JP2002531529A

JP2002531529A - 検出可能なリポーター部分を有する生物学的に活性な接合体、及びその同定方法

Info

Publication number: JP2002531529A
Application number: JP2000586371A
Authority: JP
Inventors: スキアボン，オドーネ; ベロネーゼ，フランチェスコ; カリチェッティ，パオロ; オルソリーニ，ピエロ
Original assignee: デビオルシェルシュファルマシュティークソシエテアノニム
Priority date: 1998-12-08
Filing date: 1999-12-08
Publication date: 2002-09-24
Also published as: WO2000033881A1; CA2354868A1; AU757665B2; ES2233107T3; AU1402800A; ATE283068T1; US6790942B1; DE69922245D1; EP1137442A1; EP1008355A1; DE69922245T2; EP1137442B1; DK1137442T3

Abstract

(57)【要約】本発明の目的は、アミノ酸レポーターの結合を用いて、巨大分子上のポリマーの結合部位を同定又は分析するための新しい方法を提供することである。本発明のもう１つの目的は、化合物ＦＥ−Ｌ−Ｍを提供することである。ただしＭは、タンパク質、ペプチド又はポリペプチドから成る分子であり、ＦＥは機能付与性物質であり、そしてＬは、生理学的条件下では安定であるが、特異的且つ選択的な物理化学的方法により切断され得る連結アームである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、タンパク質、ペプチド、ポリペプチドなどの生物学的に活性な分子
を含んで成る接合誘導体、特にポリマー接合誘導体に関する。本発明はまた、そ
の様な接合誘導体を化学的に同定する方法に関する。

【０００２】現在、遺伝子工学のおかげで、潜在的に有用な薬理学的活性を有する多数の新
しいペプチド及びタンパク質が合成されているが、それらの化学構造に固有な不
利な特性のために、それらの治療能力がしばしば著しく制限されている。

【０００３】例えば、ポリペプチドは、一旦投与されると、エンド若しくはエキソプロテア
ーゼによってしばしば容易に分解され、腎臓により急速に濾過排出され、しかも
ヒトの配列を有するにもかかわらず、免疫反応をしばしば誘起することがある。
更に、その様な巨大分子の大きさ及び性質のために、それらは、その治療作用の
ために望まれる部位では必ずしもない体内標的部位に達することもある。

【０００４】その様なタンパク質の表面に、生物的に適合する無毒性で、無免疫原性で、且
つ水溶性のポリマーを接合することが、前記の問題を軽減し、そしてまれではあ
るが、有用な治療適用を可能にする一つの方法であることが分かっている。

【０００５】この様な接合のためにしばしば使用されるポリマーは、部分的にはその非常に
望ましい生物学的特性の点で、ポリ（エチレン−グリコール）（ＰＥＧ）であり
（“Poly (ethyleneglycol) chemistry and biological application”M.J. Har
ris, Ed. Plenum Press (1994) 参照）、そしてその他の中では特にデキストラ
ン、アルブミン、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、及びポリ（Ｎ−アクリロイル
モルホリン）である。New synthetic polymers for enzyme and liposome modif
ication Poly (ethylene glycol), p.182, ACS Symp Series 680, 1997にも、そ
の様なポリマーのいくつかが記載されている。

【０００６】体内の特定部位を目標にするために、タンパク質及びペプチドに、抗体及びそ
の他の高親和性リガンドを接合することもある。

【０００７】タンパク質内の種々のアミノ酸残基が、ポリマー接合のために適することが分
かっている。それらには、例えば、リシンのアミノ基及びαアミノ末端基が含ま
れる。システインのチオール基、アルギニンのグアニジノ基、末端カルボキシル
基、及びアスパラギン酸若しくはグルタミン酸のカルボキシル基も考えられてい
る。

【０００８】タンパク質のアミノ基の修飾に関する研究及び方法の報告には、Davies and A
buchowski (Abuchowski et al. 1977a及び1977b), Benchamp et al., 1983, Ver
onese et al., 1985, Zalipsky et al., 1983, Delgrado et al., 1990の報告が
ある。タンパク質のＳＨ基の修飾は、Morpurgo et al., 1996に記載されており
、一方グアニジノ基の修飾はPande et al.により記載されている。多糖残基が、
タンパク質内に存在する場合、それを結合のために主に用いることはほとんど無
い。しかし、この様な残基の中で、アミノ基への接合が最も重要である。

【０００９】プロドラッグ調製におけるポリマー接合に関係する現時点での情報にもかかわ
らず、依然として、ポリペプチド及びタンパク質には、前記の全ての基が、場合
によっては非常に多数存在するので（そしてまた、それらの基は、その巨大分子
の表面に異なって露出されており、あるいは異なる求核性を有するので）、一般
的には、不均質で且つ複雑なパターンの生成物が得られる。現在まで、タンパク
質の一次配列上でポリマー接合の位置を確実に記載することは、依然として非常
に困難である。

【００１０】ほとんどの場合で、現在利用できる最新の方法を利用しても、接合体の混合物
から異なる接合体を分画することは、不可能でないにしても、非常に困難である
ことから、前記の困難性がいっそう大きくなる。当該タンパク質分子の妨害物が
、そのタンパク質表面の荷電を隠すことがあり、その結果、イオン交換樹脂への
結合が低下し、親和性リガンドへの結合選択性が低下し、そして前記分画を達成
する際に、種々の方法、例えばゲル濾過クロマトグラフィーの能力が低下する。

【００１１】接合部位の同定、特に高分子ポリマーが接合物である場合の接合部位の同定に
関する種々の方法が文献に報告されている。

【００１２】その一つの方法は、ＰＥＧ接合された生成物においてＨＰＬＣにより得られた
指紋的パターンを、天然の非接合ポリペプチドにおいて得られたパターンと比較
することに基づく。その接合体のトリプシン消化において消失するＰＥＧペプチ
ドの同定に基づいて、結合部位に関するいくらかの情報が得られたが、この情報
は、トリプシンが、ＰＥＧが結合しているところ、又はその近傍には作用しない
こと、その結果、それに対応するペプチドが遊離されないことを前提にした。

【００１３】この方法は、成長ホルモンペプチドの研究で有用であったが（Ross Clark et
al., J. Biol. Chem. 271, 21969-21977, 1996)、それが常に決定的であること
はない。なぜならこの方法は、間接的な証拠に基づき、そして単純なタンパク質
消化パターンを生じる比較的短かいポリペプチドの場合でのみ、ＰＥＧの結合部
位に関する情報を与え得る方法であるからである。

【００１４】もう一つの方法は、ＰＥＧとタンパク質との間にコハク酸のアームを有するポ
リマーによるタンパク質の「ＰＥＧ化」に基づくものであった。コハク酸を、不
安定なエステル官能基によりＰＥＧに、そして安定なアミドによりタンパク質に
連結した。ＰＥＧとコハク酸とを連結する不安定なエステル結合を穏やかな塩基
性条件により加水分解することにより、そのタンパク質からＰＥＧ鎖を除去した
。一方コハク酸部分は、レポーター基として、ＰＥＧが結合していた残基に連結
されたままで残こり、次にその標識されたペプチドを質量分析により認識した（
M.M. Vestling et al. Drug Metab. Disp. 21, 911-917)。

