JPH02218695A

JPH02218695A - 新規イソヒルジン類

Info

Publication number: JPH02218695A
Application number: JP1271932A
Authority: JP
Inventors: Dominique Tripier; ドミニク・トリピーア; Peter Crause; ペーター・クラウゼ; Paul Habermann; パウル・ハーバーマン; Martin Kramer; マルテイン・クラーマー; Joachim Engels; ヨーアヒム・エルゲルス; Matthias Scharf; マテイーアス・シヤルフ
Original assignee: Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1988-10-21
Filing date: 1989-10-20
Publication date: 1990-08-31
Anticipated expiration: 2013-12-09
Also published as: US5322926A; DK522689D0; DK522689A; JP2833798B2; GR3015491T3; EP0364942A2; PT92043B; EP0364942A3; DE3835815A1; ES2068870T3; ATE118789T1; DE58909027D1; PT92043A; IE67041B1; IE893399L; DK175408B1; EP0364942B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明はタンツク録における変異（Ｗｕｔａｔｉｏｎ）
のゆえにこれ迄知られているヒルジンとけ異なる新規な
、ヒルジン類からのトロンビン阻害剤に関する。

ヒルジンは例えばヨーロッパ特許出願（ＥＰ　−Ａ　）
１４２．８６０　：（ＩＰ−Ａ）１５ａ５６４　：（Ｅ
Ｐ−Ａ）１５ａ９８Ｓ　：（ＥＰ−Ａ）１６ａ３４２　
：　（ＢＰ−Ａ）１７ｔ０２４　：　（ＥＰ−Ａ）１９
４１７５　：（ＢＰ−Ａ）２００，６５５　：　（ＥＰ
−Ａ）　２０９，０６１　：　（ＥＰ−Ａ）２２ス９３
８；Ｃｈａｎｇ、ＦＥＢＩ３．Ｖｏｌ、　１６４（１９
８３）３０７：Ｊ、Ｄｏｄｔ他、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ
、　Ｈｏｐｐｅ−８ｅｙｌｅｒ　３６７（１９８６）８
０３〜８１１およびり、　Ｔｒｉｐｌｅｒ、　Ｆｏｌｉ
ａ　＆ｅｒＢａｔｏ１．　Ｌｅｉｐｚｉｇ　１　’Ｉ　
５（１９８８）１〜２，３０〜３５から知られている。

しかしながら、これらヒルジン類は活性中心を介してま
たはトロンビンへの結合に関与しているアミノ酸を介し
て担体に部分的だ結合されうる。

さらに、知られたヒルジン類＃ｉ舒皮的性質が限られて
おり、排除速度が高いゆえに非常に寿命が短かいので定
常的なオたに外来での血栓症の予防が困難となる。

それゆえ比活性が高く、安定性が高くかつ良好な導力学
的性質を有するヒルジン類を見出すとい５ＬｉＡ題があ
った。さらに、これらヒルシン類は物体上への固定化に
際［５て化学的取扱い性がより良好でなければならない
。

この課題は本発明による式（Ａ）Ｓｅｒ−Ｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｍ−Ａｓｎ−Ｎ−Ｃｙｓ
−Ｖａｌ−Ｔｈｒ　−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（Ｒ）−Ｌｅｕ−
Ｇｌｎ　　　　　　　　　　　　（Ａ）を有するインヒ
ルジン類、およびそれらが生成されうる場合はそれらの
変異体および生理学的に受容され５る塩により達成され
た。ここで上式（Ａ）中、ＡはＶａｌまたはＩｌｅであ
り、ＢはＶａｌまたはＴｈｒであり、ＣはＧｌｎ　ｊた
は（）ｌｕであ夛、Ｅ　１６　Ａｓｎ　ｉたはＡｓｐで
あり、ＦはＧｌｕ　”！たＦｉＧｌｎであり、ＧはＡｓ
ｐ　ｔ　ｆ？−はＧｌｙであり、工はＡ８ｐまｆｃｔｊ
Ａａｎであり、ＪはＧｌｎ　、　（）ｌｕ　。

ＡｓｎまたはＬｙｓであり、Ｋは工１ｅ　ｔたはＬｙｓ
であり、Ｌ　ｔｒｉ　ＡｓｐまたはＡＳｎであり、Ｍ　
ＦｉＬｙｓま；ｔＦｉＧｌｕであり、Ｎは（）ｉｎ　１
７ｔはＧｌｕそしてＲは水素または８０ｓＨを表わすも
のとする、但し、ＪがＧｉｎである場合はＬ　ｔｄ　Ａ
ｓｐではないものとする。

下記イソヒルジン類が特に好ましい。ここでＲｔｌ水素
または８０５Ｈを表わす。

Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｔ
ｈｒ−Ｇｌｕ−８ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｌｅ
ｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−８ｏｒ
−Ａａｎ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−
Ａｓｎ−Ｌｙｓ−ＶａＬ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａ
ｓｐ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−（）ｌｕ−８ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇ
ｌｎＬｅｕ−ＧｌｎＶａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｔ
ｈｒ−Ｇｌｕ−８ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｌｅ
ｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａａｎ
−Ｇｌｎ−ＣｙＩｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ
−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−’Ｉ”ｙｒ−Ｔｈ
ｒ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃ）ｌｕ−８ｅｒ−Ｇｌ
ｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ
−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−
Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−８ｅｒ−ＡｓｒＪ−
Ｇｉｎ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇ
ｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｉｍｘｘｅ−’ｒｈｒ−’ｒｙｒ−’ｒｈｒ−Ａｓｐ−ｃｙ
ｓ−’ｒｈｒ−ｏ１ｕ−ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｓ
ｐ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ
−Ａａｎ−Ｇｌｎ−Ｃｙａ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔ
ｈｒ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−８ｅｒ−Ｇｌ
ｙ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ
−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−
Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−８ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇ
ＩＩＩＶａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｔ
ｈｒ−Ｇｌｕ−８ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｌｅ
ｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−（）ｌｎ−Ａｓｐ−８ｏ
ｒ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ
−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−
８ｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇ
ｌｎ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌ
ｙ−Ｔｈｒ−（Ｉｌｌｂ）Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｔ
ｈｒ−Ｇｌｕ−Ｒｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｌｅ
ｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−（）ｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｓ
ｎ−（）ｌｎ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−（）ｌｙ−Ｇ
ｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ本発明けさらに、抽出法、沈澱法およびクロドグラフイー法の組み合せによシヒルからインヒルジンを単離および精製し、所望の場合は場合に工り存在するフェノールエステル基Ｂを加水分解
により除去してフェノール性ヒドロキシル基を生成させ。

そして得られるポリペブチドを場合によシその生理学的に受容されうる塩に変換することからなる、イソヒルジンの製法にも関す
る。

イソヒルジン類ＦｉＦ、　Ｍａｒｋｗａｒｄｔ　ＫよＪ
）　Ｂｉｏｍｅｄ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ａｃｔａ　４４（１９８５）１００
７〜１０１３またはＥＰ−Ａ　１５ａ９８Ｓ　オヨびＥ
Ｐ−Ａ　２０９，０６１　Ｋ記載されるようにして初め
に抽出しセして次に粗製イソヒルジン類を沈澱させるの
が好ましい。以後の単離お工び精製は例えばＰ、　Ｗａ
ｌｓｍａｎｎによＦ）　Ｐｈａｒ−ｍａｚｉｅ　３６（
１９８１）８６０〜８６１に記載されるよ５にしてクロ
マトグラフィー法の組み合せにより行われる。しかしな
がら、下記クロマトグラフィー法の組み合せが用いらｈ
るのが好ましい。

