JPH01250396A - ポリペプチドの製造方法 - Google Patents
ポリペプチドの製造方法Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/006—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length of peptides containing derivatised side chain amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/595—Gastrins; Cholecystokinins [CCK]
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
本発明はポリペプチドの製造方法に関し、特にはTyr
とSerおよび/またはThr残基を有するポリペプチ
ドのTyrのOH基を選択的に硫酸化する方法に関する
ものである。
とSerおよび/またはThr残基を有するポリペプチ
ドのTyrのOH基を選択的に硫酸化する方法に関する
ものである。
(従来の技術)
ポリペプチドは遺伝子操作の研究対象となるタンパク質
として近年大いに注目され、各種のポリペプチドが合成
されている。この合成法としては同相法と液相法が知ら
れているが、固相法は得られるペプチドの純度が低く、
最終工程での積装に多くの困難があるため工業的製法と
しては適当でない、一方、液相法にはステップワイズ法
とフラグメント縮合法があるが、前者は固相法と同様に
生成物のaSが困難であるため、後者のフラグメント縮
合法が多く利用されている。フラグメント縮合法は合成
をフラグメントごとに分割できるので損失が少なくでき
、最終生成物の純度も高く、生成しやすい利点を持つ反
面、縮合反応においてC末端アミノ酸残基がラセミ化を
受けやすい欠点を伴うため、フラグメントの組合せをど
のように選ぶかが重要である。
として近年大いに注目され、各種のポリペプチドが合成
されている。この合成法としては同相法と液相法が知ら
れているが、固相法は得られるペプチドの純度が低く、
最終工程での積装に多くの困難があるため工業的製法と
しては適当でない、一方、液相法にはステップワイズ法
とフラグメント縮合法があるが、前者は固相法と同様に
生成物のaSが困難であるため、後者のフラグメント縮
合法が多く利用されている。フラグメント縮合法は合成
をフラグメントごとに分割できるので損失が少なくでき
、最終生成物の純度も高く、生成しやすい利点を持つ反
面、縮合反応においてC末端アミノ酸残基がラセミ化を
受けやすい欠点を伴うため、フラグメントの組合せをど
のように選ぶかが重要である。
これまで、ポリペプチドとしてヒトコレシストキニン(
hCCK−33)をフラグメント縮合法で全合成する試
みがなされてきたが、いずれも成功していない、その理
由は保護基を有する複数個のフラグメントを順次アジド
縮合させる場合に、アミノ酸残基(SerまたはThr
)の存在下にTyr残基のみを選択的に硫酸化する試薬
がなく、かつ試薬による硫酸化は目的とするTyr−O
Hに起こらず、優先的に5er−OHまたはThr−0
)1に起こるためである。
hCCK−33)をフラグメント縮合法で全合成する試
みがなされてきたが、いずれも成功していない、その理
由は保護基を有する複数個のフラグメントを順次アジド
縮合させる場合に、アミノ酸残基(SerまたはThr
)の存在下にTyr残基のみを選択的に硫酸化する試薬
がなく、かつ試薬による硫酸化は目的とするTyr−O
Hに起こらず、優先的に5er−OHまたはThr−0
)1に起こるためである。
本発明者らはこの点について種々検討の結果、塩基性条
件下において脱保護可能なアミノ基およびTyr残基を
選択的に硫酸化できる試薬と方法を見出し本発明を完成
することができた。
件下において脱保護可能なアミノ基およびTyr残基を
選択的に硫酸化できる試薬と方法を見出し本発明を完成
することができた。
(発明の構成)
本発明はTyrとSerおよび/またはThr残基を有
する出発物質としてのポリペプチドのアミノ基を塩基性
条件下において脱離可能なアミノ保護基で保護し、Se
rおよび/またはThr残基のOH基をマスキングした
のち脱保護してTyr残基のOH基を選択的に硫酸化す
ることを特徴とするポリペプチドの製造方法を要旨とす
るものである。
する出発物質としてのポリペプチドのアミノ基を塩基性
条件下において脱離可能なアミノ保護基で保護し、Se
rおよび/またはThr残基のOH基をマスキングした
のち脱保護してTyr残基のOH基を選択的に硫酸化す
ることを特徴とするポリペプチドの製造方法を要旨とす
るものである。
以下、本発明の詳細な説明するが、この説明において用
いたアミノ酸はグリシンを除きいずれもL型のものであ
り、アミノ酸の略号は英文3文字による一般の用法に従
い、その他の略号は次の通りである。
いたアミノ酸はグリシンを除きいずれもL型のものであ
り、アミノ酸の略号は英文3文字による一般の用法に従
い、その他の略号は次の通りである。
Bzl :ベンジル
CHA ニジクロヘキシルアミン
Chp ニジクロヘプチル
Cl2−Bzl : 2,6−ジクロロベンジルDCH
A ニジシクロヘキシルアミン DMF ニジメチルホルムアミド DNSOニジメチルスルホキシド EDT :エタンジチオール Fmoc : 9−フルオレニルメチルオキシカルボニ
ルHMPA :ヘキサメチルホスホアミドMts :メ
シチレンー2−スルホニルNMM : N−メチルモル
ホリン (0):スルホキシド Su : N−ヒドロキシサクシンイミジルTEAニト
リエチルアミン TFAニトリフルオロ酢酸 T)IF :テトラヒドロフラン TMSOTf : トリメチルシリルトリフルオロメタ
ンスルホネート tBuPh2Si : tert−ブチルジフェニルシ
リルtBuMeSi : tert−ブチルジメチルシ
リルMe2Siニトリメチルシリル 2:ベンジルオキシカルボニル Z(OMe) : p−メトキシベンジルオキシカルボ
ニル本発明の方法はTyrとSerおよび/またはTh
r残基を有するポリペプチドを出発物質とするのであり
、ヒトコレシストキニン(hCCK−33)の未硫酸化
形がこれに該当する。
A ニジシクロヘキシルアミン DMF ニジメチルホルムアミド DNSOニジメチルスルホキシド EDT :エタンジチオール Fmoc : 9−フルオレニルメチルオキシカルボニ
ルHMPA :ヘキサメチルホスホアミドMts :メ
シチレンー2−スルホニルNMM : N−メチルモル
ホリン (0):スルホキシド Su : N−ヒドロキシサクシンイミジルTEAニト
リエチルアミン TFAニトリフルオロ酢酸 T)IF :テトラヒドロフラン TMSOTf : トリメチルシリルトリフルオロメタ
ンスルホネート tBuPh2Si : tert−ブチルジフェニルシ
リルtBuMeSi : tert−ブチルジメチルシ
リルMe2Siニトリメチルシリル 2:ベンジルオキシカルボニル Z(OMe) : p−メトキシベンジルオキシカルボ
ニル本発明の方法はTyrとSerおよび/またはTh
r残基を有するポリペプチドを出発物質とするのであり
、ヒトコレシストキニン(hCCK−33)の未硫酸化
形がこれに該当する。
したがって、以下フラグメント縮合法によるhccX−
33の合成を例として本発明を説明する。
33の合成を例として本発明を説明する。
本発明の方法は次の3段階の工程からなる。すなわち、
第1段階は保護基を有するhCCK−33の合成、第2
段階は保護基の除去・脱離による硫酸化されていないh
CCK−33の取得、そして第3段階はTyr残基の選
択的硫酸化である。
第1段階は保護基を有するhCCK−33の合成、第2
段階は保護基の除去・脱離による硫酸化されていないh
CCK−33の取得、そして第3段階はTyr残基の選
択的硫酸化である。
第1段階においては第1図に示すように下記7個のポリ
ペプチドフラグメントを順次アジド法で縮合させること
によって保護基を有するhCCK−33が合成される。
ペプチドフラグメントを順次アジド法で縮合させること
によって保護基を有するhCCK−33が合成される。
(1) If−Asp (OChp)−Arg (Mt
s)−Asp (OChp)−Tyr−Met (0)
−Gly−Trp (Mts)−Met (0)−As
p (OChp)−Phe−N)l。
s)−Asp (OChp)−Tyr−Met (0)
−Gly−Trp (Mts)−Met (0)−As
p (OChp)−Phe−N)l。
(2)Z(OMe)−His−Arg(Mts)−11
e−5er−NHNH。
e−5er−NHNH。
(3)Z(Oi4e)−Asp(OBzl)−Pro−
Set(Bzl)−NON)l。
Set(Bzl)−NON)l。
(4)Z(OMe)−Asn−Lau−Gin−Asn
−Leu−NHNH。
−Leu−NHNH。
(5)Z(OMe)−3ar(Bzl)−11s−Va
l−Lys(Z)−NHNH。
l−Lys(Z)−NHNH。
(6) Z (OMs)−Gly−Arg (Mts)
−Met (0) −NHNH。
−Met (0) −NHNH。
(7)Z(OMa)−Lys(Z)−Ala−Pro−
5et−NHNH。
5et−NHNH。
この場合フラグメント(1)は第2図に示すように、最
初にTyr (C1i−Bzl)を用い、 Suエステ
ル法によりZ(OMa)−Tyr(C1,−Bzl)−
0Hを、Z(OMe)−Mat(0)−Gly−Trp
(Mts)−Mat (0)−Asp (OChp)
−Phe−NH,のTFA処理試料と縮合させることに
よって得られる。
初にTyr (C1i−Bzl)を用い、 Suエステ
ル法によりZ(OMa)−Tyr(C1,−Bzl)−
0Hを、Z(OMe)−Mat(0)−Gly−Trp
(Mts)−Mat (0)−Asp (OChp)
−Phe−NH,のTFA処理試料と縮合させることに
よって得られる。
第2図の方法で得られたC末端デカペプチドアミド(1
)(位置24〜33)から出発して各フラグメントを順
次縮合させる場合、 DMF−DMSO−HMPA (
1:1:1)を用いてフラグメントを溶解し、アシル成
分を1.5〜5当量用いて反応の完結に努めた。過剰の
アシル成分を用いたが、各反応は過アシル化することな
く、スムースに進行した0反応後過剰のアシル成分は再
沈殿法ないしはゲルろ過によって精製した。
)(位置24〜33)から出発して各フラグメントを順
次縮合させる場合、 DMF−DMSO−HMPA (
1:1:1)を用いてフラグメントを溶解し、アシル成
分を1.5〜5当量用いて反応の完結に努めた。過剰の
アシル成分を用いたが、各反応は過アシル化することな
く、スムースに進行した0反応後過剰のアシル成分は再
沈殿法ないしはゲルろ過によって精製した。
酸加水分解の生成物中のアミノ酸組成比は第1表に示す
通りである。これによって保護されたhCCK−33を
合成するルートが確立できた。
通りである。これによって保護されたhCCK−33を
合成するルートが確立できた。
第2段階として保護されたhCCK−33からすべての
保護基を除いて硫酸化されていないhCCK−33を得
た。保護基を除くに先立って、Mat(0)残基をフェ