【００１５】この方法には、少くとも２つの重大な制約がある。第一の制約は、ＰＥＧとタ
ンパク質との化学的連結にあり、この化学連結は、人間に用いる生成物にとって
一般的には適当でもなく、又は都合の良いこともない。なぜならＰＥＧとコハク
酸との間のエステル結合は、生理学的な循環中に容易に切断され、新しい生成物
を生じることがあるからである。第二の制約は、ペプチド地図における、コハク
酸標識されたペプチドの同定は、質量分析のみによって行われ得るということに
ある。

【００１６】配列の研究のために通常用いられる方法である標準的なアミノ酸分析を、この
様な場合に適用することはできない。なぜならアミノ酸の同定（ＡＡＡ）前に行
う必要のある強酸による加水分解の際中に、コハク酸部分が、それが結合してい
るアミノ酸から除去されるからである。そのために、最も正確なＡＡＡ方法によ
り、コハク酸が結合していたペプチドを同定することはできない。更に、この結
合の弱さのために、その他の重要な配列分析方法の使用が妨げられる。

【００１７】米国特許第５，２８６，６３７（Veronese et al., 02/15/1994）も、Ｍ−Ｐ
ＥＧを用いる方法を記載している。この発明の方法は、アミノ酸、又は種々の構
造及び特性を有するペプチドのスペーサーアームを、モノアルコキシポリエチレ
ングリコールのヒドロキシル基に、前記アミノ酸又はペプチドのＮＨ₂ 基が関与
する炭酸連結を介して連結することに基づく。

【００１８】この反応に続いて、前記アミノ酸又はペプチドスペーサーアームのＣＯＯＨ基
をスクシンイミジルエステルとして活性化し、従ってそれが、生物学的に活性な
ペプチド、タンパク質又は薬剤のアミノ基に反応性を示す様になる。この方法に
も、ＰＥＧ鎖を接合する方法の全てに共通な短所があり、全てでないとしても、
ほとんどの接合生成物の分画、並びにＰＥＧ化した消化混合物の適当な分画が妨
げられる。

【００１９】そのために、タンパク質に結合しているポリマーの位置の正確な同定は、依然
として問題であり、対応するプロドラッグを調製する場合、その様な同定は、プ
ロドラッグ接合体の構造と活性との間の相関を合理的に導くために必須な前提条
件である。この相関に関する情報は、実際、薬物動態上、薬理学上、及び治療上
のより都合の良い特性を有する新しい接合体を設計するために最も有用な指針の
一つとなろう。

【００２０】また接合部位の正確な同定は、生物学的に活性な巨大分子生成物のより正確な
分析上の特性評価のために重要であり、特に、その接合体を治療上使用するつも
りである場合、そして健康関係当局の要件を満たすために正確な特性評価が必要
である場合、この同定は重要である。

【００２１】治療において巨大分子を使用する際にその接合体が必要である場合、その機能
付与性物質の元々の位置を同定する方法を見い出すことが重要である。その様な
接合体では、ＰＥＧを巨大分子上の多くの異なる部位に結合し得る（治療に適用
する接合体として、例えばＰＥＧとタンパク質との組合せを用い得る）。

【００２２】巨大分子としてのタンパク質に結合しているＰＥＧの結合位置を正確に発見す
る方法を有することが重要である。本発明では、接合生成物の同定及び評価を補
助するために、分析において、接合されたアミノ酸レポーター部分を利用する。

【００２３】本発明の目的は、ポリペプチド及びタンパク質のポリマーによる修飾のために
、前記方法において報告されている制約を克服して、生物学的に活性な接合誘導
体を提供することである。

【００２４】これを実行するために、本発明の対象の一つは、下記の一般式（Ｉ）：ＦＥ−Ｌ−Ｍ（Ｉ）を有する生物学的に活性な接合誘導体である。ただし前記式中、Ｍは、タンパク質、ペプチド及びポリペプチドから成る群から選択される生物学
的に活性な分子に対応する基であり、ＦＥは、機能付与性物質であり、そして

【００２５】Ｌは、標準的な分析方法によって検出可能なレポーター部分を有する連結アーム
であり、ただしこの連結アームはインビトロでの化学処理又は酵素処理によって
切断され得るものであり、そのレポーター部分は、連結アームが切断された後も
、生物学的に活性な分子に接合し続ける。

【００２６】本発明によれば、特定のスペーサー基を用いることにより、前記分子の破壊又
は変性を回避するために苛酷性を減弱して、一方で同定のために前記分子にアミ
ノ酸レポーター部分が接合されたままで、接合体から機能付与性物質ＦＥを除去
できる様になることが分かった。

【００２７】連結アームＬは、生理学的条件下では安定であるが、特異的且つ選択的な物理
化学的方法によって切断され得る。その場合、標準的な分析方法によって検出可
能な安定なレポーター部分は、Ｍに接合したままであり、従ってその存在を、場
合により、質量分析によって同定することができ、そして標準的なアミノ酸分析
により評価するために、化学処理又は酵素処理により切断することができる。代りの同定方法には、未切断接合体のＭａｌｄｉ質量分析がある。

【００２８】好ましくは、本発明の生物学的に活性な接合誘導体において、機能付与性物質
ＦＥは、ＰＥＧ、ＰＶＰ、ＰａｃＭ、デキストラン、ホルモン、抗体又は抗体断
片の中から選択される。より好ましくは、機能付与性物質ＦＥは、分子量２Kd〜
５０Kdのポリマーである。機能付与性物質ＦＥは、直線状ポリマー又は分枝状ポ
リマーのいずれかでよい。

【００２９】好ましくは、本発明の生物学的に活性な接合誘導体において、連結アームＬは
、断片Ｍｅｔ−Ｘを含んで成る。ただしＸはレポーター部分であり、そしてこの
レポーター部分はアミノ酸である。より好ましくは、このアミノ酸Ｘは、Ｎｌｅ
及びベータＡｌａから選択される。また好ましくは、連結アームＬは、ジペプチドＧｌｎ−Ｇｌｙ又はＡｓｐ−Ｐ
ｒｏのいずれかを含んで成る。

【００３０】好ましくは、本発明の生物学的に活性な接合誘導体において、基Ｍは、生物学
的に活性な分子に相当し、この分子は、インスリン、リゾチーム、インターフェ
ロン、特にインターフェロンα−２ｂ、エリスロポエチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＨの
中から選択されるタンパク質である。

【００３１】本発明のもう一つの対象は、前記の生物学的に活性な薬物接合誘導体において
、生物学的に活性な分子Ｍ上で、機能付与性物質ＦＥの接合部位を同定する方法
であって、連結アームＬをインビトロで特異的に化学的又は酵素的に切断するこ
と、伝統的な方法によりＦＥを遊離し、除去し、そして分離することを含んで成
る前記方法である。