イオン交換クロマトグラフィー→グル透過りａマドグラ
フィー→アフイニテイクロマトグラフイー→ゲル透過り
ロマトグラフィー→イオン交換りロマトグラフィー→ミ
クロ？アＲＰ　ＥＰＬＣそれぞれのクロマトグラフィー
法は一般に知られてｂる。

本発明による方法は内径１１’ｌのカラムが用いらする
最終的なミクロがアＲＰ−ＨＰＬＣを含む種々のクロマ
トグラフィー法の組み合せが％徴である。プレートの高
さがより小さくかつカラム中の拡散がより低いので、慣
用の４．６ｍカラムにおけるよりもこの場合には分離が
より高くなる（　Ｒ，Ｐ、Ｗ、　５ｃｏｔｔ、　Ｊ、Ｃ
ｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ　５ｃｉｅｎｃｅ　２３
（１９８６）２３３〜２３７　：　　Ｒ，Ｇ１ユｌ、Ｊ
、ｃｈｒｏｎｎｔｊ）ｇｒａｐｈｙ　１６（１９８６）
２８１　）。

ここで用いられるミクロボアＲＰ−ＨＰＬＣユニットは
４２１ａ制御器で制御される２個のＢｅｃｋｍａｎ１１
４Ｍ溶媒供給モジュールからなる。各ポンプ−不動態化
されたΔインチ■８スチールチューブ製−への緩衝液管
路はＴ−接手管を介して動的なミクログラジェントミキ
サーに連結されており、このミキサーが緩衝溶液をホモ
ジナイズし、生ずる脈動は系統内に組み込まれた脈動メ
ンバー（Ｗａｔｅｒｓ　ｐａｒｔ　４９８０６０　）　
忙より吸収されそして緩衝溶液がサンプルアプリケータ
ー（Ｇ１１ｓｏｎ　Ａｂｉｍｅｄ　２５１　Ｆｉｚ、希
釈器４０１型）のレオダイン（Ｒｅｏｄｙｎｅ　）バル
ブを経てミクロデアカラムに導入される。アクアボア（
Ａｑｕａｐｏｒｅ　）　ＲＰ−３００（細孔寸法３００
Ｘ）７μｍ球状シリカを充填したミクロデアカラム（Ａ
ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　。

カタログ１６４００４２２Ｒｐ　）を炉（ＳｙｋａｍＳ
４１１０゜４０℃）中に置く。検出は買検出器で２０５
ｎｍで行５　（０，０８ＡＵＦＳを偏えそれに調整され
たＳｙｋａｍ　Ｓ　３３００　）。補償式レコーダー（
１０ｍＶ　ＦＳ）により記録をとり、積分Ｆｉφ変換（
Ｅ（Ｐ　１　Ｂ６２５Ａ／Ｄ変換器）後にＬＡＳシステ
ム（Ｈｅｗｌｅｔｔ　Ｐａｃｋａｒｄ）を用いて行う。

直線状グラジェント操作を最適化する。

下記混合物ＡおよびＢが酸価剤とし、て用いられる：Ａ：水９０重量畳、アセトニトリル（ｐ−ｃｃＮ）　＋
　０．１容量唾のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）　１０重
量幅。

Ｂ二ＡｃＣＮ　９０重量幅、水＋０．１重量％のＴＦＡ
　ｊ　Ｏ重量繋。

この場合、種々の分離および精製工程に対し５ｓの異な
るグラジェントが用いられる。

ａ）分析および分取操作におけるインヒルシンの相互の
分離に：ＢＯｑｌＩ〜Ｂ、１１０壬（グラジェント　Ｅ　ｏ、　
０６　ｇ、分）ｂ）再クロマトグラフィーおよび最終的
な精製に：ＢＯＩ　〜Ｂ３５％（グラジェント　Ｂ　０．４１７分
）Ｃ）ペプチド分離に：ＢＯ壬〜Ｂ３０優（グラジェント　Ｂ１，７憾／分）ク
ロマトグラフィーは流速毎分８０μｔおよび手動による
分別によシ実施される。

知られた単離法および精製法に加えて本発明に従いミク
ロがアＲＰ−ＨＰＬＣを用いることによってのみ新規ペ
プチＰをさらに分離することができる。しかしながら、
仰々の成分のアフィニテイが大きすぎるゆえＫここでも
また分離が不完全なままであるような不運な事例もある
。これは例えばイソヒルジン■およびｎ’：ｍａおよび
ｍａ’：［１ｂおよびｌｌ１ｂ′の場合がそうである。

／けこれら変異体が見出されたことを意味する、すなわ
ち関連するタンノック質の配列分析中に付加的に整理配
列されたものであることを意味する。すなわち例えば、
イソヒルジン■′はインヒルジン■の分析において分解
段階２０で見出された。

本出願に記載される新規なイソヒルジン類はトロンビン
−セファロースカラムでのアフイニテイクロマトグラフ
イーな含む文献上知られた方法によシ精製される。得ら
れるインヒルジン混合物を次にミクロボアＲＰ−ＨＰＬ
Ｃを用いてその構成分に分離する。分離困難な場合、単
離したフラクションをわずかに条件を変えて再クロマト
グラフィーする。新規なイソヒルノンそれぞれを均質と
なるまでまたは事実上均質となるまで精製しそして、あ
る場合にはアミノ酸配列が配列分析によシ決定さｈるの
みならす、新規な配列を調べるために付加的なタンパク
化学的方法例えば特別な化学的開裂を用いてその配列を
完全に解明する。

アミノ酸はＢｅｃｋｍａｎｎ　６３０　［］アミノ酸ア
ナライザーを用い、製造者の指示に従って分析する。

これを行うには、タンパク質（３０〜５０ｐモル）を予
め４Ｘ４０＋＋＋ｍ石英試験管中で乾燥しそして次に窒
素雰囲気の下ＨＣｌ７’ｏ、ａ　％フェノール共沸を用
いて気相中１１０℃で加水分解した。各パッチに関し、
インシュリン標準物５００ｐモルを同時に分析する。そ
れらの結果なＬＡＳシステム（Ｈｅｗｌｅｔｔ　Ｐａｃ
ｋａｒｄ　）を用いて積分する。

Ｎ−末端アミノ酸配列は天然のタンパクについて自動化
された配列分析によシ決定する。これはデータ分析シス
テムを備えた１２０ＡＰＴＨアナライザーとオンライン
連結した４　７７　Ａ　Ｐｕ１ｓｅｄＬｉｑｕｉｄ−Ｐ
ｈａｓｅ（′ｒ”タンパク質シークエンサー（Ａｐｐｌ
ｉｅｄＢｉｏＳＹＳ　ｔｅｍｓ製）を用いて製造者の指
示に従い行う。