ニルチオトリメチルシランで処理してNetに還元し、
還元されたペプチドをTMSOTf−チオアニソール/
TFAで処理して、すべての保護基を除いた。
保護基を除いて硫酸化されていないhCCK−33を得
た。保護基を除くに先立って、Mat(0)残基をフェ
ニルチオトリメチルシランで処理してNetに還元し、
還元されたペプチドをTMSOTf−チオアニソール/
TFAで処理して、すべての保護基を除いた。
保護基を除去したペプチドを5ephadex G−2
5を用いてゲルろ過し、重炭酸アンモニウム緩衝液を使
用してCM−トリスアクリルN上でイオン交換クロマト
グラフィーを行った0合成された硫酸化されていないh
CCに−33の均質性を、6N塩酸による加水分解後の
アミノ酸分析と逆相系カラムを用いた1+PLCによっ
て確かめた。
5を用いてゲルろ過し、重炭酸アンモニウム緩衝液を使
用してCM−トリスアクリルN上でイオン交換クロマト
グラフィーを行った0合成された硫酸化されていないh
CCに−33の均質性を、6N塩酸による加水分解後の
アミノ酸分析と逆相系カラムを用いた1+PLCによっ
て確かめた。
次に第3段階としてTyr残基を選択的に硫酸化するの
であるが、このためにTyr、 Ser、 Trp、
Net。
であるが、このためにTyr、 Ser、 Trp、
Net。
flusおよびLysについて若干のモデル実験を行っ
た。
た。
本発明者らはこのモデル実験から5er−OHがTyr
−〇(1より遥かに速い速度でシリル化されることを発
見した。ピリジン−5oJJ体で行う硫酸化の条件下2
4時間後の時点で、Set(Me2Si)誘導体および
Set(tBuMesi)誘導体は分解されるが、5e
r(tBuPh2Si)誘導体はそのままの形で残るこ
とがわかり、シリル化剤としてtBuPh2Si塩化物
を選択するに至った。
−〇(1より遥かに速い速度でシリル化されることを発
見した。ピリジン−5oJJ体で行う硫酸化の条件下2
4時間後の時点で、Set(Me2Si)誘導体および
Set(tBuMesi)誘導体は分解されるが、5e
r(tBuPh2Si)誘導体はそのままの形で残るこ
とがわかり、シリル化剤としてtBuPh2Si塩化物
を選択するに至った。
tBuPh2Si塩化物によるZ(OMa)−5er−
0阿eのシリル化はイミダゾールの存在下で30分以内
に定量的に進行した。一方、この条件でTyr−OHは
一部シリル化されるのであるが、水冷下フェノール化合
物の添加によりこれを抑制できることが判った。フェノ
ール化合物として3種類を選んで試験を行ったが。
0阿eのシリル化はイミダゾールの存在下で30分以内
に定量的に進行した。一方、この条件でTyr−OHは
一部シリル化されるのであるが、水冷下フェノール化合
物の添加によりこれを抑制できることが判った。フェノ
ール化合物として3種類を選んで試験を行ったが。
この中でフェノールが最も良い結果を与えた。
第3図に示されるように、フェノール(20当量)の添
加はTyr−OHのシリル化を4錦から31%(4時間
後)に抑制する。 tBuPh2Si基はDMF中のI
Mのテトラブチルアンモニウムふっ化物(Bu4NF)
による簡単な処理(0℃、60分)で分解されることが
知られているが、こ九に対してTyr(So、H)はこ
のハード塩基処理の下に安定であった。薄層クロマトグ
ラフィー(TLC)で検査したところ、シリル化および
脱シリル化の条件の下にHis、 MrtおよびTrp
は不変に残っていた。これらのモデル実験から5et−
OHの存在下でのTyr−OHの優先的硫酸化はtBu
Ph、si基による5et−OHの水酸基の可逆的マス
キングによって行われると結論された。なお、Thrは
hccに一33中には無い。
加はTyr−OHのシリル化を4錦から31%(4時間
後)に抑制する。 tBuPh2Si基はDMF中のI
Mのテトラブチルアンモニウムふっ化物(Bu4NF)
による簡単な処理(0℃、60分)で分解されることが
知られているが、こ九に対してTyr(So、H)はこ
のハード塩基処理の下に安定であった。薄層クロマトグ
ラフィー(TLC)で検査したところ、シリル化および
脱シリル化の条件の下にHis、 MrtおよびTrp
は不変に残っていた。これらのモデル実験から5et−
OHの存在下でのTyr−OHの優先的硫酸化はtBu
Ph、si基による5et−OHの水酸基の可逆的マス
キングによって行われると結論された。なお、Thrは
hccに一33中には無い。
1970年にカルピノ(Carpino)とハン(Ha
n)により塩基で除去可能なアミノ保護基として紹介さ
れたFmoc基は、DMF中のIMのBu、NFによる
処理で。
n)により塩基で除去可能なアミノ保護基として紹介さ
れたFmoc基は、DMF中のIMのBu、NFによる
処理で。
tBuPh2Si基と共に分解されることがわかったの
で、本発明ではa酸化に先立って二つのLys残基(位
=1.11)のα−およびε−アミノ官能基をF脂oc
基でマスクした。 TLCで検査すると、TyrのFa
+oc−OSuによる部分的アシル化はフェノールの添
加により効果的に抑制されていた。
で、本発明ではa酸化に先立って二つのLys残基(位
=1.11)のα−およびε−アミノ官能基をF脂oc
基でマスクした。 TLCで検査すると、TyrのFa
+oc−OSuによる部分的アシル化はフェノールの添
加により効果的に抑制されていた。
最近になって、アセチル硫酸ピリジニウム(PAS試薬
)がペンダ(Penka)らによって硫酸化剤として紹
介された。この試薬はペンダらによりDMF−ピリジン
中で、シラン(にurano)らによりTFA中で、S
’er−OHをそれぞれアセチル基またはフェノキシア
セチル基でマスクした後、ブタCCK−33の製造に使
用された。
)がペンダ(Penka)らによって硫酸化剤として紹
介された。この試薬はペンダらによりDMF−ピリジン
中で、シラン(にurano)らによりTFA中で、S
’er−OHをそれぞれアセチル基またはフェノキシア
セチル基でマスクした後、ブタCCK−33の製造に使
用された。
Tyr(So、H)の機工安定性および本発明の場合の
未硫酸化hCCK−33中のマスクされていないTrp
残基の存在を考慮して、本発明では塩基性の条件下にT
yr残基を硫酸化した。 DMF中のピリジンの存在の
下では、ピリジン−So、 9体はPAS試薬よりも容
易にZ (OMe)−Tyr−OMeを硫酸化した(第
4図)。
未硫酸化hCCK−33中のマスクされていないTrp
残基の存在を考慮して、本発明では塩基性の条件下にT
yr残基を硫酸化した。 DMF中のピリジンの存在の
下では、ピリジン−So、 9体はPAS試薬よりも容
易にZ (OMe)−Tyr−OMeを硫酸化した(第
4図)。
Z (OMa)−5ar−OMeの硫酸化反応でも同様
の傾向が観察された。 TLCで検査すると、Hisは
ピリジン−8O3錯体により部分的に硫酸化されていた
が(4時間後、32%)水の添加により60分以内に定
量的にHisが再生された。硫酸化の間のMatの部分
的酸化およびTrpの変化を抑制するにはIEDTの使
用が有効であった。第4回はDMF−ピリジン中でのピ
リジン−803錯体またはアセチル硫酸ピリジニウムに
よるZ(OMe)−Tyr−OMeおよびZ (OMe
)−9ar−OMgの硫酸化を示すものである。
の傾向が観察された。 TLCで検査すると、Hisは
ピリジン−8O3錯体により部分的に硫酸化されていた
が(4時間後、32%)水の添加により60分以内に定
量的にHisが再生された。硫酸化の間のMatの部分
的酸化およびTrpの変化を抑制するにはIEDTの使
用が有効であった。第4回はDMF−ピリジン中でのピ
リジン−803錯体またはアセチル硫酸ピリジニウムに
よるZ(OMe)−Tyr−OMeおよびZ (OMe
)−9ar−OMgの硫酸化を示すものである。
これらのモデル実験の後、第1図および第5図に示すよ
うに、前記未硫酸化形のhCCK−33に対し、次の反
応を逐次行わせて硫酸化hCCX−33に添加させた。
うに、前記未硫酸化形のhCCK−33に対し、次の反
応を逐次行わせて硫酸化hCCX−33に添加させた。
:
1)TEAの存在下にFmoc−O5uで処理して、す
べてのアミノ官能基を保護した(0℃、2時間)。
べてのアミノ官能基を保護した(0℃、2時間)。
Tyr残基を保護するためにフェノールを加えた。
2)イミダゾールの存在下にtBuPb、5x−C1で
処理して、4個の5et−OH官能基を優先的に保護し
た(4℃、 14時間、モデル実験より長い時間)、フ
ェノールを加えてTyr残基のシリル化を最小にした。
処理して、4個の5et−OH官能基を優先的に保護し
た(4℃、 14時間、モデル実験より長い時間)、フ
ェノールを加えてTyr残基のシリル化を最小にした。
3)20%のピリジンを含むDMF中のピリジン−8O
2錯体での処理によりTyr−OHを硫酸化(25℃、
24時間)し、EDTを加えてNetとTrρを保護し
た。
2錯体での処理によりTyr−OHを硫酸化(25℃、
24時間)し、EDTを加えてNetとTrρを保護し
た。
4)DMF中のIMのBu4NFで処理して、tBuP
h2Si保護基とFn+oc保護基を除去した(4℃、
1時間。
h2Si保護基とFn+oc保護基を除去した(4℃、
1時間。
次いで25℃、1時間)、 EDTを添加してF+*o
c基から由来するジベンゾフルペンをクエンチングさせ
た。
c基から由来するジベンゾフルペンをクエンチングさせ
た。
このようにして硫酸化されたhCCK−33の粗試料を
、0.2MのNi148CO3緩衝液による傾斜溶離法
を用いてCトドリスアクリルS上でイオン交換クロマト
グラフィーにかけ1次いで0.1MのAc0NH4溶液
中のMeCN (31%)を用いるアイソクラチックエ
ル−ジョン(isocratic elution)に
よるAsahipakODP−50カラムでの1(PL
Cで精製した。前者の精製は過度に硫酸化されたhCC
Kと未硫、酸化hCCKを除去するのに有効であった。
、0.2MのNi148CO3緩衝液による傾斜溶離法
を用いてCトドリスアクリルS上でイオン交換クロマト
グラフィーにかけ1次いで0.1MのAc0NH4溶液
中のMeCN (31%)を用いるアイソクラチックエ
ル−ジョン(isocratic elution)に
よるAsahipakODP−50カラムでの1(PL
Cで精製した。前者の精製は過度に硫酸化されたhCC
Kと未硫、酸化hCCKを除去するのに有効であった。
このHPLCカラムでは、YMC−005302カラム
より、所望の生成物の分離がより良好であった。総合収
率は未硫酸化hccに−33より計算して15%であっ
た。収率は用いられたシリル化条件に全く依存するよう
に思われる。最適のシリル化条件は確認されていないが
シリル化を25℃、3時間で行ったときの収率は13%
であった。
より、所望の生成物の分離がより良好であった。総合収
率は未硫酸化hccに−33より計算して15%であっ
た。収率は用いられたシリル化条件に全く依存するよう
に思われる。最適のシリル化条件は確認されていないが
シリル化を25℃、3時間で行ったときの収率は13%
であった。
このようにして得られた合成hCCK−33の純度は分
析的HPLCと酸加水分解後のアミノ酸分析によって確
かめられた。 ryr(SOi−)の存在はロイシン−
