PT92043B - Processo para a preparacao de novas isohirudinas - Google Patents
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Description
DESCRIÇÃO
A presente invenção refere-se a novos Inibidores de trombina da família das hirudinas, que se distinguem das hirudinas conhecidas atê ao presente por mutação na cadeia proteica.
As hirudinas são conhecidas por exemplo das publicações EP-A 142 860; EP-A 158 564; EP-A 158 986; EP-A 168 342; EP-A 171 024; EP-A 193 175; EP-A 200 655; EP-A 209 061; EP-A 227 938; Chang, FEBS Vol. 164 (1983) 307; J. Dodt et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 367 (1986) 803-811 e D. Tripier, Folia Haematol. Leipzig 115 (1988) 1-2, 30-35. Estas hirudinas podem, no entanto, estar ligadas parcialmente ao suporte através de centros activos, ou através de aminoácidos que participam na ligação à trombina. Além disso as hirudinas conhecidas têm reduzidas propriedades transdérmicas e, devido às elevadas taxas de
eliminação, têm vida curta, de modo que dificultam uma profilaxia estacionaria ou ambulante de tromboses.
Subsiste pois uma necessidade de se en contrarem hirudinas com elevada actividade específica, alta esta bilidade e boa farmacocinética. Além disso, estas hirudinas deve rão caracterizar-se, na fixação a suportes, por melhor capacidade de manipulação química.
Este objectivo é solucionado de acordo
com a invenção pelas | 3 isohirudinas de fórmula (A) |
1 A - B - Tyr - Thr - | 5 10 Asp - Cys - Thr - Glu - Ser - Gly - |
C - E - Leu - Cys - | 15 20 Leu - Cys - F - G - Ser - I - Vai - |
25 Cys - Gly - J - Gly | 30 - Asn - Lys - Cys - K - Leu - Gly - |
3-5 Ser - L - Gly - Glu | 40 - M - Asn - N - Cys - Vai - Thr - Gly - |
45 50 Glu - Gly - Thr - Pro - Lys - Pro - Gin - Ser - His - Asn - | |
55 60 Asp - Gly - Asp - Phe - Glu - Glu - Ile - Pro - Glu - Glu - |
Tyr(R) - Leu - Gin (A) na qual
A representa Vai ou Ile, | |||
B | Vai | Thr, | |
C | n | Gin | Glu, |
E | π | Asn | Asp, |
F | « | Glu | • Gin, |
G | «1 | Asp | Gly, |
I | N | Asp | Asn, |
J | V* | Gin, | Glu, Asn ou Lys, |
K | Ile | ou Lys, | |
L | « | Asp | Asn, |
M | 1* | Lys | * Glu, |
N | n | Gin | Glu e |
R | representa | hidrogénio ou SOgH, |
com a condição de, no caso de J representar Gin, L nao representa Asp,
assim como os seus mutantes e os seus sais fisiologicamente acei -táveis, caso estes possam ser obtidos.
Citam-se especialrnente as seguintes isohirudinas nas quais R representa hidrogénio ou SO3H:
Vai - | Vai | - | Tyr | - | Thr | - | Asp | - | Cys | - | Thr | - | Glu | - | Ser - | |
Gly - | Gin | - | Asn | - | Leu | - | Cys | - | Leu | - | Cys | - | Glu | - | Gly - | |
Ser - | Asn | - | Vai | - | Cys | - | Gly | - | Lys | - | Gly | - | Asn | - | Lys - | |
Cys - | Ile | - | Leu | - | Gly | - | Ser | - | Asp | - | Gly | - | Glu | - | Lys - | (la) |
Asn - | Gin | - | Cys | - | Vai | - | Thr | - | Gly | - | Glu | - | Gly | - | Thr - | |
Pro - | Lys | - | Pro | - | Gin | - | Ser | - | His | - | Asn | - | Asp | - | Gly - | |
Asp - | Phe | - | Glu | - | Glu | - | Ile | - | Pro | - | Glu | - | Glu | - | Tyr(R) - | |
Leu - | Gin | |||||||||||||||
Vai - | Vai | - | Tyr | - | Thr | - | Asp | - | Cys | - | Thr | - | Glu | - | Ser - | |
Gly - | Gin | - | Asn | — | Leu | - | Cys | - | Leu | - | Cys | - | GlU | - | Gly - | |
Ser - | Asn | - | Vai | - | Cys | - | Gly | - | Asn | - | Gly | - | Asn | - | Lys - | |
Cys - | Ile | - | Leu | - | Gly | - | Ser | - | Asp | - | Gly | - | Glu | - | Lys - | (I) |
Asn - | Gin | - | Cys | - | Vai | - | Thr | - | Gly | - | Glu | - | Gly | - | Thr - | |
Pro - | Lys | - | Pro | - | Gin | - | Ser | - | His | - | Asn | - | Asp | - | Gly - | |
Asp - | Phe | - | Glu | - | Glu | - | Ile | - | Pro | - | Glu | - | Glu | - | Tyr(R) - | |
Leu - | Gin | |||||||||||||||
Ile - | Thr | - | Tyr | - | Thr | - | Asp | - | Cys | - | Thr | - | Glu | - | Ser - | |
Gly - | Gin | - | Asn | - | Leu | - | Cys | - | Leu | - | Cys | - | Glu | - | Gly - | |
Ser - | Asn | - | Vai | - | Cys | - | Gly | - | Asn | - | Gly | - | Asn | - | Lys - | |
Cys - | Lys | - | Leu | - | Gly | - | Ser | - | Asp | - | Gly | - | Glu | - | Glu - | (Ha) |
Asn - | Gin | - | Cys | - | Vai | - | Thr | - | Gly | - | Glu | - | Gly | - | Thr - | |
Pro - | Lys | - | Pro | - | Gin | - | Ser | - | His | - | Asn | - | Asp | - | Gly - | |
Asp - | Phe | - | Glu | - | Glu | - | Glu | - | Ile | - | Pro | - | Glu | - | TyR(R) - | |
Leu - | Gin | |||||||||||||||
Ile - | Thr | - | Tyr | - | Thr | - | Asp | - | Cys | - | Thr | - | Glu | - | Ser - | |
Gly - | Gin | - | Asp | - | Leu | - | Cys | - | Leu | - | Cys | - | Glu | - | Gly - | |
Ser - | Asn | - | Vai | - | Cys | - | Gly | - | Lys | - | Gly | - | Asn | - | Lys - | |
Cys - | Ile | - | Leu | - | Gly | - | Ser | - | Asn | - | Gly | - | Glu | - | Glu - | (II) |
Asn - | Gin | - | Cys | - | Vai | - | Thr | - | Gly | - | Glu | - | Gly | - | Thr - | |
Pro - | Lys | - | Pro | - | Gin | - | Ser | - | His | - | Asn | - | Asp | - | Gly - | |
Asp - | Phe | - | Glu | - | Glu | - | Ile | - | Pro | - | Glu | - | Glu | - | Tyr (R) - |
Leu - Gin
Ile - Thr - Tyr - Thr - Asp Gly - Gin - Asp - Leu - Cys Ser - Asp - Vai - Cys - Gly Cys - Ile - Leu - Gly - Ser Asn - Gin - Cys - Vai - Thr Pro - Lys - Pro - Gin - Ser Asp - Phe - Glu - Glu - Ile Leu - Gin
Ile - Thr - Tyr - Thr - Asp Gly - Gin - Asn - Leu - Cys Ser - Asn - Vai - Cys - Gly Cys - Ile - Leu - Gly - Ser Asn - Gin - Cys - Vai - Thr Pro - Lys - Pro - Gin - Ser Asp - Phe - Glu - Glu - Ile Leu - Gin
Vai - Vai - Tyr - Thr - Asp Gly - Gin - Asn - Leu - Cys Ser - Asn - Vai - Cys - Gly Cys - Ile - Leu - Gly - Ser Asn - Gin - Cys - Vai - Thr Pro - Lys - Pro - Gin - Ser Asp - Phe - Glu - Glu - Ile Leu - Gin
Vai - Vai - Tyr - Thr - Asp Gly - Glu - Asp - Leu - Cys Ser - Asn - Vai - Cys - Gly Cys - Ile - Leu - Gly - Ser Asn - Glu - Cys - Vai - Thr Pro - Lys - Pro - Gin - Ser Asp - Phe - Glu - Glu - Ile Leu - Gin
Cys - Thr - Glu - Ser Leu - Cys - Glu - Gly Lys - Gly - Asn - Lys Asn - Gly - Glu - Glu - (II*)
Gly - Glu - Gly - Thr His - Asn - Asp - Gly Pro - Glu - Glu - Tyr(R) -
Cys - Thr - | Glu - | Ser - |
Leu - Cys - | Glu - | Gly - |
Lys - Gly - | Asn - | Lys - |
Asn - Gly - | Glu - | Glu - (Ilb) |
Gly - Glu - | Gly - | Thr - |
His - Asn - | Asp - | Gly - |
Pro - Glu - | Glu - | Tyr(R) - |
Cys ~ Thr - | Glu | - Ser - |
Leu - Cys - | Glu | - Asp - |
Glu - Gly - | Asn | - Lys - |
Asn - Gly - | Glu | - Lys - (IHa) |
Gly - Glu - | Gly | - Thr - |
His - Asn - | Asp | - Gly - |
Pro - Glu - | Glu | - Tyr (R) - |
Cys - Thr | - Glu | - Ser - |
Leu - Cys | - Glu | - Gly - |