ある場合には、すなわちインヒルジン■、■、ｎｂ、ｍ
およびｌｅａに関しては、プロテアーゼ特異的なペプチ
Ｐ開裂が付加的に実施される。これを行うには、個々の
タンパク質の「ジスルフィッド橋」を初めに過蟻酸を用
いて酸化するとそれによシシスチンがシスティンに変換
される。

この酸化によシタンパク質がその空間的配置を失いそし
て厳密に限定できる配置を有しないアミノ酸のポリマー
〔節〕を形成する。酸化後反応混合物を凍結乾燥し、得
られるタンパク質を適当な緩衝液中トリプシンを用いて
開裂させ、ペプチド混合物をミクロデアＲＰ−ＨＰＬＣ
を用いてそれぞれの構成分に分離しそして分取操作によ
り単離する。次にこれらペプチドのアミノ酸分析によシ
主な配列を決定する。塩基性アミノ酸すなわちＡｒｇま
たはＬｙｓの後を開裂させるセリンプロテアーゼ好まし
くはトリプシンを用いて特異的な開裂を行う。

式Ａを有する新規イソヒルジン類ＦｉＥＰ−Ａ−１７１
，０２４号記載の方法と同様にして製造することもでき
る。

本発明によるイソヒルジン類は特異的なトロンビン阻害
剤である。本発明による阻害剤によるトロンビンの定量
的阻害によりトロンビン阻害剤／トロンビン複合体が事
実上解離しないままであることが示される。

本発明によるインヒルジンの活性従って純度は以下に記
載されるトロンビン阻害試験を用いて後処理期間中およ
び精製期間中に測定されうる。この場合かくして精製さ
れた一般成因を有するイソヒルジンはトロンビン阻害１
２〜１６ＡＴ−υ／μｇ（アンチトロンビン単位／μｇ
）を有する。

活性測定のためのトロンビン阻害試紗試験Ｆｉ９６−ウェルマイクロタイタープレート中合計
容量２００μｌで室温で行う。トロンビン（ウシトロン
ビン５０　ＮＩＨ−Ｕ／Ｗ　（Ｍｅｒｃｋ　、　Ｉｔｅ
ｎ４１２３７４）原液：２０ｍＭＭＥＳｐ）ｉ６．０．
１５４ｍＭＮａＣ１，０，２％　ＰＥＧ　６０００．１
１ＢｓＡ中４０　ＮＩＨ−Ｕ、４４）をイソヒルジン１
〜５０μｔと最終容量１００μｔテフレインキユペーシ
ヨンしたのち基質を添加することにより反応を開始させ
る。試験の測定領域中のα０３〜０．１Ｓ　ＡＴ−Ｕに
活性があるので。

測定すべき検体はそれに相当して試験緩衝液で希釈する
必要がある。マイクロタイターウェル１個所当り必要量
の試験緩衝液（５０ｍＭ）！７ス／ＨＣ１％ｐＨ８：　
１５４ｍＭＮａＣｔ：０．２１ポリエチレングリ；−ル
（５０００）を初めに導入する。次に４　ＮＩＨ−Ｕ〜
のトロンビン溶液（前出）各５０μｔずつおよび検体を
加える。１０分間インキュベーションしたのち、ｌ　ｍ
Ｍ　Ｃｈｒｏｍｏｚｙｍ　ＴＨ（Ｂｏｅｈｒｉｎ−ｇｅ
ｒ　＊　ＩｔｅｍＡ　２０６８４９　：　１０　ｍＭ、
　ｗａｔｅｒ／ＨＣｔｐＨ６中：操作溶液：試験緩衝液
で希釈して１ｍＭ）１００μｔの添加にニジ反応を開始
させる。残留するトロンビンを色原体基質と５〜１０分
間インキュベーションしたのち放出されたニトロアニリ
ンを４０５　ｎｍで測光測定する。マイクロタイタープ
レートのウェルな速やかに読みとるのに＠ＥＬ　Ｉ８Ａ
読みとシ器（シｍｙ　Ｒｅａｄｅｒ　ＥＡＲ４００（Ｓ
ＬＴ　Ｌａｂｉｎ−８ｔｒｕｍ８Ｄｔ８　、　Ａｕ５ｔ
ｒｉａ　）が利用できる場合は反応停止剤は必要ない。

アンチトロンビン単位の絶対的測定は限定されたトロン
ビン活性量を使用することＫより可能であるので、ヒル
ジン標準物は原則的には不必要である。ただし操作溶液
を徐々に不活性化させるとそのシステムに誤差を生じ、
この誤差は測定され比値を所定のヒルジン標準物に関連
づけることにより排除できる。そこでこの試験はトロン
ビンの絶対濃度とは無関係となり、再現性のある測定が
できる。

下記対照が用いられる。

ａ）ブランクトロンビン溶液を緩衝液により置換する（光度計ゼロ補
正）。

ｂ）　　）ロンビン値マイクロタイタープレートのウェルをインヒビターなし
で放置。

Ｃ）ヒルジン８ｉｓ物既知ヒルジン標準物（［アフイニテイクロマトグラツイ
ーにより精製さハたＪ　Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍヒルジン
、比活性：　１０ＡＴ−Ｕ／μｇ、濃度：　０．ＩＡＴ
−Ｕ１５０μｔ）の０．０７〜０．ＩＡＴ−Ｕをマイク
ロタイタープレートのウェル１組に加える。検体の濃度
を検べるには、１〜２０μｇのインヒルジンに関する検
量曲線をミクロポアＨＰＬＣで測定した。

第１表はミクロポアＨＰＬＣで測定された濃度値をトロ
ンビン阻害試験で得られたものと比較したものである。

第　　１表Ｉａ　　　　　　　　５６　　　　　５９　　　　　１
４Ｉｂ　　　　　　　　３４　　　　　３８　　　　　
１６１１ａ　　　　　　　　６９　　　　　７２　　　
　　１５ＩＩ　　　　　　　　１２０　　　　１４０　
　　　　１６１１ｂ　　　　　　　１３７　　　　１４
５　　　　　１６ｍａ　　　　　　　　８４　　　　　
８７　　　　　１２１［１ｂ　　　　　　　　　９７　
　　　１０９　　　　　１４それゆえ本発明はまた式（
Ａ）を有するインヒルジン類の血栓塞栓症の進行の予防
および治療における血液凝固阻害剤としての使用、なら
びに診断剤および試薬としてのそれらの使用にも胸する
。加えて、本発明によるイソヒルジン類はまた指体に結
合させることもでき、それにより例えば西ドイツ特許出
ＴＡｐ　３８１９０７９．６号に提案されるような特効
性のトロンビン阻害作用を有する誘導体が形成さする。

本発明はまた製剤上受容され５る何形剤中における式（
４）のイソヒルジンを含有する医薬製剤にも関する。

これら製剤は、例えば非経口（例えば静脈内、皮肉、筋
肉内または皮下）、経口または局所的に投与された場合
、特に前記した適応症に使用できる。薬用量は主に特定
の投与形およびその治療または予防の目的の如何による
、それぞれの量および投与様式は％個々の疾患例につい
てそれぞれに評価することにより最も良く判定できる。

