JPS6222799A - 血液凝固阻害作用を有する新規ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抗凝固剤は血栓塞栓性経過の予防および治療に用いられ
る。それらの主なる使用分野はなかんず（静脈血栓塞栓
症においてでおる。抗凝固剤はさらに保存血の調製にも
必要である。例えばこの目的に使用される４−ヒドロキ
シクマリンまたは１．４−インダンジオンの誘導体は広
範な最適化にも拘らず多数の欠点を有する。

それゆえ特にヒトの医薬においては、毒性が少な（そし
て少ししか副作用を有しないものでありかつそれらの代
謝により伺らの負荷も病気の生体にかけないもの′″′
ｃｔＢる血液凝固阻止剤を入手することが望ましい。

アンチトロンビン■のような血漿中の内因性阻害剤の他
に、例えば大豆から得られるクニック（Ｋｕｎｉｔｚ）
抑制剤のような他の多くの蛋白質も血液凝固阻止活性を
有する。この阻害剤は活性化された第Ｚ因子を抑制する
ことにより血液凝固カスケードを遮断するが、しかし阻
害剤の特異性が小さいので、多（の副作用、すなわち血
漿カリクレイン、プラスミンおよびトリプシンの阻害か
らり、従って治療上使用できない。回虫のまたはカザル
ス（ｋａｚａｌｓ　）の阻害剤のような他の活性物質も
特異性に欠けろゆえに伺ら重要性を獲得し得なかった。

これＫ　対し薬用ヒル（ヒルドーメジシナリス（Ｈｌｒ
ｕｄｏ　ｒｎｅｄ、１ｃｉｎａｌｉｓ））から得られる
ポリＲプチドでおるヒルジンは特異的なアンチトロンビ
ン活性を示す。

その単離および精製に骨が折れるのでこれまで実際上使
用するには欠陥があった。

今、ヒルから式ｌを有する活性の高いボ＋Ｊ　ｚ４プチ
ドが単離されうろことが見出された。

それゆえ本発明は式■を有するボＩＪ−？プチドならび
にそれらの生理学的に受容しうる塩に関する。

）Ｉ−（Ｘ）ＩＩ］−Ａ　−Ｂ　−Ｃ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ
−Ａｓｐ−Ｃｙｓ　−Ｆ　−Ｇｌｕ−８ｅｒ−−Ｇｌｙ
−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｌａｕ−Ｃｙｓ−
Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−−８ｅｒ−Ａｓｎ−２８−８ｅｒ−Ａ
ｓｎ−−Ｊ　−Ｇ１．ｙ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−−Ｃｙｅ−
１１ｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−８ｏｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ　−
Ｄ　−Ｇ　−−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｖａ、１−Ｔ
ｈｒ−Ｇ’１ｙ−（）ｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−−Ｐｒｏ
−Ｌｙｓ−Ｔ’ｒｏ−Ｇｌｎ−８ｅｒ−Ｈｌｓ−Ａｓｎ
−Ａａｐ−Ｇｌｙ−−Ａａｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ　−１−
工１ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ　−６４・６５　６６ −Ｔｙｒ（Ｒ）−Ｈ−Ｇｌｎ−（Ｚ）Ｈ−ＯＨここで上
式中　。

ｍは０〜５０であり、 ｎは０〜１００であり、 Ｒはフェノール性水素またはフェノールエステル基であ
り、 Ｘは同じかまたは相異なる天然に存在するα−アミノ酸
の残基であり、　　　　　　。

２は同じかまたは相異なる天然に存在するα−アミノ酸
の残基でおり、 ＡはＩＩθまたはアミノ酸の非存在を意味し、ＢはＩＩ
θまたはＴｈｒまたはアミノ酸の非存在を意味し、 ＣはＴｈ’ｒ、　Ｖａｌ、工１θ、ＬｅｕまたはＰｈｅ
を意味し、Ｄはｌｌｕ’またはアミノ酸の非存在を意味
し、ＥはＧｌｕまたはＰｒｏであり、 ＦはＴｈｒまたは工１ｅであり、 ＧはＬｙｓまたはｌ７１ｉ１−Ａｌｉｌｐ″ｒｓす、Ｈ
はＡ１．ａまたはＬｅｕであり、そしてＪはＧｌｎまた
はＬｙｓであり、 かつ上式中６個のＣｙｓ残基はジスルフイツド橋を、介
して対で結合しているものとする。

３個のジスルフイツド橋は好ましくは７位と１５・位、
１７と２９位ならびに２３と４０位の　　　　”Ｃｙｅ
基の間に存在する◎ 天然に存在するα゛−アミノ酸特に Ｇｌｙ、　Ａｌａ、　８ｅｒ％”Ｔｈｒ％Ｖａｌ、Ｌｅ
ｕ、’、工１ｅ、　１Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、旧ｎ’
、　Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、　Ａｒｇ、　Ｌｙｓ、Ｈｙｌ、’
Ｏｒｎ、　Ｃ１ｔ。

Ｔｙｒ％Ｐｈｅ、　Ｔｒｐ、　Ｈｌｓ、ＰｒｏおよびＨ
ｙｐがあげられる。

Ｒは好ましくは水素、５Ｏ５ＨまたはＰＯ，、Ｈ２であ
り、特に好ましくは水素である。

塩としては特にアルカリ金属塩およびアルカリ土類金属
塩、生理学的に受容しうるアミンとの塩ならびに生理学
的に受容しうる酸例えばＨＣ１％　Ｈ２ＳＯ４、マレイ
ン酸または酢酸との塩が適当である。

ＣがＴｈｒを表わす式■のポリばプチドが好ましく、さ
らに、ＣがＴｈｒでありセしてＡが１１θである式Ｉの
ボＩＪ　、、？プチドが好ましい。特に適当なペプチド
は −Ａ−工１ｅ％Ｂ＝Ｔｈｒ、　ＣｗＴｈｒ、　Ｄｃ＝Ｇ
１ｕ、　Ｅ＝Ｇ１ｕ。

