JP2833798B2 - 新規イソヒルジン類 - Google Patents
新規イソヒルジン類Info
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Description
にこれ迄知られているヒルジンとは異なる新規な、ヒル
ジン類からのトロンビン阻害剤に関する。
860;(EP−A)158,564;(EP−A)158,986;(EP−A)
168,342;(EP−A)171,024;(EP−A)193,175;(EP−
A)200,655;(EP−A)209,061;(EP−A)227,938;Ch
ang,FEBS,Vol.164(1983)307;J.Dodt他、Biol.Chem.Ho
ppe−Seyler367(1986)803〜811およびD.Tripier,Foli
a Haematol.Leipzig115(1988)1〜2,30〜35から知ら
れている。しかしながら、これらヒルジン類は活性中心
を介してまたはトロンビンへの結合に関与しているアミ
ノ酸を介して担体に部分的に結合されうる。さらに、知
られたヒルジン類は経皮的性質が限られており、排除速
度が高いゆえに非常に寿命が短かいので定常的なまたは
外来での血栓症の予防が困難となる。
学的性質を有するヒルジン類を見出すという課題があつ
た。さらに、これらヒルジン類は担体上への固定化に際
して化学的取扱い性がより良好でなければならない。
場合はそれらの変異体および生理学的に受容されうる塩
により達成された。ここで上式(A)中、AはValまた
はIleであり、BはValまたはThrであり、CはGlnまたは
Gluであり、EはAsnまたはAspであり、FはGluまたはGl
nであり、GはAspまたはGlyであり、IはAspまたはAsn
であり、JはGln、Glu、AsnまたはLysであり、KはIle
またはLysであり、LはAspまたはAsnであり、MはLysま
たはGluであり、NはGlnまたはGluそしてRは水素また
はSO3Hを表わすものとする、但し、JがGlnである場合
はLはAspではないものとする。
またはSO3Hを表わす。
フイー法の組み合せによりヒルからイソヒルジンを単離
および精製し、所望の場合は場合により存在するフエノ
ールエステル基Rを加水分解により除去してフエノール
性ヒドロキシル基を生成させ、そして得られるポリペプ
チドを場合によりその生理学的に受容されうる塩に変換
することからなる、イソヒルジンの製法にも関する。
Acta44(1985)1007〜1013またはEP−A158,986およびEP
−A209,061に記載されるようにして初めに抽出しそして
次に粗製イソヒルジン類を沈澱させるのが好ましい。以
後の単離および精製は例えばP.WalsmannによりPharmazi
e36(1981)860〜861に記載されるようにしてクロマト
グラフイー法の組み合わにより行われる。しかしなが
ら、下記クロマトグラフイー法の組み合せが用いられる
のが好ましい。
ラフイー→アフイニテイクロマトグラフイー→ゲル透過
クロマトグラフイー→イオン交換クロマトグラフイー→
ミクロボアRP HPLC それぞれのクロマトグラフイー法は一般に知られてい
る。
終的なミクロボアRP−HPLCを含む種々のクロマトグラフ
イー法の組み合わせが特徴である。プレートの高さがよ
り小さくかつカラム中の拡散がより低いので、慣用の4.