関連する血液因子を測定するのに必要な方法は専問家に
はよく知られている。通常の場合１本発明によるインヒ
ルジンの治療上有効な量の１回注射量は体重１ｋｆ当り
約ｏ、ｏｏｓ〜約０．１■である。約０．０１〜約０．
０５１１！／体重〜が好ブしい。

その投与は静脈内、筋肉内または皮下注射により行われ
る。従って、非経口投与用の医薬製剤の１回量は、投与
の種類の如何に応じ本発明によるイソヒルノン約α４〜
約７．５　Ｍを含有する。

活性化合物に加え、これら医薬製剤は通常、緩衝液例え
ば−を約３．５〜７に保つべき燐酸塩緩衝液、それに加
えて張度調整のための塩化ナトリウム、マンニトールま
たはンルビトールをも含有する。これらは凍結乾燥形態
または溶解された形態で存在でき、これら溶液は好都合
には抗１活性防腐剤、例えば０．２〜０．３係の４−ヒ
ドロキシ安息香酸メチルエステルもしくはエチルエステ
ルを含有しうる。

局′Ｆｇ［投与用の製剤は水溶液、ローションもしくは
ゼリー、油性溶液もしくｔｉｔ懸濁液、または脂肪含有
性もしくは特に乳剤軟膏の形態をとることができる。水
溶液の形態の製剤は例えば。

本発明忙よる活性化合物またはその治療上利用できる塩
をｐＨ４〜６．５の水性緩衝溶液中に溶解させ、そして
所望の場合は他の活性化合物例えば抗炎症剤、および／
″！たけ重合体状接着剤例えばポリビニルピロリドン、
および／または防腐剤を添加することにより得られる。

活性化合物の濃度は溶液約１０１またはぜＩＪ−１０９
中に約０．０８〜約１．５岬、好ましくは０．２５〜１
．　Ｏｙｎｉである。

局所投与用の油性投与形態物は例えば、ルＴ望の場合は
ステアリン酸アルミ；ラムのような膨油剤、および／ま
たはそのＨＬＢ値（親水性−親油性バランス）が１０以
下の表面活性剤（界面活性剤）例えばグリセリンモノス
テアレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモ
ノステアレートまたはソルビタンモノオレエートのよう
な多価アルコールの脂肪酸モノエステルな添加して本発
明による活性化合物ま比はその治療上利用しうる塩を油
中に懸濁させることにより得られる。脂肪を含有する軟
膏は例えば、所望の場合はＨＬＢ価１０より下の表面活
性剤を添加して本発明による活性化合物またはその塩を
腰布可能な脂肪性基剤中に懸濁させることにより得られ
る。乳剤軟膏はそのＨＬＢ値が１０よシ低い表面活性剤
を添加して、本発明による活性化合物またはその場の水
溶液を軟かい腰布可能な脂肪性基剤中に磨砕することＫ
よシ得られる。

これら局所投与形すべては防腐剤をも含有しうる。活性
化合物の濃度は基剤約１０ｊ’中に約０．０８〜約１．
５　ｗｉ、好ましくは０．２５〜１．０１１Ｆである。

ヒトまたＦｉｗ乳動乳体物体直接使用が意図される前記
医薬組成物およびその類似体に加え、本発ＦＪＡ＃′ｉ
またヒトま九は哺乳動物の生体外で医学的に使用する念
めの医薬組成物および調製物にも関する。かかる組成物
および調製物は体外で循ｍｔたけ処置（例えば人工腎臓
中での透析）、防腐または修正（例えば血液分離）にか
けられる血液への凝固阻止添加剤として主に用いられる
。これら組成物において、原液またはその他１回量形の
調製物のようなかかる調製物は前記注射製剤と同様であ
る。しかしながら好都合には活性化合物の量または濃度
は処置される血液量、もしくはよシ正確忙はそのトロン
ビン含量に関連する。この点で、本発明による活性化合
物（遊離形）は、（ａ）　　お工そ５重量倍のトロンビンを完全に不活化
し。

（ｂ）　　比較的大量においても生理学的に無害であり
、そして（ｃ）　　高濃度においても循環血液から非常に速やか
に排泄されるので、例えば輸液に際しても過剰投薬の危
険は伺ら存在しないことが観察される。それぞれの目的
の如何に応じ、適当な薬用量は血液１ノ当り活性化合物
的０．０１〜約１．０１１Ｐであり、その上限は危険を
伴うことなくうんと超過することもできる。

本発明／Ｉｉま念トロンビンを測定するための本発明に
よる化合物およびそれらの塩の生物学的分析への使用、
およびこの目的に用いられかつ本発明による活性化合物
を含有する調製物、例えば固形混合物そしてとりわけ溶
液、特に水溶液にも関する。これらはまた本発明による
活性化合物またはその塩の正確な量もしくは濃度に加え
好都合には不活性助剤゛１例えば安定化および／または
防腐機能を有する注射用調製物に関連して前記したもの
をも含有しうる。これら調製物はヒルジン調製物と同様
の知られた方法で生物学的分析例えばトロンビンの測定
に使用できる。

本発明による化合物はその上血液の保存にも使用できる
。この目的には、本発明による化合物は好都合には０．
１〜２重量係の量で血液保存物に加えられる。

以下の実施例により本発明を説明する。１文字コードは
アミノ酸の略号である。

アミノ酸の３文字コードおよび１文字コードアミノ酸　
　略語　　　アミノ酸　　略語アラニン　　　Ａｌａ（
Ａ）　　　　プロリン　　　Ｐｒｏ（Ｐ）アルギニｙ　
　　Ａｒｇ（Ｒ）　　　　セリン　　　　５ｅｒ（Ｓ）
システィン　　　Ｃｙｓ（Ｃ）　　　　）レオニン　　
　Ｔｈｒ（Ｔ）グリシン　　　　ｏｌｙ（ｏ）　　　　
　）リゾドアアン　　Ｔｒｐ（Ｗ）ヒスチジン　　　Ｈ
ｉｓ（Ｈ）　　　　チロシン　　　　Ｔｙｒ（Ｙ）イン
ロイシン　　ｌ１１３（Ｉ）　　　　バリン　　　　ｖ
ａｌ（ｖ）ロイシン　　　　Ｌｓｕ（Ｌ）　　　　アス
パラギン酸　Ａｓｐ（Ｄ）リジン　　　　ＬＹ８（Ｋ）
　　　　アスパラギン　Ａ９１１１（Ｎ）メチオニン　
　Ｍｅｔ（Ｍ）　　　　グルタミン酸　　ｏｌｕ（Ｅ）
フェニルアラニン　Ｐｈｅ（ＩＦＦ）　　　　　グルタ
ミン　　　Ｇｌｌｌ（Ｑ）実施例　１インヒルジン類１ａ、■、Ｉｂ、Ｈａ、ｎ、Ｉｌｂ、１
［１ａ、Ｉｎおよび１１ｂの単離、酸化、トリプシンに
よる開裂、配列分析およびアミノ酸分析ａ）単離新規インヒルジン類の単離は初めに文献から知られた方
法忙より行つｆｔ　（Ｐ、　Ｗａｌｓｍａｎｎ、　Ｔｈ
ｒｏｍ−ｂｏｓｉｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　４０（１９８
５）５６５〜５６９　）。最も重要な工程のみがここで
記載されるべきである。

