CN105324116B - 调适具有聚脯氨酸支架的生物聚合物的多价相互作用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种糖肽，所述糖肽包含聚脯氨酸主链和一个或多个碳水化合物分子。

Description

调适具有聚脯氨酸支架的生物聚合物的多价相互作用

技术领域

本发明总体上涉及一种调节和控制生物聚合物对它的靶结合分子的结合亲和力的方法。本发明还涉及一种生物聚合物，所述生物聚合物对它的靶结合分子具有提高的结合亲和力；用于制备这种生物聚合物的方法；以及它的用途。

背景技术

碳水化合物参与许多重要的生物过程。天然的多糖常常能够经由关键功能性基序与相应结合蛋白的受到良好控制的多价相互作用来发挥复杂的功能。迄今为止，已经有许多尝试来设计能够再现在自然界中发生的这些结合事件中的一些的拟糖物。

虽然设计拟糖物的一些结构指导是可获得的，但是仍然缺乏对这些糖模拟糖物的聚合物主链构象的精确控制。这已经阻碍了尝试去了解或模拟这些天然多糖与它们的结合分子的结合。例如使用α-螺旋糖肽进行的研究已经揭示了这些糖肽的α-螺旋度的变化归因于相对低的热力学稳定性、侧基依赖性以及与蛋白质的互补性相互作用。这使得特别难以在拟糖物上的期望位置上设计结合基序或功能性基序以促进与它们相应的结合分子的结合。

需要提供克服了或至少改进了上文所述的一或多个缺点的拟糖物。

需要提供如下的拟糖物，其不仅维持天然多糖的关键特性，而且还采取可预测的、明确限定的并且稳定的构象，所述构象使得结合基序或功能性基序能够在它的主链上被更准确地并且最佳地定位，并且因此改进对它们与结合分子的多价相互作用的控制。

发明内容

根据第一个方面，提供了一种糖肽，所述糖肽包含聚脯氨酸主链和一个或多个碳水化合物分子。有利的是，所述聚脯氨酸主链为所述糖肽提供了构象稳定性，并且具有聚脯氨酸II型(PPII)螺旋的3重的重复单元，所述螺旋允许官能团沿刚性主链在所需位点处精确取向。

所述聚脯氨酸主链可以包含(4R)-叠氮基脯氨酸(Azp)。有利的是，将Azp并入到聚脯氨酸中会经由叠氮基的旁式效应而稳定其PPII螺旋构象，并且使得所述聚脯氨酸能够通过Cu(I)催化的与炔烃进行的偶合反应(点击反应(click reaction))被高效地官能化而不影响它的PPII构象。

所述碳水化合物分子可以沿所述聚脯氨酸主链连接在预定的位置处。所述碳水化合物分子可以沿所述聚脯氨酸主链或沿所述聚脯氨酸主链的同一面以彼此相等的距离连接。有利的是，所述碳水化合物分子沿所述聚脯氨酸主链的这种预定的定位提高了所述糖肽对其一种或多种靶分子的结合亲和力。

根据第二个方面，提供了一种合成如上文所限定的糖肽的方法，所述方法包括使一个或多个碳水化合物分子连接到聚脯氨酸主链上。

根据第三个方面，提供了一种用于疗法中的如上文所限定的糖肽。

根据第四个方面，提供了一种治疗需要靶标特异性疗法的患者的方法，所述方法包括施用如上文所限定的糖肽。

根据第五个方面，提供了一种靶标特异性治疗剂，所述治疗剂包含如上文所限定的糖肽。

根据第六个方面，提供了一种用作靶标特异性生物聚合物的如上文所限定的糖肽。

根据第七个方面，提供了一种用于基于糖胺聚糖(GAG)的药物中的如上文所限定的糖肽。

根据第八个方面，提供了一种用作诊断工具的如上文所限定的糖肽。

根据第九个方面，提供了一种控制糖肽对一种或多种结合分子的结合亲和力的方法，所述方法包括使一个或多个碳水化合物分子沿聚脯氨酸主链连接在预定的位置处。

根据第十个方面，提供了一种聚脯氨酸主链，所述聚脯氨酸主链包含(4R)-叠氮基脯氨酸(Azp)。

定义

本文所用的以下词语和术语应当具有所示的含义：

如本文所用的术语“拟糖物”指的是具有与碳水化合物类似的结构以及通常生物特性的分子。

如本文所用的术语“糖肽”指的是其上连接有一个或多个碳水化合物部分的肽。糖肽通常是糖蛋白的片段，并且可以通过化学合成或酶促合成，或通过对糖蛋白进行化学裂解或酶促裂解而获得。示例性糖蛋白包括但不限于胶原、粘蛋白、转铁蛋白、血浆铜蓝蛋白、免疫球蛋白、组织相容性抗原、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、促甲状腺激素(TSH)、凝集素、选择素、细胞受体蛋白、钙联蛋白、钙网蛋白、notch(缺刻)蛋白等，而示例性糖肽包括但不限于抗生素，如万古霉素(vancomycin)、替考拉宁(teicoplanin)、特拉万星(telavancin)、博莱霉素(bleomycin)、雷莫拉宁(ramoplanin)、以及decaplanin(德卡拉宁)。

术语“多肽”和“蛋白质”是可互换使用的并且指的是经由肽键或修饰的肽键连接的氨基酸的任何聚合物(二肽或更大)，无论是天然产生还是以合成方式产生的。

术语“侧基”指的是可连接到大分子，并且形成所述大分子的侧链的任何官能团。通常，所述侧基连接到大分子的主链上。举例来说，在糖肽的情况下，碳水化合物分子可以形成侧基，所述侧基经由诸如O-糖苷键或N-糖苷键之类的键连接到糖肽的多肽主链上。糖肽的多肽主链上的示例性侧基包括但不限于单糖、二糖、低聚糖以及多糖。

术语“预定的”例如在关于沿本公开的糖肽的聚脯氨酸主链的位置使用时指的是沿所述聚脯氨酸主链的已经被选用于连接一个或多个碳水化合物分子的任何位置。所述一个或多个位置可以例如已经被选用于连接一个或多个碳水化合物分子以调节所述糖肽的一种或多种生物功能，例如提高的分子稳定性、提高的选择性或特异性、提高的结合亲和力等。

术语“连接(attach)”以及该术语的包括“连接(attaching)”和“连接(attachment)”在内的变化形式指的是一个分子与另一个分子的任何形式的缔合，所述缔合是直接地或间接地(诸如经由接头)，所述缔合经由包括但不限于共价键的任何方式、经由杂交、经由非共价相互作用，如受体-配体相互作用。

术语“炔烃官能化的”指的是将炔烃官能团并入到分子中，通常以有助于用所述炔烃官能团或经由所述炔烃官能团进行后续的化学反应。

术语“治疗”包括医治疾病状态或症状、预防疾病的形成或另外以任何方式预防、阻止、延缓或逆转疾病或其它不希望有的症状的进展的任何和所有用途。因此，“治疗”包括预防性治疗和治疗性治疗。

术语“患者”指的是人类或其它哺乳动物的患者并且包括期望使用本公开的方法加以检查或治疗的任何个体。然而，应当了解的是，“患者”并不意味着存在症状。落入本公开的范围内的合适的哺乳动物包括但不限于灵长类动物、牲畜动物(例如羊、牛、马、驴、猪)、实验室测试动物(例如兔、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠)、伴侣动物(例如猫、狗)以及圈养的野生动物(例如狐狸、鹿、澳洲野狗)。

术语“施用(administering)”以及该术语的包括“施用(administer)”和“施用(administration)”在内的变化形式包括通过任何适当手段使本公开的化合物或组合物与生物体或表面接触、或向所述生物体或表面施用、递送或提供本公开的化合物或组合物。

术语“靶标特异性”在关于疗法使用时，如用于“靶标特异性疗法”时，它意指向需要疗法的患者施用化合物，例如药物(例如本公开的糖肽)，所述化合物能够与特定的生物靶标结合以引起针对患者的期望的生物学作用或治疗作用以治疗所述患者。类似地，“靶标特异性治疗剂”指的是对特定的靶分子或疾病具有特异性的治疗剂(例如靶标特异性药物)，而“靶标特异性生物聚合物”指的是与特定的生物靶标结合的生物聚合物。

词语“基本上”并没有排除“完全地”，例如“基本上不含”Y的组合物可以完全不含Y。在必要时，词语“基本上”可以从本发明的定义中被省略掉。

除非另外说明，否则术语“包含(comprising)”和“包含(comprise)”以及其语法上的变化形式意于表示“开放性”或“包括性”语言，因此它们包括所述的要素，而且还容许包括另外的未陈述的要素。

如本文所用的术语“约”在制剂的组分浓度的背景下通常意指指定值的+/-5％，更通常指定值的+/-4％，更通常指定值的+/-3％，更通常指定值的+/-2％，甚至更通常指定值的+/-1％，并且甚至更通常指定值的+/-0.5％。