【００３２】本発明のもう一つの対象は、請求項１の生物学的に活性な接合体を調製するた
めの、下記一般式（II）：ＦＥ−Ｌ（II）を有する中間化合物である。ただし前記式中、ＦＥは機能付与性物質であり、そ
してＬは、標準的な分析方法により検出可能なレポーター部分を有する連結アー
ムである。

【００３３】このレポーター部分は、機能付与性物質の元々の位置を同定するのに有用であ
る。以下に詳述する通り、本発明は、特別なＰＥＧアミノ酸配列を利用する。こ
の場合、ＰＥＧの結合部位を同定するために利用されるレポーターアミノ酸が当
巨大分子に結合されたままになる様に、ＰＥＧが遊離される。

【００３４】制約なく、そして本発明の意図において、いくつかの機能付与性物質を考える
ことができる。例えば、Ｍが治療に用いられる場合、ＦＥは、典型的にはポリマ
ーである。本発明には多数のポリマーが含くまれるが、好ましくは、そのポリマ
ーを、ＰＥＧ、ＰＶＰ、ＰＡｃＭ、デキストランなどから成る群から選択し得る
。ＰＥＧ、ＰＶＰ及びＰａｃＭがより好ましい。その非常に好ましい生物学的な
特性のために、ＰＥＧが更により好ましい。ＭＰＥＧが更により好ましい。

【００３５】前記の通り、ＦＥは、ポリマー、又はポリマーから成る機能性物質でよい。好
ましくは、このＦＥ／ポリマーは、２Kdより大きな分子量を有し、より好ましく
は、その分子量は２〜５０Kdである。ＦＥがポリマーである場合、それは直線状
又は分枝状ポリマーでよい。

【００３６】その他の機能付与性物質、例えば、特定部位を目標とする高親和性リガンドも
本発明に含くまれる。この場合、ＦＥは、多数の高親和性リガンドのいずれかで
よい。好ましくは、ＦＥは、ホルモン、抗体、又は抗体断片でよく、あるいは認
識部位に対する高出力技術により選択された化合物でよい。より好ましくは、Ｆ
Ｅは、抗体又は抗体断片から成る群から選択され得る。

【００３７】連結アームは、好ましくは、Ｍ部分由来のアミノ基、例えばアルファアミノ基
又はリシンのイプシロンアミノ基と反応する様に設計され得る。好ましくは、連
結アームＬは、アミノ酸の活性化されたカルボキシル基により表され得る。最も
好ましくは、非天然アミノ酸であるノル−ロイシン又はベータ−アラニンが、酸
加水分解後の同定の容易さから好まれる。

【００３８】当該誘導体化合物が下記の構造：ＦＥ−Ｍｅｔ−Ｘ−Ｍである場合、Ｘは、適当なレポーター基、例えば、非天然又は天然のアミノ酸、
である。好ましくは、その非天然アミノ酸は、ノル−ロイシン（Ｎｌｅｕ）又は
アミノ酸ベータ−アラニン（ｂｅｔａ−Ａｌａ）であり、これらは、タンパク質
の構成成分中に存在しない。また、タンパク質に共有でない構成成分であるその
他のアミノ酸も好ましい。

【００３９】Ｘは、タンパク質Ｍに、例えば安定なアミド結合により、当業者に既知の方法
に従って結合され得る。レポーターとして、前記の様な種類のアミノ酸を用いる
利点は、それらはタンパク質の天然の成分ではないので、分析にとって非常に都
合が良いということである。それらの存在は、ＰＥＧが存在していたこと、そし
てその量を示す。

【００４０】本発明の前記の好ましい態様のいくつかでは、Ｘが、安定なアミド結合により
Ｍに共有結合されたままで、選択的ＣＮＢｒ処理により、当該タンパク質からＦ
Ｅを除去することができる。

【００４１】当該接合体が下記の構造：ＦＥ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｍを有する場合、アミノ酸ＧｌｙがＭに結合されたままで、好ましくはヒドラジン
処理により、ＦＥを特異的に除去することができる。

【００４２】当該接合体が下記の構造：ＦＥ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｍを有する場合、ＰｒｏがＭに結合したままで、穏和な酸処理により、ＦＥを特異
的に除去することができる。

【００４３】本発明の前記の特定の態様では、Ｍと結合しているレポーター部分は、酸加水
分解に対して非常に安定であり、従って酸加水分解後に、標準的なアミノ酸分析
によって、そして加水分解されなかったレポーター部分を含むペプチドを分析す
る場合には、質量分析によって、容易に同定される。

【００４４】好ましくは、Ｍと結合しているレポーター部分は、Ｎｌｅ、ベータＡｌａ、Ｇ
ｌｙ又はＰｒｏの群中から選択される。より好ましくは、Ｍと結合しているレポ
ーター部分は、非天然アミノ酸Ｎｌｅ又はベータＡｌａから選択される。更によ
り好ましくは、そのレポーター部分はノルロイシンである。本発明では、特にＭｅｔ−Ｘを用いる場合、アミノ酸レポーター部分としてＮ
ｌｅ又はベータＡｌａを用いることが特に好ましい。

【００４５】本発明の主要な態様として、一般的に本発明の方法は、ＦＥ−Ｌ−Ｍという組
成を有する化合物を用いて、巨大分子上の連結部位を同定又は分析することから
成り、この方法は、特異的な物理化学的なＬの切断、それに続く、ＦＥの遊離、
除去及びクロマトグラフィーによる分離に基づいて、Ｍ部分上のＦＥの結合部位
を同定することによる。

【００４６】本発明の一般的方法の適合性は、非限定的な実施例により更に証明される（Ｐ
ＥＧ化されたノナペプチド及びインスリンの一次配列におけるＰＥＧの接合部位
の決定、ただしインスリンは１又は２個のアミノ基でＰＥＧ化されている）。

【００４７】本発明の特定の態様では、ポリペプチドがＰＥＧ−Ｍｅｔ−Ｎｌｅにより修飾
された。それにより、治療上適当なタンパク質であるリゾチームへのＰＥＧの接
合、その後のＣＮＢｒによるその完全な除去を説明する。本発明のいくつかの態様では、構造ＦＥ−Ｌの実例として、いくつかのＰＥＧ
ペプチド誘導体化合物を説明する。

【００４８】その中で下記のものを、実施例において説明として報告する：ＰＥＧ−Ｍｅｔ
−Ｎｌｅ，ＰＥＧ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ，ＰＥＧ−Ｍｅｔ−βＡｌａ，ＰＥＧ−Ｇｌ
ｎ−Ｇｌｙ，ＰＥＧ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ。これらの選択されたＰＥＧ誘導体化合物
を、その末端ＣＯＯＨで、文献に報告されている方法の一つ、すなわちヒドロキ
シスクシンイミジルエステル（ＯＳｕ）によって活性化し、その後代表的なポリ
ペプチド及びタンパク質に連結した。

【００４９】本発明の好ましい別の態様では、リゾチームを、ＯＳＵとして活性化したＰＥ
Ｇ−Ｍｅｔ−ＮｌｅによってＰＥＧ化し、次にそのポリマー部分をＣＮＢｒ処理
によって除去した。