ヒルの前部を４０憾アセトンで抽出しそしてパラスト物
質を氷酢酸で沈澱させ、そして富化されたヒルジン抽出
物をアセトンで沈澱さぜた。

この沈澱をトリス／　Ｈｅｔｌ＆衝液（ｐｉ−４７，４
）中食塩水グラジェントを用いるイオン交換（例えは、
ＤＭＥ［Ｆ］５ｅｐｈａｃｅｌ　）により精製した。ア
ンチトロンビン試験において活性なフラクションを合し
て凍結乾燥した０次に駿衝剤成分を水中のセファデック
ス（８ｅｐｈａｄｅｘＩ８）　Ｇ　２５により少しずつ
分離し、活性フラクションを０．１　Ｍ　）リス／ＨＣ
ｌ１１１ｉａ（ｐＨ８，０）中でトロンビン−セファロ
ースカラムに加え、そして同じ緩衝液で洗ったのちα１
Ｍ酢酸ナトリウム１０．５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ５，
０〕を用いて溶離した。とルソンの一部分もこの間に溶
離され九゛。次に純粋なヒルジンフラクションを０．１
Ｍ）リス／ＨＣｔ／１．５Ｍベンズアミジン（−８，０
）を用いて溶離した。トロンビン−セファロースをセフ
ァデックス（）２５カラムに連結させることにより、次
にヒルジンが低い流速で溶離され、同時にトロンビン阻
害剤ベンズアミジンが分離された。凍結乾燥後、活性７
ラクシヨンは０．０１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐ）
１３、８　）　中ＢＥ−セファデックスによるイオン交
換クロマトグラフィーおよび塩化ナトリウムのダラシエ
ンドを用いる溶離により精製された。５攬の活性フラク
ションが単離された。７ラクシヨン■をセファデックス
で脱塩しそして凍結乾燥した。比活性は１２　ＡＴ−Ｕ
／μｇであった。

不均質７ラクシヨン■をミクロゲアＲＰ−ＨＰＬＣに用
いた。非常に浅いグラジェント（毎分ＢＯ，０６％　）
を用い、この混合物を非常に保持時間（ｒ）の異なる５
個の主要なピーク（ピークＩ：ＲＴ約８９分、ピーク■
二ＲＴ約１１３分、ピークｍ　：　ＲＴ約１３４分、第
１図参照）に分解した。

これら主要ピークには小さなサテライトピーク（ａおよ
びｂ）が付随する。ピークｌｌａは例えばＲＴ約１３０
分を有するサテライトピークを示し、このものは主要ピ
ーク■の直前に溶離される。

それに対応（−で、サテライトピークｌｂ　（ＲＴ約１
３９分）が溶離され、これは主要ピーク■の後に溶離さ
れる。

注射量を注意深く増量しそしてフラクション（ピーク）
を集めることによシ、ミクロ？アＲＴ−ＨＰＬＣユニッ
トを用いて種々のインヒルジン変種の分取用単離を行っ
た。５０μｇまでを注射しそしてピークの分解に際して
顕著な損失を伴うことなく種々のフラクション（ピーク
）ヲ集めた。光分な量を単離するためＫは、この操作を
数回反復して同一のクラクションを合し凍結乾燥した。

ａｉ々の再クロマトグラフィーピークを「よシ狭い」分
別により最終的に精製した。

このようにして、インヒルジンＩａ、Ｉ％　ｌｂ。

１［ａ、■、Ｉｌｂ、ＩＩＩａ、■およびｌｌｂを分離
した。

純粋な物質を必要に応じて酸化しそしてトリプシンで開
裂させた。

ｂ）ジスルフイツｒの酸化的開裂過蟻酸溶液（過酸化水素５０μｔおよび蟻酸９５０μｔ
から調製、室温で２．５時間放置）１００μｔをインヒ
ルジンに加えた。３０分後この混合物を水２００μｔで
希釈しそして次に凍結乾燥した。

ｃ）　　）リプシン開裂酸化されたインヒルジンをＮＭＭ緩衝液（氷酢酸で−８
に調整したα２Ｍ　　Ｎ−メチルモルホリン）５０μを
中忙とった。この目的には基質対酵素＝１：１００の比
率におけるＮｌ、ＩＭ　＠衝液中のトリプシンの溶液を
加えた。室温で５０分後、氷酢酸１００Ａｌの添加によ
り反応を停止させた。

得られたこの混合物を次にさらにミクロボア♂−ＨＰＬ
Ｃに用いた。

ｄ）配列分析単ｌｌｌ１および精製されたインヒルジンをデータ分析
システムを有する１２０ＡＰＴＨアナライザーとオンラ
イン結合した４　７７　Ａ　Ｐｕ１ｓｅｄ　Ｌｉｑｕｉ
ｄＰｈａｓｅ　（’ＩＭ）タンパクシークエンサー（Ａ
ｐｐｌｉｅｄ阻ｏｓｙｓｔｅｍｓ　）を用いて整理配列
した。配列決定は製造者の指示に従い行った。その結果
を第３〜１５表に示す。

ｅ）アミノ酸分析それぞれのインヒルジンのアミノ酸組成はＥｅｃｋｍａ
ｎ　６５００アミノ酸アナライザーを周込て決定した。

その際、分析は製造者の指示に従って行った。試薬およ
び分離カラムは同様にして製造者から購入した。続く積
分はＬＡＳシステム（Ｈｅｖｌｅｔ、ｔ、　Ｐａｃｋａ
ｒｄ　）を用いて実施した。タンパク質（約３０〜ｓｏ
ｐモル）を４Ｘ４０ｍの石英試験管中で乾燥しそして窒
素雰囲気の下ＨＣｌ１０．８％フェノール共沸気相中１
１０℃で加水分解した。インシュリン標準物５００ｐモ
ルを各パッチにつき同時に分析し念。

下記第２表にその結果を示す。

下記実施例２〜９において、分析ＩＩｉ実施例１に記載
される方法と同様にして実施した。比活性およびアミノ
酸分析値に関する相当するデータは第１表および第２表
に示される。

実施例　２インヒルジンＩインヒルジン１をピークｌ　（ＲＴ約８９分）から単離
して再クロマトグラフィーにニジ精製した。Ｎ−末端配
列分析にエリ３０個首でのアミノ酸の構造を決定できた
（第３表）。酸化およびトリプシン開裂後にフラグメン
トＴ２およびＴ！ｌ　（Ｃ−末端ペゾチド）を単離して
配列を解明した。その結果を第４表に示す。

第５表インヒルジンＩの定量的配列分析値ｐモル１０７９０　７６　４８　５０　　ｎｄ　　２１　２９
　１３　３０　１９　２０ｐモル１１　８　６　　ｎｄ　　５　５ｐモルアミノ酸９モル１ＥＹＬＱ＊（１）に比較したアミノ酸交換Ｄｄ：測定できずＶＶＹＴＤＣＴＥＳＧＱＮＬＣＬＣＥＧＳＮＶＣＧＱ（
）ＮＫＣＩＬ（）ＳＤＧＲＫＮＱＣＶ’ｒＧＥＧＴＰ４
ＰＱ８ＨＮＤＧＤＦＫＢＩＰＥ　Ｂ　Ｙ”Ｌ　Ｑ　　　
　　　　　　　　　　　（１１Ｙ１１スルフアトチロシ
ン第　　４　　表ペゾチ）′Ｔ２９モルｎｄ　２０４１５６１２Ｂ　４０　６３　６８　２５　
　ＢベプチＩ′Ｔ３に得られたタンパク混合物からイソヒルジンＩａを単離
した（　ＲＴ約８５分）。この生成物を再クロマトグラ
フィーにより精製した。続くＮ−末端配列分析により全
構造を決定することができた（第５表）。

