JPH0681759B2

JPH0681759B2 - ポリペプチドの製造方法

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Publication number: JPH0681759B2
Application number: JP63080116A
Authority: JP
Inventors: 治明矢島; 信孝藤井; 晋哉木山
Original assignee: Shin Etsu Chemical Co Ltd
Current assignee: Shin Etsu Chemical Co Ltd
Priority date: 1988-03-31
Filing date: 1988-03-31
Publication date: 1994-10-19
Anticipated expiration: 2009-10-19
Also published as: JPH01250396A; US5059679A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明はポリペプチドの製造方法に関し、特にはTyrとS
erおよび／またはThr残基を有するポリペプチドのTyrの
OH基を選択的に硫酸化する方法に関するものである。

（従来の技術）ポリペプチドは遺伝子操作の研究対象となるタンパク質
として近年大いに注目され、各種のポリペプチドが合成
されている。この合成法としては固相法と液相法が知ら
れているが、固相法は得られるペプチドの純度が低く、
最終工程での精製に多くの困難があるため工業的製法と
しては適当でない。一方、液相法にはステップワイズ法
とフラグメント縮合法があるが、前者は固相法と同様に
生成物の精製が困難であるため、後者のフラグメント縮
合法が多く利用されている。フラグメント縮合法は合成
をフラグメントごとに分割できるので損失が少なくで
き、最終生成物の純度も高く、生成しやすい利点を持つ
反面、縮合反応においてＣ末端アミノ酸残基がラセミ化
を受けやすい欠点を伴うため、フラグメントの組合せを
どのように選ぶかが重要である。

これまで、ポリペプチドとしてヒトコレシストキニン
（hCCK-33）をフラグメント縮合法で全合成する試みが
なされてきたが、いずれも成功していない。その理由は
保護基を有する複数個のフラグメントを順次アジド縮合
させる場合に、アミノ酸残基（SerまたはThr）の存在下
にTyr残基のみを選択的に硫酸化する試薬がなく、かつ
試薬による硫酸化は目的とするTyr-OHに起こらず、優先
的にSer-OHまたはThr-OHに起こるためである。

本発明者らはこの点について種々検討の結果、塩基性条
件下において脱保護可能なアミノ基およびTyr残基を選
択的に硫酸化できる試薬と方法を見出し本発明を完成す
ることができた。

（発明の構成）本発明はTyrとSerおよび／またはThr残基を有する出発
物質としてのポリペプチドのアミノ基を塩基性条件下に
おいて脱離可能なアミノ保護基で保護し、ターシャリブ
チルジフェニルシリル基（tBuPh₂Si）によりSerおよび
／またはThrのOH基をマスキングした後、TyrのOH基を選
択的に硫酸化し、ターシャリブチルジフェニルシリル基
とアミノ保護基を脱保護することを特徴とするポリペプ
チドの製造方法を要旨とするものである。

以下、本発明を詳しく説明するが、この説明において用
いたアミノ酸はグリシンを除きいずれもＬ型のものであ
り、アミノ酸の略号は英文３文字による一般の用法に従
い、その他の略号は次の通りである。

Bzl：ベンジル CHA：シクロヘキシルアミン Chp：シクロヘプチル Cl₂-Bzl:2,6−ジクロロベンジル DCHA：ジシクロヘキシルアミン DMF：ジメチルホルムアミド DMSO：ジメチルスルホキシド EDT：エタンジチオール Fmoc:9−フルオレニルメチルオキシカルボニル HMPA：ヘキサメチルホスホアミド Mts：メシチレン−２−スルホニル NMM:N−メチルモルホリン（Ｏ）：スルホキシド Su:N−ヒドロキシサクシンイミジル TEA：トリエチルアミン TFA：トリフルオロ酢酸 THF：テトラヒドロフラン TMSOTf：トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート tBuPh₂Si:tert−ブチルジフェニルシリル tBuMe₂Si:tert−ブチルジメチルシリル Me₃Si：トリメチルシリルＺ：ベンジルオキシカルボニルＺ（OMe）:p−メトキシベンジルオキシカルボニル本発明の方法はTyrとSerおよび／またはThr残基を有す
るポリペプチドを出発物質とするのであり、ヒトコレシ
ストキニン（hCCK-33）の未硫酸化形がこれに該当す
る。

したがって、以下フラグメント縮合法によるhCCK-33の
合成を例として本発明を説明する。

本発明の方法は次の３段階の工程からなる。すなわち、
第１段階は保護基を有するhCCK-33の合成、第２段階は
保護基の除去・脱離による硫酸化されていないhCCK-33
の取得、そして第３段階はTyr残基の選択的硫酸化であ
る。