Glu - Gly | - Asn | - Lys - |
Asp - Gly | - Glu | - Lys - (Illa') |
Gly - Glu | - Gly | - Thr - |
His - Asn | - Asp | - Gly - |
Pro - Glu | - Glu | - Tyr(R) - |
(III)
Vai - Vai - Tyr - Thr - Asp - Cys - Thr - Glu - Ser Gly - Gin - Asn - Leu - Cys - Leu - Cys - Glu - Asp Ser - Asn - Vai - Cys - Gly - Gin - Gly - Asn - Lys Cys - Ile - Leu - Gly - Ser - Asn - Gly - Glu - Lys Asn - Gin - Cys - Vai - Thr - Gly - Glu - Gly - Thr Pro - Lys - Pro - Gin - Ser - His - Asn - Asp - Gly Asp - Phe - Glu - Glu - Ile - Pro - Glu - Glu - Tyr(R) Leu - Gin
Vai - Vai - Tyr - Thr - Asp - Cys - Thr - Glu - Ser Gly - Gin - Asn - Leu - Cys - Leu - Cys - Gin - Asp Ser - Asn - Vai - Cys - Gly - Gin - Gly - Asn - Lys Cys - Ile - Leu - Gly - Ser - Asn - Gly - Glu - Lys - (Illb)
Asn - Gin - Cys - Vai - Thr - Gly - Glu - Gly - Thr Pro - Lys - Pro - Gin - Ser - His - Asn - Asp - Gly Asp - Phe - Glu - Glu - Ile - Pro - Glu - Glu - Tyr(R) Leu - Gin
Vai - Vai - Tyr - Thr - Asp - Cys - Thr - Glu - Ser Gly - Gin - Asn - Leu - Cys - Leu - Cys - Gin - Gly Ser - Asn - Vai - Cys - Gly - Gin - Gly - Asn - Lys Cys - Ile - Leu - Gly - Ser - Asn - Gly - Glu - Lys - (Illb')
Asn - Gin - Cys - Vai - Thr - Gly - Glu - Gly - Thr Pro - Lys - Pro - Gin - Ser - His - Asn - Asp - Gly Asp - Phe - Glu - Glu - Ile - Pro - Glu - Glu - Tyr(R) Leu - Gin
A presente invenção refere-se ainda a um processo para a preparação das isohirudinas, o qual é caracte rizado por se isolarem e purificarem isohirudinas de sanguessugas com auxilio de uma combinação de métodos de extracçâo, métodos de precipitação e processos cromatogrãficos, por se dissociar um grupo éster fenõlico R eventualmente existente, se desejado hidroliticamente, com formação do grupo hidroxilo fenõlico, e eventualmente por se transformar o polipeptídeo obtido nos seus sais fisiologicamente aceitáveis.
As isohirudinas são de preferência extraídas primeiro como é descrito por F. Markwardt, em Biomed. Biochem. Acta 44 (1985) 1007-1013 ou em EP-A 158 986 e EP-A
209 061, e em seguida promove-se a precipitação da isohirudina bruta. O isolamento e purificação posteriores são realizados por meio de uma combinação de processos cromatograficos, como por exemplo os que são descritos por P. Walsmann em Pharmazie 36 (1981) 860-861. Ê todavia empregue de preferência a seguinte com binação de processos cromatogrãficos:
cromatografia por permuta de iões —* cromatografia de permeação por gel —* cromatografia de afinidade —* cromatografia de permea ção por gel —► cromatografia de permuta de iões —» Micro-Bore RP -HPLC.
Os processos cromatogrãficos individuais sao jã genericamente conhecidos por si.
O processo de acordo com a invenção ca racteriza-se pela combinação de diversos processos cromatogrãficos, inclusive o processo final Micro-Bore RP-HPLC, nos quais são utilizadas colunas com 1 mm de diâmetro interno. Devido a uma reduzida altura de base e â fraca difusão na coluna, resulta daqui xima separação maior do que no caso das colunas tradicionais de 4,6 mm (R. P. W. Scott, J. Chromatographie Science 23 (1986) 233-237; R. Gill, J. Chromatographie 16 (1986) 281).
A instalação Micro-Bore RP-HPLC aqui utilizada consiste em dois módulos Beckmann 114 M Solvent Delive ry, que são controlados por um 421A Controller. As condutas de tampão para cada bomba - de tubo de aço passivado V8 de 1/8 nomi nal - são ligadas através de uma peça em T com um misturador de microgradiente dinâmico que homogeniza as soluções tampão, sendo as pulsações resultantes interceptadas por um amortecedor de pul sacões ligado em serie (Waters part nr. 98060) e a solução tampão é introduzida na coluna Micro-Bore através de uma válvula Reodyne de um amostrador (Gilson Abimed modelo 231, Dilutor mode lo 401). A coluna Micro-Bore (Applied Biosystems, n9 de catalogo 400422 Rp) cheia com Aquapore RP-300 (300 Ã pore size 7 pm spherical Silica) é colocada numa estufa (Sykam S 4110, temperatura 409 C). Detecta-se a 205 nm com um detector UV (Sykam S 3300) que é ligado e ajustado a 0,08 AUFS. 0 registo é realizado por meio de um registador de compensação (10 rav FS) e a integração é realizada com o sistema LAS (Hewlett Packard) por conversão A/D (HP 18625A A/D Convertor). Ê optimizado para um trabalho com gra
diente linear.
São utilizadas como tampões as seguintes misturas A e B:
A: 90% em peso de ãgua, 10% em peso de acetonitrilo (AcCN) + 0,1% em volume de ãcido trifluoracetico (TFA)
B: 90% em peso de AcCN, 10% em peso de ãgua + 0,1% em volume de TFA.
Ho presente caso utilizam-se três gradientes diferentes para os diversos passos de separação e purifi cação:
a) Para a separação das isohirudinas entre si nos campos anallti co e preparativo:
0% de B atê 40% de B (taxa de acréscimo 0,06% B/minuto)
b) Para cromatografia e purificação final:
0% £ atê 35% B (taxa de acréscimo 0,4% B/mlnuto)
c) Para a separação de peptídeos:
0% B até 30% B (taxa de acréscimo 1,7% B/minuto).
Tabalha-se com um débito de 80 μΐ/minuto e procede-se ao fracclo namento manualmente.
Através da utilização de acordo com a invenção de Micro-Bore RP-HPLC - adicionalmente aos processos jã conhecidos de isolamento e purificação - jã é possível realizar-se outras novas separações de peptídeos. Infelizmente, porém, ainda ocorrem por vezes casos nos quais, devido a uma afinidade demasiado grande dos componentes individuais, também nestes casos a separação permanece incompleta. Ê o caso por exemplo quanto às isohirudinas II e II’; Illa, Illa’; Illb e Illb'. O sinal * significa pois que estas mutações foram encontradas durante a análise sequencial das proteínas com afinidade, isto ê, foram se quencladas em simultâneo. Assim por exemplo, na anãllse da isohi rudina II no passo de degradação 20 encontrou-se a isohirudina II’ .
As novas isohirudinas descritas no pre sente pedido de patente são purificadas primeiro de acordo com métodos jã conhecidos da literatura, incluindo a cromatografia de afinidade em colunas trombina-Sepharose. Seguldamente a isohi rudina mista resultante ê separada nos seus componentes por meio
de Micro-Bore RP-HPLC. No caso de problemas dificeis de separação as fracções isoladas são recromatografadas em condições 11geiramente modificadas. Cada nova lsohirudina é purificada até à homogeneidade ou quase homogeneidade, e é perfeitamente elucidada na sua sequência, determinando-se em alguns casos não sõ a se quência de aminoácidos por análise sequencial, mas utilizando-se adicionalmente métodos proteico-químicos, como dissociação quími ca específica, para se estabelecerem as novas sequências.