【００５０】前記の選択された実施例の態様では、ＦＥ−Ｌ−Ｍ複合体を、接合後に、活性
化された未反応ポリマー及び未修飾のＭを除くために、ＨＰＬＣ又はＦＰＬＣに
より精製した。

【００５１】更なる過程として、Ｍのアミノ酸含量に対するレポーターのアミノ酸基の比率
を基にして、Ｍに結合しているポリマー鎖の数を評価するために、好ましくは、
酸加水分解後にアミノ酸分析により（並びに加水分解されていない誘導体の質量
分析により）、精製した接合体を調べ、その組成を定量した。

【００５２】更に、トリニトロベンゼンスルホネート（ＴＮＢＳ）の比色分析により、反応
しなかったアミノ基の数を評価するために、（そしてＰＥＧに特異的なヨウ素検
査により）、好ましい態様では、その存在を明かにするために、精製した接合体
を分析した。

【００５３】本発明の化合物及び方法を用いた場合、ＰＥＧを他の方法により活性化した場
合と同様に、全てのＦＥ−Ｌがポリペプチドに連結されたことが、分析により示
めされる。また、Ｍａｌｄｉ質量分析により評価された通り、分子量の増加は、
ポリペプチドの分子量からの、ＦＥ−Ｌの重量又はその複数分の重量の増加に一
致することも分かった。

【００５４】更に、ポリペプチド内のレポーターアミノ酸基の存在を、驚くことに、アミノ
酸分析により常に明かにして、そして定量的に評価することができた。得られた
数値は、アミノ基の比色分析評価を基にして計算された修飾数に一致した。

【００５５】最後に、全ての場合で、接合体はヨウ素に反応すること、そしてポリペプチド
のアミノ基の減少又は消失が、ＦＥ−Ｌの結合数に一致する程度で起こることが
分かった。

【００５６】本発明の方法では、前記方法によりＰＥＧを除去した後、そのＰＥＧを欠失し
たポリペプチドをゲル濾過により精製する。その場合、その重量の減少のために
、それはより多量の容量で溶出される。新しい溶出容量は、ＰＥＧ修飾する前の
Ｍの溶出容量にほぼ一致する。理論的には、そのわずかな差は、ＦＥの除去後に
Ｍに結合されたままであるレポーター基による重量増加のためである。

【００５７】本発明では、ＰＥＧの接合部位を同定するために、配列決定の過程、例えばエ
ドマン分解、還元及びカルボキシメチル化、又はタンパク質分解を用いることも
でき、より容易なレポーターアミノ酸の検出では、酸加水分解後のアミノ酸分析
により、又は可能な場合には、加水分解されていないペプチドの質量分析により
同定が行われる。この様な興味深い特性のいくつかを下記実施例及び図面により説明する。

【００５８】実施例１：ＭＰＥＧ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−ＯＨ（５０００Da）の合成無水塩化メチレン中に溶解したＭＰＥＧ−ＯＨ５０００（ただしＭＰＥＧはポ
リ（エチレングリコール）メチルエーテルのことである）を、pH８で４−ニトロ
−フェニルクロロホルメートと、等モル量のトリエチルアミンの存在下で反応し
て、ＭＰＥＧ−ｐ−ニトロフェニルカーボネートを得た。この生成物１ｇ（０．
１９mmol）を、５０％アセトニトリルの水溶液４ml中に溶解した２８３mg（１．
１４mmol）のＨ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−ＯＨ溶液に小量ずつ加え、そしてＴＥＡによ
りpH８に調整した。一晩撹拌した後、この混合反応液のpHを、固形のクエン酸に
より３に調整した。エーテル抽出により４−ニトロフェノールを除き、その後、
クロロホルムにより生成物を抽出した。その有機溶液を、固形の乾燥Ｎａ₂ＳＯ₄ により無水化し、そして減圧下で濃縮した。

【００５９】そのクロロホルムにジエチルエーテル２００mlを加えた後、その溶液を−２０
℃で１時間冷却し、分離された生成物を濾過により集め、そして真空下で乾燥し
た。更に、このＭＰＥＧ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−ＯＨを、ＱＡＥ−セファデックスＡ
５０カラム（２．５×５５cm）のイオン交換クロマトグラフィーにより、最初に
水で、次に１０mM ＮａＣｌ水溶液で溶出して精製した。この溶出分画を、ＰＥ
Ｇを検出するためにヨウ素検査により分析した。ＭＰＥＧ−ペプチドのナトリウ
ム塩を含んでいる分画を集め、酸性化し、そして凍結乾燥した。ＭＰＥＧ−ペプ
チドの収率は７０〜７５％であった。この生成物を、 ¹Ｈ−ＮＭＲ（２００MHz
；ＣＤＣｌ₃ ）により同定した。

【００６０】実施例２：ＭＰＥＧ−Ｍｅｔ−Ｎｌｅ−ＯＨ（５０００Da）の合成ＭＰＥＧ−Ｍｅｔ−ＯＨを得るために、ＭＰＥＧ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−ＯＨの調
製に関する実施例１に記載の方法に従って、ＭＰＥＧ５０００をＭｅｔ−ＯＨに
結合した。５２３mg（２．８８mmol）のＨ−Ｎｌｅ−ＯＭｅ及び等モル量のＴＥ
Ａ（４０１μｌ）を、３．７１ｇ（０．７２mmol）の合成したＭＰＥＧ−Ｍｅｔ
−ＯＨ、３０５mg（０．７２mmol）の１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリ
ノエチル）カルボジイミドメト−ｐ−トルエンスルホネート（ＣＭＣ）、及び９
７mg（０．７２mmol）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を含ん
でいる無水ジクロロメタン１０ｍｌ溶液に加えた。室温で３日間撹拌した後、こ
の混合液を、ジエチルエーテル２５０ml中に一滴ずつ加えた。

【００６１】その沈殿物を濾過により集め、そして真空下で乾燥した。更にこの生成物を、
ＱＡＥ−セファデックスＡ５０カラム（２．５×５５cm）のイオン交換クロマト
グラフィーにより、最初に水で、次に１０mM ＮａＣｌ水溶液で溶出して精製し
た。この分画を、ＰＥＧの存在を確認するためにヨウ素検査により分析した。Ｍ
ＰＥＧ−ペプチド−メチルエステル（ＭＰＥＧ−Ｍｅｔ−Ｎｌｅ−ＯＭｅ）を含
んでいる分画を集め、そして凍結乾燥した。この収率は９３％であった。この生
成物の構造を ¹Ｈ−ＮＭＲ（２００MHz ；ＣＤＣｌ₃ ）により確認した。

【００６２】Ｎｌｅのメチルエステルを、２０当量のＮａＯＨ１Ｎを含有するメタノール
溶液中で、室温で２日間撹拌することにより、加水分解した。その溶液のpHを、
１ＮＨＣｌにより２に調整し、そして生成物をクロロホルム中に抽出した。そ
のクロロホルム溶液を、固形の乾燥Ｎａ₂ＳＯ₄により無水化し、そして減圧下で
濃縮した。激しく撹拌しながら、ジエチルエーテル２００mlを加え、生成した固
形物を濾過により集め、そして真空下で乾燥した。ＭＰＥＧ−Ｍｅｔ−Ｎｌｅ−
ＯＨの収率は６７％であった。この生成物を、 ¹Ｈ−ＮＭＲ（２００MHz ；ＣＤ
Ｃｌ₃ ）により同定した。このスペクトルを図１に示す。

