ES2233107T3 - Conjugados biologicamente activos que contienen una fraccion reportera detectable y procedimiento para identificar dicho derivado. - Google Patents
Conjugados biologicamente activos que contienen una fraccion reportera detectable y procedimiento para identificar dicho derivado.Info
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Abstract
Derivado conjugado biológicamente activo que presenta la siguiente fórmula general (I): FE-L-M (I); en la que: M representa el radical correspondiente de una molécula biológicamente activa seleccionada de entre el grupo que consta de proteínas, péptidos y polipéptidos; FE representa una entidad funcionalizante seleccionada de entre PEG, PVP, PacM, dextrano, hormonas, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos; y L representa un brazo enlazante que consta de un dipéptido seleccionado de entre Met-Nle, Met-âAla, Gln-Gly, y Asp-Pro, el cual puede ser cortado mediante tratamiento químico para dejar Nle, âAla, Gly o Pro, respectivamente, como grupo reportero unido a M.
Description
Conjugados biológicamente activos que contienen
una fracción reportera detectable y procedimiento para identificar
dicho derivado.
La presente invención se refiere a un derivado
conjugado, en particular un derivado conjugado polimérico, de una
molécula biológica activa tal como una proteína, un péptido, un
polipéptido. La presente invención se refiere asimismo a un
procedimiento de identificación química de dicho derivado
conjugado.
El conjugado de la invención presenta un brazo
enlazante que consta de un dipéptido seleccionado de entre
Met-Nle, Met-\betaAla,
Gln-Gly, y Asp-Pro.
Aunque gracias a la ingeniería genética
actualmente se sintetiza un gran número de péptidos y proteínas
nuevas con actividades farmacológicas potencialmente útiles, sus
potenciales terapéuticos se encuentran frecuentemente limitados
drásticamente por las propiedades negativas intrínsecas a su
estructura química. Por ejemplo, los polipéptidos, una vez
administrados, frecuentemente pueden ser cortados fácilmente por
endo- o exo-proteasas, ser excretados rápidamente
por filtración renal, y frecuentemente pueden provocar reacciones
inmunológicas, a pesar de poseer secuencias humanas. Además, el
tamaño y naturaleza de la macromolécula pueden dictar una diana en
el cuerpo que no siempre resulta ser la deseada para su acción
terapéutica.
Se ha constatado que la conjugación en la
superficie proteica de polímeros biocompatibles, no tóxicos, no
inmunogénicos, solubles en agua, resulta ser un procedimiento que
puede reducir estos problemas y permite, en algunos casos,
aplicaciones terapéuticas útiles. Un polímero que se utiliza
frecuentemente para tal conjugación es el
poli(etilen-glicol) (PEG) debido en parte a
sus propiedades biológicas muy favorables, (ver
"Poly(ethylene glycol) chemistry and biological
application" M.J. Harris Ed. Plenum Press (1994), (incorporado en
la presente memoria como referencia)) así como también el dextrano,
albúmina, poli(N-vinilpirrolidona), y
poli(N-acriloilmorfolina, entre otros. "New
synthetic polymers for enzyme and liposome modification
Poly(ethylene glycol)", p. 182, ACS Symp Series 680, 1997,
también da a conocer algunos de los últimos polímeros.
Las proteínas y péptidos también han sido
conjugados a anticuerpos y otros ligandos de alta afinidad con el
propósito de dirigirlos a un sitio específico en el interior del
cuerpo.
Se han encontrado varios residuos aminoacídicos
en las proteínas que resultan apropiados para la conjugación de
polímeros, incluyendo, por ejemplo, los grupos amino de la lisina y
los grupos alfa amino terminales. Se ha tenido en cuenta el grupo
tiol de la cisteína, el grupo guanidino de la arginina y el grupo
carboxílico terminal, así como también el grupo carboxílico de los
ácidos aspártico o glutámico. Los estudios y metodologías descritas
para la modificación de los grupo amino de proteínas incluyen los
estudios de Davies y Abuchowski (Abuchowski et al., 1977a y
1977b), los de Benchamp et al., 1983, Veronese et al.,
1985, Zalipsky et al., 1983, Delgrado et al., 1990. La
modificación del grupo SH de proteínas se describe en el trabajo de
Morpurgo et al., 1996, mientras que la modificación de
guanidino ha sido descrita por Pande et al. Los residuos
polisacarídicos, cuando se encuentran en las proteínas, se han
explotado más raramente, y principalmente, para unión. Sin embargo,
de entre estos residuos, la conjugación a los grupos amino es, con
diferencia, la más importante.
A pesar del estado actual del conocimiento
referente a la conjugación de polímeros en preparaciones de
profármacos, sigue siendo cierto que puesto que en polipéptidos y
proteínas todos estos grupos se encuentran presentes en un número
que puede ser muy elevado, (y además los propios grupos presentan
diferentes exposiciones a la superficie de la macromolécula, o
poseen diferente nucleofilicidad), generalmente se obtiene un patrón
de productos heterogéneo y complejo. Hasta el momento, ha resultado
muy difícil determinar con éxito la posición de la conjugación del
polímero en la secuencia primaria de la proteína.
Esta dificultad se agrava por el hecho de que
resulta extremadamente difícil, si no imposible, en la mayoría de
los casos, fraccionar los diferentes conjugados a partir de la
mezcla de conjugación, incluso cuando se utilizan los procedimientos
más sofisticados disponibles en la actualidad. La disposición de la
molécula de proteína puede enmascarar los cambios en la superficie
proteica, reduciendo así la unión a resinas de intercambio iónico,
así como también la selectividad de unión a ligandos de afinidad, y
reduce el potencial de varios procedimientos, incluyendo la
cromatografía de filtración en gel, en la realización de esta
tarea.
En la literatura se han descrito varios enfoques
sobre la identificación del sitio de conjugación, especialmente
cuando la especie de conjugación es un polímero de elevado peso
molecular.
Un enfoque se basa en la comparación de las
huellas, obtenidas por HPLC, en el caso del producto conjugado con
PEG respecto a las obtenidas en el caso del polipéptido nativo no
conjugado. Aunque se obtuvo cierta información sobre los sitios de
unión en base a la identificación de los péptidos PEG ausentes en la
digestión tríptica del conjugado, esta información se basaba en la
presunción de que la tripsina no actúa en los sitios de unión del
PEG o en sus alrededores inmediatos, y que no se produce la
liberación de los péptidos correspondientes.