アミノペプチダーゼ(LAP)消化によって確認された
。
析的HPLCと酸加水分解後のアミノ酸分析によって確
かめられた。 ryr(SOi−)の存在はロイシン−
アミノペプチダーゼ(LAP)消化によって確認された
。
合成hCCK−33は並行して合成hCCに−8による
バイオアッセイにかけられ、活性が測定された。バイオ
アッセイはベンドパルビタールで麻酔された雑種犬(n
=4)におけるすい臓毛細血管流とすい臓のタンパク
質放出で行われた。すい臓毛細血管の血液流はレーザー
ドツプラー潅流モニターで測定し、すい臓のタンパク質
の濃度はローリ(Lovry)らの方法で測られた。
バイオアッセイにかけられ、活性が測定された。バイオ
アッセイはベンドパルビタールで麻酔された雑種犬(n
=4)におけるすい臓毛細血管流とすい臓のタンパク
質放出で行われた。すい臓毛細血管の血液流はレーザー
ドツプラー潅流モニターで測定し、すい臓のタンパク質
の濃度はローリ(Lovry)らの方法で測られた。
大腿静脈カテーテルを経て、合成hCCK−33および
CCK−8のBo1us注射(1,0,3,125,6
,25,12,5,25,50,100,200ピコモ
ル/kg・体重)が60分の間隔を置いて与えられた。
CCK−8のBo1us注射(1,0,3,125,6
,25,12,5,25,50,100,200ピコモ
ル/kg・体重)が60分の間隔を置いて与えられた。
すい臓血管流は合成hccに−33の投与により、用量
に従って増加した。
に従って増加した。
すい臓のタンパク質放出も合成hCCK−33の投与に
より、用量に従って増加した。 3.125ピコモル/
眩の最小用量で増加効果がl1lI察された。最大の効
果は用量200ピコモル/kgでl1151された。す
い臓毛細血管血液流およびすい臓のタンパク質放出に対
する影響に関しては、モル量を基準として1合成hCC
K−33の活性が合成CCK−8の活性の921であっ
た。ラットの生体標本における胃酸、ペプシン放出、す
い臓分泌から見ると、合成hCCK−33はモル基準で
CCK−8の約2ないし3倍強力であった。切離された
モルモットの胃組織からペプシノーゲン分泌の刺激にお
いては、モル基準で合成hCCK−33はCCK−8と
同程度に有効であった0モル基準でCCK−8は全ブタ
CCK−33分子の2.5倍強力であった。従って、本
発明による合成hCCK−33は天然のブタCCK−3
3の活性に匹敵するか、これより高い活性を持つものと
判断できる。前記犬アッセイ系では、未硫酸化hccl
−33の活性はCCK−8の活性(モル基準で1とする
)に対する比が0.074であったので、CCKの生体
活性にとって分子の硫酸部分が重要な役割をしているこ
とが確かめられた。
より、用量に従って増加した。 3.125ピコモル/
眩の最小用量で増加効果がl1lI察された。最大の効
果は用量200ピコモル/kgでl1151された。す
い臓毛細血管血液流およびすい臓のタンパク質放出に対
する影響に関しては、モル量を基準として1合成hCC
K−33の活性が合成CCK−8の活性の921であっ
た。ラットの生体標本における胃酸、ペプシン放出、す
い臓分泌から見ると、合成hCCK−33はモル基準で
CCK−8の約2ないし3倍強力であった。切離された
モルモットの胃組織からペプシノーゲン分泌の刺激にお
いては、モル基準で合成hCCK−33はCCK−8と
同程度に有効であった0モル基準でCCK−8は全ブタ
CCK−33分子の2.5倍強力であった。従って、本
発明による合成hCCK−33は天然のブタCCK−3
3の活性に匹敵するか、これより高い活性を持つものと
判断できる。前記犬アッセイ系では、未硫酸化hccl
−33の活性はCCK−8の活性(モル基準で1とする
)に対する比が0.074であったので、CCKの生体
活性にとって分子の硫酸部分が重要な役割をしているこ
とが確かめられた。
第6図は麻酔された犬における3種のCCK−ペプチド
に応答したすい臓のタンパク質放出の増加を示すもので
ある。
に応答したすい臓のタンパク質放出の増加を示すもので
ある。
本発明によれば、ペンダおよびフラノらによって報告さ
れたブタCCK−33の合成と異なり、ペプチドを強塩
基にさらすことなく、高度に活性なhCCに一33製品
を得ることができる。
れたブタCCK−33の合成と異なり、ペプチドを強塩
基にさらすことなく、高度に活性なhCCに一33製品
を得ることができる。
(実施例)
つぎに本発明の方法によるヒトコレシストキニンhcc
K−33の合成について実施例を挙げてさらに具体的に
説明する。
K−33の合成について実施例を挙げてさらに具体的に
説明する。
なお、検値はシリカゲル(メルク社製キーゼルゲルG)
上の薄相クロマトグラフィー(TLC)にて下記混合溶
媒を用いて測定したものである。
上の薄相クロマトグラフィー(TLC)にて下記混合溶
媒を用いて測定したものである。
R,:n−BuOH−AcOH−AcOET−H,O(
1:1:1:1)ニンヒドリン発色の強さは島津二波長
TLCスキャナー型C5−900で測定した。 Fab
−MSスペクトルはFABイオン源とJEOL JM
HX−100:重収束質量分析計で得た。 LAPはシ
グマ社Lot Noルー6007で、 CCK−8はタ
ンパク質研究所から購入し、HPLCはVatars2
04 modelで行った。肝臓毛細管血液流はレーザ
ードツプラー権流モニター(米国ワシントン州シアトル
モデルパシフイソク社のモデルLD5000)を使用し
た。
1:1:1:1)ニンヒドリン発色の強さは島津二波長
TLCスキャナー型C5−900で測定した。 Fab
−MSスペクトルはFABイオン源とJEOL JM
HX−100:重収束質量分析計で得た。 LAPはシ
グマ社Lot Noルー6007で、 CCK−8はタ
ンパク質研究所から購入し、HPLCはVatars2
04 modelで行った。肝臓毛細管血液流はレーザ
ードツプラー権流モニター(米国ワシントン州シアトル
モデルパシフイソク社のモデルLD5000)を使用し
た。
「洗浄操作」は特記しない限り溶媒を蒸発した後、残滓
を5%クエン酸およびエーテルで処理し、得られた粉末
を5%クエン酸、5%NaHCO,,および水で洗い、
適当な溶媒から再結晶または沈殿させる操作を意味する (1) Z(OMe)−Tyr(C1,−Bzl)−
Mat(0)−Gly−Trp(Mts)−Mat(0
)−Agp(OChp)−Phe−NH,(1)(位置
27〜33)の製法 TFAで処理したZ (OMe)−Met (0)−G
ly−Trp (Mts)−Net (0)−Asp
(OChp)−Pha−NH,(4、57g、3.63
ミリモル)を、TEA(0,51a Q、1当量)を含
むDMF(25mΩ)中に溶解し、次いでZ(Owg)
−Tyr(C12−Bzl)−0Su(2,62g、1
.2当量)及びNMM(0,4On+ Q、1当量)を
加え、混合物を一夜かきまぜた8生成物を、洗浄操作と
、次にAc0Etを含むDNFから沈殿させることによ
り精製した:収量5.26 g (92%)、R,10
,64,物理的定数と分析データは、保護された中間体
のそれらのものと共に、第2表に示されている。
を5%クエン酸およびエーテルで処理し、得られた粉末
を5%クエン酸、5%NaHCO,,および水で洗い、
適当な溶媒から再結晶または沈殿させる操作を意味する (1) Z(OMe)−Tyr(C1,−Bzl)−
Mat(0)−Gly−Trp(Mts)−Mat(0
)−Agp(OChp)−Phe−NH,(1)(位置
27〜33)の製法 TFAで処理したZ (OMe)−Met (0)−G
ly−Trp (Mts)−Net (0)−Asp
(OChp)−Pha−NH,(4、57g、3.63
ミリモル)を、TEA(0,51a Q、1当量)を含
むDMF(25mΩ)中に溶解し、次いでZ(Owg)
−Tyr(C12−Bzl)−0Su(2,62g、1
.2当量)及びNMM(0,4On+ Q、1当量)を
加え、混合物を一夜かきまぜた8生成物を、洗浄操作と
、次にAc0Etを含むDNFから沈殿させることによ
り精製した:収量5.26 g (92%)、R,10
,64,物理的定数と分析データは、保護された中間体
のそれらのものと共に、第2表に示されている。
(2) Z(OMe)−Asp(OChp)−Tyr
(C1,−Bzl)−Met(0)−Gly−Trp
(Mts)−Met (0)−Asp (OChp)−
Phe−NH,(1) (位置26〜33)の製造 前記7個残基のペプチドアミドのTFAで処理した試料
(4,95g、 3.13ミリモル)を、 TEA(0
,43rmn 。
(C1,−Bzl)−Met(0)−Gly−Trp
(Mts)−Met (0)−Asp (OChp)−
Phe−NH,(1) (位置26〜33)の製造 前記7個残基のペプチドアミドのTFAで処理した試料
(4,95g、 3.13ミリモル)を、 TEA(0
,43rmn 。
1゛当量)を含むDMF(30m Q )中に溶解し、
次にTI(F(15i Q )中のZ(OMe)−As
p(OChp)−0Su(DCHA塩2.70 g 。
次にTI(F(15i Q )中のZ(OMe)−As
p(OChp)−0Su(DCHA塩2.70 g 。
1.5当量から調製〕とNMM(0,41m12 、1
.2当量)を添加し、混合物を一夜かきまぜた。生成物
に洗浄操作を施し1次いでAc0Etを含む[1MFか
ら沈殿させて、精製した:収量5.23 g (90%
)、 R,、0,75゜(3) Z(OMa)−Ar
g(Mts)−Asp(OChp)−Tyr(C1,−
Bzl)−Met (0)−Gly−Trp (Mts
)−Mat (0)−Asp (OChp)−Phe−
NH。
.2当量)を添加し、混合物を一夜かきまぜた。生成物
に洗浄操作を施し1次いでAc0Etを含む[1MFか
ら沈殿させて、精製した:収量5.23 g (90%
)、 R,、0,75゜(3) Z(OMa)−Ar
g(Mts)−Asp(OChp)−Tyr(C1,−
Bzl)−Met (0)−Gly−Trp (Mts
)−Mat (0)−Asp (OChp)−Phe−
NH。
〔1〕(位置25〜33)の製造
前記8個残基のペプチドアミドのTFAで処理した試料
(4,75g、 2.65ミリモル)を、TEA(0,
37m Q 。
(4,75g、 2.65ミリモル)を、TEA(0,
37m Q 。
1当量)を含むDMF(30m A )中に溶解し、次
いでTHF(20ra Q )中の2(0阿e)−Ar
g (Nts)−0Su (CHA塩3.28 g 。
いでTHF(20ra Q )中の2(0阿e)−Ar
g (Nts)−0Su (CHA塩3.28 g 。
2当量から調製)とNMM(0,35m1.1.2当量
)を加え。
)を加え。
混合物を一夜かきまぜた。生成物に洗浄操作を施して、
次いでAc0Etを含むDMFから沈殿させて精製した
:収量4.15 g (74%)、R,LO,78゜(
4) Z(OMe)−Asp(OChp)−Arg(
Mts)−Asp(0(:hp)−Tyr(CI、−B
zl) −Met (0)−Gly−Trp−(Mts
)−Met (0)−Asp(OChp)−Phe−H
,(1)(位[24〜33)の製造前記9個残基のペプ
チドアミドのTEAで処理した試料(4,15g、1.