第１段階においては第１図に示すように下記７個のポリ
ペプチドフラグメントを順次アジド法で縮合させること
によって保護基を有するhCCK-33が合成される。

（１）Ｈ−Asp（OChp）−Arg（Mts）−Asp（OChp）−Ty
r-Met（Ｏ）−Gly-Trp（Mts）−Met（Ｏ）−Asp（OCh
p）−Phe-NH₂ （２）Ｚ（OMe）−His-Arg（Mts）−Ile-Ser-NHNH₂ （３）Ｚ（OMe）−Asp（OBzl）−Pro-Ser（Bzl）−NHNH
₂ （４）Ｚ（OMe）−Asn-Leu-Gln-Asn-Leu-NHNH₂ （５）Ｚ（OMe）−Ser（Bzl）−Ile-Val-Lys（Ｚ）−NH
NH₂ （６）Ｚ（OMe）−Gly-Arg（Mts）−Met（Ｏ）−NHNH₂ （７）Ｚ（OMe）−Lys（Ｚ）−Ala-Pro-Ser-NHNH₂ この場合フラグメント（１）は第２図に示すように、最
初にTyr（Cl₂-Bzl）を用い、Suエステル法によりＺ（OM
e）−Tyr（Cl₂-Bzl）−OHを、Ｚ（OMe）−Met（Ｏ）−G
ly-Trp（Mts）−Met（Ｏ）−Asp（OChp）−Phe-NH₂のTF
A処理試料と縮合させることによって得られる。

第２図の方法で得られたＣ末端デカペプチドアミド
（１）（位置24〜33）から出発して各フラグメントを順
次縮合させる場合、DMF-DMSO-HMPA（1:1:1）を用いてフ
ラグメントを溶解し、アシル成分を1.5〜５当量用いて
反応の完結に努めた。過剰のアシル成分を用いたが、各
反応は過アシル化することなく、スムースに進行した。
反応後過剰のアシル成分は再沈殿法ないしはゲルろ過に
よって精製した。

酸加水分解の生成物中のアミノ酸組成比は第１表に示す
通りである。これによって保護されたhCCK-33を合成す
るルートが確立できた。

第２段階として保護されたhCCK-33からすべての保護基
を除いて硫酸化されていないhCCK-33を得た。保護基を
除くに先立って、Met（Ｏ）残基をフェニルチオトリメ
チルシランで処理してMetに還元し、還元されたペプチ
ドをTMSOTf−チオアニソール/TFAで処理して、すべての
保護基を除いた。保護基を除去したペプチドをSephadex
G-25を用いてゲルろ過し、重炭酸アンモニウム緩衝液
を使用してCM−トリスアクリルＭ上でイオン交換クロマ
トグラフィーを行った。合成された硫酸化されていない
hCCK-33の均質性を、6N塩酸による加水分解後のアミノ
酸分析と逆相系カラムを用いたHPLCによって確かめた。

次に第３段階としてTyr残基を選択的に硫酸化するので
あるが、このためにTyr、Ser、Trp、Met、HisおよびLys
について若干のモデル実験を行った。

本発明者らはこのモデル実験からSer-OHがTyr-OHより遥
かに速い速度でシリル化されることを発見した。ピリジ
ン−SO₃錯体で行う硫酸化の条件下24時間後の時点で、S
er（Me₃Si）誘導体およびSer（tBuMeSi）誘導体は分解
されるが、Ser（tBuPh₂Si）誘導体はそのままの形で残
ることがわかり、シリル化剤としてtBuPh₂Si塩化物を選
択するに至った。tBuPh₂Si塩化物によるＺ（OMe）−Ser
-OMeのシリル化はイミダゾールの存在下で30分以内に定
量的に進行した。一方、この条件でTyr-OHは一部シリル
化されるのであるが、氷冷下フェノール化合物の添加に
よりこれを抑制できることが判った。フェノール化合物
として３種類を選んで試験を行ったが、この中でフェノ
ールが最も良い結果を与えた。

第３図に示されるように、フェノール（20当量）の添加
はTyr-OHのシリル化を46％から31％（４時間後）に抑制
する。tBuPh₂Si基はDMF中の1Mのテトラブチルアンモニ
ウムふっ化物（Bu₄NF）による簡単な処理（０℃、60
分）で分解されることが知られているが、これに対して
Tyr（SO₃H）はこのハード塩基処理の下に安定であっ
た。薄層クロマトグラフィー（TLC）で検査したとこ
ろ、シリル化および脱シリル化の条件の下にHis、Mrtお
よびTrpは不変に残っていた。これらのモデル実験からS
er-OHの存在下でのTyr-OHの優先的硫酸化はtBuPh₂Si基
によるSer-OHの水酸基の可逆的マスキングによって行わ
れると結論された。なお、ThrはhCCK-33中には無い。

1970年にカルピノ（Carpino）とハン（Han）により塩基
で除去可能なアミノ保護基として紹介されたFmoc基は、
DMF中の1MのBu₄NFによる処理で、tBuPh₂Si基と共に分解
されることがわかったので、本発明では硫酸化に先立っ
て二つのLys残基（位置１、11）のα−およびε−アミ
ノ官能基をFmoc基でマスクした。TLCで検査すると、Tyr
のFmoc-OSuによる部分的アシル化はフェノールの添加に
より効果的に抑制されていた。

最近になって、アセチル硫酸ピリジニウム（PAS試薬）
がペンケ（Penke）らによって硫酸化剤として紹介され
た。この試薬はペンケらによりDMF−ピリジン中で、ク
ラノ（Kurano）らによりTFA中で、Ser-OHをそれぞれア
セチル基またはフェノキシアセチル基でマスクした後、
ブタCCK-33の製造に使用された。

Tyr（SO₃H）の酸不安定性および本発明の場合の未硫酸
化hCCK-33中のマスクされていないTrp残基の存在を考慮
して、本発明では塩基性の条件下にTyr残基を硫酸化し
た。DMF中のピリジンの存在の下では、ピリジン−SO₃錯
体はPAS試薬よりも容易にＺ（OMe）−Tyr-OMeを硫酸化
した（第４図）。