Aunque este enfoque resultó útil en el estudio
del péptido de la hormona de crecimiento (Ross Clark et al.,
J. Biol. Chem. 271, 21969-21977, 1996), no
siempre se puede considerar concluyente ya que se basa en una
evidencia indirecta, y se basa en un procedimiento que puede
proporcionar información sobre el sitio de unión del PEG solo en el
caso de polipéptidos relativamente cortos que dan lugar a patrones
simples de digestión proteolítica.
Otro enfoque se basó en la "PEGilación" de
la proteína con un polímero que lleva un brazo de ácido succínico
entre el PEG y la proteína. El ácido succínico se unía al PEG
mediante una función éster lábil y a la proteína mediante una amida
estable. Las cadenas de PEG se extraían de la proteína mediante una
hidrólisis básica suave de la unión éster lábil que une el PEG al
ácido succínico, dejando una fracción de ácido succínico, como grupo
reportero, unida a los residuos a los que se había unido el PEG,
identificando después los péptidos marcados mediante
espectrofotometría de masas (M.M. Vestling et al., Drug
Metab. Disp. 21, 911-917). Este procedimiento
presenta por lo menos dos limitaciones importantes: la primera
reside en la química del enlace del PEG a la proteína, por lo que
generalmente se considera que la química no es apropiada o
conveniente para productos de uso humano, puesto que el enlace éster
entre el PEG y el ácido succínico puede ser cortado fácilmente en la
circulación fisiológica, dando lugar a productos nuevos; la segunda
limitación reside en el hecho de que la identificación del péptido
marcado con ácido succínico, en el mapa peptídico, únicamente se
puede realizar mediante espectrofotometría de masas. El análisis de
aminoácidos estándar, que representa el procedimiento habitual para
los estudios de secuencia, no se puede aplicar en tal caso ya que
durante la fuerte hidrólisis ácida que debe realizarse antes de la
identificación de aminoácidos (AAA), la fracción de ácido succínico
se separa del aminoácido al que estaba unida. Por esta razón, el
procedimiento AAA más preciso no permite identificar los péptidos a
los que se unía el ácido succínico. Además, el carácter débil de la
misma unión impide el uso de otros procedimientos importantes de
análisis de
secuencias.
secuencias.
La patente US nº 5.286.637 (Veronese et
al.,) presentada el 15 de Febrero, 1994, también describe un
enfoque y un procedimiento que utiliza M-PEG. El
procedimiento de dicha invención se basa en la unión de un brazo
espaciador aminoacídico o peptídico de varias estructuras y
propiedades con la función hidroxilo de monoalcoxipolietilenglicol a
través de una unión de carbonato que implica al grupo NH_{2} del
aminoácido o péptido. Esta reacción es seguida de la activación de
la función COOH del brazo espaciador aminoacídico o peptídico como
succinimidil éster, el cual adquiere de ese modo la capacidad de
reaccionar con el grupo amino del péptido, proteína o fármaco
biológicamente activo. La utilización de este procedimiento presenta
la desventaja, común entre todos los procedimientos de conjugación
de cadenas de PEG, de impedir la utilización de la mayoría de los
procedimientos, sino todos, de fraccionamiento del producto
conjugado, así como también un fraccionamiento apropiado de la
mezcla de digestión PEGilada.
Por esta razón, la identificación exacta del
sitio de unión del polímero en la proteína continua representando un
problema cuando se prepara el profármaco correspondiente, aunque
resulta un prerequisito esencial para establecer una correlación
racional entre la estructura y la actividad de los conjugados de
profármacos. De hecho, el conocimiento de esta correlación puede
representar una de las guías más útiles para diseñar conjugados
nuevos con propiedades farmacocinéticas, farmacológicas y
terapéuticas más convenientes.
La identificación exacta del sitio de conjugación
también resulta importante para una caracterización analítica más
precisa de un producto macromolecular biológicamente activo,
particularmente cuando se pretende que el conjugado tenga un uso
terapéutico, y requiere de una caracterización precisa para cumplir
los requerimientos de la autoridad sanitaria.
La importancia de encontrar un procedimiento para
identificar la localización original de la entidad funcional se
demuestra en la utilización de macromoléculas en terapia: en ésta,
los conjugados son necesarios. En tales conjugados, (los cuales
pueden utilizar en aplicaciones terapéuticas, por ejemplo, una
combinación de PEG + proteína), el PEG puede estar unido a muchos
sitios distintos de la macromolécula. Es importante disponer de un
procedimiento para descubrir el sitio o sitios exactos en los que se
unió el PEG + proteína unido a la macromolécula. La presente
invención retiene unida una fracción reportera aminoacídica,
ayudando así a identificar y describir, a través del análisis, el
producto de conjugación.
Los objetivos de la presente invención consisten
en proporcionar derivados conjugados biológicos activos superando
las limitaciones descritas en los procedimientos de modificaciones
poliméricas de polipéptidos y proteínas mencionados
anteriormente.
A tal efecto, uno de los objetivos de la presente
invención es un derivado conjugado biológico activo que presenta la
siguiente fórmula general (I)
(I)FE-L-M
en la
que:
M representa el radical correspondiente de una
molécula biológica activa seleccionada de entre el grupo que consta
de proteínas, péptidos y polipéptidos;
FE representa una entidad funcionalizante; y
L representa un brazo enlazante que consta de un
dipéptido seleccionado de entre Met-Nle,
Met-\betaAla, Gln-Gly, y
Asp-Pro, que puede ser cortado mediante tratamiento
químico para dejar Nle, \betaAla, Gly o Pro, respectivamente, como
grupo reportero unido a M.
De acuerdo con la presente invención, se ha
observado que grupos espaciadores específicos permiten la
posibilidad de extraer la entidad funcional FE a partir del
conjugado con una severidad reducida para evitar la destrucción o
desnaturalización de la molécula, reteniendo una fracción
aminoacídica reportera unida a la molécula para la
identificación.