95ミリモル)をTEA(0,27m Q、1当量)を
含むDMF(40+++ Q )中に溶解し、次いでT
IIF(15m Q )中のZ(OMe)−Asp(O
Chp−OSu(DCHA塩1.68 g 。
次いでAc0Etを含むDMFから沈殿させて精製した
:収量4.15 g (74%)、R,LO,78゜(
4) Z(OMe)−Asp(OChp)−Arg(
Mts)−Asp(0(:hp)−Tyr(CI、−B
zl) −Met (0)−Gly−Trp−(Mts
)−Met (0)−Asp(OChp)−Phe−H
,(1)(位[24〜33)の製造前記9個残基のペプ
チドアミドのTEAで処理した試料(4,15g、1.
95ミリモル)をTEA(0,27m Q、1当量)を
含むDMF(40+++ Q )中に溶解し、次いでT
IIF(15m Q )中のZ(OMe)−Asp(O
Chp−OSu(DCHA塩1.68 g 。
1゜5当量から調製とNMM(0,26m!、1.2当
量)を加え。
量)を加え。
混合物を18時閏かきまぜた。生成物に洗浄操作を施し
、次にMeOHを含むf)NFから沈殿させて精製した
:収量3.57 g (78%)、R,10,70゜(
5) Z(OMe)−His−Arg(Mts)−1
1e−5er−Asp(OChp)−Arg(Mts)
−Asp(OChp)−Tyr(C1,−Bzl)−M
et(0)−Gly−丁rp(Mts)−Met(0)
−Asp(OChp)−Pha−NH,(位置20〜3
3)の製造 DMF (40履Ω)中のフラグメント(2) (7,
99g、2当量)から調製したアジド体とNMM(0,
61m12,1.2当量)とを、TEA(0,64履Ω
、1当りを含むDMF(30IIIQ)中のフラグメン
ト〔1〕のTFA処理試料(10,73g、4.58ミ
リモル)の水冷溶液に加え、混合物を一夜かきまぜた。
、次にMeOHを含むf)NFから沈殿させて精製した
:収量3.57 g (78%)、R,10,70゜(
5) Z(OMe)−His−Arg(Mts)−1
1e−5er−Asp(OChp)−Arg(Mts)
−Asp(OChp)−Tyr(C1,−Bzl)−M
et(0)−Gly−丁rp(Mts)−Met(0)
−Asp(OChp)−Pha−NH,(位置20〜3
3)の製造 DMF (40履Ω)中のフラグメント(2) (7,
99g、2当量)から調製したアジド体とNMM(0,
61m12,1.2当量)とを、TEA(0,64履Ω
、1当りを含むDMF(30IIIQ)中のフラグメン
ト〔1〕のTFA処理試料(10,73g、4.58ミ
リモル)の水冷溶液に加え、混合物を一夜かきまぜた。
生成物に洗浄操作を施した後、MeOHを含むDMFか
ら沈殿させて精製した:収量11゜99 g (87%
)、RflO,73゜このものの物理恒数及び分析デー
タは、他の保護基を有するペプチドについての結果と共
に、第3表に示した。
ら沈殿させて精製した:収量11゜99 g (87%
)、RflO,73゜このものの物理恒数及び分析デー
タは、他の保護基を有するペプチドについての結果と共
に、第3表に示した。
(6) Z(OMn)−Asp(OBzl)−Pro
−5er(Bzl)−His−Arg(Mrs)−Il
e−5ar−Asp (OChp)−Arg (Mts
)−Asp (OChp)−Tyr(C1,−Bzl)
−Met(0)−Gly−Trp(Mts)−Net(
0)−Asp(OChp)−Pha−NH,(位[17
〜33)の製造DMF(10m Q )中(7)7ラグ
メント(3)3.46 g (1,5当量)から調製し
たアジド体とNMM(0,52m Q 、 1.2当量
)とを、TEA(0,55+*Q 、 1当量)を含む
DMF(30a m )中の前記17個残基のペプチド
アミドのτFA試料の氷冷溶液に加え、混合物を一夜か
きまぜた。生成物に洗浄操作を施し、Ac0Etを含む
DMFから沈殿させて精製した:収量L64 g (6
3%′)、R,、0,71゜(7) Z(OMa)−
Asn−Leu−Gln−Asn−Leu−Asp(O
Bzl)−Pro−5ar (Bzl)−His−Ar
g (Mts)−IIs−Sar−Asp (OChp
)−Arg(Mt s )−Asp (OChp)−T
yr (C1,−Bzl) −Mat (0) −Gl
y−Trp(Mts)−Met (0)−Asp(OC
hp)−Phe−N)Is (位置12〜33)の製造 DMF−DMSO−HMPA(1:1:1,90mfi
)中のフラグメント(4)7.57 g (4当量)
から調製したアジド体とTEA (0,41m m 、
1.2当量)とを、TEA(0,34m1 、1当量
)を含むDMF(30誼Q )中の前記17個残基のア
ミドのTF^処理試料(8,50g、2.43ミリモル
)の水冷溶液に加え、混合物を48時間かきまぜた。生
成物を5epha−dsx LH−60でゲルろ過し、
Ac0Etを含むDMFから沈殿させて精製した:収量
4.84g(49%)。
−5er(Bzl)−His−Arg(Mrs)−Il
e−5ar−Asp (OChp)−Arg (Mts
)−Asp (OChp)−Tyr(C1,−Bzl)
−Met(0)−Gly−Trp(Mts)−Net(
0)−Asp(OChp)−Pha−NH,(位[17
〜33)の製造DMF(10m Q )中(7)7ラグ
メント(3)3.46 g (1,5当量)から調製し
たアジド体とNMM(0,52m Q 、 1.2当量
)とを、TEA(0,55+*Q 、 1当量)を含む
DMF(30a m )中の前記17個残基のペプチド
アミドのτFA試料の氷冷溶液に加え、混合物を一夜か
きまぜた。生成物に洗浄操作を施し、Ac0Etを含む
DMFから沈殿させて精製した:収量L64 g (6
3%′)、R,、0,71゜(7) Z(OMa)−
Asn−Leu−Gln−Asn−Leu−Asp(O
Bzl)−Pro−5ar (Bzl)−His−Ar
g (Mts)−IIs−Sar−Asp (OChp
)−Arg(Mt s )−Asp (OChp)−T
yr (C1,−Bzl) −Mat (0) −Gl
y−Trp(Mts)−Met (0)−Asp(OC
hp)−Phe−N)Is (位置12〜33)の製造 DMF−DMSO−HMPA(1:1:1,90mfi
)中のフラグメント(4)7.57 g (4当量)
から調製したアジド体とTEA (0,41m m 、
1.2当量)とを、TEA(0,34m1 、1当量
)を含むDMF(30誼Q )中の前記17個残基のア
ミドのTF^処理試料(8,50g、2.43ミリモル
)の水冷溶液に加え、混合物を48時間かきまぜた。生
成物を5epha−dsx LH−60でゲルろ過し、
Ac0Etを含むDMFから沈殿させて精製した:収量
4.84g(49%)。
Rf、0・73・
(8) Z(OMe)−5et([3zl)−11e
−Val−Lys(Z)−Asn−Leu−Gin−A
sn−Leu−Asp (OBzl)−Pro−5er
(Bzl)−His−Arg(Mts)−I 1a−
Ser−Asp (OChp )−Arg (Mts)
−Asp (OChp )−Tyr (C1,−Bzl
)−Met (0)−Gly−Trp (Mts)−M
et (0)−Asp(OChp)−Phe−NHz
(位置8〜33)の製造DMF(20gm Q )中の
フラグメント〔5〕からm製したアジド体(2,10g
、4当量)とTEA(0,10mΩ、1.2当量)を、
TEA(86μQ、1当量)を含むDMF(10m
Q )中の前記22個残基ペプチドアミドのTEA処理
試料(2,53g、0.62ミリモル)の水冷溶液に加
え、混合物を一夜かきまぜた。生成物を5ephade
x LH−60でゲルろ過した後、 Ac0Etを含む
DMFから沈殿させて精製した:収量1.95 g (
67%)、R7,0,63゜(9) Z(OMe)−
Gly−Arg(Mts)−Met(0)−5er(B
zl)−11s−Va 1−Lys (Z)−A 5n
−Lau−G ln−Asn−Leu−Asp (OB
zl)−Pr。
−Val−Lys(Z)−Asn−Leu−Gin−A
sn−Leu−Asp (OBzl)−Pro−5er
(Bzl)−His−Arg(Mts)−I 1a−
Ser−Asp (OChp )−Arg (Mts)
−Asp (OChp )−Tyr (C1,−Bzl
)−Met (0)−Gly−Trp (Mts)−M
et (0)−Asp(OChp)−Phe−NHz
(位置8〜33)の製造DMF(20gm Q )中の
フラグメント〔5〕からm製したアジド体(2,10g
、4当量)とTEA(0,10mΩ、1.2当量)を、
TEA(86μQ、1当量)を含むDMF(10m
Q )中の前記22個残基ペプチドアミドのTEA処理
試料(2,53g、0.62ミリモル)の水冷溶液に加
え、混合物を一夜かきまぜた。生成物を5ephade
x LH−60でゲルろ過した後、 Ac0Etを含む
DMFから沈殿させて精製した:収量1.95 g (
67%)、R7,0,63゜(9) Z(OMe)−
Gly−Arg(Mts)−Met(0)−5er(B
zl)−11s−Va 1−Lys (Z)−A 5n
−Lau−G ln−Asn−Leu−Asp (OB
zl)−Pr。