【００６３】実施例３：ＭＰＥＧ−Ｍｅｔ−Ｎｌｅ−ＯＨ（１００００Da）の合成分子量１００００のＭＰＥＧ−ＯＨから始めて、実施例２の通りに、この生成
物を調製した。

【００６４】実施例４：（ＭＰＥＧ−Ｍｅｔ−Ｎｌｅ）₂ −ノナペプチドの合成ＭＰＥＧ−Ｍｅｔ−Ｎｌｅ−ＯＨの末端ＣＯＯＨを、アミノ酸スペーサーとし
てのＮｌｅを有するＭＰＥＧに関する文献に既に報告された方法に従って（Appl
ied Biochemistry and Biotechnology, 27, 45-54, 1991）、ヒドロキシスクシ
ンイミジルエステル（ＭＰＥＧ−Ｍｅｔ−Ｎｌｅ−ＯＳｕ）として活性化した。

【００６５】下記の構造：Ｎｐｓ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｔｙｒ（
ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｙｓ−（Ｂｏｃ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ
−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨを有する、固相合成法により得られた、完全に保護されたノナペプチドを、トリ
フルオロ酢酸及びジクロロメタンの１：１混合液中で、室温で２時間放置するこ
とにより、脱保護化した。この溶液を濃縮して乾燥させ、そして０℃でジエチル
エーテル中で抽出を繰り返し行うことにより、Ｎｐｓ基を除去した。最後にこの
生成物を、真空下で１２時間、ＫＯＨ上で乾燥した。完全に脱保護されたこのペ
プチドの収率は９０％であった。

【００６６】４３mg（４．０μmole）のＭＰＥＧ−Ｍｅｔ−Ｎｌｅ−ＯＳｕを、１mlのＤＭ
ＳＯ中に溶解した脱保護化ノナペプチド０．９mg（０．８μmol）に、ＴＥＡに
よりpH８に調整して、小量ずつ加えた（ノナペプチド：ＭＰＥＧ−Ｍｅｔ−Ｎｌ
ｅ−ＯＳｕのモル比＝１：５）。室温で３日間撹拌した後、その反応混合液のpH
を１ＮＨＣｌで３に調整し、そしてその生成物をクロロホルム中に多数回抽出
した。そのクロロホルム溶液を固形の乾燥Ｎａ₂ＳＯ₄により無水化し、そして濃
縮して乾燥させた。

【００６７】更にこの接合体を、Ｓｈｉｍａｄｚｕ社の半調製的なＨＰＬＣシステムにおい
て、逆相Ｖｙｄａｃ２１８ＴＰ５４カラム（Ｃ₁₈結合相、０．４６×２５cm
i.d.，５μｍ粒子直径）により、０．０５％トリフルオロ酢酸の水溶液と０．０
５％トリフルオロ酢酸のアセトニトリル溶液との直線勾配により精製した。２８
０nm波長の吸光を監視した。その生成物の特性を、ＭＰＥＧを検出するためのヨ
ウ素検査及びアミノ酸分析により評価した。

【００６８】実施例５：ＭＰＥＧ−Ｍｅｔ−Ｎｌｅ−インスリンの合成実施例４の記載通りに調製した８．６mg（１μmol）のＭＰＥＧ−Ｍｅｔ−Ｎ
ｌｅ−ＯＳｕを、ＤＭＳＯ１ml中に溶解したウシインスリン６mg（１μmol）
に加え（インスリンのアミノ基：ＭＰＥＧのモル比＝３：１）、そしてこの混合
液を室温で５時間撹拌した。その接合体を、Ｓｈｉｍａｄｚｕ社の半調製的なＨ
ＰＬＣシステムにおいて、逆相Ｖｙｄａｃ２１８ＴＰ１０２２カラム（Ｃ₁₈結
合相、２．２×２５cm i.d.，１０μｍ粒子直径）により、０．０５％トリフル
オロ酢酸の水溶液と０．０５％トリフルオロ酢酸のアセトニトリル溶液との直線
勾配により、２８０nm波長の吸光を測定しながら、精製した。

【００６９】インスリン接合体を含んでいる主要な溶出ピーク分画を集め、そして凍結乾燥
した。その生成物の評価では、アミノ基の比色分析により、インスリン内の１つ
のアミノ残基の損失が示され、そして酸加水分解後のアミノ酸分析により、イン
スリンあたり１つのＮｌｅが存在することが明かにされ、その結果インスリン分
子あたり１つのポリマー鎖が結合していることが支持された。

【００７０】実施例６：（ＭＰＥＧ−Ｍｅｔ−Ｎｌｅ）₂ −インスリンの合成実施例４の記載通りに調製した１７mg（２μmol）のＭＰＥＧ−Ｍｅｔ−Ｎｌ
ｅ−ＯＳｕを、ＤＭＳＯ１ml中に溶解したウシインスリン６mg（１μmol）に
加えた（インスリンのアミノ基：ＭＰＥＧのモル比＝３：２）。室温で５時間撹
拌した後、その生成物を、ＭＰＥＧ−Ｍｅｔ−Ｎｌｅ−インスリンに関する実施
例５の記載通りに逆相ＨＰＬＣにより精製した。インスリン接合体を含んでいる
主要な溶出ピーク分画を集め、そして凍結乾燥した。その接合体の評価では、ア
ミノ基の比色分析により、２つのアミノ残基の損失が示され、そして酸加水分解
後のアミノ酸分析により、インスリンあたり２つのＮｌｅが存在することが確認
され、その結果インスリン分子あたり２つのＰＥＧ部分が結合していることが示
された。

【００７１】実施例７：ＣＮＢｒによる（ＭＰＥＧ−Ｍｅｔ−Ｎｌｅ）₂ −ノナペプチドの反
応実施例４の記載通りに得られた１mg（８５．２μmol）の（ＭＰＥＧ−Ｍｅｔ
−Ｎｌｅ）₂ −ノナペプチドを、７０％ギ酸水溶液中で１００当量のＣＮＢｒに
より（Methods in Enzymology, pp. 238-254, 1967に従って）処理した。室温で
２４時間放置した後、その混合液を１０倍量の水中に注ぎ、そして凍結乾燥した
（この行程を２回繰り返した）。得られた生成物を、Ｓｈｉｍａｄｚｕ社の分析
的ＨＰＬＣシステムにおいて、逆相Ｖｙｄａｃ２１８ＴＰ５４カラム（Ｃ₁₈結
合相、０．４６×２５cm i.d.，５μｍ粒子直径）により、０．０５％トリフル
オロ酢酸の水溶液と０．０５％トリフルオロ酢酸のアセトニトリル溶液との直線
勾配により、分析した。