Ｚ（OMe）−Ser-OMeの硫酸化反応でも同様の傾向が観察
された。TLCで検査すると、Hisはピリジン−SO₃錯体に
より部分的に硫酸化されていたが（４時間後、32％）水
の添加により60分以内に定量的にHisが再生された。硫
酸化の間のMetの部分的酸化およびTrpの変化を抑制する
にはEDTの使用が有効であった。第４図はDMF−ピリジン
中でのピリジン−SO₃錯体またはアセチル硫酸ピリジニ
ウムによるＺ（OMe）−Tyr-OMeおよびＺ（OMe）−Ser-O
Meの硫酸化を示すものである。

これらのモデル実験の後、第１図および第５図に示すよ
うに、前記未硫酸化形のhCCK-33に対し、次の反応を逐
次行わせて硫酸化hCCK-33に転化させた。：１）TEAの存在下にFmoc-OSuで処理して、すべてのアミ
ノ官能基を保護した（０℃、２時間）。Tyr残基を保護
するためにフェノールを加えた。

２）イミダゾールの存在下にtBuPh₂Si-Clで処理して、
４個のSer-OH官能基を優先的に保護した（４℃、14時
間、モデル実験より長い時間）。フェノールを加えてTy
r残基のシリル化を最小にした。

３）20％のピリジンを含むDMF中のピリジン−SO₃錯体で
の処理によりTyr-OHを硫酸化（25℃、24時間）し、EDT
を加えてMetとTrpを保護した。

４）DMF中の1MのBu₄NFで処理して、tBuPh₂Si保護基とFm
oc保護基を除去した（４℃、１時間、次いで25℃、１時
間）。EDTを添加してFmoc基から由来するジベンゾフル
ベンをクエンチングさせた。

このようにして硫酸化されたhCCK-33の粗試料を、0.2M
のNH₄HCO₃緩衝液による傾斜溶離法を用いてCM−トリス
アクリルＭ上でイオン交換クロマトグラフィーにかけ、
次いで0.1MのAcONH₄溶液中のMeCN（31％）を用いるアイ
ソクラチックエルーション（isocratic elution）によ
るAsahipak ODP-50カラムでのHPLCで精製した。前者の
精製は過度に硫酸化されたhCCKと未硫酸化hCCKを除去す
るのに有効であった。このHPLCカラムでは、YMC-ODS 30
2カラムより、所望の生成物の分離がより良好であっ
た。総合収率は未硫酸化hCCK-33より計算して15％であ
った。収率は用いられたシリル化条件に全く依存するよ
うに思われる。最適のシリル化条件は確認されていない
がシリル化を25℃、３時間で行ったときの収率は13％で
あった。

このようにして得られた合成hCCK-33の純度は分析的HPL
Cと酸加水分解後のアミノ酸分析によって確かめられ
た。Try（SO₃ ^-）の存在はロイシン−アミノペプチダー
ゼ（LAP）消化によって確認された。

合成hCCK-33は並行して合成hCCK−８によるバイオアッ
セイにかけられ、活性が測定された。バイオアッセイは
ペントバルビタールで麻酔された雑種犬（ｎ＝４）にお
けるすい臓毛細血管流とすい臓のタンパク質放出で行わ
れた。すい臓毛細血管の血液流はレーザードップラー灌
流モニターで測定し、すい臓のタンパク質の濃度はロー
リ（Lowry）らの方法で測られた。

大腿静脈カテーテルを経て、合成hCCK-33およびCCK−８
のBolus注射（1.0、3.125、6.25、12.5、25、50、100、
200ピコモル/kg・体重）が60分の間隔を置いて与えられ
た。すい臓血管流は合成hCCK-33の投与により、用量に
従って増加した。すい臓のタンパク質放出も合成hCCK-3
3の投与により、用量に従って増加した。3.125ピコモル
/kgの最小用量で増加効果が観察された。最大の効果は
用量200ピコモル/kgで観察された。すい臓毛細血管血液
流およびすい臓のタンパク質放出に対する影響に関して
は、モル量を基準として、合成hCCK-33の活性が合成CCK
−８の活性の92％であった。ラットの生体標本における
胃酸、ペプシン放出、すい臓分泌から見ると、合成hCCK
-33はモル基準でCCK−８の約２ないし３倍強力であっ
た。切離されたモルモツトの胃組織からペプシノーゲン
分泌の刺激においては、モル基準で合成hCCK-33はCCK−
８と同程度に有効であった。モル基準でCCK−８は全ブ
タCCK-33分子の2.5倍強力であった。従って、本発明に
よる合成hCCK-33は天然のブタCCK−33の活性に匹敵する
か、これより高い活性を持つものと判断できる。前記犬
アッセイ系では、未硫酸化hCCK-33の活性はCCK−８の活
性（モル基準で１とする）に対する比が0.074であった
ので、CCKの生体活性にとって分子の硫酸部分が重要な
役割をしていることが確かめられた。

第６図は麻酔された犬における３種のCCK−ペプチドに
応答したすい臓のタンパク質放出の増加を示すものであ
る。

本発明によれば、ペンケおよびクラノらによって報告さ
れたブタCCK-33の合成と異なり、ペプチドを強塩基にさ
らすことなく、高度に活性なhCCK-33製品を得ることが
できる。