El brazo enlazante L es estable bajo condiciones
fisiológicas pero puede ser cortado mediante medios
físico-químicos específicos y selectivos, por lo que
una fracción reportera estable detectable mediante procedimientos
analíticos estándar permanece unida a M y de ese modo su presencia
puede ser identificada opcionalmente mediante espectrometría de
masas y puede ser cortada mediante tratamiento químico o enzimático
para la evaluación mediante un análisis de aminoácidos estándar.
Un procedimiento de identificación alternativo
puede incluir el análisis por espectrometría de masas Maldi de un
conjugado no cortado.
En el derivado conjugado biológico activo según
la presente invención, la entidad funcionalizante FE es un polímero
con un peso molecular comprendido en el intervalo entre 2 Kd y 50
Kd. La entidad funcionalizante FE puede ser tanto un polímero lineal
como un polímero ramificado.
Preferentemente, en el derivado conjugado
biológico activo según la presente invención, el radical M
corresponde a una molécula biológica activa y dicha molécula es una
proteína seleccionada de entre insulina, lisozima, interferón, en
particular interferón \alpha-2b, eritropoietina,
G-CSF, GH.
Otro objetivo de la presente invención consiste
en un procedimiento para identificar los sitios de unión de la
conjugación de la entidad funcionalizante FE de un conjugado
biológico activo FE-L-M tal como se
ha descrito anteriormente en la presente solicitud, consistiendo tal
procedimiento en un corte químico específico del del brazo enlazante
L, liberando después de extraer y separar FE mediante procedimientos
clásicos, para dejar Nle, \betaAla, Gly o Pro, respectivamente,
como grupo reportero unido a M.
Otro objetivo de la presente invención consiste
en un compuesto intermediario, para la preparación de un conjugado
FE-L-M biológicamente activo tal
como se ha descrito anteriormente en la presente solicitud,
presentando la siguiente fórmula general (II)
(II)FE-L
en la
que:
FE representa una entidad funcionalizante
seleccionada de entre PEG, PVP, PacM, dextrano, hormonas,
anticuerpos o fragmentos de anticuerpos; y
L representa un brazo enlazante que consta de un
dipéptido seleccionado de entre Met-Nle,
Met-\betaAla, Gln-Gly, y
Asp-Pro.
La fracción reportera se utiliza para identificar
la localización original de la entidad funcional. La presente
invención descrita en detalle a continuación, se aprovecha del uso
de secuencias especiales de aminoácido PEG, en las que el PEG puede
ser liberado de un modo que permita dejar un aminoácido reportero
unido a la macromolécula que se explota para la identificación del
sitio de unión del PEG.
Sin limitación, se pueden prever varias entidades
funcionalizantes, por ejemplo, típicamente FE es un polímero cuando
M se destina a aplicaciones terapéuticas. Aunque se pueden incluir
muchos polímeros en la presente invención, preferentemente, el
polímero se puede seleccionar de entre el grupo que consta de PEG,
PVP, PAcM, dextrano y otros. Aún más preferidos son PEG, PVP y PacM.
Aún más preferido es el PEG por sus propiedades biológicas muy
favorables. Aún más preferido es el MPEG.
Tal como se ha descrito anteriormente, el FE,
según se describe en la presente invención, puede ser un polímero o
una entidad funcional que consta de polímeros. Preferentemente, el
FE/polímero presenta un peso molecular superior a 2 kd; más
preferentemente, el peso molecular se encuentra comprendido en el
intervalo entre 2 kd y 50 kd. Cuando FE es un polímero, FE puede ser
un polímero lineal o ramificado.
En la presente invención se pueden incluir otras
entidades funcionalizantes, por ejemplo ligandos de alta afinidad
para dirigir a sitios específicos. En este caso, FE puede ser
cualquiera de numerosos ligandos de alta afinidad. Preferentemente,
FE puede ser una hormona, anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo,
o un compuesto seleccionado con una técnica de alto rendimiento para
un sitio de reconocimiento. Más preferentemente, FE se puede
seleccionar de entre el grupo que consta de anticuerpo(s) o
fragmento(s) de anticuerpo.
El brazo enlazante L consiste en un dipéptido
seleccionado de entre Met-Nle,
Met-\betaAla, Gln-Gly, y
Asp-Pro.
Cuando el conjugado presenta la estructura
siguiente:
FE-Gln-Gly-M,
la extracción específica de FE se
puede obtener preferentemente mediante un tratamiento con hidracina,
dejando el aminoácido Gly unido a
M.
Cuando el conjugado presenta la estructura
siguiente:
FE-Asp-Pro-M,
la extracción específica de FE se
puede obtener mediante un tratamiento ácido suave, dejando Pro unido
a
M.
En las formas de realización anteriores de la
presente invención, las fracciones reporteras unidas a M son muy
estables frente a la hidrólisis ácida y por lo tanto resultan
fácilmente identificadas mediante el análisis de aminoácidos
estándar tras la hidrólisis ácida, así como también mediante
espectrofotometría de masas si el péptido no hidrolizado que las
contiene se analiza mediante esta técnica. Las fracciones reporteras
unidas a M se seleccionan de entre el grupo que consta de Nle,
\betaAla, Gly o Pro. Más preferentemente, las fracciones
reporteras unidas a M se seleccionan de entre aminoácidos no
naturales, Nle o \betaAla. Aún más preferentemente, la fracción
reportera es norleucina.
En general, en una forma de realización principal
de la presente invención, el procedimiento de la presente invención
consiste en identificar o analizar sitios de unión en macromoléculas
utilizando un compuesto que presenta la composición
FE-L-M mediante la identificación
del sitio de unión de FE en la fracción M basada en el corte
físico-químico de L, y a continuación liberar,
extraer y separar FE mediante métodos cromatográficos.
La idoneidad de los procedimientos generales de
la presente invención se demuestra adicionalmente mediante los
Ejemplos no limitativos (la localización del sitio de la conjugación
de PEG en la secuencia primaria de un nonapéptido e insulina
PEGilados, tanto si la insulina se encontraba PEGilada en uno o a
nivel de dos grupos amino).
En una forma de realización específica de la
presente invención los polipéptidos se modificaron mediante
PEG-Met-Nle. Por ello se ilustra la
conjugación de PEG a la proteína, lisozima de interés terapéutico
seguida de su completa extracción con CNBr.
En varias formas de realización de la presente
invención, se ilustran varios compuestos derivados PEG de péptidos
como ejemplos de la estructura: FE-L.