A análise de aminoácidos ê realizada com um analisador de aminoácidos Beckmann 6300 de acordo ccm as indicações do fabricante. Para isso as proteínas (30-50 pmol) fo ram secas previamente num tubo de ensaio de quartzo de 4 x 40 mm e em seguida hidrolizou-se na fase vapor com a mistura azeotrõpi ca HCl/0,8% fenol sob atmosfera de azoto, a 1109 C. Para cada preparado analizam-se em simultâneo 500 pmol de insulina Standard. A integração é realizada com o sistema LAS (Hewlett Packard).
Por análise de sequência automatizada da proteína nactlva determina-se a sequência de aminoácidos N-terminal. Trabalha-se com um aparelho 477A Pulsed liquid-phase (TM) Protein Sequencer da firma Applied Biosystems, de acordo com as indicações do fabricante, o qual estã acoplado em série (on-line) com um 120 A PTH Analysator com um sistema de avaliação de dados.
Em alguns casos, isto é, para as lsohl rudinas I, II, Ilb, III e Illa, realiza-se adicionalmente uma dissociação de peptldeos específica de protease. Para isso oxidam-se primeiro as pontes de dissulfureto de cada uma das proteínas com ãcido perfõrmico, transformando-se a cisteina em ãcido cisteínico. Estas oxidação dá origem a que a proteína perca a sua configuração espacial e forme agora um polímero (um novelo: de aminoácidos sem configuração solidamente definida. Depois da oxidação a mistura reactiva ê liofilizada, a proteína obtida é dissociada num tampão apropriado com tripsina, a mistura de peptídeos ê separada nos seus componentes individuais por melo de Micro-Bore RP-HPLC e é Isolada por uma via de trabalho preparati va. Em seguida, através da análise de aminoácidos, determina-se a sequênc£a primária destes peptldeos. Para a dissociação especl
fica utiliza-se de preferência tripsina, uma protease de serina que promove a dissociação depois de um aminoãcido básico, isto é, depois de Arg ou Lys.
As novas isohiridinas de fórmula A podem ainda ser preparadas analogamente ao processo descrito na es pecificação EP-A 171 024.
As isohirudinas de acordo com a invenção são inibidores específicos de trombina. A inibição quantitativa de trombina através dos inibidores de acordo com a invenção mostra que o complexo inibidor de trombina/trombina praticamente não dissocia.
Com auxilio dos testes de inibição de trombina descritos adiante pode determinar-se, durante a recuperação e purificação, a actividade e, consequentemente, o grau de pureza das isohirudinas de acordo com a invenção. As isohirudlnas assim purificadas, de fórmula geral (A), possuem neste caso uma inibição de trombina de 12-16 ΑΤ-ϋ/pg (unidades antitrombina/pg) .
TESTE DE INIBIÇÃO DE TROMBINA PARA DETERMINAÇÃO DA ACTIVIDADE
O teste é realizado com um volume total de 200 pl em placas de microtltulo de 96 cavidades, ã temperatura ambiente. Depois de uma pré-incubação da trombina (trombi na de vitelo 50 NIH-D/mg (Firma Merck, art9 n9 12374); solução de base: 40 NIH-U/ml em 20 mM MES pH 6, 0,154 mM NaCl, 0,2% PEG 6000, 1% BSA) num volume final de 100 pl com 1 a 50 pl de isohirudina, realiza-se o arranque da reacção por adição de substrato. Como as actividades, nas gamas de medição do teste, estão compre endidas entre 0,03 e 0,15 AT-U, as amostras a ensaiar têm que ser diluídas de forma correspondente com um tampão de ensaio.
Introduz-se previamente a quantidade necessária do tampão de ensaio (50 mM tris/HCl, pH 8; 154 mM NaCl 0,2% de polietilenoglicol 6000) por cada cavidade da placa de mi crotltulo. Seguidamente adicionam-se a cada uma 50 pl 4 NIH-D/ml de solução de trombina (ver acima) e adiciona-se a amostra. Depois de um tempo de incubação de 10 minutos inicia-se em seguida a reacção por adição de 100 pl 1 mM Chromozym TH (Firma Boehrin9 ger, art9 nQ 206849; 10 mM em ãgua/HCl, pK 6; solução de ensaio:
mM diluído com tampão de ensaio). Depois de incubação durante a 10 minutos do resto de trambina com o substrato de cromogéneo determina-se então fotometricamente, a 405 nm, a nitroanilina libertada. Não é necessária uma paragem de reacção desde que (R) se disponha de um aparelho ELISA-Reader (Easy-Reader EAR 400 (SLT-Labinstruments, Ãustria) para a leitura rãpida das cavidades da placa de microtltulo. Em princípio também não é necessário um padrão de hirudina, visto que pela utilização de uma acti vidade de trombina definida é possível fazer-se uma determinação absoluta de unidades antitrombina. De resto a inactivação sucessiva da solução de ensaio conduz a um erro sistemático que pode ser eliminado se se referirem os valores medidos a um padrão de hirudina definido. O ensaio i então independente da concentração absoluta de trombina e permite determinações reproductíveis.
Foram utilizados os seguintes controles:
a) branco a solução de trombina é substituída por um tampão (regulação do zero fotométrico)
b) valores de trombina uma das cavidades da placa de microtltulo é deixada sem inibi dor,
c) padrão de hirudina sobre uma cavidade da placa de microtltulo adicionam-se 0,07 - 0,1 AT-U de um padrão de hirudina conhecido (Hirudin Pentapharm purified by affinity chramatography, actividade específica: 10 AT-U/pg, concentração: 0,1 AT-U/50 jul).
Para se estabelecerem as concentrações das amostras determinou-se, para o Micro-Bore HPLC, uma curva pa drão para um 1 a 20 jug de isohirudina.
O quadro 1 adiante apresenta os valores de concentração determinados com o Micro-Bore HPLC relativamente aos valores determinados pelo teste de inibição de trombina:
QUADRO 1:
QUADRO 1;
Isohirudina | concentração /pg/ml/ | AT-U/pg | |
Micro-Bore | HPLC Teste de inibição • de trombina | ||
la | 56 | 59 | 14 |
I | 56 | 62 | 15 |
Ib | 34 | 38 | 16 |
lia | 68 | 72 | 15 |
II | 120 | 140 | 16 |
Ilb | 137 | 145 | 16 |
Iíia | 84 | 87 | 12 |
III | 397 | 533 | 16 |
Illb | 97 | 109 | 14 |
A invenção refere-se pois, também, à utilização de isohirudinas de formula (A) como inibidores de coa gulação do sangue, para utilização na profilaxia e terapia de processos tromboembólicos, assim como â sua utilização como meios de diagnóstico e reagentes. Além disso as isohirudinas de acordo com a invenção podem também ser acopladas a um suporte, formando -se deste modo derivados com acção inibitória de trombina retardada, como se propõe no Pedido de Patente Alemã P 3 819 079.6.
A invenção refere-se ainda a composições farmacêuticas gue contêm uma isohirudina de fórmula (A) num suporte farmaceuticamente aceitável.
Estas composições podem ter aplicação, espeeialmente para as indicações acima referidas, se forem administradas por exemplo por via parentérica (tal como intravenosa, intracutânea, intramuscular ou subcutânea, por via oral ou tópica. A dose depende primeiramente da forma específica de administração e do objectivo da terapia, ou profilaxia. A grandeza dae doses individuais, assim como o esquema de administração, podem ser fixados da melhor forma com base numa avaliação individual do quadro clínivo particular; os métodos necessários para o efei to, para determinação de factores sanguíneos relevantes, são do domínio dos especialistas. Em casos normais para uma injecção a
quantidade terapeuticamente eficaz das isohirudinas de acordo com a invenção situa-se num intervalo de doses de cerca de 0,005 até cerca de 0,1 mg/kg de peso corporal. Ê preferido o intervalo de cerca de 0,01 atê cerca de 0,05 mg/kg de peso corporal. A administração ê realizada por injecção intravenosa, intramuscular ou subcutânea. Em conformidade, as composições farmacêuticas para administração parentérica na forma de doses individuais contêm, em função do tipo de aplicação, cerca de 0,4 a cerca de 7,5 mg por dose da isohirudina de acordo com a invenção. Além da substância activa estas composições farmacêuticas contêm habitualmente ainda um tampão, por exemplo um tampão de fosfato que permite manter o valor de pH entre cerca de 3,5 e 7, e ainda cio reto de sódio, manite ou sorbite para ajustamento da isotonia. Podem apresentar-se na forma liofilizada ou em forma dissolvida, podendo as soluções conter vantajosaraente, um conservante com ac ção antibacteriana, por exemplo 0,2 a 0,3% de 4-hidroxibenzoato de metilo ou de etilo.
