   う。
7. 【請求項７】等電点が約4.6であり、分子量が約21〜25k
   D（8M尿素の存在下でのSDS−PAGEにより測定）又は約14
   kD（還元条件下でのSDS−PAGEにより測定）であり、プ
   ロテアーゼインヒビターの生物学的活性を有する、次
   式： （ただし、Xaaは任意のアミノ酸残基を表す）で表わさ
   れるＮ末端配列を含むポリペプチド。