De entre éstos, los siguientes se describen como
ilustrativos y aparecen en varios ejemplos:
PEG-Met-Nle,
PEG-Met-Val (no incluido en la
invención),
PEG-Met-\beta-Ala,
PEG-Gln-Gly,
PEG-Asp-Pro. Todos estos compuestos
de derivados PEG seleccionados se activaron en el COOH terminal con
uno de los procedimientos descritos en la literatura, esto es
hidroxisuccinimidilester (OSu), y posteriormente se acoplaron a los
polipéptidos y proteínas representativas.
Como forma de realización preferida adicional de
la presente invención, se PEGiló lisozima con
PEG-Met-Nle, se activó como OSu, y a
su vez, la fracción polimérica se extrajo mediante tratamiento con
CNBr.
En todos estos ejemplos de formas de realización
seleccionados anteriormente, los complejos
FE-L-M, después de la conjugación,
se purificaron mediante HPLC o FPLC a fin de extraer el polímero sin
reaccionar activado así como también el M no modificado.
Como etapa adicional, se examinaron los
conjugados purificados y se cuantificó la composición, en un modo
preferido, mediante análisis de aminoácidos tras la hidrólisis ácida
a fin de evaluar, en base a la relación entre el grupo aminoacídico
reportero y el contenido aminoacídico de M, (así como también por
espectrometría de masas del derivado no hidrolizado), el número de
cadenas poliméricas que se unieron a M.
Adicionalmente, mediante el ensayo colorimétrico
con trinitrobencenosulfonato (TNBS), los conjugados purificados se
analizaron para evaluar el número de grupos amino que no habían
reaccionado (y mediante en ensayo con yodo, específico para PEG), en
una forma de realización preferida, para revelar su presencia.
Para los compuestos y utilizando el procedimiento
de la presente invención, los análisis demuestran que todos los
FE-L se unieron a los polipéptidos de modo similar a
lo que ocurre cuando el PEG se activa según otros procedimientos.
También se observó que el aumento del peso molecular, según lo
evaluado por espectrometría de masas Maldi, corresponde al peso
molecular del polipéptido incrementado con el peso de
FE-L o sus múltiples. Además, sorprendentemente
siempre se pudo revelar la presencia de grupos aminoacídicos
reporteros en el polipéptido y evaluar cuantitativamente mediante el
análisis de aminoácidos, y el valor obtenido correspondía a la
modificación calculada en base a la evaluación colorimétrica de los
grupos amino. Finalmente, se observó que en todos los casos los
conjugados reaccionaban con yodo y que se producía un descenso o
desaparición de los grupos amino del polipéptido a un grado que se
corresponde con el número de FE-L unidos.
En el procedimiento de la presente invención,
después de extraer el PEG mediante el procedimiento mencionado
anteriormente, el polipéptido exento de PEG se purifica mediante
filtración en gel desde donde se eluye a un volumen superior debido
a su reducción en peso. El nuevo volumen de elución corresponde
aproximadamente al de M antes de la modificación con PEG; En teoría,
la pequeña diferencia es debida al incremento en el peso debido a la
unión del grupo reportero que permanece unido a M tras la extracción
de FE.
Las etapas de la evaluación de la estructura de
la secuencia, tal como degradación de Edman, reducción y
carboximetilación, o degradación proteolítica también se pueden
utilizar en la presente invención para indicar el sitio de la unión
de PEG, con una detección más fácil del aminoácido reportero
mediante análisis de aminoácidos después de la digestión ácida o,
cuando es posible, la espectrometría de masas del péptido sin
hidrolizar.
Algunas de estas interesantes propiedades se
ilustran en los ejemplos siguientes, que no son limitativos, y con
los espectros analíticos siguientes, en los que:
la fig. 1 es el espectro
^{1}H-NMR de
MPEG-Met-Nle-OH en
CDCl_{3};
la fig. 2 es la elución de HPLC de la insulina
nativa;
la fig. 3 a) es la elución de HPLC de
MPEG-Met-Nle-insulina;
b) siendo la elución de HPLC de Nle-insulina
obtenida a partir del corte con CNBr de
MPEG-Met-Nle-insulina;
la fig. 4 a) es la elución de HPLC de
(MPEG-Met-Nle)_{2}-insulina;
b) siendo la elución de HPLC de
(Nle)_{2}-insulina obtenida a partir del
corte con CNBr de
(MPEG-Met-Nle)_{2}-insulina;
la fig 5 a) es el espectro de masas Maldi de
Nle.-insulina obtenida a partir del corte con CNBr de
MPEG-Met-Nle-insulina,
b) siendo el espectro de masas Maldi de
(Nle)_{2}-insulina obtenido a partir del
corte con CNBr de
(MPEG-Met-Nle)_{2}-insulina,
la fig. 6 es el patrón cromatográfico de a) la
lisozima nativa, b) siendo la lisozima conjugada a
MPEG-Met-Nle, c) siendo
Nle-lisozima obtenida a partir del corte con CNBr de
la lisozima conjugada a
MPEG-Met-Nle.
Se hizo reaccionar MPEG-OH 5000
(siendo MPEG poli(etilenglicol)metil éter) disuelto en
cloruro de metileno anhidro, con 4-nitrofenil
cloroformato a pH 8 en presencia de una cantidad equimolecular de
trietilamina para dar
MPEG-p-nitrofenil-carbonato. Se añadió 1 g
del producto (0,19 mmoles) en pequeñas porciones a 283 mg (1,14
mmoles) de
H-Met-Val-OH
disuelto en 4 ml de una solución de acetonitrilo al 50% en agua y se
llevó a pH 8 con TEA. Tras agitar durante una noche, el pH de la
mezcla de reacción se ajustó a 3 usando ácido cítrico sólido; se
extrajo el 4-nitrofenol mediante extracción con éter
mientras que el producto se extrajo posteriormente con cloroformo.
La solución orgánica se secó con Na_{2}SO_{4} sólido seco y se
concentró bajo presión reducida. Tras añadir 200 ml de dietil éter
al cloroformo, la solución se enfrió a -20ºC durante 1 hora y el
producto separado se recogió mediante filtración y se secó al vacío.