Dm preparado para a aplicação tópica pode ser apresentado como solução aquosa, loção ou geleia, solução oleosa ou suspensão, ou creme de base gorda ou especialmente de um creme de emulsão. Dm preparado na forma de solução aquosa é obtido por exemplo dissolvendo-se a substância activa de acordo com a invenção, ou um sal terapeuticamente utilizável da mesma, numa solução tampão aquosa de pH 4 a 6,5, e adicionando-se eventualmente uma outra substância activa, por exemplo um antiin flamatório, e/ou um aglutinante polimérico, por exemplo polivinilpirrolidona, e/ou um conservante. A concentração da substância activa é de cerca de 0,08 a cerca de 1,5 mg, de preferência de 0,25 a 1,0 mg, em cerca de 10 ml de uma solução ou am 10 g de uma geleia.
Uma forma de aplicação oleosa para a administração tópica ê obtida por exemplo por suspensão da substância activa de acordo com a invenção, ou de um sal terapêutica mente aceitável do mesmo, num óleo, eventualmente com adição de desintegrantes, como estearato de alumínio, e/ou de meios tensio activos cujo valor HLB (hydrophilic-lipophilic-balance) é infe rior a 10, tais como monoêsteres de ácido gordo com álcoois poli
funcionais, por exemplo monoestearato de glicerina, monolaurato de sorbitano, monoestearato de sorbitano ou monooleato de sorbitano. Uma pomada de base gorda pode ser obtida por exemplo pondo -se em suspensão a substância activa de acordo com a invenção, ou os seus sais, numa base de gordura capaz de ser estendida, eventualmente com adição de um meio tensioactivo de valor HLB in ferior a 10. Obtêm-se uma pomada de emulsão por trituração de uma solução aquosa da substância activa de acordo com a invenção ou de um seu sal, numa base de gordura branda capaz de ser esten dida, com adição de um meio tensioactivo cujo valo» HLB seja inferior a 10. Todas estas formas de aplicação tópica podem também conter conservantes. A concentração da substância activa ê de cerca de 0,08 até cerca de 1,5 mg, de preferência de 0,25 a 1,0 mg, em cerca de 10 g da massa de base.
Além das composições farmacêuticas des critas acima e das idênticas a estas, que se destinam a uma utilização medicinal directa no corpo do homem ou de um mamífero, a presente invenção refere-se também a composições farmacêuticas e a preparados para utilização medicinal exteriorraente ao corpo vi vo do homem ou dos mamíferos. Estas composições e preparados são utilizados em primeiro lugar como aditivos de sangue inidores de 'coagulação, o qual ê submetido, exteriormente ao corpo, a uma circulação ou tratamento (por exemplo diálise em rins artificiais) , conservação ou modificação (por exemplo hemosseparação).
Na sua composição estes preparados, quer como soluções concentra dos ou também como composições na forma de dose individual, são preparados de forma idêntica as composições injectãveis descritas acima; no entanto a quantidade ou concentração da substância activa é referida preferivelmente ao volume do sangue a tratar, ou, mais exactamente ainda, ao seu teor de trcmbina. Ê de notar neste caso que as substâncias activas de acordo com a invenção (na forma livre) (a) desactivam completamente uma quantidade de trombina aproxima damente cinco vezes maior do que o seu peso;
(b) em quantidades maiores também são fisiologicamente inócuas; e (c) separam-se muito rapidamente do sangue em circulação, mesmo em altas concentrações, de modo que não existe qualquer risco de uma dose excessiva, mesmo no caso por exemplo de trans
fusões. Consoante a finalidade específica, a dose apropriada ê de cerca de 0,01 atê cerca de 1,0 mg de substância activa/ /litro de sangue, podendo ainda ser ultrapassado este limite superior sem qualquer risco.
Pertencem também aos objectivos da pre sente invenção a utilização bioanalítica dos compostos de acordo com a invenção e dos seus sais, para determinação da trombina, assim como preparados contendo as substâncias activas de acordo com a invenção que satisfaçam àquela finalidade, por exemplo mi£ turas solidas e sobretudo soluções, especiaimente soluções aquosas; estas, além de uma quantidade ou concentração exacta da substância activa de acordo com a invenção (também na forma de um seu sal) podem conter ainda convenientemente substâncias auxi liares inertes, por exemplo as que foram jã mencionadas anterior mente a respeito das soluções injectãveis, que têm como finalida de por exemplo uma acção estabilizadora e/ou conservante. Estes preparados são utilizados em bioanãlises, de forma conhecida, análoga à dos preparados de hirudina, por exemplo para a determi nação de trombina.
Além disso, os compostos de acordo com a invenção são utilizáveis para conservação do sangue. Com esta finalidade adicionam-se os compostos de acordo com a invenção às conservas de sangue preferivelmente numa quantidade de 0,1 a 2% em peso.
Os exemplos que se seguem servem para uma melhor elucidação da presente invenção. Aqui, ao contrário da descrição anterior e das reivindicações, o código de letras é utilizado como designação abreviada para aminoãcidos.
CÕDIGO DE TRÊS | LETRAS Ξ UMA | LETRA DOS AMINOÁCIDOS | |
Aminoãcido | Abreviatura | Aminoácido Abreviatura | |
Alanina | Ala (A) | Prolina | Pro (P) |
Arginina | Arg (R) | Serina | Ser (S) |
Cisteina | Cys (C) | Treonina | Thr (T) |
Glicina | Gly (G) | Triptofano | Trp (W) |
Histidina | His (H) | Tirosina | Tyr (Y) |
Isoleucina | Ile (I) | Valina | Vai (V) |
Leucina | Leu (L) | Ácido aspãragico | Asp (D) |
Lisina | Lys (K) | Asparagina | Asn (N) |
Metionina | Met (M) | Ácido glutâmico | Glu (E) |
Fenilalanina | Phe (F) | Glutamina | Gin (Q) |
EXEMPLO 1
Isolamento das isohirudinas Ia, I, Ib, lia, II, Ilb, Illa, III, Illb, oxidação, dissociação trlptica, análise de sequência e anã lise de aminoácidos
a) Isolamento isolamento das novas isohirudinas se guiu em principio o processo conhecido da Literatura (P. Walsraann, Trorabosis Research 40 (1985) 563-569). Apenas os passos mais importantes são aqui referidos. Depois da extracção da parte anterior do gel de sangue com 40% de acetona e precipitação das substâncias excedentes com ácido acético, o extracto de hiru dina enriquecido foi precipitado com acetona. O sedimento foi pu - (R) ~ rifiçado através de ura permutador de iões (por exemplo DEAE-Sephacel) em tampão tris/HCl (pH 7,4) com auxílio de um gradien te de cloreto de sódio. As fracções activas no teste antitrombina foram reunidas e liofilizadas. Os constituintes da solução tampão foram em seguida separados às porções através de Sepha dex G 25 em ãgua, as fracções activas foram incorporadas em tampão tris/HCl 0,1 M (pH 8,0) e aplicadas numa coluna trombina-Sepharose e depois da lavagem com o mesmo tampão foram eluidas
com acetato de sõdio 0,1 M/cloreto de sõdio 0,5 M (pH 5,0). Neste caso eluiu-se também uma parte de hirudina. As fracções de hi rudina pura foram seguidamente eluídas com tris/HCl 0,1 M/benzamidina 1,5 M (pH 8,0). Por acoplamento da trombina-Sepharose sobre uma coluna de 'Sephadex G 25 realizou-se em seguida, com um débito reduzido, a eluiçao da hirudina com uma separação do inibidor de trombina benzamidina. Depois da liofilização as frac ções activas foram purificadas por cromatografia através de um ~ (r) ~ permutador de ioes por meio de SE- Sephadex em tampao de aceta to de araõnio 0,01 M (pH 3,8) e eluiçao com um gradiente de clore to de sõdio. Isolaram-se 3 fracções activas. A fracção II foi li (R) berta de sais através de 'Sephadex e liofilizada. A actividade específica ê de 12 AT-U/pg.
A fracção II não unitária foi utilizada para o Micro-Bore RP-HPLC. Utilizando-se gradientes muito fra cos (0,06% de B por minuto) a mistura foi desdobrada em três picos principais com tempos de retenção (RT) muito diferentes (pico I: RT cerca de 89 minutos; pico II; RT cerca de 113 minutos; pico III: RT cerca de 134 minutos; ver fig. 1). Estes picos prin cipais são acompanhados de pequenos picos satélites (a e b). O pico Illa designa por exemplo o pico satélite com tempo de reten ção de cerca de 130 minutos, o qual é eluído imediatamente antes do pico principal III. Analogamente o pico satélite Illb (RT cer ca de 139 minutos) designa o pico eluído depois do pico principal III.