ＩＰｅＴｈｒ１Ｇ＝ｓＬｙａ、Ｈ＋＝ｉＬｅｕ、　Ｊ＝
Ｇ１ｎ、　ｎ＝ｏ、ｎ−０およびＲ＝ＨまたはＥ１０５
Ｈ″′ｃあるか、−ｍ−〇、ｎ＝［Ｊ、Ｒ＝Ｈまたは５
ｏｏＨ％Ａ−Ｉｌｅ、１３ｗ直接結合、Ｃ”＝　Ｔ　ｈ
ｒ　％Ｄ　”　Ｇ　ｌｕ　ｂ　Ｆｉ　■Ｇ　ｌｕ　ｓ　
Ｆ’　＝ｋｓＧ　＝　Ｌｙｓ、Ｈ＝　ＬｅｕおよびＪ　
ｗ　Ｇｌｎであるか、−ｍ−Ｅｌ、ｎ＝ｏ、Ｒ＝Ｈまた
はＥ３０５Ｈ，Ａ＝工１８１Ｂ＝直接結合、ＣｍＴｈｒ
、　ＤｚＧｉｕ、　Ｋ＋＝Ｇｌｕ、　Ｆ＝工１θ、Ｇ　
＋＝　Ｌｙｅ、Ｈｗ　ＬｅｕおよびＪ　ｍ　Ｇｌｎであ
るか、−ｍ−０，ｎ＝０、Ｒ＝ＨまたはＳＪＨ，Ａ−工
１ｅ、　Ｂ＝直接結合、　Ｃ＝’Ｉ’ｈｒ、　ＤｚＧｌ
ｕ、　ＥｚＰｒｏ、　ＦｘＴｈｒ、　ｎ＝Ｌｙｓ、Ｈ；
ＬｅｕおよびＪｅ＝Ｇ１ｎであるか、−ｍ−０、ｎｗｏ
、Ｒ＝Ｈまたは８Ｏ５Ｈ％Ａ＝工１ｓ％Ｂ；直接結合、
ＣｍＴｈｒ、　ＤｚＧｌｕ、　ＰｅｘＰｒｏ、　Ｆｚ工
ｌｅ、　ｎ＝Ｌｙｓ、Ｔ（ｚＬｅｕおよびＪ＝０１ｎで
あるか、−ｍｗＯ１ｎ＝Ｕ、Ｒ＝Ｈまたは８０５Ｈ，Ａ
　−直接結合、Ｂ−直接結合、ＣｚＴｈｒ、Ｄ−直接結
合、　１＝ｏｌｕ％Ｎ’−Ｔｈｒ１Ｇ　＝　Ｌｙｓ、　
Ｈ＝　ＬｅｕおよびＪｍＧ］ｎであるか、−Ａ−工１ｅ
、　Ｂ−直接結合、ＣｘＴｈｒ、　Ｄ−直接結合、Ｅ＝
Ｇｌｕ、　　　１ｔ’＝Ｉｌｅ、　ｎ＝Ｌｙｓ−Ａｓｐ
、　　Ｈ＋＝Ａ１ａ、　　Ｊ＝Ｌｙｓ、ｍ−【】、ｎ＝
ＧおよびＲ＝８０！ｌＨであるか、または−Ａ−工１ｅ
％Ｂ＝直接結合、Ｃ−Ｔｈｒ、Ｄ−直接結合、Ｅ＝Ｇｌ
ｕ％　’Ｉｒｍ工Ｉｓ、Ｇｅ＝Ｌｙ８−Ａｓｐｌ　Ｈ−
Ａｌａ、ＩｇＬｙａ、（Ｈｗｚ　Ｑ　、　ｎｗｚ　Ｑお
よびＲ−Ｈである化合物である。

本発明はまたこれらポリペプチドの化学的または酵素的
分解により得られる新規な生物学的に活性なペプチド分
解生成物にも関する。

本発明はさらに、抽出法、沈殿法、膜濾過法および／ま
たはクロマトグラフィー法の組み合せを用いてポリペプ
チドを単離し、場合により存在するフェノールエステル
基Ｒを所望の場合は加水分解により除去してフェノール
性ヒドロキシル基を形成させ、Ｒプチドを場合により化
学的にまたは酵素的に分解しそして得られたペプチドを
場合によりそれらの生理学的に受容しうる塩に変換する
ことからなる前記式を有する精製されたポリペプチドの
単離法にも関する。

このポリペプチドは好ましくはヒル（Ｈ１ｒｕｄｉｎａ
θ）の種類の虫、特にアゴヒル（Ｇｎａｔｈｏｂａｅｌ
ｌｉｄａ　）目の虫の頚腺から得られる。ヒル属、アゴ
ヒル属、ヤマヒル属およびフエレモン（Ｐｈｉｌａａｎ
ｒｏｎ　）属が好ましい。特に好ましいのは薬用ヒル（
ｍｒｕｄ。

ｍｅｄｉｎａｌｉｓ　）である。ヒルの頚腺の他にその
体罰部領域またはヒル全体も使用されうる。

ヒルからの粗製抽出物の単離法はＦ！ｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ第５巻ｒＨ１ｒｕｄｉｎ　ａ８　ａｎ工ｎｈｉｂｉｔ
ｏｒ　ｏｆ　Ｔｈｒｏｍｂｉｎ　Ｊに記載されている。

ヒルジンの精製法はＢｕｌｌ。

１３００、　Ｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｌ、４５　、　５５（
１９６５）に記載されている。

本発明による方法においては、特に沈殿法およびゲル透
過クロマトグラフィーまたは限外濾過、アフイニテイク
ロマトグラフイー、および「逆相」物質での高分解性分
配クロマトグラフィーおよびシリカゲルまたは酸化アル
ミニウムでのクロマトグラフィーの組み合せが有用であ
ることが判明した。しかしながら粗油、出物の性質＝１
４− の如何に応じ、好ましくは例えばカチオン変換またはア
ニオン変換クロマトグラフィー、非特異的吸収剤特にヒ
ドロキシル燐灰石でのクロマトグラフィ（ような他のク
ロマトグラフィー法も（場合により前記した方法と組み
合せて）用いられうる。

