JPS60136597A - デスルフアトヒルジン、その製造及びそれを含む製薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な生物学的に活性な、ヒルジンから銹導さ
ｉまたポリ啄プチド、その製造、この新規な化合物を含
む製薬組成物及び特に血液の凝固を抑制するためのそれ
らの使用に関する。

この発明の化合物が銹導されるヒルジンは、天然に意す
るポリペプチドであって、薬用ヒル（Ｈｉｒｕｄ。

ｒｎｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ）の生体内でつくられ、ヒル
により摂取された血液を凝固させない。その単離、精製
、化学組成並びにその広い生物学的使用及び抗凝固剤と
しての医薬的使用は知られており、文献、例えばＰ、Ｗ
ａｌｓｍａｎｎ及びＦ、　ＭａｒｋｗａｒｄｔＸＰｈａ
ｒｍａｚ　ｉｅ　３６６５３〜６６０頁（Ｊ９８１年）
に詳細に開示されている。

最近になって、ヒルジンの完全なアミノ酸連鎖が最終的
に解明され、これによってヒルジンの合成のための実験
に対する最初の理論的根拠が創造された。ヒルジンの主
要構造は下記式に一致する。

（どの特定のシスティン残基がジスルフィドブリッ・ゾ
より２つずつ一緒に結合されているかということは今だ
に解明されていないけれども、この構造的な詳細は合成
のだめには重要性は低い）。この構造は、４７″チドの
アミン末端方向への疎水性アミノ酸の特徴的な蓄積及び
被プチドのカルｄぐキシル末端方向への極性アミノ酸の
特徴的な蓄積により、並びに独特の特徴として、下記の
部分式に相当する、６３位のチロシン残基のフェノール
性ヒドロキシル基における強酸性の硫酸モノエステル基
によシ区別される。

現在まで、極めて一般的には蛋白質における、及び特に
この化合物における、硫酸基の生物学的機能については
明らかではなかった。そして、下記の仮説が議論されて
いた。即ち、 （１）蛋白質の生物学的特性に対する有意性、（２）調
整的な細肪プロセスへの関与（可逆的燐酸化反応に対し
て知られているのと類似のもの）、（３）分泌の刺激即
ち分泌蛋白質としての同定のだめのマーカーとしての硫
酸化作用：現在までに発見されたすべての硫酸化蛋白質
は分泌蛋白質又は膜内外景白質である。すべてｂ場合に
、硫酸基はヒルジンの最も特徴的な構造的特徴の１つで
ある。

ヒル・シンは最も効力のある公知のトロンビン抑制剤の
１つであり、約６　Ｘ　１０−”ＭのＫｉバリー−を有
する。これはトロンビンに対して完壁な特効を有し、凝
固性カスケードの他のプロティナーゼを抑制しない。へ
ノ２リンとは異なって、ヒルジンはトロンビンに対する
直接的な抑制作用を有し、アンチトロンビン■を介する
作用ではない。精製されたヒルジンに観察される唯一の
薬理学的作用は、抗凝固性及び凝塊防止性の作用である
。犬に対して異常に高い投与景を与えた場合にも、心拍
数、呼吸、血圧、血小板、線維素原及びヘモグロビンに
対する影響は観察されない。ラット、豚及び犬に対する
テストにおいて、ヒルジンは、内毒素性シｖｓツク並び
にＤＩＣ（ｄｉｓｓ−ｅｍｌｎａｔｅｄｉｎｔｒａｖａ
ｓｃｕｌａｒ　ｃｏａｇｕｌａｔｌｏｎ　：散在脈管向
凝固）において、実験的血栓症（うっ血又はトロンビン
注射によシ誘発されたもの）において有効であることが
認められている。直接的な比較試験を行えばいつでも、
ヒルジンはヘパリンよりも優れていることが認められて
いる。