Por cuidadoso aumento das quantidades injectadas e da recolha das fracções (picos) utilizou-se a insta lação Micro-Bore RP-HPLC para isolamento preparativo das diversas variantes de isohirudina. Foram injectados atê 50 pg e recolheram-se as diversas fracções (picos) sem se notarem perturbações na formação dos picos. Para se isolarem quantidades suficientes este processo foi repetido varias vezes e as fracções idên ticas foram reunidas e liofilizadas. Em seguida os diversos picos foram sujeitos a recromatografia e realizou-se a purificação final por fraccionamentos mais estreitos. Deste modo foram separadas as lsohirudlnas Ia, I, Ib, Ila, II, Ilb, Illa, III, Illb.
As substâncias puras foram oxidadas
conforme necessário e foram dissociadas com tripsina.
b) Dissociação oxidante dos dissulfuretos
As isohirudinas foram misturadas com 100 μΐ de solução de ãcido perfórmico (preparado a partir de 50 pi de peróxido de hidrogénio e 950 jul de ácido fõrmico; deixa-se repousar 2,5 horas â temperatura ambiente). Passados 30 minutos diluiu-se com 200 μΐ de ãgua e seguidamente liofilizou-se.
c) Dissociação com tripsina
As isohirudinas oxidadas foram tomadas em 50 μΐ de tampão NMM (N-metilmorfolina 0,2 M ajustada a pH 8 com ãcido acético). Adicionou-se-lhe uma solução de tripsina em tampão NMM na proporção substrato/enzima » 1:100. Depois de 30 minutos à temperatura ambiente a reacção foi parada por adição de 100 ul de ácido acético. Esta mistura assim obtida foi depois utilizada poeteriormente para a Micro-Bore RP-HPLC.
d) Análise de sequência
As isohirudinas isoladas e purificadas foram sequenciadas com um sequenciador de proteínas 477A Pulsed Liquid Phase (TM) (Firma Applied Biosystems) que estava acoplado em série com um 120 A PTH-Analysator com sistema de avaliação de dados. Trabalhou-se de acordo cam as indicações do fabricante.
Os resultados estão indicados nos quadros 3 a 15.
e) Análise de aminoãcidos
A composição dos aminoãcidos das isoh_i rudinas individuais foi determinada cora um analisador de aminoãcidos Beckman 6300. Neste caso trabalhou-se em concordância com as indicações do fabricante. Os reagentes e a coluna de separação foram igualmente do fabricante referido. A integração subsequente foi realizada com o sistema LAS (Hewlett Packard). As pro teinas (cerca de 30 a 50 pmol) foram secas num tubo de ensaio de quartzo com 4 x 40 mm e hidrolizou-se na fase vapor de mistura azeotrópica HCl/0,8% de fenol sob atmosfera de azoto, a 1109 C.
Para cada preparado foram analisados simultaneamente 500 pmol de insulina Standard.
O quadro 2 adiante mostra os resultados obtidos.
QUADRO 2:
Análise de aminoácidos
Isohirudinas Ia I lia II Ilb
a | b | a | b | a | b | a | b | a | b | |
Asx | 9,6 | 9 | 9,8 | 10 | 9,9 | 10 | 9,1 | 9 | 9,2 | 9 |
Thr | 3,8 | 4 | 3,7 | 4 | 4,7 | 5 | 4,5 | 5 | 4,6 | 5 |
Ser | 3,4 | 4 | 3,4 | 4 | 3,6 | 4 | 5,6 | 4 | 3,7 | 4 |
Glx | 12/2 | 12 | 13,3 | 12 | 13,2 | 13 | 13,9 | 13 | 13,2 | 13 |
Pro | 2,3 | 3 | 2 | 3 | 2,2 | 3 | 2,1 | 3 | 2,1 | 3 |
Gly | 9,3 | 9 | 9 | 9 | 9,6 | 9 | 10,1 | 9 | 9,1 | 9 |
Cys/2 | 4 | 6 | 4,5 | 6 | 3,9 | 6 | 3,6 | 6 | 4,5 | 6 |
Vai | 2,9 | 4 | 3,0 | 4 | 1,9 | 2 | 1,9 | 2 | 1,8 | 2 |
Ile | 1,8 | 2 | 1,8 | 2 | 1,7 | 2 | 2,3 | 2 | 1,8 | 2 |
Leu | 3,7 | 4 | 4,0 | 4 | 3,8 | 4 | 3,4 | 4 | 4 | 4 |
Tyr | 1,9 | 2 | 1,9 | 2 | 1,8 | 2 | 0,6 | 2 | 1,9 | 2 |
Phe | 0,9 | 1 | 0,9 | 1 | 1 | 1 | 0,9 | 1 | 0,9 | 1 |
His | 1 | 1 | 0,9 | 1 | 0,9 | 1 | 1,3 | 1 | 0,1 | 1 |
Lys | 2,8 | 4 | 2,9 | 3 | 3,1 | 3 | 2,5 | 3 | 2,8 | 3 |
Illa | III | Illb | ||||||||
a | b | a | b | a | b | |||||
Asx | 10 | 10 | 10 | 10 | 9,5 | 10 | ||||
Thr | 3,9 | 4 | 3,8 | 4 | 3,7 | 4 | ||||
Ser | 3,7 | 4 | 4 | 4 | 3,2 | 4 | ||||
Glx | 13,6 | 13 | 13,7 | 13 | 13,1 | 13 | ||||
Pro | 2,1 | 3 | 2,2 | 3 | 2,4 | 3 | ||||
Gly | 9,4 | 9 | 9,4 | 9 | 9,1 | 9 | ||||
Cys/2 | 4,8 | 6 | 3,9 | 6 | 4,1 | 6 | ||||
Vai | 2,9 | 4 | 2,5 | 4 | 2,8 | 4 | ||||
Ile | 1,9 | 2 | 1,7 | 2 | 1,9 | 2 | ||||
Leu | 4,2 | 4 | 3,9 | 4 | 4 | 4 | ||||
Tyr | 1,7 | 2 | 1,2 | 2 | 1,7 | 2 |
Isohirudinas | Illa | III | Illb | |||
a | b | a | b | a | b | |
Phe | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
His | 0,9 | 1 | 1 | 1 | 0,9 | 1 |
Lys | 3 | 3 | 2,9 | 3 | 2,7 | 3 |
a: determinado b: calculado.
Nos exemplos 2 a 9 adiante trabalhou-se de forma análoga â descrita no Exemplo 1. Os correspondentes dados sobre a actividade específica e a análise dos aminoácidos estão indicados nos quadros 1 e 2.
EXEMPLO 2
Isohirudina I
A isohirudina I foi isolada do pico I (RT cerca de 89 minutos) e foi purificada por recromatografia. A análise de sequência N-terminal possibilitou a determinação da estrutura até 30 aminoãcidos (quadro 3). Depois da oxidação e dissociação com tripsina foram isolados os fragmentos T2 e T3 (peptídeo C-terminal) e elucidaram-se as sequências. Os resultados estão representados no quadro 4.
QUADRO 3
Análise de sequência quantitativa da isohirudina I | ||||||||||||
1 | 5 | 10 | ||||||||||
Aminoácido | V | V | Ϊ | T | D | C | T | E | s | G | Q | N |
pmol | 107 | 90 | 76 | 48 | 30 | nb | 21 | 29 | 13 | 30 | 19 | 20 |
Aminoãcido | L | C | 15 L | C | E | G | S | 20 N | V | C | G | N* |
pmol | 18 | nb | 6 | nb | 11 | 16 | 12 | 17 | 15 | nb | 12 | 13 |
Aminoãcido | 25 G | N | K | C | I | 30 L | G | S | D | G | E | K |
pmol | 11 | 8 | 6 | nb | 5 | 5 |
- 19 Aminoãcido pmol
Aminoãcido pmol
Aminoãcido pmol
N C C
Q S H
E E Y
* Permuta de aminoãcidos por nb: não determinável comparação com (1)
V V Y T C G Q G E G T P L Q
L C K N EE E
E G S Ν V
Q C V T G
I Ρ E E Y*
Y* Sulfatotirosina (1)
QUADRO 4
Análise de sequência quantitativa dos produtos dissociados com tripsina da ieohirudina I
Peptideo T2
Aminoãcidos
T2 pmol
Peptideo T3
Aminoãcidos
T3 pmol
Aminoãcidos
T3 pmol
Aminoãcidos
T3 pmol
28 C | I | 30 L | G | S | D | G | 35 E | K | |||
nb | 204 | 156 | 128 | 40 | 63 | 68 | 23 | 8 | |||
37 N | Q | C | 40 V | T | G | E | G | T | P | K | P |
159 | 178 | nb | 105 | 89 | 122 | 89 | 86 | 63 | 57 | 58 | 25 |
Q | 50 S | H | N | D | G | 55 D | F | E | E | I | 60 P |
36 | 12 | 6 | 12 | 9 | 10 | 11 | 7 | 7 | 3 | 4 | 5 |
E | E | Y | L | 65 Q | |||||||
4 | 4 | 1 | 1 | 3 |
nb: não determinável
EXEMPLO 3
Isohirudina Ia
Analogamente ao Exemplo 1 isolou-se a isohirudina Ia a partir da mistura de proteínas que tinha sido obtida a partir do pico I (RT cerca de 85 minutos). O produto foi purificado por recromatografia. A análise de sequência N-terminal posterior permitiu determinar a estrutura global (Quadro 5).