（実施例）つぎに本発明の方法によるヒトコレシストキニンhCCK-3
3の合成について実施例を挙げてさらに具体的に説明す
る。

なお、R_f値はシリカゲル（メルク社製キーゼルゲルＧ）
上の薄相クロマトグラフィー（TLC）にて下記混合溶媒
を用いて測定したものである。

ニンヒドリン発色の強さは島津二波長TLCスキヤナー型C
S-900で測定した。Fab-MSスペクトルはFABイオン源とJE
OL JM HX-100二重収束質量分析計で得た。LAPはシグマ
社Lot No.L-6007で、CCK−８はタンパク質研究所から購
入し、HPLCはWaters 204 modelで行った。すい臓毛細管
血液流はレーザードップラー灌流モニター（米国ワシン
トン州シアトルモデルパシフィック社のモデルLD5000）
を使用した。

「洗浄操作」は特記しない限り溶媒を蒸発した後、残滓
を５％クエン酸およびエーテルで処理し、得られた粉末
を５％クエン酸、５％NaHCO₃、および水で洗い、適当な
溶媒から再結晶または沈殿させる操作を意味する（１）Ｚ（OMe）−Tyr（Cl₂-Bzl）−Met（Ｏ）−Gly-
Trp（Mts）−Met（Ｏ）−Asp（OChp）−Phe-NH₂〔１〕
（位置27〜33）の製法 TFAで処理したＺ（OMe）−Met（Ｏ）−Gly-Trp（Mts）
−Met（Ｏ）−Asp（OChp）−Phe-NH₂（4.57g、3.63ミリ
モル）を、TEA（0.51ml、１当量）を含むDMF（25ml）中
に溶解し、次いでＺ（OMe）−Tyr（Cl₂-Bzl）−OSu（2.
62g、1.2当量）及びNMM（0.40ml、１当量）を加え、混
合物を一夜かきまぜた。生成物を、洗浄操作と、次にAc
OEtを含むDMFから沈殿させることにより精製した：物理的定数と分析データは、保護された中間体のそれら
のものと共に、第２表に示されている。

（２）Ｚ（OMe）−Asp（OChp）−Tyr（Cl₂-Bzl）−Me
t（Ｏ）−Gly-Trp（Mts）−Met（Ｏ）−Asp（OChp）−P
he-NH₂〔１〕（位置26〜33）の製造前記７個残基のペプチドアミドのTFAで処理した試料
（4.95g、3.13ミリモル）を、TEA（0.43ml、１当量）を
含むDMF（30ml）中に溶解し、次にTHF（15ml）中のＺ
（OMe）−Asp（OChp）−OSu〔DCHA塩2.70g、1.5当量か
ら調製〕とNMM（0.41ml、1.2当量）を添加し、混合物を
一夜かきまぜた。生成物に洗浄操作を施し、次いでAcOE
tを含むDMFから沈殿させて、精製した：（３）Ｚ（OMe）−Arg（Mts）−Asp（OChp）−Tyr（C
l₂-Bzl）−Met（Ｏ）−Gly-Trp（Mts）−Met（Ｏ）−As
p（OChp）−Phe-NH₂〔１〕（位置25〜33）の製造前記８個残基のペプチドアミドのTFAで処理した試料
（4.75g、2.65ミリモル）を、TEA（0.37ml、１当量）を
含むDMF（30ml）中に溶解し、次いでTHF（20ml）中のＺ
（OMe）−Arg（Mts）−OSu（CHA塩3.28g、２当量から調
製）とNMM（0.35ml、1.2当量）を加え、混合物を一夜か
きまぜた。生成物に洗浄操作を施して、次いでAcOEtを
含むDMFから沈殿させて精製した：（４）Ｚ（OMe）−Asp（OChp）−Arg（Mts）−Asp（O
Chp）−Tyr（Cl₂-Bzl）−Met（Ｏ）−Gly-Trp−（Mts）
−Met（Ｏ）−Asp（OChp）−Phe-NH₂〔１〕（位置24〜3
3）の製造前記９個残基のペプチドアミドのTEAで処理した試料
（4.15g、1.95ミリモル）をTEA（0.27ml、１当量）を含
むDMF（40ml）中に溶解し、次いでTHF（15ml）中のＺ
（OMe）−Asp（OChp-OSu〔DCHA塩1.68g、1.5当量から調
製とNMM（0.26ml、1.2当量）を加え、混合物を18時間か
きまぜた。生成物に洗浄操作を施し、次にMeOHを含むDM
Fから沈殿させて精製した：（５）Ｚ（OMe）−His-Arg（Mts）−Ile-Ser-Asp（OC
hp）−Arg（Mts）−Asp（OChp）−Tyr（Cl₂-Bzl）−Met
（Ｏ）−Gly-Trp（Mts）−Met（Ｏ）−Asp（OChp）−Ph
e-NH₂（位置20〜33）の製造 DMF（40ml）のフラグメント〔２〕（7.99g、２当量）か
ら調製したアジド体とNMM（0.61ml、1.2当量）とを、TE
A（0.64ml、１当量）を含むDMF（30ml）中のフラグメン
ト〔１〕のTFA処理試料（10.73g、4.58ミリモル）の氷
冷溶液に加え、混合物を一夜かきまぜた。生成物に洗浄
操作を施した後、MeOHを含むDMFから沈殿させて精製し
た：このものの物理恒数及び分析データは、他の保護基を有
するペプチドについての結果と共に、第３表に示した。