【００７２】その溶出パターンから、ＰＥＧ−ペプチド接合体の溶出時間３６．３分から、
ＣＮＢｒにより処理された前記接合体の溶出時間１５．８分への移動が示された
。後者の数値は、ペプチド単独の数値（１６．４分）に近かった。このことから
、ＰＥＧ部分が除去されたことが示めされた。酸加水分解後のアミノ酸分析及び
質量分析により、ペプチド分子あたり２つのＮｌｅ残基が存在することが明かに
された。このことは、レポーター基としてのＮｌｅがポリペプチドに結合された
まま、当該分子からＰＥＧを除去する当該方法の有効性を示している。

【００７３】実施例８：ポリマーの除去後の、異なって修飾されたインスリン試料に結合して
いたポリマー鎖の数の評価実施例５及び６の記載通りに得られた、１又は２本のＭＰＥＧ−Ｍｅｔ−Ｎｌ
ｅ鎖を有するインスリン接合体に相当する生成物を、７０％ギ酸水溶液中でＣＮ
Ｂｒにより処理した。インスリン含量とＣＮＢｒとのモル比は１：２００であっ
た。室温で２４時間撹拌した後、その混合液を１０倍量の水中に注ぎ、そして凍
結乾燥した。この行程を２回繰り返した。

【００７４】得られた生成物を、Ｓｈｉｍａｄｚｕ社の分析的ＨＰＬＣシステムにおいて、
逆相Ｖｙｄａｃ２１８ＴＰ５４カラム（Ｃ₁₈結合相、０．４６×２５cm i.d.
，５μｍ粒子直径）により、０．０５％トリフルオロ酢酸の水溶液と０．０５％
トリフルオロ酢酸のアセトニトリル溶液との直線勾配により、分析した。その溶
出パターンから、１又は２本のＰＥＧ鎖を有するＰＥＧ−インスリン接合体の各
溶出時間２２．２分及び２３．２分から、ＣＮＢｒにより切断された前記生成物
の各溶出時間１８．９分及び１９．２分への移動が示された。後者の数値は、ペ
プチド単独の数値（１８．３分）に近く、これらのことから、ＰＥＧ部分が除去
されたことが示めされた（図２，３及び４）。

【００７５】質量分析から、モノ誘導化インスリン（ＭＰＥＧ−Ｍｅｔ−Ｎｌｅ−インスリ
ン）から始めた場合には、１分子のインスリンと１残基のＮｌｅとの合計質量が
、そして（ＭＰＥＧ−Ｍｅｔ−Ｎｌｅ）₂ −インスリンの場合には、１分子のイ
ンスリンと２残基のＮｌｅとの合計質量が認められた（図５）。これらの質量ス
ペクトルパターンは、当該接合体（実施例５及び６）の分析において得られたパ
ターンよりもはるかに明確であった。なぜならポリマーの存在により、その多分
散系のために、スペクトル及びその解釈がより困難且つ不正確になるからである
。

【００７６】更に、それらの値をアミノ酸分析により確認し、従って試料中でインスリン分
子あたり１又は２個のＮｌｅ残基が存在することが判明した。これらの全てのデータは、Ｎｌｅが結合されたまま、当該分子からＰＥＧを除
去し得る可能性を支持し、従って本方法の有効性を証明する。

【００７７】実施例９：Ｎｌｅ−インスリンの還元及びカルボキシメチル化実施例８の記載通りにＭＰＥＧ−Ｍｅｔ−Ｎｌｅ−インスリンから得られた、
５００μｇ（０．０８μmol）のＮｌｅ−インスリンを、２mM ＥＤＴＡ及び６
ＭＧｄｎ−ＨＣｌを含有するＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液、pH７．５、２５０μｌ
中に溶解し、そして３．８mgの１，４−ジチオ−Ｌ−トレイトール（ＤＴＴ）を
加え、そしてこの混合液を３７℃で２時間放置した。最後に９．２mgのヨードア
セトアミドを加え、そしてこの混合液を３７℃で１時間放置した。この溶液を凍
結乾燥し、そしてその生成物を、Ｓｈｉｍａｄｚｕ社の半調製的なＨＰＬＣシス
テムにおいて、逆相Ｖｙｄａｃ２１８ＴＰ５４カラム（Ｃ₁₈結合相、０．４６
×２５cm i.d.，５μｍ粒子直径）により、０．０５％のトリフルオロ酢酸の水
溶液と０．０５％のトリフルオロ酢酸のアセトニトリル溶液との直線勾配により
、分画した。

【００７８】溶出した生成物を２２６nm波長の吸光により監視し、インスリンのα鎖及びβ
鎖に対応する２つの主要なピークの存在が認められ、それらが分離及び回収され
た。酸加水分解後のアミノ酸分析により、β鎖ピークのアミノ酸中に付加的なア
ミノ酸としてＮｌｅが認められた。エドマン分解（Protein Practical Chemistr
y, pp. 371-373, 1986による）により、最初の過程でＰｈｅ及びＮｌｅが放出さ
れた。このことは、αアミノ基が遊離していたこと、従ってＰＥＧはβ鎖の²⁹Ｌ
ｙｓに結合していたことを示す。更に質量分析により、１残基のＮｌｅの質量の
増加が、β鎖のみに認められたことが示された。

【００７９】実施例１０：Ｎｌｅ₂ −インスリンの還元及びカルボキシメチル化実施例８の記載通りにＭＰＥＧ−Ｍｅｔ−Ｎｌｅ−インスリンから得られた、
６００μｇ（０．１μmol）のＮｌｅ₂ −インスリンを、２mM ＥＤＴＡ及び６
ＭＧｄｎ−ＨＣｌを含有するＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液、pH７．５、２００μｌ
中に溶解し、そしてこの混合液に７．６mgの１，４−ジチオ−Ｌ−トレイトール
（ＤＴＴ）を加え、そして３７℃で３時間放置した。最後に１８．５mgのヨード
アセトアミドを加え、そして３７℃で１時間放置した。

【００８０】この溶液を凍結乾燥し、Ｎｌｅ−インスリンに関する実施例９の記載通りに、
その生成物を単離及び分析した。酸加水分解後のアミノ酸分析により、アミノ酸
Ｎｌｅは、α鎖及びβ鎖の両方に存在することが分かった。更に質量分析により
、両方の鎖において、１残基のＮｌｅに相当する重量の増加が認められた。これ
らのデータは、実施例６の条件下で、両方の鎖にＰＥＧ化が起きたことを示す。

【００８１】実施例１１：ＭＰＥＧ−Ｍｅｔ−Ｎｌｅ−リゾチームの合成４２．２mg（７．８μmol）のＭＰＥＧ−Ｍｅｔ−Ｎｌｅ−ＯＳｕを、少量ず
つ且つ撹拌しながら、０．２Ｍホウ酸塩緩衝液、pH８．５，１ml中に溶解した３
．７５mg（０．２６μmol）の卵白由来のリゾチームに加えた。リゾチームのア
ミノ基：ＭＰＥＧのモル比は１：５であった。３０分間撹拌した後、その接合体
を、半調製的なＦＰＬＣシステムにおいて、ゲル濾過Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２^TM カラム（１．５×２５cm）により、０．０１Ｍリン酸塩緩衝液及び０．１５Ｍ
ＮａＣｌ，pH７．２により溶出して精製した。それらの分画を、リゾチーム溶出
に関して２８０nmでの吸光により、そしてＰＥＧ検出に関してヨウ素検査により
分析した。