QUADRO 5
Análise de sequência quantitativa da isohirudina Ia 15 10
Aminoácidos | V | V | Y | T | D | C | T | E | S | G | Q | N |
pmol | 336 | 334 | 297 | 614 | 161 | nb | 339 | 114 | 241 | 185 | 196 | 181 |
Aminoácidos | L | C | 15 L | C | E | G | S | 20 N | V | C | G | K* |
pmol | 188 | nb | 173 | nb | 123 | 156 | 130 | 149 | 146 | nb | 132 | 118 |
Aminoácidos | 25 G | N | K | C | 30 I | L | G | S | D | G | 35 E | K |
pmol | 122 | 118 | 78 | nb | 71 | 84 | 71 | 53 | 69 | 76 | 60 | 69 |
Aminoácidos | N | Q | C | 40 V | T | G | E | G | 45 T | P | K | P |
pmol | 60 | 61 | nb | 46 | 39 | 43 | 37 | 39 | 24 | 16 | 28 | 19 |
Aminoácidos | Q | 50 S | H | N | D | G | 55 D | F | E | E | I | 60 P |
pmol | 17 | 11 | 6 | 16 | 12 | 9 | 11 | 13 | 6 | 5 | 5 | 3 |
Aminoácidos | E | E | Y | L | 65 Q | |||||||
pmol | 4 | 4 | 3 | 3 | 2 | |||||||
* permuta de | aminoácidos | por | comparação | com | (1) | |||||||
nb: não determinado. | ||||||||||||
EXEMPLO 4 | ||||||||||||
Isohirudina | lia | |||||||||||
A | isohirudina | lia | foi | isolada | a partir | |||||||
do pico lia | (RT | cerca de | 107 | minutos) e | foi | purificada por croma |
tografia. Através da análise de sequência N-terminal deduziu-se a estrutura (Quadro 6).
QUADRO 6
Analise de sequência quantitativa da isohirudina lia
Aminoácidos | 1 I* | T* | y | T | 5 D | C | T | E | S | 10 G | Q | N |
pmol | 423 | 372 | 377 | 310 | 368 | nb | 392 | 274 | 295 | 261 | 287 | 271 |
Aminoácidos | L | C | 15 L | C | E | G | S | 20 N | V | C | G | N* |
pmol | 258 | nb | 241 | nb | 230 | 228 | 227 | 226 | 218 | nb | 223 | 210 |
Aminoácidos | 25 G | N | K | C | K* | 30 L | G | S | D | G | 35 E | E* |
pmol | 191 | 149 | 200 | nb | 171 | 182 | 169 | 176 | 162 | 145 | 135 | 125 |
Aminoácidos | N | Q | C | 40 V | T | G | E | G | 45 T | P | K | P |
pmol | 115 | 126 | nb | 107 | 105 | 96 | 93 | 92 | 79 | 72 | 71 | 62 |
Aminoácidos | Q | 50 S | H | N | D | G | 55 D | F | E | E | I | 60 P |
pmol | 60 | 49 | 55 | 52 | 50 | 41 | 43 | 47 | 30 | 31 | 30 | 16 |
Aminoácidos | E | E | y | L | 65 Q | |||||||
pmol | 15 | 15 | 17 | 12 | 12 | |||||||
* permuta de | aminoácidos | por | comparação | com | (1) |
nb: não determinável.
EXEMPLO 5
Isohirudinas II e II’
Analogamente ao Exemplo 1 isolaram-se as isohirudinas II e II' em mistura, a partir da fracção II (pico II; RT cerca de 113 minutos) e foram purificadas por recrcmatografia. Por meio da análise de sequência N-terminal deduziram-se as sequências das isohirudinas até ao aminoácido 35. O peptl deo C-terminal (28-65) foi isolado depois da oxidação e dissocia ção com tripsina e determinou-se a sequência (Quadro 8). A anãli se de sequência global das isohirudinas II e II' estã indicada no Quadro 7. A isohirudina II', como já foi descrito anteriormen te, foi caracterizada durante a análise de sequência da mistura de isohirudinas II e II'. A isohirudina II' destingue-se da isohlrudina II pela troca de asparagina por ãcido aspãrgico na posi
QOADRO 7
Analise de sequência quantitativa das isohirudinas II e 11' | |||||||||||
1 | 5 | 10 | |||||||||
Aminoãcidos | I* | T* Y | T | D | C | T | E | S | G | Q | D* |
II | |||||||||||
pmol | 311 | 268 278 | 267 | 242 | nb | 169 | 175 | 165 144 | 165 | 163 | |
Aminoãcidos | L | 15 C L | C | E | G | S | 20 N | V | C | G | K* |
II | |||||||||||
pmol | 150 | nb 132 | nb | 124 | 109 | 116 | 124 | 110 | nb | 111 | 110 |
Aminoãcidos | D** | ||||||||||
11' pmol Aminoãcidos II | 25 G | N K | C | I | 30 L | G | 4 5 | N* | G | 35 E | E* |
pmol | 98 | 89 74 | nb | 66 | 55 | 43 | 70 | 49 | 51 | 45 | 28 |
Aminoãcidos | N | Q C | 40 V | T | G | E | G | 45 T | P | K | P |
II | |||||||||||
pmol | 20 | 22 nb | 17 | 12 | 13 | 10 | 3 | 15 | |||
Aminoãcidos | Q | 50 S H | N | D | G | 55 D | F | E | E | I | 60 P |
II pmol Aminoãcido II pmol | E | Ε Y | L | 65 Q | |||||||
* permuta | de aminoãcidos por comparação com (1) | ||||||||||
** permuta | de aminoãcidos por comparação com II | ||||||||||
nb: não determinável. |
QUADRO 8
Análise de sequência quantitativa do produto de dissociação com tripsina das isohirudinas II e II*
Aminoãcidos | 28 C | I | 30 L | G |
pmol | nb | 266 | 242 | 250 |
Aminoãcidos | 40 V | T | G | E |
pmol | 144 | 125 | 138 | 126 |
Aminoãcidos | N | D | G | 55 D |
pmol | 117 | 100 | 106 | 97 |
Aminoãcidos | L | 65 Q | ||
pmol | 38 | 16 | ||
* permuta | de aminoácidos · | |||
nb: não determinável |
5 | N* | G | 35 E | E* | N | Q | C |
223 | 217 | 184 | 178 | 178 | 169 | 145 | nb |
G | 45 T | P | K | P | Q | 50 S | H |
125 | 137 | 118 | 112 | 102 | 125 | 91 | 113 |
F | E | E | I | 60 P | E | E | Y |
99 | 83 | 79 | 80 | 68 | 59 | 63 | 41 |
comparação com (1)
EXEMPLO 6
Isohirudina Ilb
Analogamente ao Exemplo 1 isolou-se a isohirudina Ilb a partir da mistura proteica, depois do pico II (RT cerca de 115 minutos) e purificou-se por cromatografia. Por análise de sequência N-terminal determinou-ee a sequência global representada no Quadro 9. Adicionalmente realizou-se ainda uma dissociação com tripsina que conduziu ao isolamento de peptídeo 28-65 (Quadro 10). Determinou-se a correspondente sequência.