在整个本公开中，某些实施方案可以范围的形式被公开。应当了解的是，呈范围形式的说明仅仅是为了方便和简洁起见并且不应当被理解成对所公开范围的范围的硬性限制。因此，对范围的说明应当被认为是已经具体地公开了该范围内的所有可能的子范围以及单个数值。举例来说，对诸如1至6的范围的说明应当被认为是已经具体地公开了该范围内诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等子范围以及单个数值，例如1、2、3、4、5以及6。无论范围的宽度如何，这均适用。

某些实施方案也可以被宽泛地和一般性地描述于本文中。落入一般性公开内的较缩小内容和亚类分组中的每一个也形成本公开的一部分。这包括以从所述类中去除任何主题的附带条件或负面限制条件来一般性地说明实施方案，不论所排除的内容是否在本文被具体地叙述。

具体实施方式

现在将公开一种糖肽、一种用于合成所述糖肽的方法和所述糖肽的用途以及一种控制糖肽对它的结合分子的结合亲和力的方法的示例性非限制性实施方案。

在第一个方面，提供了一种糖肽，所述糖肽包含聚脯氨酸主链和一个或多个碳水化合物分子。所述糖肽的聚脯氨酸主链可以包含(4R)-叠氮基脯氨酸(Azp)。换句话说，所述聚脯氨酸主链可以是叠氮基官能化的。

在一个实施方案中，所述聚脯氨酸主链具有以下通式(I)：

其中R是H或N₃，并且n是正整数。在一个实施方案中，n是至少1。或者，n可以是至少2、至少3、至少4或至少5。举例来说，n可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50或更大。在一个实施方案中，n是4。在另一个实施方案中，n是8。在又另一个实施方案中，n是12。

所述碳水化合物分子可以沿所述聚脯氨酸主链连接在预定的位置处。可以基于所要结合的生物靶标(例如蛋白质)来选择碳水化合物的类型。举例来说，在生物靶标是神经生长因子(NGF)的情况下，用于形成糖肽的合适的碳水化合物可以是硫酸软骨素(CS)。可以使用其它合适的碳水化合物代替CS。本领域技术人员将能够确定适用于形成糖肽以结合期望的生物靶标的碳水化合物的类型。所述聚脯氨酸主链上一个或多个碳水化合物的定位可以基于诸如以下的因素来确定：所使用的碳水化合物分子的类型和/或结构以及期望的生物靶标的类型和/或结构(例如晶体结构)。

在一个实施方案中，所述碳水化合物分子沿所述聚脯氨酸主链以彼此相等的距离连接。本申请的发明人已经有利地发现增加碳水化合物分子之间的距离以及维持脯氨酸与糖单元之间最小的间隔区长度允许对碳水化合物单元进行最大限度的位置控制并且增强糖肽对它的一种或多种结合分子的结合亲和力。举例来说，碳水化合物分子可以存在于聚脯氨酸主链上的每一个脯氨酸单元上，或它可以存在于聚脯氨酸主链上每隔一个的脯氨酸单元上，或它可以存在于聚脯氨酸主链上每隔两个的脯氨酸单元上。在一个实施方案中，碳水化合物分子存在于聚脯氨酸主链上每隔两个的脯氨酸单元上。本领域技术人员还将能够基于所述糖肽所要结合的生物靶标来确定最佳的最小间隔区长度。

所述碳水化合物分子可以沿所述聚脯氨酸主链的所有面连接。或者，所述碳水化合物分子可以沿所述聚脯氨酸主链的同一面连接。本申请的发明人已经有利地发现将碳水化合物分子沿聚脯氨酸主链的单个面排列增强了糖肽对它的一种或多种结合分子的结合亲和力。

糖蛋白的结合分子可以包括诸如但不限于以下各项的分子：细胞表面受体、激素、蛋白质、其它糖蛋白、肽、碳水化合物，如凝集素或选择素，或可以包括诸如病毒、细胞、细菌等靶标。

所述聚脯氨酸主链可以是刚性的或半柔性的。

在一个实施方案中，所述一个或多个碳水化合物分子可以是炔烃官能化的。炔烃官能化使得所述一个或多个碳水化合物分子能够被并入到聚脯氨酸主链的PPII螺旋中。可以使用本领域已知的其它官能团来实现这个目的。举例来说，可以使用胺官能化的碳水化合物分子，所述碳水化合物分子可以经由酰胺偶合反应与聚脯氨酸主链缀合。

所述一个或多个碳水化合物分子可以选自由单糖、二糖、低聚糖以及多糖组成的组。示例性单糖包括但不限于β-D-葡萄糖、β-D-半乳糖、β-D-甘露糖、α-L-岩藻糖、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰神经氨酸、木糖等。示例性二糖包括但不限于蔗糖、乳果糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、硫酸软骨素、肝素、硫酸肝素、硫酸皮肤素、透明质酸、硫酸角质素等。示例性低聚糖包括但不限于棉子糖、水苏糖、低聚果糖、低聚半乳糖、异麦芽三糖、麦芽三糖、松三糖。示例性多糖包括但不限于纤维素、壳多糖、淀粉、糖原、果胶、胼胝质或昆布多糖、金藻昆布糖(chrysolaminarin)、木聚糖、阿拉伯木聚糖、甘露聚糖、岩藻依聚糖以及半乳甘露聚糖。

在一个实施方案中，所述一个或多个碳水化合物分子是二糖。举例来说，所述二糖可以是硫酸软骨素、肝素、硫酸肝素、硫酸皮肤素、透明质酸或硫酸角质素。硫酸软骨素可以选自由硫酸软骨素A、硫酸软骨素C、硫酸软骨素D以及硫酸软骨素E组成的组。在一个实施方案中，所述硫酸软骨素是硫酸软骨素E。

所述糖肽可以进一步在聚脯氨酸主链的一端包含一个或多个聚乙二醇(PEG)单元。有利的是，一个或多个PEG单元的并入使得能够引入期望的官能团以有助于一个或多个报告分子与PEG-糖肽复合物的缀合或有助于将糖肽固定到表面上。举例来说，可以在聚脯氨酸主链的一端处并入约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或更多个PEG单元。在一个实施方案中，在聚脯氨酸主链的一端处并入12个PEG单元。所述PEG可以是与生物素缀合的以有助于将糖肽固定到表面上，例如以用于分析中(例如用于将糖肽固定到ELISA分析中涂有链霉亲和素的板上或固定到涂有链霉亲和素的芯片上以用于表面等离子体共振)以及有助于通过诸如亲和色谱或亲和沉降测定(affinity pull-down assay)的技术对糖肽进行纯化。生物素化还可以有助于诸如用酶报告子或荧光探针对糖肽进行标记以用作体内诊断试剂。

在一个实施方案中，所述糖肽具有以下通式(II)：

其中X是如上文所限定的糖肽。

X可以是选自由以下各项组成的组的化学式：(P_E)₁₂、(P_E)₄G(P_E)₄G(P_E)₄、(PP_E)₁₂、(PPP_E)₁₂、(P_U)₁₂以及(PPP_U)₁₂，

其中P是脯氨酸；

G是甘氨酸；

P_E是以及

P_U是

在一个实施方案中，所述糖肽可以进一步包含脂质。所述脂质可以是脂肪酸、甘油脂、甘油磷脂、鞘脂、糖脂、聚酮化合物、甾醇脂质、异戊烯醇脂质等。

在第二个方面，提供了一种合成如上文所限定的糖肽的方法，所述方法包括使一个或多个碳水化合物分子连接到聚脯氨酸主链上。所述碳水化合物分子可以是炔烃官能化的，而所述聚脯氨酸主链可以是叠氮基官能化的，如上文所述。

在所述方法的一个实施方案中，经由点击反应使所述一个或多个碳水化合物分子连接到所述聚脯氨酸主链上。可以在DMSO中在环境温度下在碘化亚铜(I)、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)以及三[(1-苯甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺(TBTA)存在下在氩气氛下将所述点击反应进行约7天。可以使用本领域已知的用于使碳水化合物分子连接到聚脯氨酸主链的其它合适的方法。

所述方法可以进一步包括以下步骤：

(i)使由所述点击反应产生的反应混合物从THF/甲醇混合物中沉淀；

(ii)使所述反应混合物转化成它们的钠盐形式；以及

(iii)通过尺寸排阻色谱对所述盐进行纯化。

在一个实施方案中，所述碳水化合物分子是炔烃官能化的硫酸软骨素二糖。所述炔烃官能化的硫酸软骨素二糖可以通过以下来合成：

(i)使用三氟甲磺酸三甲代甲硅酯使三氯乙酰亚胺酯8转化成受充分保护的二糖9

(ii)使用正三丁基锡烷和AIBN，通过自由基介导的还原将N-三氯乙酰基还原成N-乙酰基同类物，得到乙酰胺10

(iii)将苯亚甲基缩醛水解，继而去除TMS基团，产生二醇11

(iv)任选地将二醇11用SO₃·三甲胺复合物处理；以及

(v)将所得的混合物用LiOOH和NaOH处理。

可以使用本领域已知的蛋白质合成方法，如经由固相肽合成(例如使用Fmoc或Boc作为一个或多个保护基)或液相肽合成来合成所述聚脯氨酸主链。

在一个实施方案中，所述方法包括经由液相肽合成来合成所述聚脯氨酸主链。所述液相肽合成可以包括以下步骤：

(i)使用O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)作为偶合试剂来使受Boc保护的氨基酸与氨基酸甲酯进行偶合；