−5er (Bzl)−His−A rg (M t
s)−11e−3er−A sp (OChp)−A
rg(M t 5)−A sp (OChp )−Ty
r (C1,−Bzl )−Mat (0)−G ly
−Trp(Mts)−Met (0)−Asp (OC
hp)−Phe−Nl(、(位置5〜33)の製造 DMF(5mfl)中のフラグメント〔6〕から調製し
たアジド体(0,98g、4当量)とNMHCO,15
gm Q 、 4当量)とを、TEA(46μfl、1
当量)を含むDMF(5mQ)中の前記26個残基のペ
プチドのTFA処理試料(1,51g、0.33ミリモ
ル)の水冷溶液に加え、混合物を一夜かきまぜた。生成
物に洗浄操作を施した後、MeOHを含むDMFから沈
殿させて精製した:収量1.45g(86幻、Rflo
、77゜ (10) Z(OMg)−LyS(Z)−Ala−P
ro−5ar−Gly−Arg(Mts)−Met (
0)−Set (Bz l )−ll5−Va 1−L
ys (Z)−Asn−Leu−Gln−A sn−L
au−A sp (OBzl)−Pro−5ar (B
zl)−His−Arg (Mts) −11e−5a
r−A sp (OChp )−A rg (Mt
s )−Asp (OChp)−Tyr (C1゜−B
zl)−Met (0)−Gly−Trp (Mts)
−Mat (0) −Asp (OChp) +Phe
−N)1. (保厩されたhCCK−33)の製造DM
F(5+on)中のフラグメント〔7〕から調製したア
ジド体(0,81g、5当量)とNMM (38μΩ、
5当量)とを、TEA (32μQ、1当量)を含むD
MF(5履Q)中の前記29個残基のペプチドアミドの
TFA処理試料(1,20mg、0.23ミリモル)の
水冷溶液に加え、混合物を24時間かきまぜた。生成物
を5ephadsx LH−60でゲルろ過し、次いで
Ac0Etを含むDMFから沈殿させて精製した:収量
7.6g、 Rf、 0.77゜(11) )l−L
ys−Ala−Pro−3et−Gly−Arg−Me
t−5er−11e−Val−Lys−Asn−Leu
−Gln−Asn−Leu−Asp−Pro−5sr−
His−Arg−11a−5er−Asp−Arg−A
sp−丁yr−Mat−Gly−Trp−Met−As
p−Phe−NH,(hCCK−33の遊離形)DMF
(3+aQ)中の保護されたhccに−33(317+
g、54.7マイクロモル)をフェニルチオトリメチル
シラン(300μQ、30当量)で室温において60分
間処理した後、留去により溶媒を除去し、Ac0Etを
加えて粉末を得た:収量289mg(89%)、 R,
tO,72゜m−クレゾール(2447! Q 、13
0当量)とEDT(38μm 。
s)−11e−3er−A sp (OChp)−A
rg(M t 5)−A sp (OChp )−Ty
r (C1,−Bzl )−Mat (0)−G ly
−Trp(Mts)−Met (0)−Asp (OC
hp)−Phe−Nl(、(位置5〜33)の製造 DMF(5mfl)中のフラグメント〔6〕から調製し
たアジド体(0,98g、4当量)とNMHCO,15
gm Q 、 4当量)とを、TEA(46μfl、1
当量)を含むDMF(5mQ)中の前記26個残基のペ
プチドのTFA処理試料(1,51g、0.33ミリモ
ル)の水冷溶液に加え、混合物を一夜かきまぜた。生成
物に洗浄操作を施した後、MeOHを含むDMFから沈
殿させて精製した:収量1.45g(86幻、Rflo
、77゜ (10) Z(OMg)−LyS(Z)−Ala−P
ro−5ar−Gly−Arg(Mts)−Met (
0)−Set (Bz l )−ll5−Va 1−L
ys (Z)−Asn−Leu−Gln−A sn−L
au−A sp (OBzl)−Pro−5ar (B
zl)−His−Arg (Mts) −11e−5a
r−A sp (OChp )−A rg (Mt
s )−Asp (OChp)−Tyr (C1゜−B
zl)−Met (0)−Gly−Trp (Mts)
−Mat (0) −Asp (OChp) +Phe
−N)1. (保厩されたhCCK−33)の製造DM
F(5+on)中のフラグメント〔7〕から調製したア
ジド体(0,81g、5当量)とNMM (38μΩ、
5当量)とを、TEA (32μQ、1当量)を含むD
MF(5履Q)中の前記29個残基のペプチドアミドの
TFA処理試料(1,20mg、0.23ミリモル)の
水冷溶液に加え、混合物を24時間かきまぜた。生成物
を5ephadsx LH−60でゲルろ過し、次いで
Ac0Etを含むDMFから沈殿させて精製した:収量
7.6g、 Rf、 0.77゜(11) )l−L
ys−Ala−Pro−3et−Gly−Arg−Me
t−5er−11e−Val−Lys−Asn−Leu
−Gln−Asn−Leu−Asp−Pro−5sr−
His−Arg−11a−5er−Asp−Arg−A
sp−丁yr−Mat−Gly−Trp−Met−As
p−Phe−NH,(hCCK−33の遊離形)DMF
(3+aQ)中の保護されたhccに−33(317+
g、54.7マイクロモル)をフェニルチオトリメチル
シラン(300μQ、30当量)で室温において60分
間処理した後、留去により溶媒を除去し、Ac0Etを
加えて粉末を得た:収量289mg(89%)、 R,
tO,72゜m−クレゾール(2447! Q 、13
0当量)とEDT(38μm 。
23当量)の存在下に、保護されたhCCK−33の還
元形(100mg、 17.4マイクロモル)をTFA
(5厘A)中のINのTMSOTf−チオアニソニルで
水浴中2.5時間処理した後、乾燥エーテルを加えた。
元形(100mg、 17.4マイクロモル)をTFA
(5厘A)中のINのTMSOTf−チオアニソニルで
水浴中2.5時間処理した後、乾燥エーテルを加えた。
得られた粉末を氷冷したMeOH−H,O(1rs Q
−2ra Q )中に溶解し、2−メルカプトエタノ
ール(200μQ)とIMのNH4F(600μQ、3
6当量)とを加えた。溶液のpHをTEAにより8.0
に調整した後、30分後にlNAcOHで6.0に調整
した。遠心分mにより多少の不溶物を除いた後。
−2ra Q )中に溶解し、2−メルカプトエタノ
ール(200μQ)とIMのNH4F(600μQ、3
6当量)とを加えた。溶液のpHをTEAにより8.0
に調整した後、30分後にlNAcOHで6.0に調整
した。遠心分mにより多少の不溶物を除いた後。
溶液を5ephadex G−25(3,3X 105
cm)のカラムに加えINのAc0)lで溶離した。フ
ロントメインビークに相当するフラクション(各8.0
mg、管番号30〜44.280止の紫外線(UV)吸
収の測定により監視)を集め、凍結乾燥により溶媒を除
去して粉末を得た:収量64.2mg(95,4%)。
cm)のカラムに加えINのAc0)lで溶離した。フ
ロントメインビークに相当するフラクション(各8.0
mg、管番号30〜44.280止の紫外線(UV)吸
収の測定により監視)を集め、凍結乾燥により溶媒を除
去して粉末を得た:収量64.2mg(95,4%)。
次に、粗粉末をCトドリスアクリルM(2,OX4.2
cm)によるイオン交換クロマトグラフィーにかけ。
cm)によるイオン交換クロマトグラフィーにかけ。
pH7,9のIMのNH,HCO,緩衝液<250ra
Q )を含む混合フラスコを通しpH7,9の0.2
MのNH4HCO3緩衝液(250m Q )の形成す
る線形傾斜で溶離した。メインピークに相当するフラク
ション(各8.2a+fi、管番号24〜31.2g0
nI++のUVで監視)を集め、凍結乾燥で溶媒を除い
て羽毛状の粉末を得た:20.1+*g(31,1%)
。
Q )を含む混合フラスコを通しpH7,9の0.2
MのNH4HCO3緩衝液(250m Q )の形成す
る線形傾斜で溶離した。メインピークに相当するフラク
ション(各8.2a+fi、管番号24〜31.2g0
nI++のUVで監視)を集め、凍結乾燥で溶媒を除い
て羽毛状の粉末を得た:20.1+*g(31,1%)
。
次の精製は5ynchropak RPPカラム(4,
OX 25cm)上の逆相1(PLCで行い、0.1%
TFA水溶液中のMeCNの傾斜(30分間に25%か
ら35幻をもって1.0m+f/分の流速で溶離した。
OX 25cm)上の逆相1(PLCで行い、0.1%
TFA水溶液中のMeCNの傾斜(30分間に25%か
ら35幻をもって1.0m+f/分の流速で溶離した。
メインピーク(第7a図、保持時間37分、280nm
のUVで検出)に相当する溶離液を集め、凍結乾燥で溶
媒を除去して羽毛状の粉末を得た:収量10.6mg
(53%)、〔α〕♂’−65.7″(C=O,l、
0.5N Ac0H)。
のUVで検出)に相当する溶離液を集め、凍結乾燥で溶
媒を除去して羽毛状の粉末を得た:収量10.6mg
(53%)、〔α〕♂’−65.7″(C=O,l、
0.5N Ac0H)。
精製したペプチドは)IPLCにかけ(第7b図、保持
時間27分)、YMCムM−302−ODSカラム(4
X 150mm)から、1%TFA中のMaCNの線形
傾斜(30分間に40〜45%)により1.0m127
分の流速で溶離したとき、唯1個のピークしか示さなか