第　　５　　表イソヒルジンＩａの定量的な配列分析値９モル１５９１７８　ｎｄ　１０５８９１２２８９８６６３５
７５８２５ｐモル　５３６５５４２９７６ｊ４１６１　
ｎｄ　３３９１１４２４ｆ　ｔ８５１９６１８１アミノ
酸９モルＬ　　ＣＬ　　Ｃ’　　Ｅ　　Ｇ　　８　　Ｎ　　Ｖ　
　ＣＧ　　Ｋ”１８８　ｎｄ　１７３　ｎｄ　１２３１
５６１３０１４９１４６　ｎｄ　ｔ３２１１８ｐモル　
１２２１１８７８　ｎｄ　７１８４７１５３６９７６６
０６９ｎｄ　：測定できず実施例　３インヒルジンＩａ実施例１におけると同様にしてピークＩの前ｐモル６０　６１　　ｎｄ　４６　３９　４５　３７　３９　
２４　１６　２８　１９ｐモルアミノ酸　ＥＥＹＬＱ９モル　　４４　３３２傘（１）と比較したアミノ酸交換ｎｄ：測定できず実施例　４イソヒルジンＩｌａイソヒルジｙｌｌａはピークＩｌａ　（ＲＴ約１０７分
）から単離しそして再クロマトグラフィーにより精製し
念。その構造はＮ−末端配列分析により解明した（第６
表）。

第　　６　　表イソヒルジンＩｌａの定量的配列分析値９モル　　４２
３３７２３７７３１０３６８　ｎｄ　３９２２７４２９
５２６１２８７２７１ｐモル　　２５８　ｎｄ　２４１
　ｎｄ　２３０２２８２２７２２６２１８　ｎｄ　２２
３２１０ｐモル１９１１４９２００　ｎｄ　１７１１８２１６９１７６
１６２　ｆ４５１３５１２５ｐモル１１５１２６　ｎｄ　１０７１０５９６　９３　９２　
７９　７２　７１　６２ｐモル　　６０４９５５５２５
０４１　４５４７３０３１　３０１６アミノ酸　ＥＥＹ
ＬＱｐモル　　１５１５１７１２　ｆ２本（１）と比較したアミノ酸交換ｎｄ：測定できず実施例　５イソヒルジン■および■ｌ実施例１と同様にして、イソヒルジンＩＩおよび■ｔを
フラクション■（ピークｎ　：　ＲＴ約１１３分）から
混合物として単離しそして再クロマトグラフィーした。

アミノ酸３５までのインヒルジンの配列なＮ−末端配列
分析によυ解明した。

Ｃ−末端ペプチド（３８〜６５）は酸化およびトリプシ
ン開裂により単離しそして配列を決定した（第８表）。

イソヒルシン■および■′の全配列分析値を第７表に示
す。その際インヒルジン■′は前記と同様にしてイソヒ
ルノン混合物■および■′の配列分析中に特性化された
。インヒルシンｎ’Ｆ！２０−位のアスパラギンがアス
パラギン酸により置換されている点でイソヒルジン■と
相異する。

第　　７　　表インヒルジン■およびｌｌ／の定量的配列分析値■ ｐモル３１１２６Ｂ　２７８２６７２４２　ｎｄ　１６９１７
５１６５１４４１６５１６３アミノ酸 ■ ｐモルＥＥＹＬＱ申（１）と比較したアミノ酸交換傘申■と比較したアミノ酸交換ｎｄ：測定できず第　　８表インヒルジン■およびｎ′のトリジシン開裂生成物の定
量的分析値 ■ ｐモル９８８９　７４　　ｎｄ　　６６　５５　４３　７０　
４９　５１　４５　２８■ ｐモル２０　２２　　ｎｄ　１７　１２　１３　１０　３　１
５ｐモルｎｄ　　２６６２４２２５０２２５２１７１８４１７８
１７８１６９１４５　　ｎｄアミノ酸ｐモルＶＴＧＥＧＴＰＫＰＱ８Ｆ！１４４１２５１３８１２６　ｊ２５　ｆ３７１１８１１
２１０２１２５５’１　１１３ｐモルアミノ酸　　ＬＱｐモル　　　３８１６申（１）と比較したアミノ酸交換ｎｄ：測定できず実施例　６イソヒルジン■ｂ実施例１と同様にして、インヒルノンｉｔ）をピーク■
の後のタンパク質混合物から単離しく　ＲＴ約１１５分
）そして再クロマトグラフィーにより精製した。第９表
に示される全配夕ＩＪはＮ−末端配列分析により決定さ
れた。付方０的にトリプシン開裂を行いペプチＰ２８〜
６５カを単離された（第１０表）。相当する配列が決定
された。

第　　９　　表イソヒルジン［ｂの定量的配列分析値ｐモルｐモルアミノ酸ｐモルｐモル１８５１７４　ｎｄ　１６３１５６１４５１３２１４０
１２９１ｊ２１０５９１ｇＹＬＱ申（１）と比較したアミノ酸交換第１０イソヒルジン■ｂのトリプシン処理ペプチドの定量的配
列分析値３００３７９３８１３６８３４７３３７３３２３１６３
０５２９！ｌ　２７１　ｎｄｐモル２５５２４９２３４２２８２１２２Ｑ５１９７１６７１
５４１４３１３３１２７ｐモル２１５２３０２１９　ｎｄ　２２１２２２２１７２１０
２０６２ＬＩｕ　１γ５１’１０ｐモルアミノ酸ｐモルＱ申（ｊ）ｔｃ比較したアミノ酸交換！１ｄ：測定できず実施例　フインヒルジンｍａおよびｌ］ａ／イソヒルジンｌ１ｌａおよび■ａ′はＲＴ約１２６分を
有するピークから単離しそして再クロマトグラフィーに
より精製した。Ｎ−末端配列分析によシカルゴキシル末
端までの構造を決定することができた（第１１表）。イ
ンヒルジンｌａ　／は前記と同様にして配列分析中に特
性化された。インヒルジンｌｌ１ａ′は１１−位のグル
タミンがグルタミン酸により、１２−位のアスパラギン
がアスパライン酸により、１８−位のアスノぞラギン酸
がグリシンによシ、セして３３−位のアスパラインがア
スパライン酸により交換さｈている点でインヒルジンｌ
１ｌａと相違する。