長い間知られていたけれども、ヒルジンは今日まで、優
れた生物学的特性から当然に期待されてもよいような広
い治療上の用途を与えていない。

その極端に制限された入手の可能性という重大な欠点が
、医薬における広い使用の障害になっているのである。

今日まで、ヒルジン製剤は、専ら、高価で入手が困難で
ある天然材料、薬用ヒル、から、複雑な単離及び精製操
作により、得られていた。６５アミノ酸の比較的長い連
続が、従来の蛋白質合成によるアプローチの部分的な可
能性をほとんど望みのないものとしている。しかしなが
ら、遺伝子技法の一般的方法に従って、適当な？リヌク
レオチドを合成し、これを生産微生物の遺伝暗号中に組
入れることにより達成することのできるような、生合成
のルートは全く見込みのないものであ−った。必要なＯ
−スルホン化チロシン残基の導入は直接的な生合成にお
けるほとんど克服できない困難を与えるであろうと考え
られていたのである。

驚くべきことに１今や、上記の理論的な考察とハ異なＦ
）、（Ｔｙｒ　：］残基のフェノール性ヒドロキシル基
から特徴的な硫酸モノエステル基を除去するならば、ヒ
ルジンの好ましい生物学的特性が残留されるということ
が見出されたのである。

Ｔｙｒ６３残基における硫酸エステル基がないことを除
いて、得られる分解生成物、即ち下記式Ｉ及び■、 以下余白 〔上式中、−Ｃｙｓ＋−残基はヒルジンにおけると同様
にジスルフィドブリッジにより２つずつ結合されている
〕 で示されるデスルファトヒルジンの両者は、ヒルジンの
他のすべての構造的特徴により特徴うけられている。短
縮されていないアミノ酸の連続が式ｉのデスルファトヒ
ルジン中に存在しており、これは狭い意味での実際のデ
スルファトヒルジンである。一方式１１のデスルファト
ヒルジンとして示す類似のへキサコンタトリペプチドは
、効力において同等であり、更に２個のＣ末端アミノ酸
、Ｌｅｕ及びＧｌｙを欠いている。しかしながら、驚く
べきことに、これらの化合物は、量的にも質的にも、少
なくとも抗凝固性においてヒルノンと等価である。

このことは、このペプチドの通常の生物技術的合成の可
能性に関して極めて重要である。ヒルジンにおけるヒド
ロキシスルホニル基の存在は直接的な生合成を事実上妨
げているけれども、デスルファトヒルジン中のこの基の
不存在は生物技術的合成を成功させるだめに実質的によ
り良い構造的な条件を与える。生物学的活性が同等であ
るならば、デスルファトヒルジンは、生物技術的ルート
による実質的により良い入手可能性のために、技術的及
び経済的にヒルジンよりも明らかによシ優れている。

この発明の実施において、式ｌ及びＨのデスルファトヒ
ルジンはそれ自体公知の方法で得ることができる。例え
ば、これらの化合物は、上記しだ式Ａのへキサコンタペ
ンタペプチドヒルジン中の、６３位に硫酸化された形で
存在しているチロシン残基のフェノール性水酸基を解離
させることにより製造することができる。

下記の反応式、 ＨＯ−８０２−０−Ｐｅｐｔ−＋ＨＯ−Ｐｅｐｔ（式中
、ｒａｐｔはヒルジンの残余の部分である）に従ってこ
の基を解離するだめのプロセスは、それ自体公知の方法
で、例えば、化学的又は生物学的製法を用いて加水分解
することによシ、行うことができる。

この解離を行うだめの化学的プロセスは、好ましくは、
有利には反応媒体としてのトリフルオロ酢酸中において
薄い、例えば約２〜４Ｎの、塩酸の水溶液によシ、又は
反応体及び溶剤の両方としてのトリフルオロ酢酸水溶液
のみにより、酸触媒加水分解の一般的な条件下に行われ
る。ペプチド結合の加水分解による解離の危険性を最小
にするために、反応を温オロな条件下、例えば室温を越
えない温度範囲、において実施し、加水分解の過程を、
例えば薄層クロマトグラフィーにより、分析的に監視す
るのが良い。