(ii)在随后的偶合反应之前，分别通过用CF₃CO₂H/CH₂Cl₂混合物和NaOH水溶液处理来去除所得肽的Boc和甲酯保护基；

(iii)重复步骤(i)和(ii)直到获得所期望的聚脯氨酸衍生物为止；以及

(iv)通过二氧化硅快速柱色谱或反相HPLC来纯化所述聚脯氨酸衍生物。

在第三个方面，提供了一种用于疗法中的如上文所限定的糖肽。

在第四个方面，提供了一种治疗需要靶标特异性疗法的患者的方法，所述方法包括施用如上文所限定的糖肽。其中如上文所限定的糖肽可用于的示例性靶标特异性疗法包括但不限于癌症疗法、HIV疗法、以及针对诸如以下的疾病的疗法：神经退行性疾病(例如帕金森氏病(Parkinson's disease)、阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)等)、骨病、软骨疾病、免疫疾病(例如类风湿性关节炎、骨质疏松症)、炎症性疾病以及感染，如细菌感染、病毒感染以及真菌感染。

在第五个方面，提供了一种靶标特异性治疗剂，所述治疗剂包含如上文所限定的糖肽。其中如上文所限定的糖肽可用于的示例性靶标特异性治疗剂包括但不限于抗癌剂、抗HIV剂、抗炎剂、抗细菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂、抗生素、神经元促进剂等。

在第六个方面，提供了一种用作靶标特异性生物聚合物的如上文所限定的糖肽。其中如上文所限定的糖肽可用于的示例性靶标特异性生物聚合物包括但不限于抗凝剂(如抗凝性肝素模拟物)、生理活性调节剂(例如与诸如动脉粥样硬化、癌症以及自身免疫性病症的疾病具有临床关联性的趋化因子活性的调节剂)、抗登革热剂、抗疟疾剂等。

在第七个方面，提供了一种用于基于GAG的药物中的如上文所限定的糖肽。其中如上文所限定的糖肽可用于的示例性基于GAG的药物包括但不限于抗凝剂(如抗凝性肝素模拟物)、生理活性调节剂(例如与诸如动脉粥样硬化、癌症以及自身免疫性病症的疾病具有临床关联性的趋化因子活性的调节剂)、抗登革热剂、抗疟疾剂等。

在第八个方面，提供了一种用作诊断工具的如上文所限定的糖肽。其中如上文所限定的糖肽可用于的示例性诊断工具包括但不限于用于癌症、感染(例如细菌感染、病毒感染或真菌感染)、物质滥用(substance abuse)等的诊断工具。

在第九个方面，提供了一种控制糖肽对一种或多种结合分子的结合亲和力的方法，所述方法包括使一个或多个碳水化合物分子沿聚脯氨酸主链连接在预定的位置处。所述聚脯氨酸主链可以包含(4R)-叠氮基脯氨酸(Azp)，如上文所述。在一个实施方案中，所述聚脯氨酸主链具有以下通式(I)：

其中R是H或N₃，并且n是正整数。n可以是至少1，如上文所述。所述聚脯氨酸主链可以是刚性的或半柔性的。在控制糖肽对一种或多种结合分子的结合亲和力的方法的一个实施方案中，所述碳水化合物分子沿所述聚脯氨酸主链被连接在预定的位置处。举例来说，所述碳水化合物分子可以沿所述聚脯氨酸主链以及沿所述聚脯氨酸主链的同一面以彼此相等的距离被连接，如上文所述。

在第十个方面，提供了一种聚脯氨酸主链，所述聚脯氨酸主链包含(4R)-叠氮基脯氨酸(Azp)。所述聚脯氨酸主链可以用于制造如上文所述的包含沿所述主链在预定的位置处的碳水化合物分子的糖肽。

附图说明

附图图示了所公开的实施方案并且用来阐明所公开的实施方案的原理。然而，应当了解的是，所述附图仅被设计用于阐明目的，而不用作对本发明的限制条件的限定。

图1示出了在如图30的示意图中所描绘的合成如上文所限定的糖肽的方法的一个实施方案中在由三氯乙酰亚胺酯8转化之后，受充分保护的二糖9的¹H NMR谱。

图2示出了在如图30的示意图中所描绘的合成如上文所限定的糖肽的方法的一个实施方案中在由三氯乙酰亚胺酯8转化之后，受充分保护的二糖9的¹³C NMR谱。

图3示出了在如图30的示意图中所描绘的合成如上文所限定的糖肽的方法的一个实施方案中在用正三丁基锡烷和AIBN使N-三氯乙酰基经自由基介导的还原为N-乙酰基同类物之后，乙酰胺10的¹H NMR谱。

图4示出了在如图30的示意图中所描绘的合成如上文所限定的糖肽的方法的一个实施方案中在用正三丁基锡烷和AIBN使N-三氯乙酰基经自由基介导的还原为N-乙酰基同类物之后，乙酰胺10的¹³C NMR谱。

图5示出了在如图30的示意图中所描绘的合成如上文所限定的糖肽的方法的一个实施方案中在使10的苯亚甲基缩醛水解，继而去除TMS基团之后，二醇11的¹H NMR谱。

图6示出了在如图30的示意图中所描绘的合成如上文所限定的糖肽的方法的一个实施方案中在使10的苯亚甲基缩醛水解，继而去除TMS基团之后，二醇11的¹³C NMR谱。

图7示出了在如图30的示意图中所描绘的合成如上文所限定的糖肽的方法的一个实施方案中在将11脱保护之后，未硫酸化二糖12的¹H NMR谱。

图8示出了在如图30的示意图中所描绘的合成如上文所限定的糖肽的方法的一个实施方案中在将11脱保护之后，未硫酸化二糖12的¹³C NMR谱。

图9示出了在如图30的示意图中所描绘的合成如上文所限定的糖肽的方法的一个实施方案中在将11用SO₃·三甲胺复合体处理后，硫酸酯基序的¹H NMR谱。

图10示出了在如图30的示意图中所描绘的合成如上文所限定的糖肽的方法的一个实施方案中在将11用SO₃·三甲胺复合体处理后，硫酸酯基序的¹³C NMR谱。

图11示出了在如图30的示意图中所描绘的合成如上文所限定的糖肽的方法的一个实施方案中在LiOOH和NaOH的相继处理之后，所期望的CS-E二糖13的¹H NMR谱。

图12示出了在如图30的示意图中所描绘的合成如上文所限定的糖肽的方法的一个实施方案中在LiOOH和NaOH的相继处理之后，所期望的CS-E二糖13的¹³C NMR谱。

图13示出了生物素-PEG₁₂-叠氮基聚脯氨酸-OCH₃的一般结构以及示例性聚脯氨酸1至5的化学式。

图14示出了聚脯氨酸1的分析型HPLC曲线(顶部)和ESI质量数据(底部)。

图15示出了聚脯氨酸2的分析型HPLC曲线(顶部)和ESI质量数据(底部)。

图16示出了聚脯氨酸3的分析型HPLC曲线(顶部)和ESI质量数据(底部)。

图17示出了聚脯氨酸4的分析型HPLC曲线(顶部)和ESI质量数据(底部)。

图18示出了聚脯氨酸5的分析型HPLC曲线(顶部)和ESI质量数据(底部)。

图19示出了示例性聚脯氨酸1至5和糖肽1至7的FT-IR谱。糖肽的谱中叠氮化物谱带的消失表明CS-二糖至聚脯氨酸主链的偶合完成。

图20示出了糖肽1的¹H NMR谱。

图21示出了糖肽2的¹H NMR谱。

图22示出了糖肽3的¹H NMR谱。

图23示出了糖肽4的¹H NMR谱。

图24示出了糖肽5的¹H NMR谱。

图25示出了糖肽6的¹H NMR谱。

图26示出了糖肽7的¹H NMR谱。

图27示出了在25℃化合物12和13(2.4mM)的CD谱。

图28示出了在25℃糖肽1至7(0.2mM)的CD谱。

图29示出了(A)具有CS-E二糖的低聚脯氨酸PPII螺旋的模型；(B)含有CS二糖的修饰的聚脯氨酸糖肽1至7的结构；以及(C)糖肽1至7的碳水化合物展示的构型。

图30示出了(A)炔烃官能化的CS二糖的合成的示意图；(B)生物素化的叠氮基聚脯氨酸的合成的示意图；以及(C)用于合成糖肽1至7的点击反应的示意图。

图31示出了(A)在各种浓度下糖肽1至7对NGF的结合亲和力的比较；以及(B)来自图31(A)的糖肽1至3的放大图；◇1，▲2，○3，●4，■5，□6，◆7。所有数据均呈现为三次重复实验的平均值±SD。