【００８２】修飾されたリゾチームを含んでいる分画を集め、そしてＹＭ３膜（カットオフ
３０００）を用いたアミコン系の限界濾過により、小量に濃縮した。その濃縮溶
液を水で希釈し、そして限界濾過した。この行程を繰り返して塩を除き、最終的
に生成物を凍結乾燥した。比色によるアミノ基検査により、修飾率が８７％と計
算された。酸加水分解後のアミノ酸分析により、Ｎｌｅ含量に基づいて、同様の
数値が得られた。質量分析による修飾率の定量評価は信頼できるものではなかっ
た。

【００８３】実施例１２：ＣＮＢｒによるＭＰＥＧの遊離、及びＮｌｅ−リゾチームの単離実施例１１の記載通りに得られた０．０４μmol の修飾リゾチームを、７０％
ギ酸水溶液中で６００当量のＣＮＢｒにより処理し、そして室温で２４時間撹拌
した。この混合液を水５０ml中に注ぎ、そして凍結乾燥した（この行程を２回繰
り返した）。その生成物を、ＦＰＬＣシステムのゲル濾過により、クロマトグラ
フィーのパターンを比較するために、実施例１１で報告したポリマー修飾リゾチ
ームにおいて用いたものと同一のカラム及び溶液条件により分析した。

【００８４】その結果、リゾチームの溶出ピークは、ポリマー接合時にはより早い位置に出
現し、そしてＣＮＢｒ処理後には、元々のリゾチームの溶出容量の位置近くに移
動することが分かった。相応して、ＴＮＢＳにより滴定されたアミノ基は、ポリ
マーによりリゾチームが修飾された場合には約１０％に減少し、ＣＮＢｒにより
処理した後には、未修飾リゾチームの場合の数値に回復した（図６）。

【００８５】質量スペクトルパターンもまた、６残基のＮｌｅが増加したリゾチームの重量
として、非常に明確且つ容易に説明された。アミノ酸分析によっても、Ｎｌｅの
量が、ＴＮＢＳ検査及び質量分析によって評価した量に近いことが分かった。こ
れらの全てのデータは、タンパク質にＰＥＧが接合していること、ＣＮＢｒ処理
によりそれが除去されるが、Ｎｌｅはレポーターアミノ酸としてタンパク質に結
合したままであることを支持する。

【００８６】実施例１３０．１Ｍホウ酸緩衝液、pH７．８，４ml中に溶解された１５mgのインターフェ
ロンα−２ｂを、１００mgのＰＥＧ−Ｍｅｔ−Ｎｌｅ−ＯＳｕ（１００００Daの
直線状又は分枝状ＰＥＧ）と反応した。室温で２時間放置した後、その溶液をpH
６に調整し、限界濾過により濃縮し、そしてゲル濾過カラムＳｕｐｅｒｄｅｘ
２００にかけた。少量の未修飾タンパク質の他に、異なって修飾されたインター
フェロンの２つのピークが得られた。

【００８７】ＰＥＧ修飾タンパク質のピークには、生物学的抗ウイルス活性の大部分が維持
されていた。そのタンパク質を凍結乾燥により回収し、そして実施例１２の記載
通りにＢｒＣＮにより処理した。いずれの場合でも、この接合タンパク質からＰ
ＥＧが遊離することにより、溶出容量が増加し、その新しい容量は、未接合型の
容量に一致した。このことは、実施例１２の記載通り、その接合体からＰＥＧが
遊離したことを示す。

【００８８】実施例１４実施例１３に記載の方法に従って、ただし２００００Daの直線状又は分枝状の
ＰＥＧ−Ｍｅｔ−Ｎｌｅ−ＯＳｕを用いて、インターフェロンα−２ｂを修飾し
た。またこの実験では、ペプチドアームとしてＭｅｔ−βＡｌａを有するＰＥＧ
２００００Daも用いた。いずれの場合でも、生物学的に活性な生成物が得られた。更にＢｒＣＮ処理に
より、ＰＥＧを欠失したタンパク質が遊離し、そのタンパク質には、レポーター
基としてＮｌｅ又はβＡｌａが結合していた。

【００８９】実施例１５実施例１３及び１４の方法に従って、Ｇ−ＣＳＦに、１００００Da又は２００
００Daの直線状又は分枝状のＰＥＧ−Ｍｅｔ−Ｎｌｅ−ＯＳｕを接合した。また
ＰＥＧ−Ｍｅｔ−βＡｌａも接合に用いた。いずれの場合でも、生物学的に活性なタンパク質が得られた。ＢｒＣＮ処理に
よりＰＥＧを除くことができ、レポーターアミノ酸としてＮｌｅ又はβＡｌａが
タンパク質に結合したまま残った。

【００９０】実施例１６実施例１５の記載に従って、糖タンパク質エリトロポエチンをＰＥＧ−Ｍｅｔ
−Ｎｌｅ又はＰＥＧ−Ｍｅｔ−βＡｌａにより修飾した。この場合も、この接合
タンパク質は活性を有しており、ＢｒＣＮ処理によるＰＥＧの遊離が達成された
。

【００９１】実施例１７実施例１に記載したものと同様な方法に従って、ＭＰＥＧ−ＯＨ５０００及
びＨ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＯＨから、ＭＰＥＧ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＯＨを調製し、
次にこれを、スクシンイミドにより活性化されたエステルＭＰＥＧ−Ｇｌｎ−Ｇ
ｌｙ−ＯＳｕに変換した。

【００９２】実施例１８実施例５に記載したものと同様な方法に従って、実施例１７に記載の活性化エ
ステルを用いて、生物学的に活性な接合体ＭＰＥＧ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−インスリ
ンを調製した。この接合体は、生物学的な活性を示し、そして伝統的なヒドラジ
ン処理により、結合されたＧｌｎ−Ｇｌｙの位置で選択的に切断された。

【００９３】実施例１９実施例１に記載したものと同様な方法に従って、ＭＰＥＧ−ＯＨ５０００及
びＨ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−ＯＨから、ＭＰＥＧ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−ＯＨを調製し、
次にこれを、スクシンイミドにより活性化されたエステルＭＰＥＧ−Ａｓｐ−Ｐ
ｒｏ−ＯＳｕに変換した。

【００９４】実施例２０実施例５に記載したものと同様な方法に従って、実施例１９に記載の活性化エ
ステルを用いて、生物学的に活性な接合体ＭＰＥＧ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−インスリ
ンを調製した。この結合体は、生物学的な活性を示し、そして伝統的な穏和な酸
処理により、結合されたＧｌｎ−Ｇｌｙの位置で選択的に切断された。