しかしながら、特に、加水分解は、フェノール性の硫酸
エステル基を温和な条件下に遊離のフェノール基に解離
する生物学的手段により、好ましくは特定の酵素、即ち
アリールスルファターゼを用いることにより、行われる
。硫酸化されたヒドロキシル基の生物学的解離は、富化
された活性成分を含む適当な酵素製剤又は単離された酵
素により行うことができ、或いは適当な酵素系、即ち、
生きているか又は死んだ生物学的材料、例えば、成長中
の又は静止した微生物、細胞培地、細胞ホモジネート又
は自己分解物中に直接的に存在するものを同一反応系で
用いることができる。生物学的加水分解の大きな利点の
１つは、感応性の出発原料中における、他の官能基、特
にペプチド結合を攻撃することなく、モ、ノ硫酸エステ
ル結合の所望の解離のみを行う高い選択性である。特に
、本発明の化合物は、ヒルジシを水性の、好ましくは緩
衝された、溶液又は懸濁液中で個々のアリールスルファ
ターゼ製剤、例えば、Ｈｅ１ｉｘ　ｐｏｍａｔｉａのア
リールスルファターゼにより、酵素プロセスに通常用い
られる温度、例えば、約２０°〜４５℃の範囲、好まし
くは２５°〜３０℃の範囲の温度において、処理するこ
とにより得られる。弱酸性反応、即ち、約４〜７の−、
特に約５〜６０声における反応が好ましく、この−値は
有機カルボン酸とアルカリ金属又は有機塩基との塩、例
えば、酢酸ナトリウム又は、好ましくは、酢酸ピリジン
（約ｐｉ（５，４）の約０．０３〜０．３モル溶液の如
きバッファーで調整される。用いられる酵素の基材（ヒ
ルジン）に対する比は、一般に、それぞれの製剤の活性
によって決まり、通常は約１；１〜１：１００、好まし
くは約１：５〜１：２０である。

可能な限り高い純度及び活性を有する酵素を用いるのが
有利である。アリールスルファターゼは硫酸エステル基
の除去だけでなくその導入にも触媒作用を有し、出発原
料と最終製品との間の平衡を調整するので、各酵素製剤
に対して、最適の濃度、基材に対する比、及び脱硫酸化
に必要遅時間を予備実験により決定するのが有利である
。原則として反応は数分後に完了する。しかしながら、
反応生成物の品質は活性酵素により長時間（約４時間ま
で）接触されても（例えば、反応混合物を放置しても）
害されない。

酵素による脱硫酸の過程は、反応混合物から採られるサ
ンプルの生物学的分析によシ監視することができる。例
えば、この操作は、酵素の活性をサンプルを簡単に（約
３分間）約１００℃に加熱することにより破壊すること
である。そして、基材をカル？キシ啄ブチダーゼＹによ
り処理する。

（このカルボキシペゾチダーゼＹはカルボキシル末端か
ら始まるペプチド鎖を分解し、一方これらのアミノ酸は
各アミド結合を解離することにより次々に分離される）
。原則として、ペプチド鎖の分解は、６３位の硫酸化さ
れた及び／又は遊離のアミノ酸（Ｔｙｒ”）が完全に分
離され、従って通常のアミノ酸分析器における測定が可
能となるまでは、約１５分後に進行される。

式■のデスルファトヒルジンは、Ｃ末端アミノ酸成分Ｌ
ｅｕ及びＧｌｙの両者をヒルシンの加水分解の間に解離
することにより生成される。このようにして得られる混
合物の成分の分離を、次いで、例えば、予備的なりロマ
トグラフィーにより行うことができる。式■のデスルフ
ァトヒルノンは式■のデスルファトヒルジンと同じ生物
学的特性を有する。

この発明のデスルファトヒルジンは、遊離形においての
みではなく、その塩形においても存在し得る。これらは
遊離のアミン基又はアミジノ基をいくつかのアミノ酸残
基中に含むので、この発明の化合物は酸付加塩の形にあ
ってもよい。適当な酸付加塩は、特に、通常の治療的に
許容され得る酸との生理学的に許容され得る塩である。

代表的な無機酸はハロゲン化水素酸、（例えば塩酸）及
び硫酸、燐酸及びピロ燐酸である。代表的な有機酸は、
特にアルエンスルホン酸（例工ばベンゼンスルホン］ｌ
：ｐ−）ルエンスルホン酸）、又ハ低級アルカンスルホ
ンｆｆ（例えばメタンスルホン酸）、並びに酢酸、乳酸
、・やルミチン酸、ステアリン酸、シんご酸、酒石酸、
アスコルビン酸及びクエン酸の如きカルボン酸である。