クロマトグラフィーに適する粗抽出物を得るには、ヒル
をＭｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｆ！ｎｉｙｍｏ１ｏｇｙ　４
５　、６６９〜６７８　（１９７６）記載の方法で処理
しうる。また例えばヒルの頭部を凍結状態で粉砕１−そ
して水性緩衝溶液（例えば燐酸塩緩衝液）を用いて抽出
することもできる。不溶物質は例えば短時間遠心分離す
ることによるかまたはガーゼでＰ遇することにより分離
しそして得られる抽出液からポリペプチドを分離および
単離する。この抽出物を７０℃〜９０℃に速やかに加熱
することが好ましい。何故ならそれにより蛋白分解酵素
の主要量が変性および沈殿されるからで、次に例えば遠
心分離により分離されうる。抽出物から本発明によるペ
プチドを含有する蛋白質フラクションは、例えば抽出物
を水混和性有機溶媒中に加えて沈殿させる方法で単離す
る。例えば、アセトンは抽出液量の数倍量、好ましくは
約１０倍量にて使用でき、その場合沈殿は冷却下１通常
は０〜−４０℃好ましくは約−２０℃で行われる。

沈殿を行うもう一つの可能な方法は例えば硫酸アンモニ
ウムのような塩の添加である。ｐＨ調整によりある種の
選択的沈殿が行われ５る。等電点３．５〜４を有する本
発明によるペプチドは硫酸アンモニウムを約５０％の濃
度となるまで添加することによりｐＨ３〜５好ましくは
約４で沈殿でき、その場合多くの随伴蛋白質は溶液中に
残存する。この沈殿も約−５′ｃ〜＋１５℃好ましくは
０〜＋４℃に冷却して行われる。

この粗抽出物から比較的高い分子量を有する蛋白質は例
えば限外濾過またはゲル透過クロマトグラフィーにより
分離されうる。比較的大量・の反応混合物の場合、限外
濾過は例えば２段階で行われうる。第１段階ではｓｏ、
ｏｏｏダルトンの排除限界を有する毛管膜を用いて操作
しそして次に第２段階では１００００ダルトンの排除限
界を有する平面膜を用いて操作する。毛管膜を用いるこ
とにより、選択的に働（平面膜の通過を妨げられる比較
的高分子物質が速やかに分離される。少量では限外濾過
の第１段階は回避することもできる。

粗抽出物の精製は例えばＨｏｐｐｅ−８ｅｙ’ｌａｒ’
ａ　Ｚ。

Ｐｈｙｓｉｏｌ、　ｃｈｅｍ、　３４８　（１９６７）
　１５８１〜１３８６記載の方法でＤＫＡＥ■−セファ
デックスでのイオン交換クロマトグラフィーによっても
行われ５る。

かくして得られる物質は本発明によるトロンビン阻害剤
および他のポリペプチドの混合物からなる。式ｒ（式中
Ｒ＝Ｈまたは５Ｏ５Ｈ）を有する阻害剤の好ましい単離
法の一つは、担体に結合したトロンビンと接合物形成す
るその性質に基づぎ、トロンビンと何ら複合物を形成し
ない生成物からトロンビン阻害剤を分離することにおる
。そのトロンビン親和性に基づぎ取得されたフラクショ
ンは次に第２の高分解性クロマトグラフィー系により個
々の成分に分離されうる。

かくして式Ｉの阻害剤が単離される。アフイニテイク日
マドグラフィーにはトロンビン−セファロースの使用か
特に良いことが判った。トロンビン−セファロースはＢ
ｒｏｓｓｔａｄ法（Ｔｈｒｏｍｂｏｓ。

Ｒｏｅ、　ＩＩ、’　１１９（１９７７）　）により調
製された。

分１１ｉ１ｉｔルにハ、　　）ロンビン−セファロース
は例、ｆｃｊｆ　Ｏ，Ｉ　Ｍ　Ｎ−メチルモルホリンア
セテート緩衝液（ｐＨａＯ，）または０．１Ｍ　）リス
／　ＨＣ’Ａ緩衝液（ｐＨａ５　）のような適当な緩衝
液金含有するカラム中に注ぐ。振盪することにより分離
が行われる。カラムがｉ責に達したのち沈殿から得られ
る混合物を同じ緩衝液に溶解させそしてカラムに適用す
る。何らトロンビン親和性を有しないはブチぐは緩衝液
で洗浄することにより除去する。次にトロンビク／トロ
ンビン阻害、剤複−物は０．１　Ｍ　Ｎ−メチ“８“ホ
リンてセテー）　（ｐ、ＨａＯ）中の０．５〜２Ｍベン
ズアミジンまたは４−アミノーインズアミジンからなる
緩衝液でカラムを洗浄することにより分離する。種々。

を活性なフラ（ジョン奪−緒にして集めそしてｐＨａ［
］の００．０５ＭＮ−メチルモルホリンアセテートを用
いセファデックスＧ２５上慣用のゲル透過クロマドグ、
ラフイーにより脱塩する。

種々のトロンビン阻害剤相互の分離は高分解性クロマト
グラフィーにより行われる。、これにはやに高性能液体
クロマトグラフィー　（以下ＨＰＬＣと略記する）が良
いことが判った。