6mmカラムにおけるよりもこの場合には分離がより高く
なる(R.P.W.Scott,J.Chromatographic Science23(198
6)233〜237;R.Gill,J.Chrometography16(1986)28
1)。
制御器で抑制される2個のBeckman114M溶媒供給モジユ
ールからなる。各ポンプ−不動態化された1/8インチV8
スチールチューブ製−への緩衝液管路はT−接手管を介
して動的なミクログラジエントミキサーに連結されてお
り、このミキサーが緩衝溶液をホモジナイズし、生ずる
脈動は系統内に組み込まれた脈動ダンパー(Waters par
tNo.98060)により吸収されそして緩衝溶液がサンプル
アプリケーター(Gilson Abimed231型、希釈器401型)
のレオダイン(Reodynea)バルブを経てミクロボアカラ
ムに導入される。アクアポア(Aquapore)RP−300(細
孔寸法300Å)7μm球状シリカを充填したミクロボア
カラム(Applied Biosystems,カタログNo400422Rp)を
炉(Sykam S4110,40℃)中に置く。検出はUV検出器で20
5nmで行う(0.08AUFSを備えそれに調製されたSykam S 3
300)。補償式レコーダー(10mV FS)により記録をと
り、積分はA/D変換(HP 18625A/D変換器)後にLASシス
テム(Hewlett Packard)を用いて行う。直線状グラジ
エント操作を最適化する。
トリフルオロ酢酸(TFA)10重量%。
なるグラジエントが用いられる。
の分離に: B0%〜B40%(グラジエント B0.06%/分) b) 再クロマトグアフイーおよび最終的な精製に: B0%〜B35%(グラジエント B0.4%/分) c) ペプチド分離に: B0%〜B30%(グラジエント B1.7%/分) クロマトグラフイーは流速毎分80μおよび手動によ
る分別により実施される。
クロボアRP−HPLCを用いることによつてのみ新規ペプチ
ドをさらに分離することができる。しかしながら、個々
の成分のアフイニテイが大きすぎるゆえにここでもまた
分離が不完全なままがであるような不運な事例もある。
これは例えばイソヒルジンIIおよびII′;III aおよびII
a′;III bおよびIII b′の場合がそうである。′はこ
れら変異体が見出されたことを意味する、すなわち関連
するタンパク質の配列分析中に付加的に整理配列された
ものであることを意味する。すなわち例えば、イソヒル
ジンII′はイソヒルジンIIの分析において分解段階20で
見出された。
ン−セフアロースカラムでのアフイニテイクロマトグラ
フイーを含む文献上知られた方法により精製される。得
られるイソヒルジン混合物を次にミクロボアPR−HPLCを
用いてその構成分に分離する。分離困難な場合、単離し
たフランクシヨンをわずかに条件を変えて再クロマトグ
ラフイーする。新規なイソヒルジンそれぞれを均質とな
るまでまた事実上均質となるまで精製しそして、ある場
合にはアミノ酸配列が配列分析により決定されるのみな
らず、新規な配列を調べるために付加的なタンパク化学
的方法例えば特別な化学的開裂を用いてその配列を完全
に解明する。
い、製造者の指示に従つて分析する。これを行うには、
タンパク質(30〜50pモル)を予め4×40mm石英試験管
中で乾燥しそして次に窒素雰囲気の下HCl/0.8%フエノ
ール共沸を用いて気相中110℃で加水分解した。各バツ
チに関し、インシユリン標準物500pモルを同時に分析す
る。それらの結果をLASシステム(Hewlett Packard)を
用いて積分する。
動化された配列分析により決定する。これはデータ分析
システムを備えた120A PTHアナライザーとオンライン連
結した477A Pulsed Liquid−Phase(TM)タンパク質シー
クエンサー(Applied Biosystems製)を用いて製造者の
指示に従い行う。
IIIおよびIII aに関しては、プロテアーゼ特異的なペプ
チド開裂が付加的に実施される。これを行うには、個々
のタンパク質の「ジスルフイツド橋」を初めに過蟻酸を
用いて酸化するとそれによりシスチンがシステインに変
換される。この酸化によりタンパク質がその空間的配置
を失いそして厳密に限定できる配置を有しないアミノ酸
のポリマー(節)を形成する。酸化後反応混合物を凍結
乾燥し、得られるタンパク質を適当な緩衝液中トリプシ
ンを用いて開裂させ、ペプチド混合物をミクロボアRP−
HPLCを用いてそれぞれの構成分に分離しそして分取操作