しかしながら、デスルファトヒルジンは幾つかのアミノ
酸残基中の遊離カルボキシル基をも含み、これらのカル
ボキシル基が全体のベノチドに対して酸性を与えるので
、これらはまだ塩形、例えばナトリウム、カリウム、カ
ルシウム又はマグネシウム塩形、或いはまたアンモニア
または生理学的に許容され得る有機窒素含有塩基から誘
導されるアンモニウム塩の形であってもよい。しかしな
がら、これらの化合物は同時に遊離のカルボキシル基及
び遊離のアミノ（アミジノ）基を含むので、分子内塩の
形にあってもよい。

用いられる方法によって、式Ｉの化合物は遊離形又は酸
付加塩形、分子内塩形又は塩基との塩形で得られる。遊
離化合物は酸付加塩から公知の方法で得ることができる
。一方、治療上許容され得る酸付加塩は遊離化合物から
酸、例えば、上記の塩を形成する酸との反応によシ、そ
して蒸発及び凍結乾燥により得ることができる。分子内
塩は−を適当な中和点に調整することにより得ることが
できる。

本発明は、また、少なくとも１種の本発明の化合物又は
製薬上許容され得るその塩を、所望によυ製薬キャリヤ
ー及び／又は賦形剤と共に含む、製薬組成物に関する。

これらの組成物は特に上記の徴候に対して、例えば、非
経口投与（例えば静脈内、皮肉、筋肉内又は皮下）又は
経口膜力又は局所投与により、用いることができる。投
与量は主として個々の組成及び治療又は予防の目的によ
って決まる。個々の投与量並びに投与の方法は、特定の
ケースにおいて個々に評価することにより決定するのが
最良である。関連する血液因子を測定するだめの適当な
方法は当業者に公知である。

注射に対しては、この発明の化合物の治療量は、通常、
体重ｋｙ”４１＞約０．００５〜０１ηの投与範囲であ
シ、体重ゆ当シ約０９０１〜ｏ、ｏ５ｍｙの範囲が好ま
しいであろう。投与は静脈内、筋肉内又は皮下注射によ
り行われる。従って、非経口投与のだめの製薬組成物は
、単一の投与単位形において、投与の形態によって、投
与当υ約０．４〜７．５■のこの発明の化合物を含むで
あろう。活性成分に加えて、これらの製薬組成物は、通
常、バッファー、例えば、ｐ）１を約３．５〜７の範囲
に保持するホスフェートバッファーを含み、また塩化ナ
トリウム、マンニット又はンルビトールを等張圧を調整
するために含むであろう。これらの組成物は凍結乾燥物
又は溶液の形にあってもよい。溶液は有利には殺菌性の
保存薬、例えば、０．２〜０．３％のメチルモジくはエ
チル４−ヒドロキシベンゾエートを含むことがズきる。

局所適用のだめの組成物は、水溶液、ロー７ヨン又はゼ
リーとして又は油溶液又は懸濁液として、又は脂肪、特
に、乳化された軟こうとして調整されてもよい。水溶液
の形の組成物は、例えば、本発明の化合物又はその治療
許容性の塩をｐ）（４〜６．５の水性バッファー溶液に
溶解し、所望ならば、他の活性成分、例えば、抗炎症剤
、及び／又はポリマーバインダー、例えばＩリビニルビ
ロリドン、及び／又は保存薬を添加することにより得ら
れる。

活性成分の濃度は、溶液約１０づ中又はゼリー１０．９
中、約０．０８〜１５ｍ９、好ましくは０１２５〜１．
０■である。

局所、適用のだめの油状製剤は、例えば、本発明の化合
物又はその治療許容性の塩を、オイル中に懸濁させ、所
望によυステアリン酸アルミニウムの如き膨潤剤、及び
／又は１０以下のＨＬＢ値（浸水性−浸油性バランス）
を有する界面活性剤、例えば、多価アルコールの脂肪酸
モノエステル、例えば、グリセロールモノステアレート
、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノステアレ
ート又は）ｋビタンモノオレエートを添加−するこ、！
：により得られる。脂肪軟こうは、例えば、本発明の化
合物又はその治療許容性の壇を、展延可能な脂肪ペース
中に懸濁させ、所望により１０以下のＨＬＢ値を有する
界面活性剤を添加することにより得られる。乳化された
軟こうは、本発明の化合物又はその塩の水溶液を軟質の
展延可能な脂肪ペース中で微粉砕し、１０以下のＨＬＢ
値を有する界面活性剤を添加することにより得られる。