图32示出了在不同的浓度(从上到下是185nM、93nM、46nM、23nM以及11nM)下NGF与固定的CS糖肽的结合的表面等离子体共振。在25℃，(A)使用糖肽5以及(B)使用糖肽1进行结合分析。

图33示出了使用如上文所限定的糖肽作为拟糖物在结合β-NGF中的用途的一个实施方案。

图34展示了糖肽1至7在PC12细胞中对NGF诱导的神经突生长的作用。在存在或不存在NGF(4ng/ml)和不同的糖肽(10μM)的情况下将细胞培养72小时。(A)对照/仅NGF；(B)糖肽5；(C)糖肽7；(D)CS-E多糖；(E)糖肽1；(F)糖肽4；(G)半柔性糖肽2；(H)无规卷曲糖肽3；(I)仅糖肽5。

图35展示了在两组实验条件下带有神经突的细胞的定量。左图：4ng/ml NGF和10μM糖肽，培养3天。右图：2ng/ml NGF和6μM糖肽，培养5天并且在第3天更换含有完全补充剂的培养基。对于每组条件，数据是来自三次独立实验的平均值±SD值。

图36示出了糖肽5增强PC12细胞中NGF介导的TrkA激活。NGF处理的对照样品的比率被归一化到1。对于每组条件，数据是来自五次独立实验的平均值±SD值(****p<0.0001)。

图37示出了所预测的糖肽5与NGF/TrkA复合体的结合位点(碱性残基用白色圈出)。

附图详细说明

实施例

将通过参考具体实施例进一步更详细地描述包括最佳方式以及比较实施例在内的本发明的非限制性实施例，所述实施例不应当被视为以任何方式限制本发明的范围。

实施例1：一般方法

除非另有说明，否则在火焰干燥的玻璃器皿中在氩气氛下并且使用无水溶剂(drysolvents)进行反应。除非另外指出，否则将所有可商购获得的试剂原样使用。使用E.Merck硅胶60F254预涂板(0.25mm)进行薄层色谱(TLC)。根据需要，通过UV、钼酸铈铵或茚三酮染色剂来对所显影的色谱图进行可视化。使用Merck硅胶60(粒度：0.040mm-0.063mm)进行快速色谱。使用凝胶过滤色谱(超细型葡聚糖凝胶(Sephadex)G-15)以实现糖肽的纯化。

在Bruker AVIII(400MHz)光谱仪上记录¹H NMR和质子去偶实验并且以相对于CDCl₃(7.26ppm)、CD₃OD(4.87ppm)、以及D₂O(4.80ppm)的百万分率(δ)的形式报告。¹H NMR谱的数据如下报告：化学位移(δppm)；多重性(s＝单峰，bs＝宽单峰，d＝双峰，t＝三重峰，q＝四重峰，m＝多重峰)；偶合常数(Hz)；以及积分。在Bruker AVIII(100MHz)光谱仪上获得¹³CNMR谱并且用化学位移来报告。质谱是从新加坡国立大学(National UniversityofSingapore)的化学、分子以及材料分析中心(Chemical,Molecular andMaterialsAnalysis Centre)获得的。

3-三甲代甲硅烷基炔丙基O-(2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯)-(1→3)-4,6-O-苯亚甲基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-β-D-吡喃半乳糖苷9：将供体8(0.500g，0.573mmol)与甲苯(3×5mL)一起共蒸发并且在真空下干燥过夜。向8和3-三甲代甲硅烷基炔丙醇(0.425mL，2.863mol)在无水CH₂Cl₂(7.35mL)中的溶液中添加粉状分子筛。将反应在室温下搅拌30分钟，冷却到-78℃，然后再搅拌30分钟。在-78℃将三氟甲磺酸三甲代甲硅酯(0.227mM于CH₂Cl₂溶液，0.115mmol，500μL)逐滴添加到反应中。使反应升温到-15℃，搅拌2小时，并且用三乙胺骤冷。将反应混合物经由硅藻土过滤并且浓缩，得到黄色糖浆状物。通过快速色谱(1％→2％的2-丙醇:CH₂Cl₂)纯化产物，得到呈淡黄色固体状的略微不纯的9。然后再一次通过快速色谱(2％→5％的THF:[2:1的己烷:CH₂Cl₂])纯化不纯的9，得到呈白色固体状的纯的9(0.295g，61％)。R_f＝0.45(6:3:1的CH₂Cl₂:己烷:THF)。¹HNMR(400MHz,CDCl₃):δ7.53(m,2H,ArH),7.38-7.33(m,3H,ArH),6.97(d,J＝6.8Hz,1H,NH),5.59(s,1H,PhCH),5.23(d,J＝8.2Hz,1H,H-1'),5.23(t,J＝9.4Hz,1H,H-4),5.16(t,J＝8.8Hz,1H,H-3),5.04(t,J＝7.8Hz,1H,H-2),4.90(d,J＝7.5Hz,1H,H-1),4.77(dd,J＝11.1,J＝3.4Hz,1H,H-3'),4.46(d,J＝3.3Hz,1H,H-4'),4.40(s,2H,CH₂-C≡C),4.33(d,J＝12.4Hz,1H,H-6'),4.10(d,J＝11.6Hz,1H,H-6'),4.03(d,J＝9.7Hz,1H,H-5),3.83-3.77(m,1H,H-2'),3.72(s,3H,OCH₃),3.55(s,1H,H-5'),2.01(s,3H,C(O)CH₃),2.01(s,3H,C(O)CH₃),2.00(s,3H,C(O)CH₃),1.99(s,3H,C(O)CH₃),0.16(s,3H,SiCH₃)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):δ170.20,169.57,169.32,167.32,162.27,137.80,128.99,128.24,126.33,100.83,100.40,100.17,96.10,92.54,92.48,75.76,74.22,72.57,72.12,71.40,69.22,69.14,66.76,56.53,55.03,53.04,20.97,20.72,20.63,-0.06；ESI MS：[C₃₄H₄₂Cl₃NO₁₅Si+Na]⁺的m/z计算值：860.1287，实测值：860.1296。9的¹H NMR谱示于图1中，并且它的¹³C NMR谱示于图2中。

3-三甲代甲硅烷基炔丙基O-(2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯)-(1→3)-4,6-O-苯亚甲基-2-脱氧-2-乙酰胺基-β-D-吡喃半乳糖苷10：使用修改自Bélot等^[1]的程序使三氯乙酰胺基团进行还原。将二糖9(0.353g，0.421mmol)溶解在甲苯(8.7mL)中，并且添加三丁基锡烷(1132μL，4.21mmol)和2,2'-偶氮双异丁腈(34.5mg，0.211mmol)。在室温下搅拌30分钟之后，将反应混合物加热到80℃并且再搅拌4小时30分钟。然后将反应物冷却到室温并且浓缩，得到白色固体。通过快速色谱(3％→11％的THF:CH₂Cl₂)纯化产物，得到呈白色固体状的所需乙酰胺(0.281g，91％)。R_f＝0.25(4％THF:CH₂Cl₂)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ7.53(m,2H,ArH),7.37-7.32(m,3H,ArH),5.81(d,J＝6.6Hz,1H,NH),5.56(s,1H,PhCH),5.25-5.18(m,3H,H-3,H-4,H-1'),5.01(t,J＝7.7Hz,1H,H-2),4.92-4.88(m,2H,H-1,H-3'),4.43-4.36(m,3H,H-4',CH₂-C≡C),4.30(d,J＝12.5Hz,1H,H-6'),4.08-4.02(m,2H,H-5,H-6'),3.70(s,3H,OCH₃),3.53(s,1H,H-5'),3.47-3.41(m,1H,H-2'),2.02(s,6H,NHC(O)CH₃,C(O)CH₃),2.00(s,3H,C(O)CH₃),1.98(s,3H,C(O)CH₃),0.18(s,3H,SiCH₃)；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃):δ171.31,170.29,169.59,169.18,167.47,137.90,128.92,126.37,100.85,100.81,100.57,97.07,91.88,75.98,75.16,72.52,72.03,71.74,69.29,69.18,66.60,56.75,54.31,52.98,23.98,20.86,20.75,20.65,-0.07；ESIMS：[C₃₄H₄₅NO₁₅Si+Na]⁺的m/z计算值：758.2456，实测值：758.2469。10的¹H NMR谱示于图3中，并且它的¹³C NMR谱示于图4中。

2-炔丙基O-(2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯)-(1→3)-2-脱氧-2-乙酰胺基-β-D-吡喃半乳糖苷11：将乙酰胺(0.353g，0.480mmol)溶解在AcOH/水(4:1，3.0mL)中并且在80℃搅拌。在30分钟之后，将反应混合物冷却并且浓缩。将所得的浓缩物与甲苯(3×3mL)共蒸发以完全去除AcOH。