により単離する。次にこれらペプチドのアミノ酸分析に
より主な配列を決定する。塩基性アミノ酸すなわちArg
またはLysの後を開裂させるセンプロテアーゼ好ましく
はトリプシンを用いて特異的な開裂を行う。
号記載の方法と同様にして製造することもできる。
害剤である。本発明による阻害剤によるトロンビンの定
量的阻害によりトロンビン阻害剤/トロンビン複合体が
事実上解離しないままであることが示される。
記載されるトロンビン阻害試験を用いて後処理期間中お
よび精製期間中に測定されうる。この場合かくして精製
された一般式(A)を有するイソヒルジンはトロンビン
阻害12〜16AT−U/μg(アンチトロンビン単位/μg)
を有する。
量200μで室温を行う。トロンビン(ウシトロンビン5
0NIH−U/mg(Merck,ItemNo.12374)原液:20mM MES pH
6、0.154mM NaCl、0.2%PEG 6000、1%BSA中40NIH−U
/ml)をイソヒルジン1〜50μlと最終容量100μlでプ
レインキユベーシヨンしたのち基質を添加することによ
り反応を開始される。試験の測定領域中の0.03〜0.15AT
−Uに活性があるので、測定すべき検体はそれに相当し
て試験緩衝液で希釈する必要がある。マイクロタイター
ウエル1個所当り必要量の試験緩衝液(50mMトリス/HC
l、pH8;154mM NaCl;0.2%ポリエチレングリコール600
0)を初めに導入する。次に4NIH−U/mlのトロンビン溶
液(前出)各50μずつおよび検体を加える。10分間イ
ンキユベーションしたのち、1mM Chromozym TH(Boehri
nger,ItemNo.206849;10mM、water/HCl pH6中;操作溶
液:試験緩衝液で希釈して1mM)100μの添加により反
応を開始させる。残留するトロンビンを色原体基質と5
〜10分間インキュベーシヨンしたのち放出されたニトロ
アニリンを405nmで測光測定する。マイクロタイタープ
レートのウエルを速やかに読みとるのに ELISA読みと
り器(Easy Reader EAR 400(SLT Labin−struments,Au
stria)が利用できる場合は反応停止剤は必要ない。ア
ンチトロンビン単位の絶対的測定は限定されたトロンビ
ン活性量を使用することにより可能であるので、ヒルジ
ン標準物は原則的には不必要である。ただし操作溶液を
徐々に不活性化させるとそのシステムに誤差を生じ、こ
の誤差は測定された値を所定のヒルジン標準物に関連づ
けることにより排除できる。そこでこの試験はトロンビ
ンの絶対濃度とは無関係となり、再現性のある測定がで
きる。
補正)。
で放置。
イーにより精製された」Pentapharm ヒルジン、比活性:
10AT−U/μg、濃度:0.1AT−U/50μl)の0.07〜0.1AT
−Uをマイクロタイタープレートのウエル1組に加え
る。検体の濃度を検べるには、1〜20μgのイソヒルジ
ンに関する検量曲線をミクロボアHPLCで測定した。
ビン阻害試験で得られたものと比較したものである。
類の血栓塞栓症の進行の予防および治療における血液凝
固阻害剤としての使用、ならびに診断剤および試薬とし
てのそれらの使用にも関する。加えて、本発明によるイ
ソヒルジン類はまた担体に結合させることもでき、それ
により例えば西ドイツ特許出願P3819 079.6号に提案さ
れるような持効性のトロンビン阻害作用を有する誘導体
が形成される。
(A)のイソヒルジンを含有する医薬製剤にも関する。
筋肉内または皮下)、経口または局所的に投与された場
合、特に前記した適応症に使用できる。薬用量は主に特
定の投与形およびその治療または予防の目的の如何によ
る。それぞれの量および投与様式は、個々の疾患例につ
いてそれぞれに評価することにより最も良く判定でき
る。関連する血液因子を測定するのに必要な方法は専問
家にはよく知られている。通常の場合、本発明によるイ
ソヒルジンの治療上有効な量の1回注射量は体重1kg当
り約0.005〜約0.1mgである。約0.01〜約0.05mg/体重kg
が好ましい。その投与は静脈内、筋肉内または皮下注射
により行われる。従つて、非経口投与用の医薬製剤の1
回量は、投与の種類の如何に応じ本発明によるイソヒル
ジン約0.4〜約7.5mgを含有する。活性化合物に加え、こ
れら医薬製剤は通常、緩衝液例えばpHを約3.5〜7に保
つべき燐酸塩緩衝液、それに加えて張度調製のための塩
化ナトリウム、マンニトールまたはソルビトールをも含
有する。これらは凍結乾燥形態または溶解された形態で