（６）Ｚ（OMe）−Asp（OBzl）−Pro-Ser（Bzl）−Hi
s-Arg（Mrs）−Ile-Ser-Asp（OChp）−Arg（Mts）−Asp
（OChp）−Tyr（Cl₂-Bzl）−Met（Ｏ）−Gly-Trp（Mt
s）−Met（Ｏ）−Asp（OChp）−Phe-NH₂（位置17〜33）
の製造 DMF（10ml）中のフラグメント〔３〕3.46g（1.5当量）
から調製したアジド体とNMM（0.52ml、1.2当量）とを、
TEA（0.55ml、１当量）を含むDMF（30ml）中の前記17個
残基のペプチドアミドのTFA試料の氷冷溶液に加え、混
合物を一夜かきまぜた。生成物に洗浄操作を施し、AcOE
tを含むDMFから沈殿させて精製した：（７）Ｚ（OMe）−Asn-Leu-Gln-Asn-Leu-Asp（OBzl）
−Pro-Ser（Bzl）−His-Arg（Mts）−Ile-Ser-Asp（OCh
p）−Arg（Mts）−Asp（OChp）−Tyr（Cl₂-Bzl）−Met
（Ｏ）−Gly-Trp（Mts）−Met（Ｏ）−Asp（OChp）−Ph
e-NH₂（位置12〜33）の製造 DMF-DMSO-HMPA（1:1:1、90ml）中のフラグメント〔４〕
7.57g（４当量）から調製したアジド体とTEA（0.41ml、
1.2当量）とを、TEA（0.34ml、１当量）を含むDMF（30m
l）中の前記17個残基のアミドのTFA処理試料（8.50g、
2.43ミリモル）の氷冷溶液に加え、混合物を48時間かき
まぜた。生成物をSepha-dex LH-60でゲルろ過し、AcOEt
を含むDMFから沈殿させて精製した：（８）Ｚ（OMe）−Ser（Bzl）−Ile-Val-Lys（Ｚ）−
Asn-Leu-Gln-Asn-Leu-Asp（OBzl）−Pro-Ser（Bzl）−H
is-Arg（Mts）−Ile-Ser-Asp（OChp）−Arg（Mts）−As
p（OChp）−Tyr（Cl₂-Bzl）−Met（Ｏ）−Gly-Trp（Mt
s）−Met（Ｏ）−Asp（OChp）−Phe-NH₂（位置８〜33）
の製造 DMF（20ml）中のブラグメント〔５〕から調製したアジ
ド体（2.10g、４当量）とTEA（0.10ml、1.2当量）を、T
EA（86μｌ、１当量）を含むDMF（10ml）中の前記22個
残基ペプチドアミドのTEA処理試料（2.53g、0.62ミリモ
ル）の氷冷溶液に加え、混合物を一夜かきまぜた。生成
物をSephadex LH-60でゲルろ過した後、AcOEtを含むDMF
から沈殿させて精製した：（９）Ｚ（OMe）−Gly-Arg（Mts）−Met（Ｏ）−Ser
（Bzl）−Ile-Val-Lys（Ｚ）−Asn-Leu-Gln-Asn-Leu-As
p（OBzl）−Pro-Ser（Bzl）−His-Arg（Mts）−Ile-Ser
-Asp（OChp）−Arg（Mts）−Asp（OChp）−Tyr（Cl₂-Bz
l）−Met（Ｏ）−Gly-Trp（Mts）−Met（Ｏ）−Asp（OC
hp）−Phe-NH₂（位置５〜33）の製造 DMF（5ml）中のフラグメント〔６〕から調製したアジド
体（0.98g、４当量）とNMM（0.15ml、４当量）とを、TE
A（46μｌ、１当量）を含むDMF（5ml）中の前記26個残
基のペプチドのTFA処理試料（1.51g、0.33ミリモル）の
氷冷溶液に加え、混合物を一夜かきまぜた。生成物に洗
浄操作を施した後、MeOHを含むDMFから沈殿させて精製
した：（10）Ｚ（OMe）−Lys（Ｚ）−Ala-Pro-Ser-Gly-Arg
（Mts）−Met（Ｏ）−Ser（Bzl）−Ile-Val-Lys（Ｚ）
−Asn-Leu-Gln-Asn-Leu-Asp（OBzl）−Pro-Ser（Bzl）
−His-Arg（Mts）−Ile-Ser-Asp（OChp）−Arg（Mts）
−Asp（OChp）−Tyr（Cl₂-Bzl）−Met（Ｏ）−Gly-Trp
（Mts）−Met（Ｏ）−Asp（OChp）−Phe-NH₂（保護され
たhCCK-33）の製造 DMF（5ml）中のフラグメント〔７〕から調製したアジド
体（0.81g、５当量）とNMM（38μｌ、５当量）とを、TE
A（32μｌ、１当量）を含むDMF（5ml）中の前記29個残
基のペプチドアミドのTFA処理試料（1.20mg、0.23ミリ
モル）の氷冷溶液に加え、混合物を24時間かきまぜた。
生成物をSephadex LH-60でゲルろ過し、次いでAcOEtを
含むDMFから沈殿させて精製した：（11）Ｈ−Lys-Ala-Pro-Ser-Gly-Arg-Met-Ser-Ile-Va
l-Lys-Asn-Leu-Gln-Asn-Leu-Asp-Pro-Ser-His-Arg-Ile-
Ser-Asp-Arg-Asp-Tyr-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH₂（h
CCK-33の遊離形） DMF（3ml）中の保護されたhCCK-33（317mg、54.7マイク
ロモル）をフェニルチオトリメチルシラン（300μｌ、3
0当量）で室温において60分間処理した後、留去により
溶媒を除去し、AcOEtを加えて粉末を得た：収量289mg
（89％）、Ｒ_f10.72。