QUADRO 9
Análise de sequência quantitativa da isohirudina Ilb
Aminoãcidos | 1 I* | T* | Y | T | 5 D C | T | E | S | 10 G | Q | N |
pmol | 378 | 502 | 244 | 465 | 445 nb | 377 | 400 | 396 | 303 | 291 | 281 |
Aminoãcidos | L | C | 15 L | C | E G | S | 20 N | V | C | G | K* |
pmol | 279 | nb | 269 | nb | 240248 | 248 | 235 | 235 | nb | 259 | 231 |
Aminoãcidos | 25 G | N | K | C | 30 I L | G | S | N* | G | 35 E | E* |
pmol | 215 | 230 | 219 | nb | 221222 | 217 | 210 | 206 | 200 | 195 | 195 |
40 | 45 | |||||||||||
Aminoácidos | N | Q | C | V | T | G | E | G | T | P | K | P |
pmol | 185 | 174 | nb | 163 | 156 | 145 | 132 | 140 | 129 | 112 | 105 | 91 |
50 | 55 | 60 | ||||||||||
Aminoãcidos | Q | S | H | N | D | G | D | P | E | E | I | P |
pmol | 86 | 80 | 72 | 71 | 65 | 54 | 51 | 42 | 46 | 33 | 24 | 26 |
65 | ||||||||||||
Aminoãcidos | E | E | Y | L | Q | |||||||
pmol | 18 | 18 | 15 | 12 | 10 |
permuta de aminoãcidos por comparação com (1)
QUADRO 10
Análise de sequência quantitativa do peptldeo trlptico da isohirudlna Ilb
Aminoãcidos | 28 C | •I | 30 L | G | S | N* | G | 35 E | E* | N | Q | C |
pmol | 300 | 379 | 381 | 368 | 347 | 337 | 332 | 316 | 305 | 293 | 271 | nb |
Aminoãcidos | 40 V | T | G | E | G | 45 T | P | K | P | Q | 50 S | H |
pmol | 255 | 249 | 234 | 228 | 212 | 205 | 197 | 167 | 154 | 143 | 133 | 127 |
Aminoácidos | N | D | G | 55 D | P | E | E | I | 60 P | E | E | y |
pmol | 112 | 102 | 115 | 100 | 91 | 81 | 78 | 64 | 54 | 32 | 22 | 18 |
Aminoácidos | L | 65 Q | ||||||||||
pmol | 14 | 12 | ||||||||||
* permuta | de aminoãcidos por comparação com (1) | |||||||||||
nb: não determinável | • · |
EXEMPLO 7
Isohirudinas Illa e Illa*
As isohirudinas Illa e Illa* foram iso ladas do pico com RT cerca de 126 minutos e foram purificadas por recrornatografia. A análise de sequência N-terminal possibilitou a determinação da estrutura atê ao tezminus carboxi (Quadro 11). A isohirudlna Illa*, como já foi descrito anteriormente, foi caracter izada durante a análise de sequência. A isohirudlna Illa’ £3ώΐ ·ιΐ52ΐ23Σ55^?Tg-m^u
distingue-se da isohirudina Illa por permuta do ãcido glutâmico por glutamiua na posição 11, de ãcido aspãrgico por asparglna na posição 12, de glicina por ãcido aspãrgico na posição 18 e de ãcido aspãrgico por asparagina na posição 33.
QUADRO 11
Analise de sequência quantitativa das isohirudinas Illa e Illa’
10
Aminoácidos | V | V | Y | T | D | C | T | E | s | G | Q | N |
Illa | ||||||||||||
pmol | 660 | 675 | 666 | 477 | 407 | nb | 321 | 458 | 238 | 390 | 269 | 282 |
Aminoácidos | E** | D** | ||||||||||
pmol | 46 | 33 | ||||||||||
15 | 20 | |||||||||||
Aminoácidos | L | C | L | C | E | D* | S | N | V | C | G | E* |
Illa | ||||||||||||
pmol | 318 | nb | 284 | nb | 269 | 247 | 239 | 227 | 218 | nb | 204 | 185 |
Aminoácidos | G** | E* | ||||||||||
Illa’ | ||||||||||||
pmol | 11 | |||||||||||
25 | 30 | 35 | ||||||||||
Aminoácidos | G | N | K | C | I | L | G | S | N* | G | E | K |
Illa | ||||||||||||
pmol | 178 | 169 | 161 | nb | 150 | 157 | 154 | 137 | 131 | 128 | 125 | 120 |
Aminoácidos | D** | |||||||||||
Illa' | ||||||||||||
pmol | 4 | |||||||||||
40 | 45 | |||||||||||
Aminoácidos | N | E* | c | V | T | G | E | G | T | P | K | P |
Illa | ||||||||||||
pmol | 88 | 84 | nb | 73 | 62 | 69 | 63 | 59 | 51 | 45 | 53 | 38 |
50 | 55 | 60 | ||||||||||
Aminoácidos | Q | S | E | N | D | G | D | F | E | E | I | P |
Illa | ||||||||||||
pmol | 32 | 33 | 21 | 22 | 18 | 15 | 13 | 10 | 10 | 11 | 8 | 6 |
A isohirudina III foi isolada a partir do pico com RT cerca de 139 minutos e foi purificada por cromato grafia. A análise de sequência N-terminal em combinação com a análise de sequência do produto de dissociação com tripsina (pep tldeo 28-65) permitiu determinar a estrutura global da proteína (Quadros 12 e 13).
Em comparação com todas as isohirudinas aqui descritas, a isohirudina III foi isolada na maior quantidade, de modo que realizou-se adlcionalmente com esta substância a comprovação da estrutura, por via química de proteinas, da mutação ãcido aspãrglco para asparagina.
Bornstein (Methods in Enzymol. 47 (1977) 132 - 145) descreve uma dissociação selectiva de ligações peptldicas Asn-Gly com o agente nucleõfllo hidroxilamina.
Em conformidade, preparou-se primeiro um tampão que contêm cloridrato de guanidlnio 6M e hidroxilamina 2M. Para isso incorporaram-se 23 g de cloridrato de guanidlnio e 5,5 g de hidroxilamina, em banho de gelo, com um pouco de ãgua e, mediante agitação vigorosa, promoveu-se a sua dissolução conjuntamente com LiOH 4,5 M, não ultrapassando o pH o valor 6,5. Seguidamente ajustou-se o pH ao valor 9 e completou-se com ãgua atê 50 ml·;—
A isohirudina III (cerca de 2 nmol) foi liofilizada, tomou-se com 200 jul do tampão assim preparado e em seguida incubou-se 4 horas a 459 C em banho-raaria. Para completa mento da reacção adicionaram-se 200 jul de ãcido acético (pH 3) e
congelou-se a amostra. Seguidamente concentrou-se a amostra até 200 ul e eliminaram-se os sais por melo de uma coluna de fase re versa (4,6 mm x 250 mm) cheia com sílica-gel modificada com C-18 O gradiente foi neste caso de 0% até 100% de B en 30 minutos, com um débito de 1 ml/minuto (tampão A: 100% de água, 0,1% de TFA; tampão B: 90% de AcCN, 10% de ãgua, 0,1% de TFA). A fracção principal obtida foi em seguida recromatografada com auxílio da Micro-Bore HOPLC. Isolou-se uma fracção Fl gue, de acordo com a caracterização por análise de sequência, possuia 2 términus N (Quadro 14) nomeadamente Vai Vai Tyr e Gly Glu Lys.
Através do acoplamento de cisteina (Cys6-Cysl4, Cysl6-Cys28, Cys22-Cys39) obteve-se ainda a lsohiru dina III também depois da dissociação de hidroxilo.
QUADRO 12
Análise de sequência quantitativa da lsohirudlna III 15 10
Aminoãcidos | V | V | γ | T | D | C | T | E | S | G | Q | N |
III pmol | 615 | 569 | 468 | 377 | 265 | nb | 178 | 250 | 108 | 214 | 147 | 195 |
Aminoácidos | L | C | 15 L | C | E | D* | S | 20 N | V | C | G | Q |
III pmol | 158 | nb | 83 | nb | 102 | 88 | 72 | 64 | 54 | nb | 50 | 48 |
Aminoácidos | 25 G | N | K | C | I | 30 L | G | S | N* | G | 35 E | K |
III pmol | 32 | 37 | 29 | nb | 28 | 30 | 23 | 19 | 14 | 17 | 16 | 12 |
Aminoácidos | N | Q | C | 40 V | T | G | E | G | 45 T | P | K | P |
III pmol | 10 | 9 | nb | 5 | 3 | 5 | 6 | 4 | 2 | 1 | 1 | 3 |
Aminoãcidos | Q | 50 8 | H | N | D | G | 55 D | F | E | E | I | 60 P |
III pmol | 1 | 0,5 | 1 | 1 | 5 | 1,5 | 0,3 | 0,8 | 2 | 2 | 1,5 | 1 |
Aminoãcidos III | E | E | Y | L | 65 Q |
^S^aÃàÃwfeg^íi^ttaaswww»^ Ma pmol
0,4 0,6 0,8 0,6
* permuta de aminoâcidos por comparação com (1) nb: não determinável.