El MPEG-Met-Val-OH
se purificó adicionalmente mediante cromatografía de intercambio
iónico en una columna QAE-Sephadex® A50 (2,5 x 55
cm) eluida primero con agua y seguidamente con una solución acuosa
de NaCl 10 mM. Las fracciones eluidas se analizaron mediante el
ensayo de yodo para detectar el PEG. Se recogieron las fracciones
que contenían la sal sódica del MPEG-péptido, se
acidificaron y se liofilizaron. El rendimiento fue del
70-75% del MPEG-péptido. El producto
se identificó por ^{1}H-NMR (200 MHz;
CDCl_{3}).
Se unió MPEG 5000 a Met-OH para
obtener MPEG-Met-OH siguiendo el
procedimiento descrito en el Ejemplo 1 para la preparación de
MPEG-Met-Val-OH. Se
añadieron 523 mg (2,88 mmoles) de
H-Nle-OMe y una cantidad
equimolecular de TEA (401 \mul) a una solución de 10 ml de
diclorometano anhidro que contenía 3,71 g (0,72 mmoles) del
MPEG-Met-OH sintetizado, 305 mg
(0,72 mmoles) de 1-
ciclohexil-3-(2-morfolinoetil)carbodiimidometo-p-toluensulfonato
(CMC) y 97 mg (0,72 mmoles) de 1-hidroxibenzotriazol
(HOBt). Tras agitar 3 días a temperatura ambiente, la mezcla de
vertió a 250 ml de dietil éter; el precipitado se recogió por
filtración y se secó al vacío. El producto se purificó
adicionalmente mediante cromatografía de intercambio iónico en una
columna QAE-Sephadex® A50 (2,5 x 55 cm) eluida
primero con agua y seguidamente con una solución acuosa de NaCl 10
mM. Las fracciones se analizaron mediante el ensayo de yodo para
revelar la presencia de PEG. Se recogieron las fracciones que
contenían el MPEG-péptido-metil
éster
(MPEG-Met-Nle-OMe) y
se liofilizaron. El rendimiento fue del 93%. La estructura del
producto se verificó por ^{1}H-NMR (200 MHz;
CDCl_{3}).
El metil éster de Nle se hidrolizó en una
solución de metanol que contenía 20 equivalentes de NaOH 1 N y se
dejó la mezcla agitando durante 2 días a temperatura ambiente. El pH
de la solución se llevó a 2 utilizando HCl 1N y el producto se
extrajo con cloroformo. La solución se cloroformo se secó con
Na_{2}SO_{4} sólido seco y se concentró bajo presión reducida.
La adición de 200 ml de dietil éter al cloroformo, bajo agitación
vigorosa, produjo un producto sólido que se recogió mediante
filtración y se secó al vacío. El rendimiento fue del 67% del
MPEG-Met-Nle-OH. La
identidad del producto se verificó por ^{1}H-NMR
(200 MHz; CDCl_{3}). El espectro se proporciona en la fig. 1.
El producto se preparó de acuerdo con el Ejemplo
2 pero empezando a partir de MPEG-OH de peso
molecular 10000.
El COOH terminal de
MPEG-Met-Nle-OH se
activó como hidroxisuccinimidil éster
(MPEG-Met-Nle-OSu)
de acuerdo con un procedimiento descrito en la literatura para MPEG
con Nle como aminoácido espaciador (Applied Biochemistry and
Biotechnology, 27, 45-54, 1991).
El nonapéptido totalmente protegido obtenido por
síntesis en fase sólida con la siguiente estructura
Nps-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Lys-(Boc)-Tyr(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-OH
se desprotegió manteniéndolo en una mezcla 1:1 de ácido
trifluoracético y diclorometano, durante 2 horas a temperatura
ambiente. La solución se concentró hasta sequedad y el grupo Nps se
extrajo mediante extracciones repetidas con dietil éter a 0ºC.
Finalmente el producto se secó al vacío durante 12 horas sobre KOH.
El rendimiento del péptido totalmente desprotegido fue del 90%.
Se añadieron 43 mg (4,0 \mumoles) de
MPEG-Met-Nle-OSu, en
pequeñas porciones, a 0,9 mg (0,8 \mumoles) del nonapéptido
desprotegido disuelto en 1 ml de DMSO, a pH 8 con TEA (relación
molar de nonapéptido:
MPEG-Met-Nle-OSu =
1:5). Tras 3 días agitando a temperatura ambiente, el pH de la
mezcla de reacción se ajustó a 3 usando HCl 1N y el producto se
extrajo muchas veces con cloroformo. La solución de cloroformo se
secó con Na_{2}SO_{4}sólido seco y se concentró hasta sequedad.
El conjugado se purificó adicionalmente mediante un sistema de HPLC
semi-preparativo de Shimadzu, utilizando una columna
de fase inversa Vydac®218TP54 (fase unida C_{18}, d. i. 0,46 x 25
cm, diámetro de partícula 5 \mum) y un gradiente lineal de ácido
trifluoroacético acuoso al 0,05% y ácido trifluoroacético al 0,05%
en acetonitrilo. Se midió la absorción a una longitud de onda de 280
nm. El producto se caracterizó mediante el ensayo de yodo para MPEG
y análisis de aminoácidos.
Se añadieron 8,6 mg (1\mumol) de
MPEG-Met-Nle-OSu
preparado según el Ejemplo 4, a 6 mg (1\mumol) de insulina bovina
disuelta en 1 ml de DMSO (relación molar de grupos amino de la
insulina: MPEG = 3:1) y la mezcla se dejó agitando durante 5 horas a
temperatura ambiente. El conjugado se purificó mediante el sistema
HPLC semi-preparativo de Shimadzu, utilizando una
columna de fase inversa Vydac®218TP1022 (fase unida C_{18}, d. i.
2,2 x 25 cm, diámetro de partícula 10 \mum) y un gradiente lineal
de ácido trifluoroacético acuoso al 0,05% y ácido trifluoroacético
al 0,05% en acetonitrilo, midiendo la absorción a una longitud de
onda de 280 nm. Se recogieron las fracciones del pico de elución
principal de la insulina conjugada y se liofilizaron. La identidad
del producto se evaluó mediante el ensayo colorimétrico de grupos
amino que indicó la pérdida de un residuo amino de la insulina y
mediante análisis de aminoácidos tras la hidrólisis ácida que reveló
un Nle por insulina, de nuevo a favor de la unión de una única
cadena polimérica por molécula de insulina.