ＨＰＬＣ技術の高い分解能により、式■の阻害剤を相互
にそして微量の随伴蛋白から分離しそ１−て純粋に調製
することができる。

固定相には適当な粒径（例えば３〜２０μｍ）を有する
誘導体形成されたシリカゲルが好ましいことが判明した
。シリカゲルの誘導体形成には広く用いられるオクタデ
シルシラン残基の他に多数の他のシラン残基またはそれ
らの混合物例え、ば低級アルキル、フェニルアルキルま
たはアミン置換アルキルを有するシラン残基も適当であ
り、その場合後者残基はイオン交換クロマトグラフィー
および「逆相」クロマトグラフィーやある組み合せを提
供するものである。例えば長さ５−２５ｃｒＲおよび直
径６〜１０１１Ｉ１１の分離カラム、が使用されうる。

緩衝された溶離剤としては水と適当な親脂性を有する有
機溶媒例えば低級アルゾール、ケトン、ラトリル９、エ
ーテル、酸、アミン、７グリコールエーテル、アミドお
よびそれらの誘導体との間のす、べての二次または三名
混介物が適当である。緩衝物質としては有機および無機
塩ま、た−１ヰ他の型の添加剤も使用、寧れうる、。竺
離は好ましくはＰＨ２〜８！行われる。

、酢酸アンモ、ニウムまたは炭酸水素アンモニウムのよ
うな揮発性緩衝物質を使用すると溶出液からの阻害剤の
、単離、は簡単な凍結乾燥により行われ、うる。

６４位における硫酸モ、ノエステル基Ｐの除去は西ドイ
ツ特許４−３！３４２’Ｖ）９号記載の方法と同様にし
て酸触媒によりまたはアリール１スルフア１１＾＼ ターゼを用いて酵素的下行すれう、る。、。

本発明による式■のポ、リベプチド４ま無色ア１．。

水および水性緩衝液中に溶解性で、ポリアク・リルアミ
ド電気泳動に、おいて均一で、゛そして等電集束により
測定して等電点６．５〜４を有する。アミノ酸組成をＭ
ｏｏｒθ９およびＳ　ｔ　ｅ、、ｉ、ｎ氏の方法　□（
Ｍｅｔｈ、ｐｄｓ　、ｏｆ　Ｅｎｚ、ｙｍｏ’ｌｌｏｇ
ｙ　Ｖｉ　８．１．９７−８３１　、Ｒｏ、１．ｏ−ｖ
ｌｃｋおよｄ　Ｋａｐｌａｎ編、Ａｃａ６ｅｍｉａ　Ｐ
ｒｅ８８出版、（１９６３年））により測定すると、第
１表・に示される値が見出された。　　　−、・ 第１表 ｎ　　ｍ　　■　ｖｗ　　■　■　■ アスパラギン酸　　　９９９９９９１０１０スレオニン
　　６　５４　５４５４４ セリン　　　　４４４４４４４４ グルタミン酸　　１５　１３　１！１　１２　１２　１
２　１１　１１プロリン　　　　５５５４４　３３３ グリシン　　　　９９９９９９９９ バリン　　　　２２２２２２２２ システィン　　　６６６６６６６６ イソロイシン　　５５４　３４２４４ ０イシン　　　　４４４４４４５５ チロシン　　　　２２２２２２２２ フエニルアラニン　　１　　１　　１　　１’１’ｌ　
　　１’１リジン　　　　　３５　３５　３５４４ヒス
チジン　　１１１１１１１１ アラニン　　　　００００００１１ ■は■の脱硫酸により得られる。

本発明はさらに ａ）それ自体知られた方法で固相合成により調製される
か、または ｂ）ポリペプチド（ｍ＝ｏ’）を調製するためにＩ、ヒ
ルジンをエドマン分解に２回かけ、ＩＩ、かくして得ら
れたペプチドを 式％式％ （式中ｍ、　Ｘ％Ａ１ＢおよびＣは前記定義のとおりで
おりそして■は酸または塩基に不安定んウレタン保護基
を表わす）“′を有するアミノ酸またはペプチドの活性
エステルと反応させ、 ’Ｎ、　　ＬｙｓのＣ−アミノ官能基の７重ニルチオカ
ルバモイル基をヒドラジンを用いて、モして■、ウレタ
ン保護基口を酸または塩基を用いて除去１−１　　　　
　　− ａ）ま□たはｂ）項により得られるポリＲプチドを場合
によりその生理学的に受容しうる塩に変換する。

ことからなる前記式ｉを有するポリ’−？プチドの製法
にも関する。

同相合成においては（Ａｔｈｅｒｔｏｎ　５ｈｅｐｐｒ
ｄ著、Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ　ｉｎ　Ｐｅｐｔｌｄ
ｅ　Ｃ’ｈｅｔｎｉｓｔｒｙ、　ＫａｒｇｅｒＢａｓａ
ｌ　１９８１年、１０１〜１１７頁参照）、大抵Ｔｈｒ
のＯＨ保護基は用いずにすまされる。

式■のポリペプチドの合成は例えば、ヒドロキシメチル
化されたポリスチレン樹脂上で段階的に行われる。この
ポリスチレンは例えば１！ｊのジビニルベンゼンと交叉
結合している。これは通常小さなビードの形態で存在す
る。

アミノ酸はＮ−末端が保護されて用いられる。

最初にＮ−保護されたアミノ酸をエステル形成により担
体に付着させる。アミノ保護基を除去゛　　　したのち
次のＮ−保護されたアミノ酸をジシクロへキシルカルボ
ジイミドのような結合試薬を用いて結合させる・脱保護
および他のアミノ酸の付加は所望の配列に達するまで続
けられる。

保護基の選択はアミノ酸および結合法の如何による。

アミン保護基と仁ては例えばベンジルオキシカルボニル
（以下２と略記する）、ｐ−メト尋′シカルボベンゾキ
シ、ｐ−ニトロカルボベンゾキシ、第三ブチルオキシカ
ルボニル（以下Ｂｏａと略記する）、’Ｆｍｏｃ等のよ
うな″知られたウレタン性保護基があげられうる。