った。
時間27分)、YMCムM−302−ODSカラム(4
X 150mm)から、1%TFA中のMaCNの線形
傾斜(30分間に40〜45%)により1.0m127
分の流速で溶離したとき、唯1個のピークしか示さなか
った。
FAB−MSs/g : 3g64.4(M + H)
” (Czsv Hz** N5zO,!S3としての
計算値:3864.9)。
” (Czsv Hz** N5zO,!S3としての
計算値:3864.9)。
6Nの塩酸加水分解物中のアミノ酸の割合は第1表に示
したが、LAP消化物中のアミノ酸の割合は次の通りで
ある(括弧内の数字は理論値を示す)。
したが、LAP消化物中のアミノ酸の割合は次の通りで
ある(括弧内の数字は理論値を示す)。
Asp 3.62(4)、 Set 4.53(4)、
Pro 1.66(2)、 cxy2.13(2)、
Ala 1.1g(1)、Val 1.10(1)、N
et 2.70(3)、 Ilg 2.28(2)、L
eu 2.44(2)、Tyr 1.12(1)、Ph
s 1.00(1)、Lys 2.14(2)、)li
s 1.08(1)、 TrpO,99(1)、Arg
3.24(3)、Asn及びGlnは定量しなかった
(Phaの回収率77%)。
Pro 1.66(2)、 cxy2.13(2)、
Ala 1.1g(1)、Val 1.10(1)、N
et 2.70(3)、 Ilg 2.28(2)、L
eu 2.44(2)、Tyr 1.12(1)、Ph
s 1.00(1)、Lys 2.14(2)、)li
s 1.08(1)、 TrpO,99(1)、Arg
3.24(3)、Asn及びGlnは定量しなかった
(Phaの回収率77%)。
第7図は未硫酸化hCCに−33のHPLCM製の様子
を示す。
を示す。
至五土夾監
1) LysのF+moccAi及びその脱保設:H
a O−DMF (1: 9.2 rm 4m )中の
H−Lys−OH(14、6mg。
a O−DMF (1: 9.2 rm 4m )中の
H−Lys−OH(14、6mg。
0.1ミリモル)を、TEA(59μΩ、4当量)の存
在下にFmoc−OSu(141mg、 4当量)で6
0分間水浴中で処理した。その間に出発物質とモノFm
oc誘導体(R,□0.42)はTLCでは消失し、新
たにニンヒドリン反応に陰性なスポット(Rflo、6
6)が検出された。溶媒を蒸発した後、生成物を^cO
Etまたは他の有機溶媒に溶解し、有機物相を5%クエ
ン酸、5%NaHCO,,およびH,0−NaC1で洗
い、Na、SO2上で乾燥し濃縮した。残留物を適当な
溶媒から再結晶または沈殿させて単離した。このように
して単離したジFmoc誘導体をDMF(1mm)に溶
解し、溶液をEDT(39μjl 、 10当量)の存
在下に、T)IF中(7)LMのBu4NF(1mff
i、10当量)で25℃において60分間処理した。そ
の間にR,10,66の化合物は完全にH−Lys−O
ll(R,、出発点)に転化した。
在下にFmoc−OSu(141mg、 4当量)で6
0分間水浴中で処理した。その間に出発物質とモノFm
oc誘導体(R,□0.42)はTLCでは消失し、新
たにニンヒドリン反応に陰性なスポット(Rflo、6
6)が検出された。溶媒を蒸発した後、生成物を^cO
Etまたは他の有機溶媒に溶解し、有機物相を5%クエ
ン酸、5%NaHCO,,およびH,0−NaC1で洗
い、Na、SO2上で乾燥し濃縮した。残留物を適当な
溶媒から再結晶または沈殿させて単離した。このように
して単離したジFmoc誘導体をDMF(1mm)に溶
解し、溶液をEDT(39μjl 、 10当量)の存
在下に、T)IF中(7)LMのBu4NF(1mff
i、10当量)で25℃において60分間処理した。そ
の間にR,10,66の化合物は完全にH−Lys−O
ll(R,、出発点)に転化した。
フェノールの不存在又は存在の下にDMF(2mm)中
でZ (OMa)−Tyr−OMeを、同様にFmoc
−OSu (4当量)とTEA(4当量)を60分間冷
浴中で処理した。 TLCスキャナーで調べると、 Z
(OMa)−Tyr(Fmoc)−ONe(R,、0,
98)の形成はそれぞれ7.8%及び0%であった。こ
れによってフェノールの添加はTyrの変性の抑制に有
効であることが判明した。同様に、2(OMa)−Hi
s−OMa(0,1ミリモル)をFmoc−OSuとT
EAで処理したとき、Z(OMe)−His(Fmoc
)−OMaの形成はほとんど認められなかった。
でZ (OMa)−Tyr−OMeを、同様にFmoc
−OSu (4当量)とTEA(4当量)を60分間冷
浴中で処理した。 TLCスキャナーで調べると、 Z
(OMa)−Tyr(Fmoc)−ONe(R,、0,
98)の形成はそれぞれ7.8%及び0%であった。こ
れによってフェノールの添加はTyrの変性の抑制に有
効であることが判明した。同様に、2(OMa)−Hi
s−OMa(0,1ミリモル)をFmoc−OSuとT
EAで処理したとき、Z(OMe)−His(Fmoc
)−OMaの形成はほとんど認められなかった。
ピリジン−803錯体(10当量)を含むDMF−ピリ
ジン(8:2.2mm)中のFmoc−Lys(Fmo
c)−0H(0,1ミリモル)を25℃で18時間保っ
た。TLCでは何の変化もa奈されなかった。
ジン(8:2.2mm)中のFmoc−Lys(Fmo
c)−0H(0,1ミリモル)を25℃で18時間保っ
た。TLCでは何の変化もa奈されなかった。
2) 5sr−OHの優先的tBuPh、シリル化:
最初に、シリル化Z (OMa)−5er−OMa誘導
体の安定性をピリジン−8O□錯体による処理で検査し
た。
最初に、シリル化Z (OMa)−5er−OMa誘導
体の安定性をピリジン−8O□錯体による処理で検査し
た。
[)MF(II+1り中のZ (OMg)、−3ar−
OMe (各14mg、 0.05ミリモル)を、イミ
ダゾール(20当量)の存在の下に、水溶中60分間R
−C1(RはMe2Si、 tBuMa、SL、又はt
BuPh、SL、各10当量)で処理した。溶媒を留去
し、Fi渣をn−へキサンで洗った。各生成物(各68
マイクロモル、R=Ma2Siのもの: Rflo、9
7、R= tBuMe2Siのもの: Rf、 0.9
9)を含むDMF−ピリジン(8:2,1mm)に溶が
し、ピリジン−SO,錯体(94n+g、 10当gk
>を加えた。各溶液を25℃に保ち。
OMe (各14mg、 0.05ミリモル)を、イミ
ダゾール(20当量)の存在の下に、水溶中60分間R
−C1(RはMe2Si、 tBuMa、SL、又はt
BuPh、SL、各10当量)で処理した。溶媒を留去
し、Fi渣をn−へキサンで洗った。各生成物(各68
マイクロモル、R=Ma2Siのもの: Rflo、9
7、R= tBuMe2Siのもの: Rf、 0.9
9)を含むDMF−ピリジン(8:2,1mm)に溶が
し、ピリジン−SO,錯体(94n+g、 10当gk
>を加えた。各溶液を25℃に保ち。
定期的にTLCスキャナーで検査した。
Ma2Si化合物は30分以内に完全に脱シリル化され
、tBuMa、sii合物は24時間内で約15%が脱
シリル化された。しかしtBuPh2Si化合物は24
時間後でも変化しないで残った。
、tBuMa、sii合物は24時間内で約15%が脱
シリル化された。しかしtBuPh2Si化合物は24
時間後でも変化しないで残った。
次に、 Try−OHの存在下での5ar−OHの優先
的なtBuPh、シリル化を検査した。 Z(OMa)
−5ar−OMe(0゜05ミリモル)、Z(OMa)
−Tyr−OMe(0,05ミリモル)及びイミダゾー
ル(20当量)の混合物のDMF(1++jl)に溶解
したものを、フェノール化合物(各20当量のフェノー
ル、m−クレゾールとp−メチルチオフェノール)の不
存在又は存在の下に、4℃で4時間、tBuPh、5i
−CI(20当量)で処理した。各生成物をTLCスキ
ャナーで定量した。この結果を第3図に示した。
的なtBuPh、シリル化を検査した。 Z(OMa)
−5ar−OMe(0゜05ミリモル)、Z(OMa)
−Tyr−OMe(0,05ミリモル)及びイミダゾー
ル(20当量)の混合物のDMF(1++jl)に溶解
したものを、フェノール化合物(各20当量のフェノー
ル、m−クレゾールとp−メチルチオフェノール)の不
存在又は存在の下に、4℃で4時間、tBuPh、5i
−CI(20当量)で処理した。各生成物をTLCスキ
ャナーで定量した。この結果を第3図に示した。
反応を25℃で4時間行ったとき、Z(OMe)−Ty
s−OMeはフェノールの不存在下で75%がシリル化
され、フェノールの存在下で44%がシリル化された。
s−OMeはフェノールの不存在下で75%がシリル化
され、フェノールの存在下で44%がシリル化された。
3) Z(OMa)−Sar(t−BuPh2Si)
−OMaのtBuPh2Si基肌脱保護 DMF(1mQ)中のZ (OMe) −5et (t
−BuPh、 Si)−OMa (36mg、68マイ
クロモル)を、EDT(20μΩ)の存在下に。
−OMaのtBuPh2Si基肌脱保護 DMF(1mQ)中のZ (OMe) −5et (t