向粗制二醇(0.242g，0.374mmol)在THF(3.7mL)中的溶液中添加TBAF(于THF中的1M溶液，18.8mmol，448μL)并且将混合物在0℃搅拌1.5小时。此时，添加Amberlyst IR-120树脂并且将反应物再搅拌30分钟。在过滤之后，将混合物浓缩以得到淡黄色固体。经由快速色谱(5％→7％的MeOH:CH₂Cl₂)纯化残余物，得到呈白色固体状的所需化合物(0.147g，53％)。R_f＝0.30(10％MeOH:CH₂Cl₂)。¹H NMR(400MHz,CD₃OD):δ5.35(t,J＝6.6Hz,1H,H-3),5.11(t,J＝9.8Hz,1H,H-4),5.00(dd,J＝8.0Hz,J＝9.4Hz,1H,H-2),4.91(d,J＝8.0Hz,1H,H-1),4.66(d,J＝8.2Hz,1H,H-1'),4.43-4.37(m,2H,CH₂-C≡C),4.29(d,J＝10.0Hz,1H,H-5),4.07(bs,1H,H-4'),4.00-3.98(m,1H,H-2'),3.91-3.89(m,1H,H-3'),3.81-3.72(m,2H,H-6'),3.75(s,3H,OCH₃),3.54(t,J＝5.8Hz,1H,H-5'),2.87(t,J＝2.32Hz,1H,C≡CH),2.06(s,3H,NHC(O)CH₃),2.03(s,3H,C(O)CH₃),2.01(s,3H,C(O)CH₃),2.00(s,3H,C(O)CH₃)；¹³C NMR(100MHz,CD₃OD):δ173.41,171.48,171.21,169.31,102.60,100.50,81.36,80.14,76.47,76.13,73.45,72.95,72.57,70.84,69.17,62.40,56.43,53.41,52.56,23.40,20.97,20.77,20.49,20.41；ESI MS：[C₂₄H₃₃NO₁₅+Na]⁺的m/z计算值：598.1748，实测值：598.1760。11的¹H NMR谱示于图5中，并且它的¹³C NMR谱示于图6中。

2-炔丙基O-(钠-β-D-吡喃葡萄糖醛酸盐)-(1→3)-2-脱氧-2-乙酰胺基-β-D-吡喃半乳糖苷12：将化合物11(40mg，0.0695mmol)溶解在THF(684μL)和H₂O(388μL)中并且冷却到0℃。向其中添加1M LiOH水溶液(270μL)和30％H₂O₂(135μL)。将反应在0℃搅拌1小时并且在室温搅拌12小时。此时，添加4M NaOH(203μL)和MeOH(1008μL)并且将反应再搅拌12小时^[2]。将它用Amberlyst IR-120树脂中和，过滤，并且冻干，得到橙色固体。将产物通过葡聚糖凝胶(Sephadex)G-15(100％H₂O)纯化并且冻干，得到呈白色固体状的12(28.7mg，95％)。¹H NMR(400MHz,D₂O):δ4.70(d,J＝8.6Hz,1H,H-1'),4.52(d,J＝7.8Hz,1H,H-1),4.44-4.42(m,2H,CH₂-C≡C),4.18(d,J＝3.1Hz,1H,H-4'),4.02(dd,J＝10.9,J＝9.8Hz,1H,H-2'),3.86(dd,J＝10.8,J＝3.2Hz,1H,H-3'),3.81-3.69(m,4H,H-5,H-5',H-6',H-6'),3.53-3.46(m,2H,H-3,H-4),3.37-3.32(m,1H,H-2),2.91(t,J＝2.4Hz,1H,C≡CH),1.94(s,3H,NHC(O)CH₃)；¹³C NMR(100MHz,D₂O):δ175.38,174.93,104.10,99.57,80.11,78.84,78.83,76.07,75.85,75.25,75.01,72.64,71.68,67.67,60.98,56.56,50.94,22.25；ESI MS：[C₁₇H₂₅NO₁₂-H]^-的m/z计算值：434.1299，实测值：434.1308。12的¹H NMR谱示于图7中，并且它的¹³C NMR谱示于图8中。

2-炔丙基O-(2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯)-(1→3)-4,6-二-O-钠磺酸根合-2-脱氧-2-乙酰胺基-β-D-吡喃半乳糖苷：向二醇11(0.050g，0.087mmol)于DMF(3.9mL)中的溶液中添加三氧化硫三甲胺复合物(SO₃·TMA)(0.305g，2.17mmol)。将反应混合物在50℃搅拌过夜，然后冷却到室温。将产物在葡聚糖凝胶(Sephadex)LH-20(50％的MeOH:CH₂Cl₂)上纯化，继而通过硅胶色谱(5％→20％的MeOH:CH₂Cl₂)纯化，得到呈白色固体状的硫酸化的二糖(0.053g，82％)。R_f＝0.20(20％MeOH:CH₂Cl₂)。¹HNMR(400MHz,D₂O):δ5.43-5.39(m,1H,H-3),5.27(t,J＝9.9Hz,1H,H-4),5.02-5.00(m,2H,H-1,H-2),4.89(bs,1H,H-4'),4.78(d,J＝8.6Hz,1H,H-1'),4.46(dd,J＝4.0,J＝2.4Hz,2H,CH₂-C≡C),4.42(d,J＝9.9Hz,1H,H-5),4.32(dd,J＝11.5,J＝3.4Hz,1H,H-6'),4.26-4.21(m,1H,H-6'),4.11-4.01(m,3H,H-2',H-3',H-5'),3.80(s,3H,OCH₃),2.85(bs,1H,C≡CH),2.11(s,3H,NHC(O)CH₃),2.10(s,6H,C(O)CH₃,C(O)CH₃),2.07(s,3H,C(O)CH₃)；¹³C NMR(100MHz,D₂O):δ174.45,173.01,172.70,172.43,169.34,100.59,100.00,99.27,78.72,78.70,76.34,76.29,75.73,72.52,72.39,71.44,71.32,69.43,67.67,56.91,53.50,51.09,22.23,20.15,20.00,19.92；ESIMS：[C₂₄H₃₃NO₂₁S₂-H]^-的m/z计算值：734.0908，实测值：734.0903。硫酸化的二糖的¹H NMR谱示于图9中，并且它的¹³C NMR谱示于图10中。

2-炔丙基O-(钠-β-D-吡喃葡萄糖醛酸盐)-(1→3)-4,6-二-O-钠磺酸根合-2-脱氧-2-乙酰胺基-β-D-吡喃半乳糖苷13：将硫酸化的化合物(185mg，0.251mmol)溶解在THF(684μL)和H₂O(338μL)中并且冷却到0℃。向其中添加1M LiOH水溶液(270μL)和30％H₂O₂(135μL)。将反应物在0℃搅拌1小时并且在室温搅拌12小时。此时，添加4M NaOH水溶液(203μL)和MeOH(1008μL)并且将反应物再搅拌12小时。然后将它用AmberlystIR-120树脂中和，过滤，并且冻干，得到橙色固体。将产物通过葡聚糖凝胶(Sephadex)G-15(100％H₂O)纯化并且冻干，得到呈白色固体状的13(136mg，91％)。¹H NMR(400MHz,D₂O):δ4.86(d,J＝2.4Hz,1H,H-4'),4.78(d,J＝9.0Hz,1H,H-1'),4.70(d,J＝7.8Hz,1H,H-1),4.45(dd,J＝4.1,J＝2.4Hz,2H,CH₂-C≡C),4.31(dd,J＝11.4,J＝3.3Hz,1H,H-6'),4.24-4.19(m,1H,H-6'),4.13-4.04(m,3H,H-2',H-3',H-5'),3.90(d,J＝9.8Hz,1H,H-5),3.61(t,J＝9.1Hz,1H,H-4),3.50(t,J＝9.3Hz,1H,H-3),3.40(dd,J＝9.4,J＝7.8Hz,1H,H-2),2.92(t,J＝2.4Hz,1H,C≡CH),2.04(s,3H,NHC(O)CH₃)；¹³C NMR(100MHz,D₂O):δ177.46,175.82,106.10,101.93,81.26,78.75,78.60,78.07,77.57,77.44,74.95,74.83,73.81,70.30,59.45,53.93,24.81；ESI MS：[C₁₇H₂₅NO₁₈S₂-H]^-的m/z计算值：594.0435，实测值：594.0429。13的¹HNMR谱示于图11中，并且它的¹³C NMR谱示于图12中。

用于液相肽合成的一般程序：在典型的液相肽合成中，将Boc-肽(1)-OH(1.0当量)溶解在DMF中(将最终浓度调节到0.1M)。然后将H-肽(2)-OCH₃(1.1当量)、TBTU(1.1当量)以及DIPEA(5.0当量)添加到溶液中。将反应混合物在室温搅拌直到反应完成为止。在完成之后，在真空中去除溶剂，得到黄色固体。将这一固体通过二氧化硅快速柱色谱或反相HPLC纯化，得到Boc-肽(1)-肽(2)-OCH₃。