存在でき、これら溶液は好都合には抵菌活性防腐剤、例
えば0.2〜0.3%の4−ヒドロキシ安息香酸メチルエステ
ルもしくはエチルエステルを含有しうる。
ー、油性溶液もしくは懸濁液、または脂肪含有性もしく
は特に乳剤軟膏の形態をとることができる。水溶液の形
態の製造は例えば、本発明による活性化合物またはその
治療上利用できる塩をpH4〜6.5の水性緩衝溶液中に溶解
させ、そして所望の場合は他の活性化合物例えば抗炎症
剤、および/または重合体状接着剤例えばポリビニルピ
ロリドン、および/または防腐剤を添加することにより
得られる。活性化合物の濃度は溶液約10mlまたはゼリー
10g中に約0.08〜約1.5mg、好ましくは0.25〜1.0mgであ
る。
ステアリン酸アルミニウムのような膨油剤、および/ま
たはそのHLB値(親水性−親油性バランス)が10以下の
表面活性剤(界面活性剤)例えばグリセリンモノステア
レート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノス
テアレートまたはソルビタンモノオレエートのような多
価アルコールの脂肪酸モノエステルを添加して本発明に
よる活性化合物またはその治療上利用しうる塩を油中に
懸濁させることにより得られる。脂肪を含有する軟膏は
例えば、所望の場合はHLB値10より下の表面活性剤を添
加して本発明による活性化合物またはその塩を展布可能
な脂肪性基剤中に懸濁させることにより得られる。乳剤
軟膏はそのHLB値が10より低い表面活性剤を添加して、
本発明による活性化合物またはその塩の水溶液を軟かい
展布可能な脂肪性基剤中に磨砕することにより得られ
る。これら局所投与形すべては防腐剤をも含有しうる。
活性化合物の濃度は基剤約10g中に約0.08〜約1.5mg、好
ましくは0.25〜1.0mgである。
医薬組成物およびその類似体に加え、本発明はまたヒト
または哺乳動物の生体外で医学的に使用するための医薬
組成物および調製物にも関する。かかる組成物および調
製物は体外で循環または処置(例えば人工腎臓中での透
析)、防腐または修正(例えば血液分離)にかけられる
血液への凝固阻止添加剤として主に用いられる。これら
組成物において、原液またはその他1回量形の調製物の
ようなかかる調製物は前記注射製剤と同様である。しか
しながら好都合には活性化合物の量または濃度は処置さ
れる血液量、もしくはより正確にはそのトロンビン含量
に関連する。この点で、本発明による活性化合物(遊離
形)は、 (a) およそ5重量倍のトロンビンを完全に不活性化
し、 (b) 比較的大量においても生理学的に無害であり、
そして (c) 高濃度においても循環血液から非常に速やかに
排泄されるので、例えば輸液に際しても過剰投薬の危険
は何ら存在しないことが観察される。それぞれの目的の
如何に応じ、適当な薬用量は血液1当り活性化合物約
0.01〜約1.0mgであり、その上限は危険を伴うことなく
うんと超過することもできる。
る化合物およびそれらの塩の生物学的分析への使用、お
よびこの目的に用いられかつ本発明による活性化合物を
含有する調製物、例えば固形混合物そしてとりわけ溶
液、特に水溶液にも関する。これらはまた本発明による
活性化合物またはその塩の正確な量もしくは濃度に加え
好都合には不活性助剤、例えば安定化および/または防
腐機能を有する注射用調製物に関連して前記したものを
も含有しうる。これら調製物はヒルジン調製物と同様の
知られた方法で生物学的分析例えばトロンビンの測定に
使用できる。
る。この目的には、本発明による化合物は好都合には0.
1〜2重量%の量で血液保存物に加えられる。
はアミノ酸の略号である。
a、IIIおよびIII bの単離、酸化、トリプシンによる開
裂、配列分析およびアミノ酸分析 a) 単離 新規イソヒルジン類の単離は初めに文献から知られた
方法により行つた(P.Walsmann,Thrombosis Research40
(1985)563〜569)。最も重要な工程のみがここで記載
されるべきである。ヒルの前部を40%アセトンで抽出し
そしてバラスト物質を氷酢酸で沈澱させ、そして富化さ
れたヒルジン抽出物をアセトンで沈澱させた。この沈澱
をトリス/HCl緩衝液(pH7.4)中食塩水グラジエントを
用いるイオン交換(例えば、DEAE Sephacel)により精
製した。アンチトロンビン試験において活性なフラクシ
ヨンを合して凍結乾燥した。次に緩衝剤成分を水中のセ
フアデツクス(Sephadex )G25により少しずつ分離
し、活性フラクシヨンを0.1Mトリス/HCl緩衝液(pH8.