ｍ−クレゾール（244μｌ、130当量）とEDT（38μｌ、2
3当量）の存在下に、保護されたhCCK-33の還元形（100m
g、17.4マイクロモル）をTFA（5ml）中の1MのTMSOTf−
チオアニソールで氷浴中2.5時間処理した後、乾燥エー
テルを加えた。得られた粉末を氷冷したMeOH-H₂O（1ml-
2ml）中に溶解し、２−メルカプトエタノール（200μ
ｌ）と1MのNH₄F（600μｌ、36当量）とを加えた。溶液
のpHをTEAにより8.0に調整した後、30分後に1N AcOHで
6.0に調整した。遠心分離により多少の不溶物を除いた
後、溶液をSephadex G-25（3.3×105cm）のカラムに加
え1NのAcOHで溶離した。フロントメインピークに相当す
るフラクション（各8.0ml、管番号30〜44、280nmの紫外
線（UV）吸収の測定により監視）を集め、凍結乾燥によ
り溶媒を除去して粉末を得た：収量64.2mg（95.4％）。

次に、粗粉末をCM−トリスアクリルＭ（2.0×4.2cm）に
よるイオン交換クロマトグラフィーにかけ、pH7.9の1M
のNH₄HCO₃緩衝液（250ml）を含む混合フラスコを通しpH
7.9の0.2MのNH₄HCO₃緩衝液（250ml）の形成する線形傾
斜で溶離した。メインピークに相当するフラクション
（各8.2ml、管番号24〜31、280nmのUVで監視）を集め、
凍結乾燥で溶媒を除いて羽毛状の粉末を得た:20.1mg（3
1.1％）。

次の精製はSynchropak RPPカラム（4.0×25cm）上の逆
相HPLCで行い、0.1％TFA水溶液中のMeCNの傾斜（30分間
に25％から35％）をもって1.0ml/分の流速で溶離した。

メインピーク（第7a図、保持時間37分、280nmのUVで検
出）に相当する溶離液を集め、凍結乾燥で溶媒を除去し
て羽毛状の粉末を得た：収量10.6mg（53％）、▲〔α〕
²⁰ _D▼−65.7°（Ｃ＝0.1、0.5N AcOH）。

精製したペプチドはHPLCにかけ（第7b図、保持時間27
分）、YMC AM-302-ODSカラム（４×150mm）から、１％T
FA中のMeCNの線形傾斜（30分間に40〜45％）により1.0m
l/分の流速で溶離したとき、唯１個のピークしか示さな
かった。

FAB-MSm/g:3864.4（Ｍ＋Ｈ）^＋（C₁₆₇H₂₆₄N₅₁O₄₉S₃とし
ての計算値:3864.9）。

6Nの塩酸加水分解物中のアミノ酸の割合は第１表に示し
たが、LAP消化物中のアミノ酸の割合は次の通りである
（括弧内の数字は理論値を示す）。Asp 3.62（４）、Se
r 4.53（４）、Pro 1.66（２）、Gly 2.13（２）、Ala
1.18（１）、Val 1.10（１）、Met 2.70（３）、Ile 2.
28（２）、Leu 2.44（２）、Tyr 1.12（１）、Phe 1.00
（１）、Lys 2.14（２）、His 1.08（１）、Trp 0.99
（１）、Arg 3.24（３）、Asn及びGlnは定量しなかった
（Pheの回収率77％）。

第７図は未硫酸化hCCK-33のHPLC精製の様子を示す。

モデル実験１） LysとFmoc保護及びその脱保護： H₂O-DMF（1:9、2ml）中のＨ−Lys-OH（14.6mg、0.1ミリ
モル）を、TEA（59μｌ、４当量）の存在下にFmoc-OSu
（141mg、４当量）で60分間氷浴中で処理した。その間
に出発物質とモノFmoc誘導体はTLCでは消失し、新たにニンヒドリン反応に陰性なス
ポットが検出された。溶媒を蒸発した後、生成物をAcOEtまた
は他の有機溶媒に溶解し、有機物相を５％クエン酸、５
％NaHCO₃、およびH₂O-NaClで洗い、Na₂SO₄上で乾燥し濃
縮した。残留物を適当な溶媒から再結晶または沈殿させ
て単離した。このようにして単離したジFmoc誘導体をDM
F（1ml）に溶解し、溶液をEDT（39μｌ、10当量）の存
在下に、THF中の1MのBu₄NF（1ml、10当量）で25℃にお
いて60分間処理した。その間にの化合物は完全にＨ−Lys-OH に転化した。

フェノールの不存在又は存在の下にDMF（2ml）中でＺ
（OMe）−Tyr-OMeを、同様にFmoc-OSu（４当量）とTEA
（４当量）で60分間冷浴中で処理した。TLCスキャナー
で調べると、Ｚ（OMe）−Tyr（Fmoc）−OMe の形成はそれぞれ7.8％及び０％であった。これによっ
てフェノールの添加はTyrの変性の抑制に有効であるこ
とが判明した。同様に、Ｚ（OMe）−His-OMe（0.1ミリ
モル）をFmoc-OSuとTEAで処理したとき、Ｚ（OMe）−Hi
s（Fmoc）−OMeの形成はほとんど認められなかった。