用于对Boc-肽(1)-肽(2)-OCH₃进行Boc基团脱保护的一般方法：在0℃将Boc-肽(1)-肽(2)-OCH₃溶解在CH₂Cl₂/TFA(1:1)中，并且搅拌2小时。在完成之后，通过吹送缓慢的氮气流去除溶剂，然后添加乙醚，定量地得到呈白色沉淀物形式的H-肽(1)-肽(2)-OCH₃。

用于对Boc-肽(1)-肽(2)-OCH₃进行甲基脱保护的一般程序：向Boc-肽(1)-肽(2)-OCH₃(1.0当量)在THF/MeOH(1:1，将最终浓度调节到0.05M)中的溶液中添加NaOH水溶液(2.0当量)并且超声处理5分钟。此时，添加相同体积的CH₂Cl₂并且将反应物再搅拌2小时。然后将它用Amberlyst IR-120树脂中和，过滤并且在真空中蒸发，定量地得到H-肽(1)-肽(2)-OCH₃。

用于合成生物素-PEG₁₂-叠氮基聚脯氨酸-OCH₃的一般程序：向H-叠氮基聚脯氨酸-OCH₃(1.0当量)于DMSO(将最终浓度调节到0.1M)中的溶液中添加EZ-link NHS-PEG₁₂-生物素(1.2当量，来自赛默科技公司(ThermoScientific))和DIPEA(5.0当量)，并且在室温搅拌过夜。在完成之后，在真空中去除溶剂，得到黄色粘稠固体。通过反相HPLC纯化这一固体，得到生物素-PEG₁₂-叠氮基聚脯氨酸-OCH₃。生物素-PEG₁₂-叠氮基聚脯氨酸-OCH₃的结构示于图13中。用于生物素-PEG₁₂-叠氮基聚脯氨酸-OCH₃的分析型HPLC条件示于下表1中，而生物素-PEG₁₂-叠氮基聚脯氨酸-OCH₃的ESI-MS数据示于下表2中。聚脯氨酸1至5的分析型HPLC曲线和ESI质量数据分别示于图14至18中。

表1：用于生物素-PEG₁₂-叠氮基聚脯氨酸-OCH₃的分析型HPLC条件

*A：CH₃CN/0.1％TFA；B：H₂O/0.1％TFA。

表2：生物素-PEG₁₂-叠氮基聚脯氨酸-OCH₃的ESI-MS数据

经由点击反应合成糖肽的一般程序：在典型的点击反应中，在氩气氛下向小瓶中加入炔烃官能化的CS二糖(总共15.6当量，每个叠氮化物1.3当量)、生物素-PEG₁₂-叠氮基聚脯氨酸-OMe(1.0当量)、三[(1-苯甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺(TBTA，每个叠氮化物0.3当量)、以及小型搅拌棒。将混合物溶解在经过脱气的DMSO中，并且添加所需量的碘化亚铜(I)(每个叠氮化物0.3mol％)在DMSO中的原液和DIPEA(48当量)。然后将反应混合物在室温搅拌7天。通过装备有C-18柱的分析型反相HPLC监测生物素-PEG₁₂-叠氮基聚脯氨酸-OCH₃的消耗。在完成之后，添加无水THF/MeOH(9:1)，得到白色沉淀物(可以去除TBTA和DIPEA，这是因为糖肽和过量的CS-二糖在这种条件下是不可溶的)。将所述白色沉淀物溶解在200μL的6M NaCl水溶液中并且通过葡聚糖凝胶(Sephadex)G-15柱(100％H₂O)纯化，在冻干后得到呈白色固体状的所需糖肽。

使用FTIR针对点击偶合反应的完成监测叠氮化物振动谱带(～2100cm^-1)。使用Perkin Elmer FTIR Spectrum 100在4000cm^-1与800cm^-1之间以4cm^-1的光谱分辨率进行傅里叶变换红外光谱分析(Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR)，并且扫描数是4次。将样品放在锗台上并且在每一次测量之前挤压。糖肽的谱中叠氮化物谱带的消失表明偶合反应完成(图19)。糖肽1至7的¹H NMR谱示于图20至26中。

圆二色性分析：在装备有温度控制器的Aviv 410圆二色性光谱仪上记录CD谱。使用200μM(化合物12和13是2.4mM)浓度的糖肽溶液。CD测量之前，将在10mM磷酸氢二钠缓冲液(pH 7.0)中制备的所有样品溶液在4℃平衡24小时，然后在室温平衡1小时。使用具有1mm光程长度的样品池。在25℃从260mm到190mm记录光谱。如下计算平均残基椭圆率[θ]：

[θ]＝θ/(10·N·c·l)

θ表示以毫度为单位的椭圆率，N是氨基酸残基数，c是以mol·L^-1为单位的摩尔浓度，并且l是以cm为单位的样品池光程长度。化合物12和13的CD谱示于图27中，而糖肽1至7的CD谱示于图28中。

酶联免疫吸附测定(ELISA)：在实验之前将新的板用含有0.05％Tween20的PBS冲洗三次并且用PBS冲洗一次。将100μL的生物素化的糖肽溶液(0.5μM)添加到Pierce链霉亲和素包被的高结合力板(编号：15501)中的所需孔中，并且在室温孵育过夜。在固定糖肽之后，将板用含有0.05％Tween 20的PBS冲洗三次并且用PBS冲洗一次。然后将表面用125μL的含3％BSA的PBS封闭1小时，继而用含有0.05％Tween 20的PBS冲洗三次并且用PBS冲洗一次。将100μL的于含有1％BSA的PBS中的不同浓度(0nM、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM以及60nM)的NGF添加到孔中并且在37℃孵育2小时。将表面用含有0.05％Tween 20的PBS冲洗三次并且用PBS冲洗一次。

用含有0.05％Tween 20和0.5M NaCl的10mM乙酸钠缓冲液(pH 4.0)洗涤三次，持续10分钟。然后将板用200μL的PBS-0.05％Tween 20冲洗五次。之后，将板用10mM TBS、0.05％Tween 20以及0.5M NaCl洗涤一次，持续10分钟。将孔用PBS-0.05％Tween 20冲洗三次并且用PBS冲洗一次。

然后将孔与标记有HRP的抗NGF一起在含有1％BSA的PBS中孵育。然后使用100μL的TMB底物(来自赛默科技皮尔斯公司(Thermo ScientificPierce)，编号：0034021)使吸光度信号显影，持续20分钟至30分钟，之后用100μL的2M H₂SO₄淬灭。然后测量在450nm的吸光度。

表面等离子体共振：使用Biacore T100系统(通用电气医疗公司(GEHeathcare))进行亲和力测量。使用CM5传感器芯片进行所有的测量。首先，将所述仪器用HBS-EP+(通用电气医疗公司)缓冲液预充。然后，将700RU的链霉亲和素固定在所有的流动池上。使用0.4MEDC和0.1M NHS的1:1混合物活化流动池，并且注入在乙酸盐5.0缓冲液(通用电气医疗公司)中复原的0.008mg/mL链霉亲和素溶液。使用1M乙醇胺溶液(pH 8.5)对剩余的活化基团进行封闭。使用流动池1(或3)作为参照以扣除非特异性结合、漂移以及本体折射率，而将流动池2(或4)进一步固定以具有不同结构的二醇-肽样品。将生物素化的糖肽(20nM)溶解在HBS-EP+缓冲液中并且以30μL/min注入到流动池2(或4)中直到基线响应增加了104RU或127RU为止。然后使用运行缓冲液(HBS-EP+)预充所述仪器。将NGF溶解在HBS-EP+缓冲液中以产生185nM原液，将它连续稀释以产生低至11nM的浓度系列。对于给定的亲和力测量，在25℃使用50μL/min的流动速率将这些系列的肽溶液依次注入到流动池中，持续240秒的接触时间和800秒的解离时间。在注入每一种蛋白质溶液之后，通过2.5M MgCl₂以30μL/min持续30秒使流动池再生。

实施例2：糖肽的设计

通过叠氮基与带有炔烃的CS二糖部分的点击反应将CS二糖单体并入到PPII螺旋中^[3c]。此外，脯氨酸与糖单元之间最小的间隔区长度允许我们对碳水化合物单元进行最大限度的位置控制。最终，将与生物素缀合的PEG₁₂引入到肽链的末端处以促进表面连接(图29A和29B)。

基于上述考虑设计了七种糖肽。这些是：

i)在具有/没有主链柔性的螺旋的所有面含有CS-E二糖基序的两种糖肽(1和2)；

ii)含有完全柔性的主链的一种糖肽(3)；

iii)一种糖肽(4)，其沿螺旋主链含有均匀分布的CS-E二糖，但是与1相比间距更大；

iv)沿PPII螺旋的一个面展示所有的CS-E二糖的一种糖肽(5)；以及

v)含有未硫酸化的CS二糖部分的两种对照糖肽(6和7)。

所有的CS-E糖肽的微小差异仅在于它们的功能性基序的定向，但是具有相同数目的CS-E二糖。对1和4的相对蛋白质结合活性进行的比较将允许评价侧基之间距离的重要性。预想了如2中将甘氨酸残基纳入到聚脯氨酸上以引入链柔性。最终，糖肽5不仅提供了对糖密度的作用的了解，而且还提供了对活性基序的排列的了解(图29B和29C)。