0)中でトロンビン−セフアロースカラムに加え、そし
て同じ緩衝液で洗つたのち0.1M酢酸ナトリウム/0.5M塩
化ナトリウム(pH5.0)を用いて溶離した。ヒルジンの
一部分もこの間に溶離された。次に純砕なヒルジンフラ
クシヨンを0.1Mトリス/HCl/1.5Mベンズアミジン(pH8.
0)を用いて溶離した。トロンビン−セフアローズをセ
フアデツクスG25カラムに凍結させることにより、次に
ヒルジンが低い流速で溶離され、同時にトロンビン阻害
剤ベンズアミジンが分離された。凍結乾燥後、活性フラ
クシヨンは0.01M酢酸アンモニウム緩衝液(pH3.8)中SE
−セフアデツクスによるイオン交換クロマトグラフイー
および塩化ナトリウムのグラジエントを用いる溶離によ
り精製された。3種の活性フラクシヨンが単離された。
フラクシヨンIIをセフアデツクスで脱塩しそして凍結乾
燥した。比活性は12AT−U/μgであつた。
た。非常に浅いグラジエント(毎分B0.06%)を用い、
この混合物を非常に保持時間(RT)の異なる3個の主要
なピーク(ピークI:RT約89分、ピークII:RT約113分、ピ
ークIII:RT約134分、第1図参照)に分解した。これら
主要ピークには小さなサテライトピーク(aおよびb)
が付随する。ピークIII aは例えばRT約130分を有するサ
テライトピークを示し、このものは主要ピークIIIの直
前に溶離される。それに対応して、サテライトピークII
I b(RT約139分)が溶離され、これは主要ピークIIIの
後に溶離される。
ク)を集めることにより、ミクロボア RT−HPLCユニツ
トを用いて種々のイソヒルジン変種の分取用単離を行つ
た。50μgまでを注射しそしてピークの分解に際して顕
著な損失を伴うことなく種々のフラクシヨン(ピーク)
を集めた。充分な量を単離するためには、この操作を数
回反復して同一のフラクシヨンを合し凍結乾燥した。種
々の再クロマトグラフイーピークを「より狭い」分別に
より最終的に精製した。このようにして、イソヒルジン
I a、I、I b、II a、II、II b、III a、IIIおよびIII
bを分離した。
開裂させた。
ら調製、室温で2.5時間放置)100μlをイソヒルジンに
加えた。30分後この混合物を水200μで希釈しそして
次に凍結乾燥した。
調製した0.2M N−メチルモルホリン)50μ中にとつ
た。この目的には基質対酵素=1:100の比率におけるNMM
緩衝液中のトリプシンの溶液を加えた。室温で30分後、
氷酢酸100μの添加により反応を停止させた。得られ
たこの混合物を次にさらにミクロボア RP−HPLCに用い
た。
テムを有する120A PTHアナライザーとオンライン結合し
た477A Pulsed Liquid Phase(TM)タンパクシークエ
ンサー(Appplied Biosystems)を用いて整理配列し
た。配列決定は製造者の指示に従い行つた。その結果を
第3〜15表に示す。
00アミノ酸アナライザーを用いて決定した。その際、分
析は製造者の指示に従つて行つた。試薬および分離カラ
ムは同様にして製造者から購入した。続く積分はLASシ
ステム(Hewlett Packard)を用いて実施した。タンパ
ク質(約30〜50pモル)を4×40mmの石英試験管中で乾
燥しそして窒素雰囲気の下HCl/0.8%フエノール共沸気
相中110℃で加水分解した。インシュリン標準物500pモ
ルを各バツチにつき同時に分析した。
れる方法と同様にして実施した。比活性およびアミノ酸
分析値に関する相当するデータは第1表および第2表に
示される。
再クロマトグラフイーにより精製した。N−末端配列分
析により30個までのアミノ酸の構造を決定できた(第3
表)。酸化およびトリプシン開裂後にフラグメントT2お
よびT3(C−末端ペプチド)を単離して配列を解明し
た。その結果を第4表に示す。
たタンパク混合物からイソヒルジンI aを単離した(RT
約85分)。この生成物を再クロマトグラフイーにより精