Ｂｏａ−基は比較的緩和な条件下（、例えば有機溶媒中
トリフルオロ酢酸またはＨＣｌを用いて）除去きれうる
めで好ましい。　　　′ トレオニンははンリルエーテルとして保護できそしてリ
ジンの１−アミノ官能基は２−誘導体として保護されう
る。この両保護基はＢ’ｏａ　−基′に対する除去試薬
に対し太ぎく抵抗しそして水素添加触媒（ｐｄ／活性炭
）を用い水素添加分解的にまたは例えば液体アンモニア
中のナトリ□２６一 ラムを用いて除去されうる。

保護されたペプチドは例えばヒドラジンを用いて樹脂か
ら採取されうる。その場合ヒドラリドが生成し、これは
例えばＴｎｔ、　Ｊ、　Ｐｅｐｔ、　Ｐｒｏｔ。

Ｒａ５ａａｒｃｈ　１７　（１９８１）　６〜１１記載
の方法によりＮ−ブロモスクシンイミドを用いて遊離の
カルボン酸に変換されうる。必要な場合は、ジスルフイ
ツド橋は酸化的に閉鎖されなければならない（Ｋ６ｎｉ
ｇおよびＧｅｉｇｅｒ著、Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ　
１ｎＰｅｐｔ１ｔｌｅ、　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　、Ｋ
ａｒｇｅｒ　Ｂａ５ａｌ、第５１〜４４頁参照）。

方法ｂ）においては、ピリジン／水またはジオキサン／
水のような適当な緩衝溶液中場合によりジメチルベンリ
ルアｔン（以下ＤＭＢＡと略記する）、ジメチル了りル
アイン（以下ＤＭＡＡと略記する〕またはトリエチルア
ミンのような塩基を添加して、好ましくは約５０℃およ
びｐＨ９〜９でインチオシアナート好ましくはフェニル
イソチオシアナートと反応させることによりヒルジンを
２回のエドマン分解にかける。過剰の緩衝液および過剰
のフェニルインチオシアナートを除去したのちＮ−末゛
端のバリンを酸（ヘプタフルオロ酪酸またはトリフルオ
ロ酢酸）を用い５０℃で１０分間処理することによりフ
ェニルチアゾリノンとして除去する。この反応順序を反
復してＮ−末端の第２のバリンを除去する。

この方法で得られたデス−（Ｔ／ａｌ）２−ヒルジン誘
導体を式Ｕ　−（Ｘ）［＋１−　Ａ　−Ｂ　−Ｃ−ＯＨ
を有するアミノ酸またはペプチドの活性エステルと反応
させる。

例工ばｐ−ニトロフェニルエステル、シアノメチルエス
テル、Ｎ−ヒドロキシフタルイミドエステルまたは特に
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルが適当である。

適当なウレタン保護基Ｕは例えばＢｏａまたはＭｓｏの
ような酸性またはアルカリ性で除去できるものである。

必要な場合は、ＢおよびＣの側鎖中に場合により存在す
る官能基はまた適当な保護基により一時的に保護するこ
ともでとる。

この方法で得られた式１（ｍ＝１Ｆ）を有するボＩＪ　
４プチドの保護された前駆物質はリジンのフェニルチオ
カルバモイル基を除去するために低級アルコールまたは
低級アルコールと水との混合物のような適当な溶媒中で
とドラジ水化化物で処理する。

このポリペプチドか、らまだ残る保護基を適当なに法（
Ｂｏａは例えばトリフルオロ酢酸を用いモして１Ｊｓｏ
は塩基を用い、る）で除去し、かくして本発明による式
■のポリペプチドが得られる。

本発明による。ｔｙリ−、ニーｚチドはトロンビンの特
異的なｆヒ学童論的阻害剤である。本発明によ、る阻害
剤によるトロンビン阻害の定量的測定ではトロンビン阻
害剤／トロンビン複合物が実質上解離しないことが示さ
れる。この測定法を用いて後処理および精製の間に本発
明によるボＩ）　−ｔ＜プチドの活性従って純度等級が
測定され５る。

その場合かくして精製された前記式ＩのポＩＪ　Ａプチ
ドはアンチトロンビン単位１００００／ｗｇ以上のトロ
ンビン阻害を示し従って慣用のヒルジンのそれを凌駕し
う、る。その際生体内では６４位に遊離のフェノール性
水素を有する式Ｉの化金物は大抵さらに活性が高い。

それゆえ本発明輪さらに式Ｉ（式中ｍＳｎ％Ｒ％　　　
　　’Ｘ、　Ｚ、　Ａ、　、Ｂ、　Ｃ，、、、Ｄ、　Ｅ
ｌ、　Ｆ、　Ｇ、、　ＪおよびＩ■は前記した意味を有
する）を有するボＩＪ　ペプチドの血栓塞栓性経過の治
療における血液凝固阻害剤としての測用ならびにそれら
の診断剤および試薬としての使用にも関する。　　　　
　　。

本発明はさらに、式！のポＩＪ　ペプチドまたはその−
？プチド性分解産物を製剤上受容しうる付形剤中に含有
する薬剤にも関する。

本発明による化合物は適当な医薬製剤中にて非経口また
は局所的に投与されうる。

皮下または静脈内投与には、活性化合物またはその生理
学的に受容しうる塩を、場合により可溶化剤、乳化剤、
等張剤、防腐剤または他の助剤ノヨうなそれに慣用の物
質と一緒に溶液、懸濁液または乳濁液となす。新規な活
性化合物および相当する生理学的に受容しさる塩のため
の溶媒としては例えば水、生理食塩溶液またはアルコー
ル例エバエタノール、プロパンジオール、マタはグリセ
リン、それらと並んでまた糖溶液例えばグルコースまた
はマンニット溶液、あるいはまた前記した種々の溶媒の
混合物が適当である。