局所適用のだめのこれらの製剤はすべて保存薬を含むこ
とができる。活性成分の濃度は約１０ｇのペース中に約
０．０８〜１．５〜、好ましくは０．２５〜１．０■の
濃度である。

上記に加えて、また人体又は動物体内又はこれに対して
医薬的に使用するだめの類似の製薬組成物に加えて、本
発明はまた、人間又は動物の生体の外部での医薬用途の
だめの製薬組成物及び製剤に関する。そのような組成物
又は製剤は、特に、体外の循環又は治療（例えば賢透析
）、保存又は変成（例えば血液分離）に付される血液の
ための抗凝固剤として用いられる。そのような製剤は、
組成が類似しており、例えば、上記の注射用製剤に類似
の単一の投与単位形における製剤又はストック溶液であ
る。しかしながら、活性成分の量又は濃度は、通常、処
理されるべき血液の容量又はより正確にはトロンビン含
量に基づいている。従って、本発明の化合物は（遊離形
において）、（ａ）トロンビンの重量の約５倍完全に不
活性にし、 （ｂ）　それより多い量においても生理学的に無害であ
り、 （ｃ）例えば輸血の間においても、過剰投与の危険性が
ないように、高い濃度においても極めて急速に血液から
除去されることが必要である。特定の目的によって、適
当な投与量は血液１１当り約０．０１〜１．ｏｍｙの活
性成分である。しかしながら上限はこれをかなシ越えて
も危険性はない。

本発明は、また、本発明の化合物及びその塩を、トロン
ビンの測定のための生物学的分析に使用すること及び本
発明の化合物、例えば、固体の混合物及び好ましくは溶
液、特に水溶液の混合物を含むこの目的のための製剤に
関する。本発明の化合物（及び塩形のもの）に加えて、
これらの製剤は通常不活性の賦形剤、例えば、安定剤及
び／又は保存薬として作用する、注射製剤に関して前述
したようなものを含むこともできる。これらの製剤は、
ヒルノン組成物と類似の公知の方法で、例えば、トロン
ビン測定のための、生物学的分析に用いられる。

この明細書゛を通じて、アミノ酸及びそれらの残基に対
して用いられた略号は、一般に容認された命名法のルー
ルに従って用いられておシ、Ｌ列のα−アミノ酸及びこ
れらの残基に関する。

下記の例によυ本発明を更に説明する。

例１ 材料：ヒルジン、活性度６３０　ＩＵ、Δψ生物学的活
性をトロンビンの抑制から測定した。

その酵素活性は試験製剤と共に供給された公知の指示に
従って、色素物質Ｃｈｒｏｍｏｚｙｍ　ＴＨ（）ロンビ
ン及びヒルジン測定用の、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−、マ
ンハイム、西独、の製品）を用いて測定した。

Ｈｅ１ｉｘ　ｐｏｍａｔｌａ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇａｒ、
　マンハイム、西独、の製品）からのアリールスルファ
ターゼ（ＡＲ８）、５　ＩＵ為。

酵素活性は、色素物質、ｐ−ニトロフェノールスルフ＝
＝　）（１，８ｍＭ／’ｌパッチ）を用いて、Ｌｅｏｎ
他の、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、＋　７５巻、６１２〜６
１７頁に公知の方法によって測定された。

脱硫酸化 （１）予備実験（最適ＡＲ８濃度の測定のため）（、）
下記のストック溶液を調製した。

（Ａ）ヒルジンを溶液（ｃ）中に溶解することによシ得
られたＮ　２ｒｖ／ｍｌの濃度を有するヒルジン溶液。

（Ｂ）２５部の市販の懸濁液を１００部の溶液（ｃ）と
混合することによる、１．２５　ｍｇ／ｍｌの濃度を有
するアリールスルファターゼ溶液。

（Ｃ）酢酸ピリジンの０．１Ｍ水溶液、ｐｔ（５，４か
らなるバッファー溶液り 以下余白 （ｂ）操作 下記の成分を混合することによって一連のサンプルを得
た。即ち、各サンプルは１５μｌの溶液Ａ（ヒルノン３
（Ｊｔｔ９に相当する）及び１０μｌの溶液Ｂ（アリー
ルスルファターゼ１２．５μｇに相当する）又は酵素の
濃度をもとの濃度の’ｌ＞　、　１／Ａ。