製した。続くN−末端配列分析により全構造を決定する
ことができた(第5表)。
離しそして再クロマトグラフイーにより精製した。その
構造はN−末端配列分析により解明した(第6表)。
フラクシヨンII(ピークII:RT約113分)から混合物とし
て単離しそして再クロマトグラフイーした。アミノ酸35
までのイソヒルジンの配列をN−末端配列分析により解
明した。C−末端ペプチド(38〜65)は酸化およびトリ
プシン開裂により単離しそして配列を決定した(第8
表)。イソヒルジンIIおよびII′の全配列分析値を第7
表に示す。その際イソヒルジンII′は前記と同様にして
イソヒルジン混合物IIおよびII′の配列分析中に特性化
された。イソヒルジンII′は20−位のアスパラギンがア
スパラギン酸により置換されている点でイソヒルジンII
と相異する。
の後のタンパク質混合物から単離し(RT約115分)そし
て再クロマトグラフイーにより精製した。第9表に示さ
れる全配列はN−末端配列分析により決定された。付加
的にトリプシン開裂を行いペプチド28〜65が単離された
(第10表)。相当する配列が決定された。
るピークから単離しそして再クロマトグラフイーにより
精製した。N−末端配列分析によりカルボキシル末端ま
での構造を決定することができた(第11表)。イソヒル
ジンIII a′は前記と同様にして配列分析中に特性化さ
れた。イソヒルジンIII a′は11−位のグルタミンがグ
ルタミン酸により、12−位のアスパラギンがアスパラギ
ン酸により、18−位のアスパラギン酸がグリシンによ
り、そして33−位のアスラアギンがアスパラギン酸によ
り交換されている点でイソヒルジンIII aと相違する。
しそして再クロマトグラフイーにより精製した。
と組み合せたN−末端配列分析により全タンパク質の構
造決定ができた(第12および13表)。
このイソヒルジンIIIはより大量に単離されるのでアス
パラギン酸からアスパラギンへの突然変異のタンパク化
学的構造証明がこの物質を用いて付加的に実施された。
5)は求核試薬ヒドロキシルアミンを用いるAsn−Glyペ
プチド結合の選択的開裂について記載している。
ルアミンを含有する緩衝液を初めに調製した。この目的
には、グアニジニウム塩酸塩23gおよびヒドロキシルア
ミン5.5gを氷溶中幾分かの水を用いて混合し、pHは6.5
をこえないようにして4.5M LiOHとはげしく撹拌しなが
ら溶解させた。次にpHを9に調製しそして水を用いてこ
の溶液を50mlとなした。
み緩衝液200μにとりそして次に水浴中45℃で4時間
インキユベーシヨンした。氷酢酸(pH3)200μを加え
て反応を終了させそして試料を凍結乾燥した。次にこの
試料を200μとなるまで濃縮し、C−18変性シリカゲ
ルを充填した逆相カラム(4.6mm×250mm)で脱塩した。
その際のグラジエントは、流速毎分1mlで30分でB0%か
ら100%であつた(緩衝液A:水100%、TFA0.1%;緩衝液
B:AcCN90%、水10%、TFA0.1%)。得られる主フラクシ
ヨンを次にミクロボアHPLCを用いて再クロマトグラフイ
ーした。配列分析(第14表)による特性化によれば2個
のN−末端すなわちVal Val TyrおよびGly Glu Lysを含
有するフラクシヨンF1が単離された。
16−Cys28,Cys22−Cys39)により、ヒドロキシルアミン
による開裂後でも保持されていた。
ン配列のペプチド結合N−Gでヒドロキシルアミン開裂
が起ることが明白に証明される。
るピークから実施例1と同様にして単離されそして再ク
ロマトグラフイーにより精製された。カルボキシル末端
に至るイソヒルジンIII bの構造はN−末端配列分析に
より特性化された(第15表)。イソヒルジンIII b′の
構造は配列分析において同様に決定されてこれも第15表
に示されている。
物質を分離した結果を示す図である。
Claims (3)
- 【請求項1】式(A) を有するイソヒルジンまたはその生理学的に受容できる