QUADRO 13
Análise de sequência quantitativa do peptldeo trlptico da isohirudina III
Aminoâcidos | 28 C | I | 30 L | G | S | N* | G | 35 E | K | N | Q | C |
pmol | nb | 301 | 295 | 286 | 234 | 273 | 246 | 242 | 219 | 194 | 139 | nb |
Aminoâcidos | 40 V | T | G | E | G | 45 T | P | K | P | Q | 50 S | H |
pmol | 151 | 136 | 141 | 149 | 117 | 99 | 82 | 87 | 71 | 68 | 64 | 58 |
Aminoâcidos | N | J> | G | 55 D | P | E | E | I | 60 P | E | E | Y |
pmol | 51 | 41 | 36 | 30 | 25 | 24 | 27 | 21 | 12 | 16 | 15 | 12 |
Aminoâcidos | L | 65 Q | ||||||||||
pmol | 0,7 | 2 | ||||||||||
* p>ermuta | de aminoâcidos por i | comparação com (1) | ||||||||||
nb: não determinável | • |
QUADRO 14
Anãlise de sequência quantitativa da fracção F1 da dissociação com hidroxilamina
Passo de degradação | 1 | 2 | 3 | 4 |
Posição sequencial | 1 | 2 | 3 | 4 |
Aminoâcidos: N-terminal | V | V | Y | T |
pmol | 17 | 17 | 24 | 22 |
Posição sequencial | 34 | 35 | 36 | 37 |
Aminoâcidos: ponto de corte | G | E | K | N |
pmol | 41 | 50 | 37 | 34 |
A descoberta de 2 términus N para F1 é
a comprovação nítida da dissociação de hidroxilamina na sequência da isohirudina III, na ligação peptldica N-G.
EXEMPLO 9
Isohirudinas Illb e Illb’
As isohirudinas Illb e Illb’ foram iso ladas analogamente ao Exemplo 1, a partir do pico com o RT cerca de 134 minutos, e foram purificadas por recromatografia. Por anã lise de sequência N-terminal caracterizou-se a estrutura da isohirudina Illb atê à extremidade carboxilo (quadro 15). A estrutu ra da isohirudina Illb*, que foi determinada igualmente na anãli se de sequência, está também representada no Quadro 15.
QUADRO 15
Análise de sequência quantitativa das isohirudinas Illb e Illb*
10
Aminoácidos | V | V | Y | T | D | C | T | E | S | G | Q | N |
Illb | ||||||||||||
pmol | 530 | 511 | 499 | 433 | 460 | nb | 395 | 332 | 339 | 326 | 321 | 278 |
15 | 20 | |||||||||||
Aminoácidos | L | C | L | C | Q | D* | S | N | V | C | G | Q |
Illb | ||||||||||||
pmol | 264 | nb | 258 | nb | 246 | 240 | 221 | 224 | 195 | nb | 185 | 175 |
Aminoácidos | G** | |||||||||||
Illb’ | ||||||||||||
pmol | 56 | |||||||||||
25 | 30 | 35 | ||||||||||
Aminoácidos | G | N | K | C | I | L | G | S | N* | G | E | K |
Illb | ||||||||||||
pmol | 168 | 154 | 154 | nb | 131 | 134 | 128 | 126 | 118 | 106 | 102 | 10i |
40 | 45 | |||||||||||
Aminoácidos | N | Q | C | V | T | G | E | G | T | P | K | P |
Illb | ||||||||||||
pmol | 106 | 95 | nb | 87 | 82 | 80 | 74 | 75 | 71 | 61 | 55 | 5: |
55 60
Aminoácidos | Q | S | H | N | D G D F | Ε E | I | P |
Illb | ||||||||
pmol | 48 | 12 | 36 | 31 30 24 21 23 | 18 16 | 18 | 12 | |
Aminoácidos | E | E | Y | L | 65 Q | |||
Illb | ||||||||
pmol | 11 | 11 | 8 | 5 | à | |||
* permuta | âe | aminoácidos | por comparação com | (1) | ||||
* * permuta | de | aminoácidos | por comparação com | Illb | ||||
nb: não determinável. |
Claims (1)
- -la-
Processo para a preparação de uma isohirudina de fórmula 1 A - B - Tyr (A) 5 10 - Thr - Asp - Cys - Thr - Glu - Ser - Gly - C - E - Leu - Cys - 15 20 Leu - Cys - F - G - Ser - I - Vai - Cys - Gly - J - 25 Gly - Asn - 30 35 Lys - Cys - K - Leu - Gly - Ser - L - Gly - Glu - M - Asn - N - 40 45 Cys - Vai - Thr - Gly - Glu - Gly - Thr - Pro - Lys - Pro - Gin 50 - 55 - Ser - His - Asn - Asp - Gly - Asp - Phe - Glu - Glu - Ile - 60 65 Pro - Glu - Glu - Tyr(R) - Leu - Gin na qualA representa Vai ou Ile, B representa Vai ou Thr, C representa Gin ou Glu, E representa Asn ou Asp, F representa Glu ou Gin, G representa Asp ou Gly, I representa Asp ou Asn, J representa Gin, , Glu, Asn K representa Ile ou Lys, L representa Asp ou Asn, M representa Lys ou Glu, N representa Gin e Glu, e R representa hidrogénio ou SO3H, com a condição de, no caso de J representar Gin, L não representa Asp, bem como dos seus mutantes, e dos seus sais fisiologicamente aceitáveis, caso estes possam ser obtidos, caracterizado pelo facto de de isolarem e purificarem isohidrudinas de sangues sugas com auxílio de uma combinação de métodos de extracção, métodos de precipitação e processos cromatograficos, se dissociar um grupo éster fenõlico R eventualmente existente, se desejado hidroliticamente, com formação do grupo hidroxilo fenõlico, e eventualmente se transformar o polipeptídeo obtido nos seus sais fisiologicamente aceitáveis.Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de na fórmula (A) A representar Vai, B representar Vai, C representar Gin, E representar Asn, F repre sentar Glu, G representar Gly, I representar Asn, J representar Lys, K representar Ile, L representar Asp, M representar Lys, N representar Gin e R representar hidrogénio ou SO^H.- 3s Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de na fórmula (A) A representar Vai, B representar Vai, C representar Gin, E representar Asn, F repre sentar Glu, G representar Gly, I representar Asn, J representar Asn, K representar Ile, L representar Asp, M representar Lys, N representar Gin e R representar hidrogénio ou SOgH.Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de na fórmula (A) A representar Ile, B representar Thr, C representar Gin, E representar Asn, F repre sentar Glu, G representar Gly, I representar Asn, J representar Asn, K representar Lys, L representar Asp, N representar Glu, N representar Gin e R representar hidrogénio ou SO^H.Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de na fórmula (A) A representar Ile, B representar Thr, C representar Gin, E representar Asp, F repre sentar Glu, G representar Gly, I representar Asn, J representar Lys, K representar Ile, L representar Asn, M representar Glu, N representar Gin e R representar hidrogénio ou SO^H.62 Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de na fórmula (A) A representar Ile, B representar Thr, C representar Gin, E representar Asp, F repre sentar Glu, G representar Gly, I representar Asp, J representar Lys, K representar Ile, L representar Asn, M representar Glu, N representar Gin e R representar hidrogénio ou SO^H.- 7- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de na fõzmula (A) A representar Ile, B representar Thr, C representar Gin, E representar Asn, F repre sentar Glu, G representar Gly, I representar Asn, J representar Lys, K representar Ile, L representar Asn, M representar Glu, N representar Gin e R representar hidrogénio ou SO^H.- 82 Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de na fórmula (A) A representar Vai,Β representar Vai, C representar Gin, E representar Asn, F repre sentar Glu, G representar Asp, I representar Asn, J representar Glu, K representar Ile, L representar Asn, M representar Lys, N representar Gin, e R representar hidrogénio ou SO^H.Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de na fórmula (A) A representar Vai, B representar Vai, C representar Glu, E representar Asp, F repre sentar Glu, G representar Gly, I representar Asn, J representar Glu, K representar Ile, L representar Asp, M representar Lys, N representar Glu e R representar hidrogénio ou SO^H.- 10- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de na fórmula (A) A representar Vai, B representar Vai, C representar Gin, E representar Asn, F repre sentar Glu, G representar Asp, I representar Asn, J representar Gin, K representar Ile, L representar Asn, M representar Lys, N representar Gin e R representar hidrogénio ou SO^H.- 11- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de na fórmula (A) A representar Vai, B representar Vai, C representar Gin, E representar Asn, F repre sentar Gin, G representar Asp, I representar Asn, J representar Gin, K representar Ile, L representar Asn, M representar Lys, N representar Gin e R representar hidrogénio ou SO^H.Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de na fórmula (A) A representar Vai, B representar Vai, C representar Gin, E representar Asn, F repre sentar Gin, G representar Gly, 1 representar Asn, J representar Gin, K representar Ile, L representar Asn, M representar Lys, N representar Gin e R representar hidrogénio ou SO^H.Processo para a preparação de uma composição farmacêutica caracterizado pelo facto de se incorporar como ingrediente activo uma isohirudina de fórmula (A), guando obtida segundo um processo de acordo com qualquer das reivindica ções 1 a 12, em combinação com uma substância veicular flsiologl camente aceitável, e eventualmente com outras substâncias auxlli ares e aditivos, e de se dar ã mistura uma forma apropriada para administração farmacêutica.
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