第１１表イソヒルジン［ｌａおよび■ａ′の定量的配列分析値ｌａｐモル６６０６７５６６６４７７４０７　ｎｄアミノ酸　　Ｌ
ＣＬＣＥＤ”５ＮＶＣＧＥ”Ｉ［１ａｐモル　　３１８　ｎｄ　２８４　ｎｄ　２６９２４７
２３９２２７２１８　ｎｄ　２０４１８５アミノ酸　　
ＧＮＫＩ［１ａｐモル　　１７８１６９１６１ＣＩＬＧＳＮ＊　ＧＥＫｎｄ　１５０１５７１５４１３７１３１１２８１２５１
２０［１ａｐモルｎｄ１１ａｐモルアミノ酸１［１ａｐモルＥＥＹＬＱ実施例　８インヒルジンｍインヒルジンＩｌｌ　ＦｉＲＴ約１６４分を有するピー
クから単離しそして再クロマトグラフィーにより精製し
た。

トリプシン開裂生成物（ペプチド２８〜６５）の配列分
析と組み合せたＮ−末端配列分析により全タン・臂り質
の構造決定ができた（第１２および１３表）。

ここまで記載したすべてのインヒルジンに比較して、こ
のインヒルジンｆｌｉｔ″ｉより大量に単離されるので
アスパラギン醗からアスパラギンへの突然変異のタンパ
ク化学的構造証明がこの物質を用いて付加的に実施され
た。

Ｂｏｒｎｓｔｅｉｎ　（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｆｓｚ
ｙｍｏｌ、　４７　（１９７７）１５２〜１４５）ｔｉ
ｔ求核試薬ヒＰロキシルアミンを用いるＡ３ｎ−Ｇ１７
ペプチｒ結合の選択的開裂について記載している。

従って、６Ｍグアニ・ゾニウム塩酸塩および２Ｍヒドロ
キシルアミンを含有する緩衝液を初め圧調製した。この
目的には、グアニジニウム塩酸塩２３１−ｂよびヒドロ
キシルアミン５．５ｔを水浴中幾分かの水を用いて混合
し、Ｐ［ｉは６．５をこえないようにして４．５Ｍ　Ｌ
ｉＯＨとはげしく攪拌しながら溶解させた。次に声を９
にｖ１４ｇしそして水を用いてこの溶液を５０−となし
た。

インヒルジンｍ（約２ｎモル）を凍結乾燥し、調整ずみ
緩衝液２００μｔにとりそして次に水浴中４５℃で４時
間インキュベーションした。氷酢酸（ｐＪ（３）２００
μｌを加えて反応を終了させそして試料を凍結１！Ｆ、
ｔ＃ニジた。次にこの試料を２００μノとなるまでａｍ
し、Ｃ−１８変性シリカゲルを充填した逆相カラム（４
，６Ｈｘ　２５０ｍ）　Ｙ：ｍ塩した。その際のグラジ
ェントは、流速毎分１１１１で３０分でＢＯ４から１０
０４であった（緩衝液Ａ：水１００％、ＴＦＡｏ、１俤
：ａｍ液Ｂ：ＡｃＣＮ９０チ、水１０チ、ＴＦＡ　０．
１係）。得られる主フラクションを次にミクロデアＩ（
ＰＬＯを用いて再クロマトグラフィーした。配列分析（
第１４表）による特性化忙よれ＃−１’２個のＮ−末端
すなわちＶａｌ　Ｖａｌ　ＴｙｒおよびＧｌｙ　Ｇｌｕ
　Ｌｙｓを含有する７ラクシヨンＦ１が単離された。

イソヒルジン■はシスティン連結（Ｃｙｓ６−Ｃｙｓｌ
４゜Ｃｙｓｌ　６−Ｃｙｓ２８　、　Ｃｙｓ　２２−　
Ｃｙｓ　３９　）により、ヒドロキシルアミンによる開
裂後でも保持されていた。

第１２表イソヒルジン■の定量的配列分析値 ■ ｐモル６１５５６９４６８３７７２６５　ｎｄ　１７８２５０
１０Ｂ　２１４１４７１９５■ ｐモル１５８　ｎｄ　　８３　　ｎａ　ｆ０２８８　７２　６
４　５４　　ｎｄ　　５０　４８■ ｐモル３２　３７　２９　ｎｄ　　２８　３０　２３　１９　
１４　１７　１６　１２■ ｐモル１０９ｎｄ５３５６４２１　　１　　３アミノ酸　　Ｅ
ＥＹＬＱ ■ ｐモル　　　Ｉ　　Ｑ、４０．６０．８０．６＊（１）
と比較したアミノ酸交換ｎｄ：測定できず第表分解工程　　　１　２　３　４イソヒルジン■のトリプシン処理ペプチドの定量的配列分析値ｐモルｄ３０１２９５２８６２３４２７３２４６２４２２１９１
９４１５９　ｎｄｐモルアミノ酸ｐモルアミノ酸ｐモル５５　　　　　　　　　　　　６ＯＮＤＧＤＦＲＢＩＰＲＥ　ＹＱＯ１７２傘（１）と比較したアミノ酸交換！１ｄ：測定できず第１４表ヒドロキシルアミン開裂から得られるフラクションＦ１
の定量的配列分析値分解工程配列位置アミノ酸二Ｎ−末端ｐモルフ配列位置　　　　５４　　　３５　　　３６　　　３７
アミノ酸：開裂部位　　ＧＥＫＮｐモル　　　　　４１　　　５０　　　′５７　　　３
４Ｆ１の２個のＮ−末端についての所見によりインヒル
ジン配列のペプチド結合Ｎ−Ｇでヒドロキシルアミン開
裂が起ることが明白に証明される。

実施例　９インヒルジンｍｂおよびｍｂ’ イソヒルジンｍｂおよびＩＩＩｂ′けＲＴ約１３９分を
有するピークから実施例１と同様にして単離されそして
再クロマトグラフィーにより精製された。カル−キシル
末端に至るインヒルジンｍｂの構造はＮ−末端配列分析
によシ特性化された（第１５表）。イソヒルジンｔｕｂ
’の構造は配列分析において同様に決定されてこれも第
１５表に示されている。

第１５表イソヒルジンｍｂおよび［１ｂ／の定量的配列分析値ｂｐモルｎｄ　３９５　３３２　３３９　３２６　３２１　２７
Ｂｐモル傘（１）と比軟したアミノ酸交換＊孝１１ｉ１）と比較したアミノ酸交換ｎｄ：測定でき
ず