坏、　’／１６　、及びｈに、溶液ＢをバッファーＣに
より稀釈することによって調整した溶液を含んでいた。

各サンプルの２５μｌを２５℃で６０分間培養し、次い
で１００℃で３分間加熱してスルフェ−トを変性し、急
速に冷却し、遊離及び硫酸化さノまたチロシンの金部を
（後述するように方法に従って）分析した。

（２）予備的プロセス １５容橿部の溶液Ａを１０容号部の稀溶液Ｂと混合した
。各Ｂ溶液の最適最低可能濃度を予備実験で測定し、ス
トック溶液Ｂを・ぐッファー溶液Ｃで稀釈することによ
り調製した。混合物を２５℃で約３０〜６０分間培養し
、１００℃に簡単に（例えば急速殺菌の争件下に）加熱
し、脱硫酸化酵素を変成するために直ちに冷却した。反
応混合物を５ｅｐｈａｄｓｘ”’　Ｇ　５０又はＧ７５
、ＣＭ−■　■ ５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｗｏｆａｔｌｔ　ＣＰ、　Ａｍｂｅ
ｒｌｉｔｅ■ＩＲＣ又は他の等価のカチオン交換剤のカ
ラムを通して、所望ならば反応混合物を室温又はそれ以
下において真空下に濃縮後に、分離した。所望により、
この分離は所望の純度（例えばトロンビンによる抑制テ
ストにより及び／又はアミノ酸分析により測定、下記を
参照）のデスルファトヒルジンが得られるまで繰り返し
だ。対応する溶液（溶離液）を凍結乾燥することにより
固体状の製品が得られた。

アミノ酸分析（Ｃ末端蛋白分解による）によれば、純粋
な生成物はチロシン０−スルフェートを含まず、トロン
ビンに対する抑制活性テスト（例えばＣｈｒｏｍｏｚｙ
ｍ　ＴＨによる、上記参照）においてヒルジンの全活性
を示しだ。

脱硫酸の分析的コントロール これは、ヒルジン（出発原料として）、脱硫酸プロセス
のサンプル及び式ｌのデスルファトヒルジン（最終生成
物として）のカルゲキシル末端蛋白質のカル？キシベグ
チダーゼＹによる連続的な蛋白分解により、笈び解１１
￥１＃されたアミノ酸残基の通常のアミノ酸分析機によ
る量的測定により行われた。

（、）下記のストック溶液が調製された。

（Ａａ）　０．８０６　ｍ９７ｍ１　（ＤｍＷ（Ｄ　ヒ
ル）　ン溶液カ、０．２５０重量部のヒルジンを３１０
容量部のノ々ッ７アー溶液Ｃ＠（下記参照）に溶解する
ことによυ得られた。

（Ｂａ）２〃伜へｌの濃度のＣＰＹ溶液が、２重量部の
カルゼキシ啄プチグーゼｙ　（ｃｐｙ）１　ｉ　ｏ　ｏ
　容ｉ部のバッファー溶液Ｃａに溶解することにより得
られた。

（ＣＲ）バッファー溶液：酢酸ピリジンの０．１Ｍ水溶
液、ｐＨ５，４゜ （ｂ）操作 ２７５μｌの溶液Ａａ、２２２μｇのヒルジンに相当、
を８μ６（７）溶液Ｂａ５１６４のｃｐｙに相当、と混
合した。即ちヒルジンに対する比は１：４（重量対重量
）又は１：１２５（モル対モル）であった。混合物を２
５℃で３０分間培養した。混合物から３０μｌのサンプ
ルを採り、５μｌのトリフルオロ酢酸を添加し、このパ
ッチを遠心分離してＣＰＹの沈殿を除去した。上澄液を
蒸発乾固させ、残留物中に存在するアミノ酸をアミノ酸
分析のためのバッファー溶液中にとり、通常のアミノ酸
分析機により量的に測定した。式１のデスルファトヒル
ジンを同一の方法で分析した。結果はまた、アミノ酸、
特にチロシン０−スルフェート又ハ遊離のチロシンのヒ
ル・シンに対するモル比として表示することができる）
。コントロールサングルのために、ヒルジン及びＣＰＹ
をそれぞれ単独で同じ操作に付した。