−BuPh、 Si)−OMa (36mg、68マイ
クロモル)を、EDT(20μΩ)の存在下に。
DMF中のIMのBu4NF(1rm Q 、 15当
量)で25℃、 60分間処理した。その間に出発物質
(R,、0,99)は完全に消失し、Z(OMe)−5
et−ONgに相当するスポット(RfLo、91)が
検出された。
量)で25℃、 60分間処理した。その間に出発物質
(R,、0,99)は完全に消失し、Z(OMe)−5
et−ONgに相当するスポット(RfLo、91)が
検出された。
4) Tyr−OHの硫酸化:
20%のピリジンを含むDMF(1+mi)中のZ(O
Ma)−Ser−OMeとZ(OMe)−Tyr−OM
e(各0.05ミリモル)を25℃においてそれぞれピ
リジン−8c1錯体(5当量)又はPAS(10当量)
で処理して、溶液を定期的にτLCスキャナーで検査し
た。その結果を第4図に示した。
Ma)−Ser−OMeとZ(OMe)−Tyr−OM
e(各0.05ミリモル)を25℃においてそれぞれピ
リジン−8c1錯体(5当量)又はPAS(10当量)
で処理して、溶液を定期的にτLCスキャナーで検査し
た。その結果を第4図に示した。
Z(OMe)−Trp−OH,Z(OMe)−Met−
OH,及びZ(OMa)−)1is−OMe(各0.0
5ミリモル)を、同様にピリジン−SO,錯体又はPA
Sで4時間処理した。前二者は変化しないで残ったが、
Z (ONs)−His−OMeはピリジン−5o3@
=−ニドで32%、PASで18%が硫酸化された。こ
れに水を加えると(pH6,0)、硫酸化His化合物
(R,0,21)が60分以内に分解し、出発物質(R
,LO,6g)が再生された。
OH,及びZ(OMa)−)1is−OMe(各0.0
5ミリモル)を、同様にピリジン−SO,錯体又はPA
Sで4時間処理した。前二者は変化しないで残ったが、
Z (ONs)−His−OMeはピリジン−5o3@
=−ニドで32%、PASで18%が硫酸化された。こ
れに水を加えると(pH6,0)、硫酸化His化合物
(R,0,21)が60分以内に分解し、出発物質(R
,LO,6g)が再生された。
5)未硫酸化hCCK−33の硫酸化hCCK−33へ
の転化:Fmoc−O3u(79mg、 30当量)を
、TEAC33p Q、30当量)を含むDMF−H2
O(900−100μQ)中の未硫酸化hccK−33
(30n+g、 7.8マイクロモル)とフェノール(
22B。
の転化:Fmoc−O3u(79mg、 30当量)を
、TEAC33p Q、30当量)を含むDMF−H2
O(900−100μQ)中の未硫酸化hccK−33
(30n+g、 7.8マイクロモル)とフェノール(
22B。
30当量)の水冷溶液中に加え、混合物を水浴中で2時
間かきまぜた。乾燥エーテルを加え、得られた粉末をD
MFからエーテルで再沈殿した。このようにして得られ
たFmoc誘導体(RfiO,66)を、イミダゾール
(6,3i1g、120当量)及びフェノール(88m
g、120当量)と共に、 DMF(2mQ)中に溶解
した後。
間かきまぜた。乾燥エーテルを加え、得られた粉末をD
MFからエーテルで再沈殿した。このようにして得られ
たFmoc誘導体(RfiO,66)を、イミダゾール
(6,3i1g、120当量)及びフェノール(88m
g、120当量)と共に、 DMF(2mQ)中に溶解
した後。
tBuPh、5i−C1(216p Q、120当1J
k)を加え、溶液を4℃で14時間かきまぜた。エーテ
ルを加え、得られた粉末をDMFからエーテルで再沈殿
した。生成物(Rf、0.77)を5ephadex
LH−20(4X47cm)でゲルろ過しDMFで溶離
して精製した。所望のフラクション(各9.2mQ、背
番号21〜29,280nmのUV吸収で監視、他の精
製の場合も同じ)を−緒にし、溶媒を蒸発によって除い
た。
k)を加え、溶液を4℃で14時間かきまぜた。エーテ
ルを加え、得られた粉末をDMFからエーテルで再沈殿
した。生成物(Rf、0.77)を5ephadex
LH−20(4X47cm)でゲルろ過しDMFで溶離
して精製した。所望のフラクション(各9.2mQ、背
番号21〜29,280nmのUV吸収で監視、他の精
製の場合も同じ)を−緒にし、溶媒を蒸発によって除い
た。
残渣を20%のピリジンを含むDMF(1mQ)に溶解
した後、EDT(22μ2.30当量)とピリジン−S
O,錯体(124mg、 100当量)を加え、混合物
を25℃で24時間かきまぜた。前記したように、溶液
を5ephadaxLH−20のカラム(4X47cm
)に加えDMFで溶離した。
した後、EDT(22μ2.30当量)とピリジン−S
O,錯体(124mg、 100当量)を加え、混合物
を25℃で24時間かきまぜた。前記したように、溶液
を5ephadaxLH−20のカラム(4X47cm
)に加えDMFで溶離した。
所望のフラクション(背番号20〜24)を合わせ、溶
液を濃縮した(約1+++flに)、この溶液をEDT
(22μ悲、30当量)の存在下に、DMF(1,Om
Q )中のINのBu4NF(L、On+ Q )で
水浴中60分間1次いで室温で60分間処理した。氷で
冷却しつつIMのNH,HCO。
液を濃縮した(約1+++flに)、この溶液をEDT
(22μ悲、30当量)の存在下に、DMF(1,Om
Q )中のINのBu4NF(L、On+ Q )で
水浴中60分間1次いで室温で60分間処理した。氷で
冷却しつつIMのNH,HCO。
(4ra fl )を加え、少量の不溶物質を遠心分離
で除いた。上澄液を5ephadex G−10のカラ
ム(2,4X49cm)に加え、LMのNH4HCO,
緩衝液(pH8,2)で溶離した。フロントメインビー
クに相当するフラクション(各7.8mQ、背番号11
〜17)を合わせ、凍結乾燥を繰返して塩と共に溶媒を
除いて色粉末を得た:収量19.2mg(63,9%)
。
で除いた。上澄液を5ephadex G−10のカラ
ム(2,4X49cm)に加え、LMのNH4HCO,
緩衝液(pH8,2)で溶離した。フロントメインビー
クに相当するフラクション(各7.8mQ、背番号11
〜17)を合わせ、凍結乾燥を繰返して塩と共に溶媒を
除いて色粉末を得た:収量19.2mg(63,9%)
。
次に粗試料を、 CM−トリスアクリルM(1,6X4
.5cm)によるイオン交換クロマジグラフイーにかけ
、0.0iMのNH,)IcO,緩衝液(PH7,8,
300m Q )を含む混合フラスコを通る0、2Mの
NH,HCO,緩衝液(PH8,4゜500m Q )
で形成されるグラジェントで傾斜溶離した。第二のピー
ク(第8a[l)に相当するフラクション(各7.81
1112、背番号21〜29)を合すせ、溶媒と塩を凍
結乾燥を繰返して除き粉末を得た:収fニア、5履g(
39,1%、総合収率25.0%)。
.5cm)によるイオン交換クロマジグラフイーにかけ
、0.0iMのNH,)IcO,緩衝液(PH7,8,
300m Q )を含む混合フラスコを通る0、2Mの
NH,HCO,緩衝液(PH8,4゜500m Q )
で形成されるグラジェントで傾斜溶離した。第二のピー
ク(第8a[l)に相当するフラクション(各7.81
1112、背番号21〜29)を合すせ、溶媒と塩を凍
結乾燥を繰返して除き粉末を得た:収fニア、5履g(
39,1%、総合収率25.0%)。
ここに得られた生成物を、Asahipak 005−
50のカラム(10X 250++++m)によるHP
LCを行い、毎分2mff1の流速の0.INACON
H4(P H6,5)中の31%MeCN溶液によるア
イソクラチックエル−ジョンで、さらに精製した。所望
の溶出液(第8b図、保持時間42分)を集め、溶媒を
凍結乾燥で除いて白色のふわふわした粉末を得た:収量
4.1ag(61%、未硫酸化hCCK−33を基準と
する総合収率15%)、シリル化を25℃で3時間行っ
たときは、同様の精製後の収率は13%であった。〔α
〕も1−72.7@(C=0.1. H,0)、Rf!
0.42. Asahi Pak ODP−50(4X
150ma+)から0.INのAc0NH,(pH7,
8)中のMeCNの傾斜(30分間に20〜40%)を
用い1m07分の流速で溶離した場合(第8c図)のH
PLCの保持時間は14分であった。6NHC1加水分
解生成物中のアミノ酸組成は第1表に示したが、LAP
消化物中のアミノ酸組成(括弧の中の数字は理論値)は
次の通りであった。 Asp 3.49(4)、5er
4.22(4)、 Pro 1.50(2)、Gly
2.12(2)、Ala 1.13(1)、Val
1.14(1)、Met 2.92(3)、Ile
1.96(2)。
50のカラム(10X 250++++m)によるHP
LCを行い、毎分2mff1の流速の0.INACON
H4(P H6,5)中の31%MeCN溶液によるア
イソクラチックエル−ジョンで、さらに精製した。所望
の溶出液(第8b図、保持時間42分)を集め、溶媒を
凍結乾燥で除いて白色のふわふわした粉末を得た:収量
4.1ag(61%、未硫酸化hCCK−33を基準と
する総合収率15%)、シリル化を25℃で3時間行っ
たときは、同様の精製後の収率は13%であった。〔α
〕も1−72.7@(C=0.1. H,0)、Rf!