皮下使用においては式＋（Ｒ−フェノール性水素）を有
する化合物は大抵比較的ゆっくりした吸収を示ｌ−従っ
て遅延作用なる利点を有する。

局所用付形剤は有機または無根化合物でありうる。代表
的な製剤上用いられる付形剤は水溶液でろる、例えば、
緩衝系または、アルコールまたはアリールアルコール、
油状物、ポリアルキレングリコール、エチルセルロース
、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン
またはミリスチン酸インプロピルのような水混和性溶媒
と水との等張混合物である。適当な緩衝物質は例えば硼
酸ナトリウム、燐酸ナトリウム、酢酸ナトリウムあるい
はグルコン酸塩緩衝液である。局所使用形態物はまた例
えば乳化性防腐物質、交叉結合剤例えばポリエチレング
リコール、および抗菌性化合物のような無毒性助剤をも
含有しうる。

実施例　１ トロンビン滴定による阻害剤濃度の測定予め測定された
蛋白質含量を有する阻害剤溶液の１０〜１００μｔに炭
酸水素す）　ＩＪウム溶液（ｐＨ７Ｏ，１５Ｍ　）　２
００　／７Ｚ　ｅ　加エル。フイフリノゲン溶液（０，
５〜１％）または希クエン酸塩血漿０．１ｄを加える。

規則的な間隔で、攪拌下に室温でトロンビン溶液の一部
（５０〜１００μｔ〕を加える（１−当り約ｊ０ＯＮ工
Ｈ単位）。終末点としては半定量的操作においては選択
された時間間隔内の液体の凝固が用いられ、または定量
的測定には５４６ｎｏｉにおける濁り測定が用いられる
。

実施例　２ ドイツ国で集められた薬用ヒル種の野生ヒル（飼育物で
ない〕が用いられる。

凍結されたヒル体罰部約１５０〜２００ｔを氷冷された
０、０９％塩化ナトリウム水酵液２ｔおよびオクタツー
ル１０ｗ１ｔと共にミキサー中で３分間内でホモジナイ
ズする。Ｏｃおよび１００００　ｒｐｍで３０分間遠心
分離したのち上澄み液を二層のガーゼで沖過することに
よりさらに清澄化させそして次に攪拌下に１５分内で８
０℃まで加熱する。生成する沈殿を４層のガーゼで濾過
することにより分離する。Ｐ液を水浴中で攪拌すること
により迅速に４Ｃ以下に冷却しそして予め冷却（−２０
℃）したアセトン７、５　を中に加える。

新たに沈殿が生成し、これは５分径ガラスフィルター吸
引ν過器で濾過しそして冷アセトン（−２０℃）１ｔで
洗う。真空下に乾燥すると蛋白質含量６２　’４　（Ｌ
ｏｗｒｙ法により測定）を有する淡帯黄色粉末５２０り
が生成する。アンチトロンビン活性は約４００単位／ｑ
である。

実施例　３ 実施例２記載の粉末５２０１ｎｉを水７５―中に溶解さ
せ、次に５Ｎアンモニアを用いてｐＨａＯに調整しそし
て０〜４℃で１時間攪拌する。不溶性部分をカップ状遠
心器を用い５０００　ｒｐｍで３０分内遠心分離する。

水を添加して蛋白質含量を２５岬／ｗｄ　（Ｌｏｗｒ７
　）に調整したのち、この溶液に飽和硫酸アンモニウム
溶液３５−を加えそして４℃で１時間攪拌する。最初の
沈殿を遠心分離（５０００ｒｐｍ／３０分）により速や
かに分離する。上澄にさらに約２６９の硫酸アンモニウ
ムを溶解させそして氷酢酸を用いてｐＨ４に調整する。

５時間放置したのち全懸濁液を遠心分離しそして得られ
た湿った沈殿を以下のようにしてさらに処理する。

実施例　４ 実施例３の記載により得られた湿った沈殿をｐＩ（８の
［Ｌ１Ｍ炭酸水素アンモニウム溶液２０〇−中に溶解さ
せそして５　ＰＭ　１０一平面膜（排除限界１００００
ダルトン）を有する２５０−のＡｍ１ＯＯｎ［Ｆ］−セ
ルで限外濾過する。その際溶液は約４０−まで濃縮され
、終りにｐＨ８，０の［１１Ｍ炭酸水素アンモニウム溶
液１５０−を２回充填する。゛残留物を凍結乾燥すると
蛋白質含量８９％を有する物質約３５０ＩＩ９が得られ
る。

実施例　５ カラム（０，９ｘ　１５ｃｍ）にｐＨ８の０．１　Ｍ　
）リス緩衝液（ｎａｇ　中のトロンビンーセファロース
ヲ流す。実施例３で得られた物質を同じ緩衝液中に溶解
させ、そしてカラムにこの試料を充填する。

カラムを平衡化に用いた緩衝液で洗うことにより不活性
な随伴物質を除去する。次にベンズアミジン（１，５Ｍ
、）リス緩衝液、ｐＨ７）または４−アミノベンズアミ
ジン（１２Ｍ、）リス緩衝液ｐＨ７）の溶液を用いてヒ
ルジンをトロンビン／ヒルジン複合物から除去しそして
少しずつ溶出させる。アンチトロンビン活性を試験する
には最初に拮抗阻害剤をセファデックスＧ２０でのゲル
シ過によりヒルリンから分離する。

収量：　５５　ｖｒ／ｗ　１０ 活性＝６０００〜１２０００　ＡＴＵＡＩＩｇ実施例　
６ 実施例３記載の阻害剤２０Ｉ％ＩをＴ）Ｈ２，１６（ト
リフルオロ酢酸＋５チアセトニトリルで調整）の水２０
０μを中に溶解させそしてオクタデシルシラン−シリカ
ゲル（５μｍ）を充填した鋼製カラムに注入する（　８
ｈａｎｄｏｎ■ｏＤｓ　）。とのカラムを出発緩衝液（
水−ｐＨ２，１６＋５’Ａアセトニトリル）およびアセ
トニトリルとの間に最高２％／分の勾配をつけて溶離す
る。フラクションをそれぞれ集める。乾燥後式１（Ｒ＝
Ｈまたは５Ｏ５Ｈ）を有する本発明による阻害剤はトロ
ンビンとの１＝１複合物の化学量論に相当する比活性を
有する。