实施例3：CS糖肽1-7的制备

研究开始于含有炔烃官能团的生物活性CS-E和未硫酸化CS二糖单元的合成(图30)。简单地说，以良好的产率和立体选择性将三氯乙酰亚胺酯8^[4]转化成受充分保护的二糖9，这是由三氟甲磺酸三甲代甲硅酯所介导的。值得注意的是，对末端炔烃进行保护以避免自由基锡氢化作用^[5]。在获得了关键中间体的情况下，使用脱保护-硫酸化步骤继续研究。使用正三丁基锡烷和AIBN使N-三氯乙酰基经自由基介导的还原为N-乙酰基同类物，得到乙酰胺10。将苯亚甲基缩醛水解，继而去除TMS基团，得到二醇11。用SO₃·三甲胺复合物对11进行的处理高效地提供硫酸酯基序。通过用LiOOH和NaOH相继处理成功地制成了所需的CS-E二糖13。在类似条件下将11脱保护，得到未硫酸化的二糖12。

由于典型的固相Fmoc化学导致非常低的偶合效率，因此经由标准的液相肽合成来制备所有的含有叠氮化物的聚脯氨酸衍生物。使用O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)作为偶合试剂使受Boc保护的氨基酸与氨基酸甲酯偶合。在随后的偶合反应之前，分别通过用CF₃CO₂H/CH₂Cl₂混合物和NaOH水溶液处理来去除所得肽的Boc和甲酯保护基。重复偶合和脱保护直到获得所需的聚脯氨酸衍生物为止。通过二氧化硅快速柱色谱或反相HPLC将所有肽纯化到同质并且通过质谱分析来表征。

在获得了CS二糖和聚脯氨酸衍生物的情况下，接下来的重点在于经由使炔烃官能化的CS二糖与叠氮基官能化的聚脯氨酸缀合来合成含糖聚合物。在DMSO中在环境温度下在碘化亚铜(I)、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)以及三[(1-苯甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺(TBTA)存在下在氩气氛下将点击反应进行7天。通过FT-IR和¹H NMR光谱法来监测叠氮基向1,2,3-三唑的完全转化(参见图19和图20至26中所示的NMR谱)^[6]。虽然叠氮基-聚脯氨酸的FT-IR谱揭示了在2100cm^-1处存在强振动谱带，这是叠氮化物部分的特征，但是在糖肽衍生物的谱中叠氮化物谱带的消失明确地证实了偶合反应的完成。此外，¹H NMR谱揭示了来自CS二糖的新信号。此外，在点击反应之后在8.2ppm处的特征峰表明了1,2,3-三唑连接的形成。因此，FT-IR谱和¹H NMR谱这两者充分证实了用于二糖的点击反应的效率。使所得的反应混合物从THF/甲醇混合物中沉淀，然后转化成它们的钠盐。通过尺寸排阻色谱进行纯化，得到所需的CS糖肽1-7。

实施例4：圆二色性研究

在成功制备了糖肽的情况下，进行圆二色性(CD)研究以探究所述糖肽的PPII螺旋稳定性。尽管一些报道已经表明聚脯氨酸可以被高效地官能化，而保持PPII构象^[3b,3c,3d]，但是进行尝试以验证庞大的并且带高电荷的侧基是否可以诱导主链的构象变化，从而使得难以将官能团定位在所需的位点处。对于这些研究，将肽溶液(400μM)在4℃孵育24小时以允许完全折叠并且在室温进行测量。为了检测糖肽的主链构象，将相应CS二糖的CD信号(参见图27)^[7]从糖肽的CD信号中减去。CD曲线(展示于图28中)证实虽然3的CD谱如所预期表现出无规卷曲构象，但是其它糖肽采取聚脯氨酸II型螺旋型，在224nm-228nm处具有最大正带并且在208nm-213nm处具有最小负带，如通常对于PPII螺旋所观测到的那样^[8]。这些数据确认了将CS二糖纳入到聚脯氨酸中没有影响主链的折叠，并且聚脯氨酸支架即使在沿螺旋的同一面存在阴离子基团的情况下仍维持了天然的结构。

实施例5：ELISA

为了评价糖肽与蛋白质受体相互作用的能力，通过ELISA研究每一种制剂与神经生长因子(NGF)的结合亲和力，所述NGF已知选择性地结合CS-E硫酸化基序^[9]。对于这一研究，将恒定浓度的糖肽固定在链霉亲和素包被的96孔板上，继而将各种浓度的NGF处理到溶液中作为细胞表面上GAG-细胞外蛋白质相互作用的模拟。通过与HRP缀合的多克隆NGF抗体来测量与糖肽结合的NGF的量。糖肽1和6用作这一蛋白质结合研究的初始化合物。结果是NGF以浓度依赖性方式与CS-E硫酸化糖肽1结合并且没有展示出与未硫酸化的糖肽6有显著的结合(图31A)。尽管1对NGF表现出中等的结合亲和力，但是这些结果与先前的报道相一致，在这些报道中，CS-E硫酸化基序提供了对NGF的主要结合表位。为了增强结合亲和力，进行尝试以修饰制剂1。聚脯氨酸支架的一个预期的后果在于糖肽主链的刚性将会妨碍靶蛋白质的结合，这是因为聚合物链的柔性对于通过适应相关蛋白质的二级结构来进行相互作用来说是重要的^[10]。为了解决这个问题，制备两种化合物，这两种化合物含有部分柔性链(通过并入甘氨酸残基)(2)或完全柔性链(3)。然而，与1相比，没有观测到结合亲和力的增强，这表明链的柔性在模型系统中不是关键性的因素(图31B)。

先前的研究已经证实多价配体中结合元件的密度可以影响对靶蛋白质的结合亲和力^[6d,10,11]。为了探究结合表位密度的影响，合成糖肽4。在这一设计中，在与CS-E缀合的脯氨酸之间添加脯氨酸残基以引入更大的间距，而保持与初始制剂1相同的糖表位空间排列。与1相比，这种修饰使得NGF结合亲和力显著提高约2.6倍(图31A)。值得注意的是，相对于任何其它因素，这种现象通过利用刚性聚脯氨酸特性完全源于结合表位之间的距离，而没有干扰空间和电子环境来实现的。最终，所有的CS单元均被部署在一个面，而其它两个面含有脯氨酸残基，这产生具有重复PPPE或PPPU单元的制剂5和7(图29B和29C)。化合物5是最有效的NGF结合配体，与1相比，提高4.6倍，而7没有表现出任何结合(图31A)。因此，所述结果明确地证实多价配体中结合表位的空间排列对针对靶受体的结合亲和力具有相当大的影响。

实施例6：表面等离子体共振

进一步利用表面等离子体共振(SPR)技术来促进对糖肽-NGF相互作用的定量实时动力学分析。使用EDC/NHS偶合化学以相对低的密度(约700RU)将链霉亲和素涂在羧基葡聚糖(carboxydextran)CM5传感器芯片上以阻止与NGF的非特异性相互作用。然后以根据分子量归一化的水平^[12](对于1和5，分别是104RU和127RU)，将生物素化的糖肽固定在链霉亲和素包被的表面上。在25℃通过以50μL·min^-1将各种浓度的NGF(11nM-185nM)在表面上注射240秒并且持续800秒记录解离来监测动力学，之后使用2.5M MgCl₂溶液使表面再生。如图32中所示，这两种CS-E硫酸化糖肽均由NGF高效地识别。此外，与糖肽1相比，糖肽5提供了更高的总响应，这表明5比1更高效地募集NGF。这些结果与上文所述的ELISA的结果相一致。使用二态结合模型进行进一步的动力学分析以全面了解这一结合事件。公知的是，许多碳水化合物-蛋白质结合过程比简单朗缪尔(Langmuir)1:1相互作用要复杂得多，并且表现出二态结合动力学^[13]。在这个模型中，与表面结合的糖肽与NGF结合以形成初始复合物，然后进行构象变化以形成更稳定的复合物^[14]。包括平衡常数KD在内的全部动力学参数(其中括号中为标准误差)给出于下表3中。这一动力学分析产生有趣的结果。K_D值的比较揭示制剂5(K_D＝137nM)比制剂1(K_D＝2500nM)以约18倍更强地与NGF结合。此外，动力学结果表明5的更高的结合亲和力主要是归因于与1(k_a1(1)＝1.95(±0.39)×10³M^-1s^-1)相比，相对快速的初始缔合速率(k_a1(5)＝4.65(±0.16)×10⁴M^-1s^-1)。这个结果表明结合表位陈列中的微小变化可以显著地影响靶受体蛋白被聚集的速率。先前的研究已经集中在基于结合表位密度，通过改变生物活性单体与无活性单体的比率来优化活性[10,11]。在此，发现结合基序的简单构象变化就足以操控受体-配体相互作用。