【図面の簡単な説明】

ミクロボアＲＰ−ＨＰＬＣにょジインヒルノン活性物質
を分離した結果を第１図に示す。

Claims

【特許請求の範囲】１）式（Ａ）【遺伝子配列があります】（Ａ）を有するイソヒルジンおよびそれが生成できるものであ
る場合はその変異体および生理学的に受容できる塩、こ
こで上式中、ＡはＶａｌまたはＩｌｅであり、ＢはＶａ
ｌまたはＴｈｒであり、ＣはＧｌｎまたはＧｌｕであり
、ＥはＡｓｎまたはＡｓｐであり、ＦはＧｌｕまたはＧ
ｌｎであり、ＧはＡｓｐまたはＧｌｙであり、ＩはＡｓ
ｐまたはＡｓｎであり、ＪはＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｎま
たはＬｙｓであり、ＫはＩｌｅまたはＬｙｓであり、Ｌ
はＡｓｐまたはＡｓｎであり、ＭはＬｙｓまたはＧｌｕ
であり、ＮはＧｌｎまたはＧｌｕそしてＲは水素または
ＳＯ＿３Ｈを表わすものとする、但し、ＪがＧｌｎであ
る場合はＬはＡｓｐではないものとする。２）ＡがＶａｌであり、ＢがＶａｌであり、ＣがＧｌｎ
であり、ＥがＡｓｎであり、ＦがＧｌｕであり、ＧがＧ
ｌｙであり、ＩがＡｓｎであり、ＪがＬｙｓであり、Ｋ
がＩｌｅであり、ＬがＡｓｐであり、ＭがＬｙｓであり
、ＮがＧｌｎでありそしてＲが水素またはＳＯ＿３Ｈで
あることからなる請求項１記載の式Ａを有するイソヒル
ジン。３）ＡがＶａｌであり、ＢがＶａｌであり、ＣがＧｌｎ
であり、ＥがＡｓｎであり、ＦがＧｌｕであり、ＧがＧ
ｌｙであり、ＩがＡｓｎであり、ＪがＡｓｎであり、Ｋ
がＩｌｅであり、ＬがＡｓｐであり、ＭがＬｙｓであり
、ＮがＧｌｎでありそしてＲが水素またはＳＯ＿３Ｈで
あることからなる請求項１記載の式Ａを有するイソヒル
ジン。４）ＡがＩｌｅであり、ＢがＴｈｒであり、ＣがＧｌｎ
であり、ＥがＡｓｎであり、ＦがＧｌｕであり、ＧがＧ
ｌｙであり、ＩがＡｓｎであり、ＪがＡｓｎであり、Ｋ
がＬｙｓであり、ＬがＡｓｐであり、ＭがＧｌｕであり
、ＮがＧｌｎでありそしてＲが水素またはＳＯ＿３Ｈで
あることからなる請求項１記載の式Ａを有するイソヒル
ジン。５）ＡがＩｌｅであり、ＢがＴｈｒであり、ＣがＧｌｎ
であり、ＥがＡｓｐであり、ＦがＧｌｕであり、ＧがＧ
ｌｙであり、ＩがＡｓｐであり、ＪがＬｙｓであり、Ｋ
がＩｌｅであり、ＬがＡｓｎであり、ＭがＧｌｕであり
、ＮがＧｌｎでありそしてＲが水素またはＳＯ＿３Ｈで
あることからなる請求項１記載の式Ａを有するイソヒル
ジン。６）ＡがＩｌｅであり、ＢがＴｈｒであり、ＣがＧｌｎ
であり、ＥがＡｓｐであり、ＦがＧｌｕであり、ＧがＧ
ｌｙであり、ＩがＡｓｐであり、ＪがＬｙｓであり、Ｋ
がＩｌｅであり、ＬがＡｓｎであり、ＭがＧｌｕであり
、ＮがＧｌｎでありそしてＲが水素またはＳＯ＿３Ｈで
あることからなる請求項１記載の式Ａを有するイソヒル
ジン。７）ＡがＩｌｅであり、ＢがＴｈｒであり、ＣがＧｌｎ
であり、ＥがＡｓｎであり、ＦがＧｌｕであり、ＧがＧ
ｌｙであり、ＩがＡｓｎであり、ＪがＬｙｓであり、に
がＩｌｅであり、ＬがＡｓｎであり、ＭがＧｌｕであり
、ＮがＧｌｎでありそしてＲが水素またはＳＯ＿３Ｈで
あることからなる請求項１記載の式Ａを有するイソヒル
ジン。８）ＡがＶａｌであり、ＢがＶａｌであり、ＣがＧｌｎ
であり、ＥがＡｓｎであり、ＦがＧｌｕであり、ＧがＡ
ｓｐであり、ＩがＡｓｎであり、ＪがＧｌｕであり、Ｋ
がＩｌｅであり、ＬがＡｓｎであり、ＭがＬｙｓであり
、ＮがＧｌｎでありそしてＲが水素またはＳＯ＿３Ｈで
あることからなる請求項１記載の式Ａを有するイソヒル
ジン。９）ＡがＶａｌであり、ＢがＶａｌであり、ＣがＧｌｕ
であり、ＥがＡｓｐであり、ＦがＧｌｕであり、ＧがＧ
ｌｙであり、ＩがＡｓｎであり、ＪがＧｌｕであり、Ｋ
がＩｌｅであり、ＬがＡｓｐであり、ＭがＬｙｓであり
、ＮがＧｌｕでありそしてＲが水素またはＳＯ＿３Ｈで
あることからなる請求項１記載の式Ａを有するイソヒル
ジン。１０）ＡがＶａｌであり、ＢがＶａｌであり、ＣがＧｌ
ｎであり、ＥがＡｓｎであり、ＦがＧｌｕであり、Ｇが
Ａｓｐであり、ＩがＡｓｎであり、ＪがＧｌｎであり、
ＫがＩｌｅであり、ＬがＡｓｎであり、ＭがＬｙｓであ
り、ＮがＧｌｎでありそしてＲが水素またはＳＯ＿３Ｈ
であることからなる請求項１記載の式Ａを有するイソヒ
ルジン。１１）ＡがＶａｌであり、ＢがＶａｌであり、ＣがＧｌ
ｎであり、ＥがＡｓｎであり、ＦがＧｌｎであり、Ｇが
Ａｓｐであり、ＩがＡｓｎであり、ＪがＧｌｎであり、
ＫがＩｌｅであり、ＬがＡｓｎであり、ＭがＬｙｓであ
り、ＮがＧｌｎでありそしてＲが水素またはＳＯ＿３Ｈ
であることからなる請求項１記載の式Ａを有するイソヒ
ルジン。１２）ＡがＶａｌであり、ＢがＶａｌであり、ＣがＧｌ
ｎであり、ＥがＡｓｎであり、ＦがＧｌｎであり、Ｇが
Ｇｌｙであり、ＩがＡｓｎであり、ＪがＧｌｎであり、
ＫがＩｌｅであり、ＬがＡｓｎであり、ＭがＬｙｓであ
り、ＮがＧｌｎでありそしてＲが水素またはＳＯ＿３Ｈ
であることからなる請求項１記載の式Ａを有するイソヒ
ルジン。１３）抽出法、沈澱法およびクロマトグラフィー法の組
み合せによりヒルからイソヒルジンを単離および精製し
、所望の場合は場合により存在するフェノールエステル
基Ｒを加水分解により除去してフェノール性ヒドロキシ
ル基を生成させ、そして得られるポリペプチドを場合に
よりその生理学的に受容されうる塩に変換することから
なる請求項１〜１２のいずれか１項に記載のイソヒルジ
ンの製法。１４）薬剤として使用するための請求項１〜１２のいず
れか１項記載のイソヒルジン。１５）トロンビン阻害剤として使用するための請求項１
〜１２のいずれか１項記載のイソヒルジン。１６）請求項１〜１２のいずれか１項記載のイソヒルジ
ンおよび製剤上受容されうる付形剤を含有する医薬製剤
。１７）薬剤および付形剤を適当な投与形となすことから
なる請求項１６記載の医薬製剤の製法。