【００９５】略記Ａｓｐアスパラギン酸ＢｏｃＮ−ｔｅｒｔ−ブドキシカルボニルＣＭＣ１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミドメト−ｐ−トルエンスルホネートＤＭＳＯジメチルスルホキシドＤＴＴ１，４−ジチオ−Ｌ−トレイトールＥＤＴＡエチレンジアミン四酢酸ＦＰＬＣ急速タンパク質液体クロマトグラフィーＧｄｎ−ＨＣｌグアニジン塩酸ＨＯＢｔ１−ヒドロキシベンゾトリアゾールＨＰＬＣ高性能液体クロマトグラフィーＬｅｕロイシンＬｙｓリシンＭｅｔメチオニンＭＰＥＧ又はｍＰＥＧポリ（エチレングリコール）メチルエーテルＮｌｅノルロイシンＮＭＲ核磁気共鳴Ｎｐｓ２−ニトロフェニルスルフェニルＯＭｅメトキシＯＳｕスクシンイミジルオキシＯｔＢｕｔｅｒｔ−ブトキシＰＡｃＭポリアクリロイルモルホリンＱＡＥ第四アミノエチルＳｅｒセリンｔＢｕｔｅｒｔ−ブチルＴＥＡトリエチルアミンＴｈｒトレオニンＴＮＢＳ２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸ＴＲＩＳ−ＨＣｌトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸ＴｙｒチロシンＶａｌバリン

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ＣＤＣｌ₃ 中でのＭＰＥＧ−Ｍｅｔ−Ｎｌｅ−ＯＨの ¹Ｈ−ＮＭＲス
ペクトルを示す。

【図２】図２は、天然インスリンのＨＰＬＣによる溶出を示す。

【図３】図３は、ａ）ＭＰＥＧ−Ｍｅｔ−Ｎｌｅ−インスリンのＨＰＬＣによる溶出；
ｂ）ＣＮＢｒによるＭＰＥＧ−Ｍｅｔ−Ｎｌｅ−インスリンの切断から得られた
Ｎｌｅ−インスリンのＨＰＬＣによる溶出を示す。

【図４】図４は、ａ）（ＭＰＥＧ−Ｍｅｔ−Ｎｌｅ）₂ −インスリンのＨＰＬＣによる
溶出；ｂ）ＣＮＢｒによる（ＭＰＥＧ−Ｍｅｔ−Ｎｌｅ）₂ −インスリンの切断
から得られた（Ｎｌｅ）₂ −インスリンのＨＰＬＣによる溶出を示す。

【図５】図５は、ａ）ＣＮＢｒによるＭＰＥＧ−Ｍｅｔ−Ｎｌｅ−インスリンの切断か
ら得られたＮｌｅ−インスリンのＭａｌｄｉ質量スペクトル；ｂ）ＣＮＢｒによ
る（ＭＰＥＧ−Ｍｅｔ−Ｎｌｅ）₂ −インスリンの切断から得られた（Ｎｌｅ） ₂ −インスリンのＭａｌｄｉ質量スペクトルを示す。

【図６】図６は、ａ）天然のリゾチーム；ｂ）ＭＰＥＧ−Ｍｅｔ−Ｎｌｅ−リゾチーム
；ｃ）ＣＮＢｒによるＭＰＥＧ−Ｍｅｔ−Ｎｌｅ−リゾチームの切断から得られ
たＮｌｅ−リゾチーム、の各クロマトグラフィーパターンを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者カリチェッティ，パオロイタリア国，イ−35128 パドバ，156／セー，ビアガッタメラータ (72)発明者オルソリーニ，ピエロスイス国，セアッシュ−1920 マルティニュイ，カースポスタール 368，ルートデュルバン，146 Ｆターム(参考） 2G045 BA13 FB06 JA20 4C076 CC29 EE01 EE13 EE30 EE59 FF31 FF63 FF68 4H045 AA10 AA30 BA40 BA56 DA13 DA15 DA37 DA89 EA20 FA20

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の一般式（Ｉ）：ＦＥ−Ｌ−Ｍ（Ｉ）を有する、生物学的に活性な接合誘導体：ただし前記式中、Ｍは、タンパク質、ペプチド及びポリペプチドから成る群から選択される生物学
的に活性な分子に対応する基であり、ＦＥは、機能付与性物質であり；そしてＬは、標準的な分析方法により検出可能なレポーター部分を有する連結アームで
あり、ただしその連結アームは、インビトロでの化学処理又は酵素処理によって
切断され得るものであり、そしてそのレポーター部分は、連結アームが切断され
た後も、前記の生物学的に活性な分子に結合し続けるものである。
【請求項２】前記の機能付与性物質ＦＥが、ＰＥＧ、ＰＶＰ、ＰａｃＭ、
デキストラン、ホルモン、抗体又は抗体断片の中から選択される、請求項１に記
載の生物学的に活性な接合誘導体。
【請求項３】前記の機能付与性物質ＦＥが、２Kd〜５０Kdの範囲の分子量
を有するポリマーである、請求項１又は２のいずれかに記載の生物学的に活性な
接合誘導体。
【請求項４】前記の機能付与性物質ＦＥが、直線状ポリマーである、請求
項３に記載の生物学的に活性な接合誘導体。
【請求項５】前記の機能付与性物質ＦＥが、分枝状ポリマーである、請求
項３に記載の生物学的に活性な接合誘導体。
【請求項６】前記の連結アームＬが、断片Ｍｅｔ−Ｘを含んで成り、その
Ｘが前記のレポーター部分であり、そしてそのレポーター部分がアミノ酸である
、請求項１〜５のいずれかに記載の生物学的に活性な接合誘導体。
【請求項７】前記アミノ酸Ｘが、Ｎｌｅ及びベータＡｌａの中から選択さ
れる、請求項６に記載の生物学的に活性な接合誘導体。
【請求項８】前記の連結アームＬが、ジペプチドＧｌｎ−Ｇｌｙを含んで
成る、請求項１〜５のいずれかに記載の生物学的に活性な接合誘導体。
【請求項９】前記の連結アームＬが、ジペプチドＡｓｐ−Ｐｒｏを含んで
成る、請求項１〜５のいずれかに記載の生物学的に活性な接合誘導体。
【請求項１０】前記の生物学的に活性な分子が、インスリン、リゾチーム
、インターフェロン、エリトロポエチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＨの中から選択される
タンパク質である、請求項１〜９のいずれかに記載の生物学的に活性な接合誘導
体。
【請求項１１】請求項１に記載の生物学的に活性な薬物接合誘導体におい
て、その生物学的に活性な分子Ｍ上で、機能付与性物質ＦＥの結合部位を同定す
る方法であって、連結アームＬのインビトロでの特異的な化学的又は酵素的な切
断、ＦＥの遊離、除去及び伝統的方法による分離を含んで成る、前記方法。
【請求項１２】請求項１に記載の生物学的に活性な接合体を調製するため
の、下記の一般式（II）：ＦＥ−Ｌ（II）を有する中間体化合物：ただし前記式中、ＦＥは機能付与性物質であり、そしてＬは、標準的な分析方法により検出可能なレポーター部分を有する連結アームで
ある。