塩。 上記式中、AはValであり、BはValであり、CはGlnで
あり、EはAsnであり、FはGluであり、GはGlyであ
り、IはAsnであり、JはLysであり、KはIleであり、
LはAspであり、MはLysであり、NはGlnでありそして
Rは水素またはSO3Hであるか、 AはValであり、BはValであり、CはGlnであり、EはA
snであり、FはGluであり、GはGlyであり、IはAsnで
あり、JはAsnであり、KはIleであり、LはAsnであ
り、MはLysであり、NはGlnでありそしてRは水素また
はSO3Hであるか、 AはIleであり、BはThrであり、CはGlnであり、EはA
snであり、FはGluであり、GはGlyであり、IはAsnで
あり、JはAsnであり、KはLysであり、LはAspであ
り、MはGluであり、NはGlnでありそしてRは水素また
はSO3Hであるか、 AはIleであり、BはThrであり、CはGlnであり、EはA
spであり、FはGluであり、GはGlyであり、IはAsnで
あり、JはLysであり、KはIleであり、LはAsnであ
り、MはGluであり、NはGlnでありそしてRは水素また
はSO3Hであるか、 AはIleであり、BはThrであり、CはGlnであり、EはA
spであり、FはGluであり、GはGlyであり、IはAspで
あり、JはLysであり、KはIleであり、LはAsnであ
り、MはGluであり、NはGlnでありそしてRは水素また
はSO3Hであるか、 AはIleであり、BはThrであり、CはGlnであり、EはA
snであり、FはGluであり、GはGlyであり、IはAsnで
あり、JはLysであり、KはIleであり、LはAsnであ
り、MはGluであり、NはGlnでありそしてRは水素また
はSO3Hであるか、 AはValであり、BはValであり、CはGlnであり、EはA
snであり、FはGluであり、GはAspであり、IはAsnで
あり、JはGluであり、KはIleであり、LはAsnであ
り、MはLysであり、NはGlnでありそしてRは水素また
はSO3Hであるか、 AはValであり、BはValであり、CはGluであり、EはA
spであり、FはGluであり、GはGlyであり、IはAsnで
あり、JはGluであり、KはIleであり、LはAspであ
り、MはLysであり、NはGluでありそしてRは水素また
はSO3Hであるか、 AはValであり、BはValであり、CはGlnであり、EはA
snであり、FはGluであり、GはAspであり、IはAsnで
あり、JはGlnであり、KはIleであり、LはAsnであ
り、MはLysであり、NはGlnでありそしてRは水素また
はSO3Hであるか、 AはValであり、BはValであり、CはGlnであり、EはA
snであり、FはGluであり、GはAspであり、IはAsnで
あり、JはGlnであり、KはIleであり、LはAsnであ
り、MはLysであり、NはGlnでありそしてRは水素また
はSO3Hであるか、または AはValであり、BはValであり、CはGlnであり、EはA
snであり、FはGluであり、GはGlyであり、IはAsnで
あり、JはGlnであり、KはIleであり、LはAsnであ
り、MはLysであり、NはGlnでありそしてRは水素また
はSO3Hである。 - 【請求項2】抽出法、沈殿法およびクロマトグラフィー
法の組み合わせによりヒルからイソヒルジンを単離およ
び精製し、所望の場合は場合により存在するフェノール
エステル基Rを加水分解により除去してフェノール性ヒ
ドロキシル基を生成させ、そして得られるポリペプチド
を場合によりその生理学的に受容されうる塩に変換する
ことからなる請求項1に記載のイソヒルジンの製法。 - 【請求項3】請求項1に記載のイソヒルジンまたはその
生理学的に受容できる塩および製剤上受容されうる付形
剤を含有するトロンビン阻害剤。
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