ピリジン−SO₃錯体（10当量）を含むDMF−ピリジン（8:
2、2ml）中のFmoc-Lys（Fmoc）−OH（0.1ミリモル）を2
5℃で18時間保った。TLCでは何の変化も観察されなかっ
た。

２） Ser-OHの優先的tBuPh₂シリル化：最初に、シリル化Ｚ（OMe）−Ser-OMe誘導体の安定性を
ピリジン−SO₃錯体による処理で検査した。DMF（1ml）
中のＺ（OMe）−Ser-OMe（各14mg、0.05ミリモル）を、
イミダゾール（20当量）の存在の下に、氷浴中60分間Ｒ
−Cl（ＲはMe₃Si、tBuMe₂Si、又はtBuPh₂Si、各10当
量）で処理した。溶媒を留去し、残渣をｎ−ヘキサンで
洗った。各生成物（各68マイクロモル、Ｒ＝Me₃Siのも
の：Ｒ＝tBuMe₂Siのもの：を、EDT（20μｌ）を含むDMF−ピリジン（8:2、1ml）に
溶解し、ピリジン−SO₃錯体（94mg、10当量）を加え
た。各溶液を25℃に保ち、定期的にTLCスキャナーで検
査した。

Me₃Si化合物は30分以内に完全に脱シリル化され、tBuMe
₂Si化合物は24時間内で約15％が脱シリル化された。し
かしtBuPh₂Si化合物は24時間後でも変化しないで残っ
た。

次に、Try-OHの存在下でのSer-OHの優先的なtBuPh₂シリ
ル化を検査した。Ｚ（OMe）−Ser-OMe（0.05ミリモ
ル）、Ｚ（OMe）−Tyr-OMe（0.05ミリモル）及びイミダ
ゾール（20当量）の混合物のDMF（1ml）に溶解したもの
を、フェノール化合物（各20当量のフェノール、ｍ−ク
レゾールとｐ−メチルチオフェノール）の不存在又は存
在の下に、４℃で４時間、tBuPh₂Si-Cl（20当量）で処
理した。各生成物をTLCスキャナーで定量した。この結
果を第３図に示した。

反応を25℃で４時間行ったとき、Ｚ（OMe）−Tys-OMeは
フェノールの不存在下で75％がシリル化され、フェノー
ルの存在下で44％がシリル化された。

３）Ｚ（OMe）−Ser（ｔ−tBuPh₂Si）−OMeのtBuPh₂S
i基脱保護： DMF（1ml）中のＺ（OMe）−Ser（ｔ−BuPh₂Si）−OMe
（36mg、68マイクロモル）を、EDT（20μｌ）の存在下
に、DMF中の1MのBu₄NF（1ml、15当量）で25℃、60分間
処理した。その間に出発物質は完全に消失し、Ｚ（OMe）−Ser-OMeに相当するスポッ
トが検出された。

４） Tyr-OHの硫酸化： 20％のピリジンを含むDMF（1ml）中のＺ（OMe）−Ser-O
MeとＺ（OMe）−Tyr-OMe（各0.05ミリモル）を25℃にお
いてそれぞれピリジン−SO₃錯体（５当量）又はPAS（10
当量）で処理して、溶液を定期的にTLCスキャナーで検
査した。その結果を第４図に示した。

Ｚ（OMe）−Trp-OH、Ｚ（OMe）−Met-OH、及びＺ（OM
e）−His-OMe（各0.05ミリモル）を、同様にピリジン−
SO₃錯体又はPASで４時間処理した。前二者は変化しない
で残ったが、Ｚ（OMe）−His-OMeはピリジン−SO₃錯体
で32％、PASで18％が硫酸化された。これに水を加える
と（pH6.0）、硫酸化His化合物が60分以内に分解し、出発物質が再生された。

５）未硫酸化hCCK-33の硫酸化hCCK-33への転化： Fmoc-OSu（79mg、30当量）を、TEA（33μｌ、30当量）
を含むDMF-H₂O（900-100μｌ）中の未硫酸化hCCK-33（3
0mg、7.8マイクロモル）とフェノール（22mg、30当量）
の氷冷溶液中に加え、混合物を氷浴中で２時間かきまぜ
た。乾燥エーテルを加え、得られた粉末をDMFからエー
テルで再沈殿した。このようにして得られたFmoc誘導体を、イミダゾール（6.3mg、120当量）及びフェノール
（88mg、120当量）と共に、DMF（2ml）中に溶解した
後、tBuPh₂Si-Cl（216μｌ、120当量）を加え、溶液を
４℃で14時間かきまぜた。エーテルを加え、得られた粉
末をDMFからエーテルで再沈殿した。生成物をSephadex LH-20（４×47cm）でゲルろ過しDMFで溶離
して精製した。所望のフラクション（各9.2ml、管番号2
1〜29、280nmのUV吸収で監視、他の精製の場合も同じ）
を一緒にし、溶媒を蒸発によって除いた。