同じ方法で、簡単な加熱によりＡＲ３活性を破壊した後
予備的々脱硫酸の実験で得られた２　５　ｔｔｌのサン
プルを、それぞれ２μｓのｃｐｙ（溶液Ｂａの形で）と
混合し、混合物を２５℃で３０分間培養した。５μｌの
トリフルオロ酢酸を添加し、遠心分離し、上澄液を凍結
乾燥した後、解離されたアミノ酸を分析機で量的に測定
した（それぞれコントロールを、（１）ヒルジン、（２
）　ＣＰＹｌ（３）　ＡＲ８、（４）ヒルジン＋ｃｐｙ
１（５）ヒルジン＋ＡＲ８、（６）　ＣＰＹ　＋ＡＲ８
を用いて行った）。

例２ 材料： ヒルシン：　１．５ｍｇノヒ＃ジン（ＨＬＰＣでＮ製）
アリールス／ｌ／　７−ｒターゼ（Ｈｅ１ｉｘ　ｐｏｍ
ａｔｌａからのもの）懸濁液中（Ｂｏｅｈｒｌｎｇｅｒ
から得られたｍ品）　：　５　ｍ９／ｍｌ　＝　５　Ｉ
Ｕ／ｍ９゜アリールスルファターゼ（ＡＲ８を実験の前
にＰＤＩＯカラムを通して脱塩した。１００μｌの懸濁
液を２．５ｍｅのバッファーで処理しく０．１ＭＮＨａ
Ａｃ　−、ｐ”　５−５　）、カラムに添加し、３ｍｌ
のバッファーで溶離した。溶離された溶液の吸光度はＥ
２８０　””　０．１３９であり、溶液の１００μ４は
ＡＲ８１６μｇに相当した。

方法 ヒルジンを２μｙ／μｌのバッファー（０，１ＭＮＨ４
Ａｃ　ＸｐＨ５−５）に溶解した。２０μｓのヒルシン
にバッファー中ＡＲ８の溶液１００μｌを添加した。

酵素（ＡＲ８）：物質（ヒルジン）の重量比＝１：１．
２５゜ 予備スケールに対するパッチは２５℃で２時間であった
。反応過程は２．７μｇの抑制剤を用いて）（ＰＬＯ分
析により追跡した。

６時間後、ヒルジンは９０チ脱硫酸されて、式■のデス
ルファトヒルジンに変性された。２２時間後、式Ｉのデ
スルファトヒルジン及び式■のデスルファトヒル・シン
の混合物が得られた（Ｉ：ＩＩ＝５５：４５）。この混
合物は例１に述べたクロマトグラフィー法により分離す
ることができた。

最終生成物の蛋白−化学特性は塩化ダンシル法（Ｎ末端
測定）によシ、カルデキシベプチダーゼＹによる分解（
Ｃ末端測定）により及び２４時間及び４８時間のアミノ
酸分析により行われた。

以下余白

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ■、下記式Ｉ又は■で示されるデスルファトヒルジン又
   はその塩。 以下金白 上式中、−Ｃｙｓ−残基はヒル・シンにおけると同様に
   ジスルフィドプリツノにより２つずつ結合されている。 ２゜　ヒルジンの加水分解脱硫酸化により得られる特許
   請求の範囲第１項記載のデスルファトヒルジン又はその
   塩。 ３、　ヒルジン中の、６３位のチロシン残基のフェノー
   ル性水酸基から硫酸モノエステル基を、加水分解により
   除去することを含む、特許請求の範囲第１項記載のデス
   ルファトヒルジン又はその塩の製法。 ４　加水分解による除去がアリールスルファターゼによ
   シ行われる特許請求の範囲第３項記載の方法。 ５、加水分解による除去が酸触媒作用の条件下に行われ
   る特許請求の範囲第３項記載の方法。 ６、少なくとも１種の特許請求の範囲第１項記載のデス
   ルファトヒルジン又はその生理許容性の塩、並びに所望
   により少なくとも１種の製薬キャリヤー又は賦形剤を含
   む製薬組成物。 ７、　試薬として特許請求の範囲第１項記載のデスルフ
   ァトヒルジン又はその塩を使用することを含む、トロン
   ビンの測定のための分析方法。