実施例　７ ３ｌ− ａ）実施例４で得られた物質をＨｏｐｐθ−８θＹイθ
ｒ’ｓｚ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　３４８　
（１９６７）、１５８１．〜１３８６に記載された方法
でＤＥＡＥ−セファデックスＡ−２５で精製した。

ｂ）かくして得られた蛋白質フラクション１．１岬をＣ
−１８逆相用の、粒子寸法５μおよび細孔中３３０Ｘを
有するシリカゲルを充填した２５３Ｘ４．６ｍ＋のＢｉ
ｂ−Ｐａｄ■（Ｒｌｃｈｍｏｎｄ　、σＡ）のハイ−ポ
ール（Ｈｌ　−’Ｐａ　ｒθ）カラム上のＨＰＬＣによ
り分離した。

移動相としては０．１％トリフルオロ酢酸を有する水中
の１０優アセトニトリル（Ａ）／　ｏ、　１４　）リフ
ルオロ酢酸を有するアセトニトリル中の１０係の水（Ｂ
）の勾配速度Ａ：Ｂ−１％／分が用いられた。クロマト
グラフィーの時間的経過は２１６ｎｍで検出することに
より監視された（第１図参照）。第１図に示される斜線
をつけたフラクション１〜５をもう一回クロマトグラフ
イーする。

その場合同じＨＰＩ、Ｃ系が用いられた。

Ｃ）フラクション１を再クロマトグラフィーすると（第
２図参照）、約２００μｆの蛋白質が得られ、その構造
が配列分析により決定された。下記構造が割り当てられ
た。

ＴＴＹＴＤＣＴＥｓｏｑｌすＬＣＬＣＥｉＧ８ＮＶ（’
ｌ！Ｇ＋Ｊ（）ＮＫＣＩ’ＬＧＳＤＧＫＫＮ　Ｑ、ＣＶ
ＴＧＫＧＴＰｘ’ｐＱＳＨＮＤＧＤｙＥａＩＰＥＢＥＹ
Ｌ、Ｃｊｏ ｄ）フラクション２を再クロマトグラフィーすると（第
３図か照〕約３００．　／Ｉｆの蛋白質が得られ、この
ものの構造が配列分析により決定された。下記構造が割
り当てられた。

ｒＴＴｙＴＤｃＴｇｓＧＱＮＬＣｒ、ｃｇ６ｓＮｖｃＢ
ＧＮＫｃｒＬＧＥ］１［ＫＫＮ　ＱＣＶＴＧＦｌ！ＧＴ
ＰＫＰＱ８ＨＮＤＧＪ）Ｆ’ＫＢｉ工ＰＩＩＣＥＹＬＱ
０ θ）フラクション３を再クロマトグラフィーすると（第
４回診“照）約１５０μｔの蛋白質、が得られ、その構
造が配列分析により決定された。下記構造が割り当てら
れた。

ＴＹＴＤＣＴＥ１８ＧＱＮＬ、ＣＩ、Ｃ’、ＢＧ８ＮＶ
Ｃ，ＧＱＧＮＫ（！ｊＬＧ８Ｄ（）ＥＦ−Ｎ　ＱＣＶＴ
ＧＥＧＴＰＫＰＱＳＨＮＤＧＤＦＫＫ工ＰｋＦｉＹＬＱ
。

ｆ）フラクション４を再クロマトグラフィーすると（第
５図参照）約８０μ２の蛋白質が得られ、その構造が配
列分析により決定された。下記構造が割り当てられた。

ＩＴＹＴＤＣＴ、ＥＳＧＱＮＬＣＬＣＥ）ＧＳＮＶＣ（
）Ｑ、Ｇ、ＮＫＣＩＬＧＳＤＧＥｔＫＮＱＣＶＴ（）］
！ＩＧＴＰＫＰＱｓＨＮ、ＤＧＤＦＥＢ工Ｐ　Ｂ　Ｗ　
Ｙ　ＴＪＣＬ　。

ｇ）フラクション５（第６図参照）を再クロマトグラフ
ィーすると約４０μｔの蛋白質が得られ、その構造はま
だ調査されていない。

実施例　８ ａ）実施例５の記載に従い商業上得られる動物を処理す
ることにより得られる物質から出発し、そしてこれを実
施例７　ａ）記載の予備精製にかけた。

ｂ）かくして得られた蛋白質フラクション１岬を実施例
７　ｂ）の記載のようにしてＨＰＬＣにより分離した。

第７図に示される斜線をしたフラクションを再クロマト
グラフィーする。その際勾配速度ａ：Ｂ−ｕ、８％／分
でおること以外は同じ条件である（第８図か照）。Ｍ９
図はかくして得られた分析上純粋な蛋白質のクロマトグ
ラムを示し、これには配列分析により決定された下記構
造が割当てられる。

ＩＴＹＴＤＣｘｎｓａｑＮＬ’ｃＬｃｗ”ａｓＮ’ｖｃ
ＧＫ’ａＮ＝ｃ工ＬＧ８ＤＧ　　ＫＤＮｃ４ＣＶ’ｒＧ
ＢＧ’ｒＰＫＰＱ８ＨＮＤＧＤ？ＢＢＩＰ　Ｉ！ｆ　ｌ
　Ｙ　Ａ　Ｑ　。