Se añadieron 17 mg (2 \mumoles) de
MPEG-Met-Nle-OSu
preparado como en el Ejemplo 4, a 6 mg (1 \mumol) de insulina
bovina disuelta en 1 ml de DMSO (relación molar de grupos amino de
la insulina: MPEG = 3:2). Después de agitar durante 5 horas a
temperatura ambiente, el producto se purificó mediante HPLC de fase
inversa tal como se describe en el Ejemplo 5 para
MPEG-Met-Nle-insulina.
Se recogieron las fracciones del pico de elución principal de la
insulina conjugada y se liofilizaron. La identidad del conjugado se
evaluó mediante el ensayo colorimétrico de grupos amino que indicó
la pérdida de dos residuos amino y mediante análisis de aminoácidos
tras la hidrólisis ácida que demostró la presencia de dos Nle por
insulina, indicando la unión de dos fracciones PEG por molécula de
insulina.
Se trató 1 mg (85,2 \mumoles) del nonapéptido
(MPEG-Met-Nle)_{2},
obtenido según se describe en el Ejemplo 4, con 100 equivalentes de
CNBr en ácido fórmico acuoso al 70% (de acuerdo con Methods in
Enzymology, pag. 238-254, 1967). Tras dejarlo en
reposo durante 24 horas a temperatura ambiente, la mezcla se vertió
a 10 volúmenes de agua y se liofilizó (el procedimiento se repitió
dos veces). Los productos obtenidos se analizaron mediante el
sistema HPLC analítico de Shimadzu, utilizando una columna de fase
inversa Vydac®218TP54 (fase unida C_{18}, d. i. 0,46 x 25 cm,
diámetro de partícula 5 \mum) y un gradiente lineal de ácido
trifluoroacético acuoso al 0,05% y ácido trifluoroacético al 0,05%
en acetonitrilo. El patrón de elución indicó un desplazamiento en
los tiempos de elución desde 36,3 min para el conjugado
PEG-péptido, a 15,8 min para el mismo producto
tratado con CNBr. Este valor era similar al del péptido solo (16,4
min) demostrando que la fracción PEG había sido extraída. El
análisis de aminoácidos tras la digestión ácida y la espectrometría
de masas reveló la presencia de dos residuos Nle por molécula de
péptido, indicando la validez de este procedimiento en la extracción
de PEG a partir de la molécula dejando Me como grupo reportero unido
al polipéptido.
Los productos obtenidos según se describe en los
Ejemplos 5 y 6 correspondientes a conjugados de insulina con una o
dos cadenas de MPEG-Met-Nle
respectivamente, fueron tratados con CNBr en ácido fórmico acuoso al
70%. La relación molar entre el contenido de insulina y el CNBr
estaba comprendida entre 1 y 200. Tras 24 horas agitando a
temperatura ambiente, la mezcla se vertió a 10 volúmenes de agua y
se liofilizó y el procedimiento se repitió dos veces. Los productos
obtenidos se analizaron mediante el sistema de HPLC analítico de
Shimadzu, utilizando una columna de fase inversa Vydac®218TP54 (fase
unida C_{18}, d. i. 0,46 x 25 cm, diámetro de partícula 5 \mum)
y un gradiente lineal de ácido trifluoroacético acuoso al 0,05% y
ácido trifluoroacético al 0,05% en acetonitrilo. El patrón de
elución indicó un desplazamiento en los tiempos de elución desde
22,2 min y 23,2 min para los conjugados PEG-insulina
con una y dos cadenas PEG respectivamente, a 18,9 min y 19,2 min
para los mismos productos tras el corte con CNBr. Estos valores que
eran similares al de la insulina sola (18,3 min) demostraron que la
fracción PEG había sido extraída (ver figs. 2, 3, y 4). El análisis
por espectrometría de masas reveló una masa de una molécula de
insulina más un residuo Me cuando se partía de insulina
monoderivatizada
(MPEG-Met-Nle-insulina)
y más dos residuos en el caso de
(MPEG-Met-Nle)_{2}-insulina
(ver fig. 5). Los patrones del espectro de masas eran mucho más
claros que los obtenidos en el análisis de los conjugados (Ejemplos
5 y 6) ya que la presencia del polímero, con su polidispersividad,
hace que el espectro y su interpretación resulte más difícil e
incierta. Además, estos valores se confirmaron mediante el análisis
de aminoácidos, lo que indicó la presencia de uno o dos residuos de
Nle por molécula de insulina en las
muestras.
muestras.
Todos estos datos están a favor de la posibilidad
de extraer el PEG a partir de la molécula dejando Nle unido 10 y
demostrando así la validez del procedimiento.
Se disolvieron 500 \mug (0,08 \mumoles) de
Nle-insulina, obtenida a partir de
MPEG-Met-Nle-insulina
según se describe en el Ejemplo 8, en 250 \mul de tampón
Tris-HCl, pH 7,5, que contenía EDTA 2 mM y se añadió
6 M Gdn-HCl 3,8 mg de
1,4-ditio-L-treitol
(DTT) y la mezcla se dejó en reposo durante 2 horas a 37ºC.
Finalmente se añadieron 9,2 mg de yodoacetamida y la mezcla se dejó
durante 1 hora a 37ºC. La solución se liofilizó y los productos se
fraccionaron mediante un sistema HPLC
semi-preparativo de Shimadzu, utilizando una columna
de fase inversa Vydac®218TP54 (fase unida C_{18}, d. i. 0,46x25
cm, diámetro de partícula 5 \mum) y un gradiente lineal de ácido
trifluoroacético acuoso al 0,05% y ácido trifluoroacético al 0,05%
en acetonitrilo. La medición de la absorción de los productos
eluidos a una longitud de onda de 226 nm, reveló la presencia de dos
picos principales, correspondientes a las cadenas \alpha y \beta
de la insulina, las cuales fueron separadas y recuperadas. El
análisis de aminoácidos después de la hidrólisis ácida reveló la
presencia de Nle como aminoácido adicional entre los de la cadena
\beta. La degradación de Edman (según Protein Practical
Chemistry, pag. 371-373, 1986) liberó Phe y Nle
en la primera etapa, indicando que el grupo
\alpha-amino se encontraba libre y en consecuencia
el PEG se encontraba unido a la ^{29}Lys de la cadena \beta.