0.42. Asahi Pak ODP−50(4X
150ma+)から0.INのAc0NH,(pH7,
8)中のMeCNの傾斜(30分間に20〜40%)を
用い1m07分の流速で溶離した場合(第8c図)のH
PLCの保持時間は14分であった。6NHC1加水分
解生成物中のアミノ酸組成は第1表に示したが、LAP
消化物中のアミノ酸組成(括弧の中の数字は理論値)は
次の通りであった。 Asp 3.49(4)、5er
4.22(4)、 Pro 1.50(2)、Gly
2.12(2)、Ala 1.13(1)、Val
1.14(1)、Met 2.92(3)、Ile
1.96(2)。
Lau 2.07(2)、Tyr(So、H)0.9
1(1)、Phe 1.00(1)、Lys 2.00
(2)、His O,92(1)、 Trp O,96
(1)、 Arg2.87(3)、 AsnとGinは
検出されなかった(Phaの回収率81%)、 Asp
−Pro結合は用いられたLAPの作用に抵抗した。
1(1)、Phe 1.00(1)、Lys 2.00
(2)、His O,92(1)、 Trp O,96
(1)、 Arg2.87(3)、 AsnとGinは
検出されなかった(Phaの回収率81%)、 Asp
−Pro結合は用いられたLAPの作用に抵抗した。
第1図は保護基を有するヒトコレシストキニン(hCC
K−33)を合成する説明図、第2図は保護基を有する
C末端デカペプチドアミドを合成する説明図、第3図は
SerおよびTyrのtert−ブチルジフェニルシリ
ル化を示すグラフ、第4図はDMF−ピリジン中でのピ
リジン−3o、 錯体又はアセチル硫酸ピリジニウムに
よるZ (OMe)−Tyr−OMeおよびZ (OM
e)−3ar−OMeの硫酸化を示すグラフ、第5図は
末硫酸化hcCK−33を硫酸化hCCK−33に転化
する説明図、第6図は継電された犬におけるCCK−ペ
プチドに応答したすい臓のタンパク質放出増を示すグラ
フ、第7図は末硫酸化hCCK−33のHPLC精製に
おけるイオン交換クロマトグラフィーのチャート、第8
図は硫酸化hCCK−33のCMおよびHPLC′#l
製におけるイオン交換クロマトグラフィーのチャートで
ある。 硫酸昨匹肚翌 望、H 2(OMs) −Asp (OChp)−Arg (M
ts) −A sp (OChp)−Tyr (C1,
−Bzl)−Met (0) −Gly−Trp (M
ts)−Met (0)−Asp(OChp)−Phe
−NH。 図面の浄書(内容に変更なり、) 第3図 BuPh2Si−5er BuPh2Si−Tyr
なし −〇−−・− フェノール −〇−+ m・クレゾール−6−−去− t−BuPh2Si化度 時間 芽 4 図 二:Z t;、r−so3ン+=>3 Z(c
m−5er−use 9吋<72== =−
so、 )+=、に! zcom)−ryr−r
ye sls’ira’jイbFrnoc−(2Ly
s(Fmoc))hccX−33Fmoc−(2Lys
(Fmoc)−4Ser(tBuPh、5i))hCC
K−33F+++oe−(2Lys (Fmoc)−4
Ser (tBuPh、 Si )−Tyr (So、
H) ) hCCK−33通信北遅々ヒ垣 埠 G 匡 一11ヌtt (情令/+o治) 19毛i(こ(ピコモlし/ka) 纂7図 自) a)シンクロバックRP−Pでの CM精製試料 b)YMCAM−3020DSでの HPLC絹製試料 昭和63年7月6日
K−33)を合成する説明図、第2図は保護基を有する
C末端デカペプチドアミドを合成する説明図、第3図は
SerおよびTyrのtert−ブチルジフェニルシリ
ル化を示すグラフ、第4図はDMF−ピリジン中でのピ
リジン−3o、 錯体又はアセチル硫酸ピリジニウムに
よるZ (OMe)−Tyr−OMeおよびZ (OM
e)−3ar−OMeの硫酸化を示すグラフ、第5図は
末硫酸化hcCK−33を硫酸化hCCK−33に転化
する説明図、第6図は継電された犬におけるCCK−ペ
プチドに応答したすい臓のタンパク質放出増を示すグラ
フ、第7図は末硫酸化hCCK−33のHPLC精製に
おけるイオン交換クロマトグラフィーのチャート、第8
図は硫酸化hCCK−33のCMおよびHPLC′#l
製におけるイオン交換クロマトグラフィーのチャートで
ある。 硫酸昨匹肚翌 望、H 2(OMs) −Asp (OChp)−Arg (M
ts) −A sp (OChp)−Tyr (C1,
−Bzl)−Met (0) −Gly−Trp (M
ts)−Met (0)−Asp(OChp)−Phe
−NH。 図面の浄書(内容に変更なり、) 第3図 BuPh2Si−5er BuPh2Si−Tyr
なし −〇−−・− フェノール −〇−+ m・クレゾール−6−−去− t−BuPh2Si化度 時間 芽 4 図 二:Z t;、r−so3ン+=>3 Z(c
m−5er−use 9吋<72== =−
so、 )+=、に! zcom)−ryr−r
ye sls’ira’jイbFrnoc−(2Ly
s(Fmoc))hccX−33Fmoc−(2Lys
(Fmoc)−4Ser(tBuPh、5i))hCC
K−33F+++oe−(2Lys (Fmoc)−4
Ser (tBuPh、 Si )−Tyr (So、
H) ) hCCK−33通信北遅々ヒ垣 埠 G 匡 一11ヌtt (情令/+o治) 19毛i(こ(ピコモlし/ka) 纂7図 自) a)シンクロバックRP−Pでの CM精製試料 b)YMCAM−3020DSでの HPLC絹製試料 昭和63年7月6日
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、TyrとSerおよび/またはThr残基を有する
出発物質としてのポリペプチドのアミノ基を塩基性条件
下において脱離可能なアミノ保護基で保護し、Serお
よび/またはThrのOH基をマスキングした後、脱保
護してTyrのOH基を選択的に硫酸化することを特徴
とするポリペプチドの製造方法。 2、出発物質としてのポリペプチドが、式 【遺伝子配列があります】 で表わされるヒトコレシストキニン(hCCK−33)
の未硫酸化形である請求項1記載のポリペプチドの製造
方法。 3、脱離可能なアミノ保護基が、9−フルオレニルメチ
ルオキシカーボニル基(Fmoc)である請求項1記載
のポリペプチドの製造方法。 4、Serおよび/またはThrのOH基を、ターシャ
リブチルジフェニルシリル基(tBuPh_2Si)で
マスキングする請求項1記載のポリペプチドの製造方法
。 5、脱保護が、トリメチルシリルトリフルオロメタンス
ルホネート(TMSOTf)含有試薬で行われる請求項
1記載のポリペプチドの製造方法。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63080116A JPH0681759B2 (ja) | 1988-03-31 | 1988-03-31 | ポリペプチドの製造方法 |
US07/331,292 US5059679A (en) | 1988-03-31 | 1989-03-30 | Method of selectively sulfating peptides |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63080116A JPH0681759B2 (ja) | 1988-03-31 | 1988-03-31 | ポリペプチドの製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH01250396A true JPH01250396A (ja) | 1989-10-05 |
JPH0681759B2 JPH0681759B2 (ja) | 1994-10-19 |
Family
ID=13709222
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63080116A Expired - Fee Related JPH0681759B2 (ja) | 1988-03-31 | 1988-03-31 | ポリペプチドの製造方法 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5059679A (ja) |
JP (1) | JPH0681759B2 (ja) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2020111238A1 (ja) * | 2018-11-30 | 2020-06-04 | 中外製薬株式会社 | ペプチド化合物、またはアミド化合物の脱保護法および固相反応における脱樹脂方法、並びにペプチド化合物の製造方法 |
US11492369B2 (en) | 2017-12-15 | 2022-11-08 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for producing peptide, and method for processing bases |
US11542299B2 (en) | 2017-06-09 | 2023-01-03 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for synthesizing peptide containing N-substituted amino acid |
US11891457B2 (en) | 2011-12-28 | 2024-02-06 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Peptide-compound cyclization method |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2151611C1 (ru) * | 1999-06-18 | 2000-06-27 | Общество с ограниченной ответственностью НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННОЕ ПРЕДПРИЯТИЕ "МЕДБИОФАРМ" | Средство для регулирования йодного обмена или профилактики йоддефицитных состояний |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS57146745A (en) * | 1981-03-09 | 1982-09-10 | Amano Pharmaceut Co Ltd | Peptide amidosulfate ester derivative and its preparation |
JPS62295A (ja) * | 1985-06-27 | 1987-01-06 | Fuji Yakuhin Kogyo Kk | コレシストキニンパンクレオザイミンc端ペプチドおよびその類縁体の製造方法 |
-
1988
- 1988-03-31 JP JP63080116A patent/JPH0681759B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1989
- 1989-03-30 US US07/331,292 patent/US5059679A/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS57146745A (en) * | 1981-03-09 | 1982-09-10 | Amano Pharmaceut Co Ltd | Peptide amidosulfate ester derivative and its preparation |
JPS62295A (ja) * | 1985-06-27 | 1987-01-06 | Fuji Yakuhin Kogyo Kk | コレシストキニンパンクレオザイミンc端ペプチドおよびその類縁体の製造方法 |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11891457B2 (en) | 2011-12-28 | 2024-02-06 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Peptide-compound cyclization method |
US11542299B2 (en) | 2017-06-09 | 2023-01-03 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for synthesizing peptide containing N-substituted amino acid |
US11787836B2 (en) | 2017-06-09 | 2023-10-17 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for synthesizing peptide containing N-substituted amino acid |
US11492369B2 (en) | 2017-12-15 | 2022-11-08 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for producing peptide, and method for processing bases |
WO2020111238A1 (ja) * | 2018-11-30 | 2020-06-04 | 中外製薬株式会社 | ペプチド化合物、またはアミド化合物の脱保護法および固相反応における脱樹脂方法、並びにペプチド化合物の製造方法 |
US11732002B2 (en) | 2018-11-30 | 2023-08-22 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Deprotection method and resin removal method in solid-phase reaction for peptide compound or amide compound, and method for producing peptide compound |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US5059679A (en) | 1991-10-22 |
JPH0681759B2 (ja) | 1994-10-19 |
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