本明細書で用いられるアミノ酸の３文字および１文字記
号は下記のとおりである。

アミノ酸　　略　語　アミノ酸　略語 アラニン　　　Ａｒｇ　（Ａ）　　プロリン　　Ｐｒｏ
　（Ｐ）アルギニン　　Ａｒｇ（Ｒ）　　セリン　　　
Ｓａｒ　（８）システィン　　　Ｃｙｓ　　（Ｃ）　　
）レオニン　　Ｔｈｒ　　（Ｔ）グリシン　　　　Ｇ工
ｙ　（リ　トリプトファン　Ｔｒｐ　　（Ｗ）ヒスチジ
ン　　Ｈｌｓ　（Ｈ）　　チロシン　Ｔｙｒ　（Ｙ）イ
ソロイシン　　　エｌｅ　　（１）　バリン　　　　Ｖ
ａｌ　　（Ｖ）ロイシン　　　　Ｌｅｕ　　（リ　アス
パラギン酸　Ａｓｐ　　（Ｄ）リジン　　　　Ｌｙｓ　
　（Ｋ）　　アスパラギン　　Ａｓｎ　　（Ｎ）メチオ
ニン　　　Ｍｅｔ　　（Ｍ）　　グルタミン酸　Ｇｌｕ
（３）フェニルアラニン　ｐｈｅ゛（Ｆ）　　グルタミ
ン　　　Ｇｌｎ　　（Ｑ）

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例７ａ）で得られた蛋白質フラクションを
ＨＰＬＣにかけた場合の２１６ｎｍで検出されたクロマ
トグラフィーの時間的経過における　　　　　□フラク
ション１〜５を示す〇 第２図は第１図のフラクション１を再クロマトゲラフイ
ーした結果を示す。 第３図は第１図のフラクション２を再クロマトグラフィ
ーした結果を示す。 第４図は第１図のフラクション３を再クロマトグラフィ
ーした結果を示す。 第５図は第１図のフラクション４を再クロマトグラフィ
ーした結果を示す。 第６図は第１図のフラクション５を再クロマトグラフィ
ーした結果を示す。 第７図は実施例８ａで得られた蛋白質フラクションをＨ
ＰＬＣにかけた場合の２１６ｎｍで検出したフラクショ
ンを示す。 第８図は第７図で示される斜線をしたフラクションを再
クロマトグラフィーしまた結果を示す。 第９図はかくして得られた分析上純粋な蛋白質のクロマ
トグラムを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）式 I を有するポリペプチドまたはそれらの生理学
   的に受容しうる塩、 【遺伝子配列があります】（ I ） ここで上式中 ｍは０〜５０であり、 ｎは０〜１００であり、 Ｒはフェノール性水素またはフェノールエステル基であ
   り、 Ｘは同じかまたは相異なる天然に存在するα−アミノ酸
   の残基であり、 Ｚは同じかまたは相異なる天然に存在するα−アミノ酸
   の残基であり、 ＡはＩｌｅまたはアミノ酸の非存在を意味し、ＢはＩｌ
   ｅまたはＴｈｒまたはアミノ酸の非存在を意味し、 ＣはＴｈｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＰｈｅを意
   味し、ＤはＧｌｕまたはアミノ酸の非存在を意味し、Ｅ
   はＧｌｕまたはＰｒｏであり、 ＦはＴｈｒまたはＩｌｅであり、 ＧはＬｙｓまたはＬｙｅ−Ａｓｐであり、 ＨはＡｌａまたはＬｅｕであり、そして ＪはＧｌｎまたはＬｙｓであり、 かつ上式中６個のＣｙｓ残基はジスルフィッド橋を介し
   て対で結合しているものとする。 ２）ＣがＴｈｒである前記特許請求の範囲第１項記載の
   ポリペプチド。 ３）ＡがＩｌｅである前記特許請求の範囲第２項記載の
   ポリペプチド。 ４）Ｒが水素、ＳＯ＿３ＨまたはＰＯ＿３Ｈ＿２である
   前記特許請求の範囲第１〜３項のいずれか１項記載の化
   合物。 ５）ＲがＳＯ＿３Ｈである前記特許請求の範囲第１〜４
   項のいずれか１項記載の化合物。 ６）Ｒがフェノール性水素である前記特許請求の範囲第
   １〜４項のいずれか１項記載の化合物。 ７）前記特許請求の範囲第１〜６項のいずれか１項記載
   のポリペプチドの生物学的に活性なペプチド性分解生成
   物。 ８）アゴヒル目の虫、好ましくはヒル属の虫から抽出法
   、沈殿法、膜濾過法および／またはクロマトグラフィー
   法の組み合せを用いてポリペプチドを単離し、場合によ
   り存在するフェノールエステル基Ｒを所望の場合は加水
   分解により除去してフェノール性ヒドロキシル基を形成
   させ、ペプチドを場合により化学的にまたは酵素的に分
   解し、そして得られたペプチドを場合によりそれらの生
   理学的に受容しうる塩に変換することからなる前記特許
   請求の範囲第１〜７項のいずれか１項記載の精製された
   ポリペプチドの単離法。 ９）ａ）それ自体知られた方法で固相合成により調製さ
   れるか、または ｂ）ポリペプチド（ｍ＝０）を調製するために I 、ヒルジンをエドマン分解に２回かけ、 II、かくして得られたペプチドを式 Ｕ−Ｘ＿ｍ−Ａ−Ｂ−Ｃ−ＯＨ （式中ｍ、Ｘ、Ａ、ＢおよびＣは前記定義のとおりであ
   りそしてＵはウレタン保護基を表わす）を有するアミノ
   酸またはペプチドの活性エステルと反応させ、 III、Ｌｙｓのε−アミノ官能基のフェニルチオカルバ
   モイル基をヒドラジンを用いて、そして IV、ウレタン保護基Ｕを酸または塩基を用いて除去し、 上記ａ）またはｂ）により得られたポリペプチドを場合
   により化学的または酵素的に分解しそして場合によりそ
   の生理学的に受容しうる塩に変換することからなる前記
   特許請求の範囲第１〜７項のいずれか１項記載の式 I
   を有するポリペプチドの製法。 １０）医薬好ましくは抗凝固剤としての前記特許請求の
   範囲第１〜７項の１項記載のペプチドの使用。 １１）前記特許請求の範囲第１〜７項のいずれか１項記
   載のペプチドおよび製剤上受容しうる付形剤を含有する
   薬剤。