Adicionalmente, el análisis por espectrometría de masas demostró que
el incremento de masa de una Nle se encontraba únicamente en la
cadena \beta.
Se disolvieron 600 \mug (0,1 \mumol) de
Nle_{2}-insulina, obtenida a partir de
MPEG-Met-Nle-insulina
según se describe en el Ejemplo 8, en 200 \mul de tampón
Tris-HCl, pH 7,5, que contenía EDTA 2 mM y se añadió
6 M Gdn-HCl 7,6 mg de
1,4-ditio-L-treitol
(DTT) a la mezcla y se dejó en reposo durante 3 horas a 37ºC.
Finalmente se añadieron 18,5 mg de yodoacetamida y se dejó durante 1
hora a 37ºC. La solución se liofilizó y los productos obtenidos se
aislaron y se analizaron tal como se describe en el Ejemplo 9 para
la Nle-insulina. Mediante el análisis de aminoácidos
después de la hidrólisis ácida, se observó que el aminoácido Nle
estaba presente tanto en la cadena \alpha como en la \beta.
Además, mediante espectrometría de masas se observó que ambas
cadenas mostraban un incremento de peso correspondiente a un residuo
de Nle. Los datos indicaron que la PEGilación, en las condiciones
del Ejemplo 6, se produjo en ambas cadenas.
Se añadieron 42,2 mg (7,8 \mumoles) de
MPEG-Met-Nle-OSu, en
pequeñas porciones bajo agitación, a 3,75 mg (0,26 \mumoles) de
lisozima de clara de huevo disuelta en 1 ml de tampón borato 0,2 M,
pH 8,5. La relación molar de los grupos amino de la lisozima: MPEG
era de 1:5. Tras 30 min. de agitación a temperatura ambiente, el
conjugado se purificó mediante un sistema FPLC
semi-preparativo, utilizando una columna Superose
12^{TM} de filtración en gel (1,5 x 25 cm) eluida con tampón
fosfato 0,01 M y NaCl 0,15 M, pH 7,2. Se analizó la elución de la
lisozima en las fracciones mediante la absorción a 280 nm y se
realizó el ensayo de yodo para la evaluación de PEG. Se recogieron
las fracciones que contenían la lisozima modificada y se
concentraron hasta un volumen pequeño mediante ultrafiltración con
un sistema Amicon utilizando una membrana YM3 (corte 3000). La
solución concentrada se diluyó con agua y se ultrafiltró. Este
procedimiento se repitió para eliminar las sales, y finalmente se
liofilizó el producto. Mediante el ensayo colorimétrico de grupos
amino se calculó un grado de modificación del 87%. Se obtuvo un
valor similar en base al contenido de Nle mediante el análisis de
aminoácidos tras la hidrólisis ácida. Una evaluación cuantitativa
del grado de modificación mediante espectrometría de masas no
resultó fiable.
Se trataron 0,04 \mumoles de lisozima
modificada, obtenido según se describe en el Ejemplo 11, con 600
equivalentes de CNBr en ácido fórmico acuoso al 70% y se dejó
agitando durante 24 horas a temperatura ambiente. Seguidamente la
mezcla se vertió sobre 50 ml de agua y se liofilizó (el
procedimiento se repitió dos veces). Los productos obtenidos se
analizaron por filtración en gel en un sistema FPLC, utilizando la
misma columna y condiciones de elución utilizadas para el lisozima
modificada con polímero tal como se describe en el Ejemplo 11, con
el propósito de comparar los patrones cromatográficos. Se observó
que la elución del pico de lisozima, el cual aparecía antes con la
conjugación del polímero, se desplazaba hasta aproximadamente el
volumen original de elución de la lisozima al tratar con CNBr. En
consonancia, los grupos amino titulables por TNBS, los cuales se
redujeron a aproximadamente 10% al modificar la lisozima con el
polímero, volvían a los valores de la lisozima no modificada después
del tratamiento con CNBr (ver fig. 6). Los patrones de
espectrometría de masas también eran muy claros y fáciles de
interpretar ya que el peso de la lisozima incrementaba en 6 residuos
de Nle. El análisis de aminoácidos también reveló una cantidad de
Nle similar a la evaluada mediante el ensayo con TNBS y la
espectrometría de masas. Todos estos datos están a favor de la
conjugación de PEG a la proteína seguida de su separación al tratar
con CNBr pero dejando Nle como aminoácido reportero unido a la
proteína.
Se hizo reaccionar interferón
\alpha-2b, mg 15, disuelto en 4 ml de tampón
borato 0,1 M pH 7,8, con 100 mg de
PEG-Met-Nle-OSu (PEG
linear de 10000 Da o PEG ramificado de 10000 Da). Tras 2 horas en
reposo a temperatura ambiente, la solución se llevó a pH 6, se
concentró mediante ultrafiltración y se aplicó a una columna
Superdex 200 de filtración en gel. Se obtuvieron dos picos de
interferón diferencialmente modificado además de una pequeña
cantidad de proteína sin modificar. Los picos de proteína modificada
con PEG mantenían un elevado grado de actividad biológica antiviral.
Las proteínas se recuperaron mediante liofilización y se trataron
con BrCN como en el Ejemplo 12. En cualquier caso la liberación de
PEG a partir de la proteína conjugada incrementó el volumen de
elución, y el nuevo volumen correspondía al de la forma sin
conjugar, demostrando la liberación de PEG a partir de los
conjugados como en el Ejemplo 12.
Se modificó interferón
\alpha-2b según el procedimiento descrito en el
Ejemplo 13 pero con
PEG-Met-Nle-OSu de
lineal o ramificado de 20000 Da. En este experimento también se
utilizó PEG 20000 Da con
Met-\beta-Ala como brazo
peptídico.
En cualquier caso se obtuvieron productos
biológicamente activos. Además, el tratamiento con BrCN liberó la
proteína sin PEG pero con el Nle o \beta-Ala como
grupos reporteros unidos a las proteínas.
Siguiendo el procedimiento de los Ejemplos 13 y
14, se conjugó G-CSF con
PEG-Met-Nle-OSu de
10000 Da en la forma lineal o ramificada y de 20000 Da en la forma
lineal o ramificada. En la conjugación también se utilizó
PEG-Met-\beta-Ala.