残渣を20％のピリジンを含むDMF（1ml）に溶解した後、
EDT（22μｌ、30当量）とピリジン−SO₃錯体（124mg、1
00当量）を加え、混合物を25℃で24時間かきまぜた。前
記したように、溶液をSephadex LH-20のカラム（４×47
cm）に加えDMFで溶離した。所望のフラクション（管番
号20〜24）を合わせ、溶液を濃縮した（約1mlに）。こ
の溶液をEDT（22μｌ、30当量）の存在下に、DMF（1.0m
l）中の1MのBu₄NF（1.0ml）で氷浴中60分間、次いで室
温で60分間処理した。氷で冷却しつつ1MのNH₄HCO₃（4m
l）を加え、少量の不溶物質を遠心分離で除いた。上澄
液をSephadex G-10のカラム（2.4×49cm）に加え、1Mの
NH₄HCO₃緩衝液（pH 8.2）で溶離した。フロントメイン
ピークに相当するフラクション（各7.8ml、管番号11〜1
7）を合わせ、凍結乾燥を繰返して塩と共に溶媒を除い
て白色粉末を得た：収量19.2mg（63.9％）。

次に粗試料を、CM−トリスアクリルＭ（1.6×4.5cm）に
よるイオン交換クロマトグラフィーにかけ、0.01MのNH₄
HCO₃緩衝液（pH 7.8、300ml）を含む混合フラスコを通
る0.2MのNH₄HCO₃緩衝液（pH8.4、500ml）で形成される
グラジエントで傾斜溶離した。第二のピーク（第8a図）
に相当するフラクション（各7.8ml、管番号21〜29）を
合わせ、溶媒と塩を凍結乾燥を繰返して除き粉末を得
た：収量7.5mg（39.1％、総合収率25.0％）。

ここに得られた生成物を、Asahipak ODS-50のカラム（1
0×250mm）によるHPLCを行い、毎分2mlの流速の0.1M Ac
ONH₄（pH6.5）中の31％MeCN溶液によるアイソクラチッ
クエルージョンで、さらに精製した。所望の溶出液（第
8b図、保持時間42分）を集め、溶媒を凍結乾燥で除いて
白色のふわふわした粉末を得た：収量4.1mg（61％、未
硫酸化hCCK-33を基準とする総合収率15％）。シリル化
を25℃で３時間行ったときは、同様の精製後の収率は13
％であった。

Asahi Pak ODP-50（４×150mm）から0.1MのAcONH₄（pH
7.8）中のMeCNの傾斜（30分間に20〜40％）を用い1ml/
分の流速で溶離した場合（第8c図）のHPLCの保持時間は
14分であった。6N HCl加水分解生成物中のアミノ酸組成
は第１表に示したが、LAP消化物中のアミノ酸組成（括
弧の中の数字は理論値）は次の通りであった。Asp 3.49
（４）、Ser 4.22（４）、Pro 1.50（２）、Gly 2.12
（２）、Ala 1.13（１）、Val 1.14（１）、Met 2.92
（３）、Ile 1.96（２）、Leu 2.07（２）、Tyr（SO
₃H） 0.91（１）、Phe 1.00（１）、Lys 2.00（２）、H
is 0.92（１）、Trp 0.96（１）、Arg 2.87（３）、Asn
とGlnは検出されなかった（Pheの回収率81％）。Asp-Pr
o結合は用いられたLAPの作用に抵抗した。

【図面の簡単な説明】第１図は保護基を有するヒトコレシストキニン（hCCK-3
3）を合成する説明図、第２図は保護基を有するＣ末端
デカペプチドアミドを合成する説明図、第３図はSerお
よびTyrのtert−ブチルジフェニルシリル化を示すグラ
フ、第４図はDMF−ピリジン中でのピリジン−SO₃錯体又
はアセチル硫酸ピリジニウムによるＺ（OMe）−Try-OMe
およびＺ（OMe）−Ser-OMeの硫酸化を示すグラフ、第５
図は未硫酸化hCCK-33を硫酸化hCCK-33に転化する説明
図、第６図は麻酔された犬におけるCCK−ペプチドに応
答したすい臓のタンパク質放出増を示すグラフ、第７図
は未硫酸化hCCK-33のHPLC精製におけるイオン交換クロ
マトグラフィーのチャート、第８図は硫酸化hCCK-33のC
MおよびHPLC精製におけるイオン交換クロマトグラフィ
ーのチャートである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】TyrとSerおよび／またはThr残基を有する
出発物質としてのポリペプチドのアミノ基を塩基性条件
下において脱離可能なアミノ保護基で保護し、ターシャ
リブチルジフェニルシリル基（tBuPh₂Si）によりSerお
よび／またはThrのOH基をマスキングした後、TyrのOH基
を選択的に硫酸化し、ターシャリブチルジフェニルシリ
ル基とアミノ保護基を脱保護することを特徴とするポリ
ペプチドの製造方法。
【請求項２】出発物質としてのポリペプチドが、式Ｈ−Lys-Ala-Pro-Ser-Gly-Arg-Met-Ser-Ile-Val-Lys-As
n-Leu-Gln-Asn-Leu-Asp-Pro-Ser-His-Arg-Ile-Ser-Asp-
Arg-Asp-Tyr-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH₂ で表されるヒトコレシストキニン（hCCK-33）の未硫酸
化形である請求項１記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項３】脱離可能なアミノ保護基が、９−フルオレ
ニルメチルオキシカーボニル基（Fmoc）である請求項１
記載のポリペプチドの製造方法。