En cualquier caso se obtuvo la proteína
biológicamente activa y el PEG se pudo liberar mediante el
tratamiento con BrCN dejando el Nle o \beta-Ala
unido a la proteína.
Siguiendo el Ejemplo 5, se modificó la
glicopreteína eritropoietina con
PEG-Met-Nle o
PEG-Met-\beta-Ala.
También en este caso la conjugación dio lugar a una proteína activa
y se logró la liberación de PEG mediante el tratamiento con
BrCN.
De acuerdo con un procedimiento similar al
descrito en el Ejemplo 1, se preparó
MPEG-Gln-Gly-OH a
partir de MPEG-OH 5000 y
H-Gln-Gly-OH y
seguidamente se transformó en su éster succinimida activado
MPEG-Gln-Gly-OSu.
De acuerdo con un procedimiento similar al
descrito en el Ejemplo 5, se obtuvo un conjugado biológico activo
MPEG-Gln-Gly-insulina
utilizando el éster activado del Ejemplo 17. Este conjugado demostró
actividades biológicas y era posible cortarlo selectivamente en la
unión Gln-Gly aplicando un tratamiento clásico con
hidracina.
De acuerdo con un procedimiento similar al
descrito en el Ejemplo 1, se preparó
MPEG-Asp-Pro-OH a
partir de MPEG-OH 5000 y
H-Asp-Pro-OH y
seguidamente se transformó en su éster succinimida activado
MPEG-Asp-Pro-OSu.
De acuerdo con un procedimiento similar al
descrito en el Ejemplo 5, se obtuvo un conjugado biológico activo
MPEG-Asp-Pro-insulina
utilizando el éster activado del Ejemplo 19. Este conjugado demostró
actividades biológicas y era posible cortarlo selectivamente en la
unión Asp-Pro aplicando un tratamiento ácido suave
clásico.
Como ayuda para entender la presente invención,
se proporciona la siguiente lista de abreviaturas utilizadas en la
presente memoria y fácilmente comprensible para un experto en la
materia
| Asp | Ácido aspártico |
| Boc | N-terc-butoxicarbonilo |
| CMC | 1-Ciclohexil-3-(2-morfolinoetil)carbodiimida meto-p-toluenosulfonato |
| DMSO | Dimetil sulfóxido |
| DTT | 1,4-ditio-L-treitol |
| EDTA | Ácido etilenodiaminotretraacético |
| FPLC | Cromatografía líquida rápida de proteínas |
| Gdn-HCl | Hidrocloruro de guanidina |
| HOBt | 1-Hidroxibenzotriazol |
| HPLC | cromatografía líquida de alta resolución |
| Leu | Leucina |
| Lys | Lisina |
| Met | Metionina |
| MPEG o mPEG | Poly(etilenglicol)metil éter |
| Nle | Norleucina |
| NMR | Resonancia magnética nuclear |
| Nps | 2-Nitrofenilsulfenilo |
| OMe | Metoxi |
| OSu | Succinimidiloxi |
| OtBu | ter-butoxi |
| PAcM | Poli acriloilmorfolina |
| QAE | aminoetil cuaternario |
| Ser | Serina |
| tBu | ter-butilo |
| TEA | Trietilamina |
| Thr | Treonina |
| TNBS | Ácido 2,4,6-trinitrobencenosulfónico |
| Tris-HCl | Hidrocloruro de Tris(hidroximetil)aminometano |
| Tyr | Tirosina |
| Val | Valina |
Claims (8)
1. Derivado conjugado biológicamente activo que
presenta la siguiente fórmula general (I):
(I);FE-L-M
en la
que:
M representa el radical correspondiente de una
molécula biológicamente activa seleccionada de entre el grupo que
consta de proteínas, péptidos y polipéptidos;
FE representa una entidad funcionalizante
seleccionada de entre PEG, PVP, PacM, dextrano, hormonas,
anticuerpos o fragmentos de anticuerpos; y
L representa un brazo enlazante que consta de un
dipéptido seleccionado de entre Met-Nle,
Met-\betaAla, Gln-Gly, y
Asp-Pro,
el cual puede ser cortado mediante tratamiento
químico para dejar Nle, \betaAla, Gly o Pro, respectivamente, como
grupo reportero unido a M.
2. Derivado conjugado biológicamente activo según
la reivindicación 1, caracterizado porque dicha entidad
funcionalizante FE es un polímero con un peso molecular comprendido
en el intervalo entre 2 Kd y 50 Kd.
3. Derivado conjugado biológicamente activo según
la reivindicación 2, caracterizado porque dicho polímero es
PEG.
4. Derivado conjugado biológicamente activo según
las reivindicaciones 2 ó 3, caracterizado porque dicha
entidad funcionalizante FE es un polímero lineal.
5. Derivado conjugado biológicamente activo según
las reivindicaciones 2 ó 4, caracterizado porque dicha
entidad funcionalizante FE es un polímero ramificado.
6. Derivado conjugado biológicamente activo según
la reivindicación 1, caracterizado porque dicha molécula
biológicamente activa es una proteína seleccionada de entre
insulina, lisozima, interferón, eritropoietina,
G-CSF, GH.
7. Procedimiento para identificar los sitios de
unión de la conjugación de la entidad funcionalizante FE,
comprendiendo dicho procedimiento realizar el corte químico
específico del brazo enlazante L, liberar después de extraer y
separar FE mediante procedimientos clásicos, para dejar Nle,
\beta-Ala, Gly o Pro respectivamente, como grupo
reportero unido a M y siendo FE, L, y M tal como se definen como en
la reivindicación 1.
8. Compuesto intermediario, para la preparación
del conjugado biológicamente activo según la reivindicación 1, que
presenta la siguiente fórmula general (II)
(II);FE-L
en la
que:
FE representa una entidad funcionalizante
seleccionada de entre PEG, PVP, PacM, dextrano, hormonas,
anticuerpos o fragmentos de anticuerpos; y
L representa un brazo enlazante que consta de un
dipéptido seleccionado de entre Met-Nle,
Met-\betaAla, Gln-Gly y
Asp-Pro.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP98123307 | 1998-12-08 | ||
| EP98123307A EP1008355A1 (en) | 1998-12-08 | 1998-12-08 | Method for identifying or analyzing polymer linkage sites on macromolecules using amino acid report binding |
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