表3：糖肽1和5对NGF的计算(二态动力学模型)平衡结合常数

实施例7：用作生物模拟物的糖肽

神经营养蛋白是在中枢神经系统中发挥重要的作用以确保适当的脑功能的蛋白质家族。特别是，神经生长因子(NGF)对于某些神经元的存活和分化来说是关键的。它分布在脑的许多部分中，如黑质、基底前脑以及脑干。在这些部位中NGF的丧失可以导致神经元死亡以及最终的神经退行性病症，包括帕金森氏病和阿尔茨海默氏病。为了维持神经元的存活和神经突生长，NGF与跨膜受体TrkA结合，诱导受体磷酸化并且激活下游信号转导通路。NGF与TrkA之间的相互作用需要糖胺聚糖(GAG)硫酸软骨素，它促进稳定复合物的形成。设计和合成模拟天然GAG在各种系统中具有结合特异性和亲和力以及生物活性的糖肽。

实验程序

细胞培养

将大鼠嗜铬细胞瘤(PC12)细胞在T75组织培养瓶中维持在含有10％热灭活的马血清(HI-HS)、5％胎牛血清(FBS)以及1％青霉素(penicillin)/链霉素(streptomycin)的完全RPMI 1640生长培养基中。在实验之前将来自液氮的储备培养物在加湿室中在37℃和5％CO₂下培养72小时。

玻璃盖玻片的制备

将13mm玻璃盖玻片在65％硝酸中浸泡至少三天。将盖玻片在轻微摇动下用蒸馏水、70％乙醇以及100％乙醇洗涤3次，每次30分钟。将盖玻片在细胞培养罩中在紫外线灭菌下干燥过夜。对于涂布，向每一个盖玻片添加60μl的层粘连蛋白溶液(25μg/ml于无菌PBS溶液中)，继而在37℃孵育2小时。在使用之前将盖玻片用PBS冲洗3次，并且在培养罩中干燥。

神经突生长测定

将PC12细胞以100个细胞/mm²的密度在含有1％HI-HS的RPMI 1640分化培养基中接种在层粘连蛋白包被的盖玻片上。在37℃使细胞贴附于表面，持续1小时。将盖玻片转移到24孔板中并且将细胞与新鲜的分化培养基一起孵育1小时。在室温将糖肽与NGF在分化培养基中孵育1小时，之后共同添加到所述细胞中。在培养阶段结束时，在室温将细胞用4％甲醛溶液固定15分钟并且用PBS冲洗2次。将所有实验重复三次并且每一次按一式两份进行。对于每一种处理，对400个-500个随机选择的单细胞进行计数。通过对具有至少一个细胞体长的神经突长度的细胞数目进行计数来确定带有神经突的细胞的百分比。

蛋白质印迹

将PC12细胞以300个细胞/mm²的密度接种在层粘连蛋白包被的盖玻片上并且每一种处理使用一个盖玻片(总共约40,000个细胞)。在使用之前，使细胞在分化培养基中饥饿12-18小时。对于糖肽处理，在37℃将细胞与含有10μM糖肽的新鲜分化培养基一起孵育1小时。为了诱导TrkA磷酸化，在37℃将细胞用4ng/ml最终浓度的NGF处理5分钟。将细胞用冰冷的PBS洗涤并且使用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液裂解。将蛋白质样品在4％-12％SDS-PAGE凝胶上分离并且转移到硝化纤维素膜上。将膜在室温封闭1小时并且在4℃用抗TrkA Ab(1:1500)和抗pTrkA Ab(1:1500)探测过夜，继而与用辣根过氧化物酶缀合的二抗一起孵育2小时。使用增强型化学发光系统进行检测。使用ImageJ程序对条带进行定量并且计算磷酸化TrkA与总TrkA的比率并且以任意单位(a.u.)表示。

结果

PPPE12在PC12细胞中促进NGF介导的神经突生长

当使PC12细胞在无血清培养基中暴露于NGF时，观测到神经突的延长。与对照相比，单面糖肽5的处理显著地促进了神经突生长，而其它设计，如均匀分布的糖肽1和未硫酸化的糖肽7没有展示出作用(图34)。在不存在NGF的情况下，仅接受糖肽5处理的PC12细胞保持圆形和未分化，这表明所述糖肽经由NGF介导的通路起作用。在接受糖肽5处理的样品的情况下，带有神经突的细胞的百分比也大幅增加(图35)。

PPPE12处理增强了TrkA磷酸化

通过使用蛋白质印迹监测TrkA激活来研究糖肽5在NGF/TrkA通路中的作用。与对照样品相比，添加糖肽5使NGF诱导的TrkA磷酸化增加了约40％(图36)。这个发现进一步支持了细胞培养数据，即单面糖肽在NGF诱导的PC12分化过程中可以作为神经元促进剂起作用。

糖肽5促进稳定的NGF/TrkA复合物的形成

进行蛋白质建模研究以探究糖肽5与NGF/TrkA复合物之间的结合。根据NGF/TrkA复合物的晶体结构，有6个碱性残基相距线性排列(图37)。糖肽5提供12个二糖单元，所述二糖单元具有硫酸酯基团，相距面向同一个方向。这允许硫酸酯基团与碱性残基的完美几何契合，这使得静电相互作用达到最大并且稳定化NGF/TrkA复合物。

应用

综上所述，已经研发出一类新的CS糖肽，其中通过利用刚性聚脯氨酸支架精确控制CS基序的取向。操控多价相互作用的能力是有意义的，这是因为尽管具有高电荷密度，但是各设计对靶蛋白显示出不同的结合亲和力。确切地说，NGF对糖肽5表现出最高的结合亲和力，所述糖肽5所具有的所有CS-E基序均沿一个面。此外，制剂4和5比1更好的结合亲和力明确地证实在不干扰空间和电子环境的情况下结合表位对多价相互作用的影响。虽然迄今为止大部分的研究集中在基于结合表位优化活性，但是本发明强调了它们的空间和构象展示在设计多价配体中的重要性。本发明的发现预期提供一种用于开发靶标特异性治疗剂、生物聚合物和标记以及操控它们在体内的功能的有用工具。

将显而易见的是，本发明的各种其它改动和改进对于本领域技术人员在阅读了上述公开内容之后将是显而易见的，而不脱离本发明的精神和范围，并且所有这些改动和改进意图落入所附权利要求书的范围内。

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Claims (41)

1.一种糖肽，所述糖肽包含聚脯氨酸主链和一个或多个碳水化合物分子，其中所述聚脯氨酸主链具有以下通式(I)：

其中R独立地是H或N₃；其中至少一个R是N₃；n是1与50之间的整数；其中所述一个或多个碳水化合物分子选自由以下各项组成的组：硫酸软骨素、肝素、硫酸肝素、硫酸皮肤素、透明质酸以及硫酸角质素；并且其中所述一个或多个碳水化合物分子是炔烃官能化的，并且当R为N₃时在R处通过形成1,2,3-三唑连接至所述聚脯氨酸主链。

2.根据权利要求1所述的糖肽，其中n是8与50之间的整数。

3.根据权利要求1或2所述的糖肽，其中所述碳水化合物分子沿所述聚脯氨酸主链连接在预定的位置处。

4.根据权利要求3所述的糖肽，其中所述碳水化合物分子沿所述聚脯氨酸主链以彼此相等的距离连接。

5.根据权利要求3所述的糖肽，其中所述碳水化合物分子沿所述聚脯氨酸主链的同一面连接。

6.根据权利要求1、2、4和5中任一项所述的糖肽，其中所述聚脯氨酸主链是刚性的或半柔性的。

7.根据权利要求1、2、4和5中任一项所述的糖肽，其中所述硫酸软骨素选自由硫酸软骨素A、硫酸软骨素C、硫酸软骨素D以及硫酸软骨素E组成的组。

8.根据权利要求7所述的糖肽，其中所述硫酸软骨素是硫酸软骨素E。

9.根据权利要求1、2、4、5和8中任一项所述的糖肽，所述糖肽进一步在所述聚脯氨酸主链的一端处包含聚乙二醇(PEG)。

10.根据权利要求9所述的糖肽，其中所述PEG是与生物素缀合的。

11.根据权利要求10所述的糖肽，其中所述糖肽具有以下通式(II)：

其中X是根据权利要求1至8中任一项所述的糖肽。

12.根据权利要求11所述的糖肽，其中X是选自由以下各项组成的组的化学式：(PP_E)₁₂和(PPP_E)₁₂，

其中P是脯氨酸；并且

P_E是

13.根据权利要求1、2、4、5、8和10-12中任一项所述的糖肽，所述糖肽进一步包含脂质。

14.一种合成根据权利要求1至13中任一项所述的糖肽的方法，所述方法包括使一个或多个碳水化合物分子连接到聚脯氨酸主链上，其中所述一个或多个碳水化合物分子选自由以下各项组成的组：硫酸软骨素、肝素、硫酸肝素、硫酸皮肤素、透明质酸以及硫酸角质素。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述一个或多个碳水化合物分子经由点击反应被连接到所述聚脯氨酸主链上。

16.根据权利要求15所述的方法，所述方法包括在DMSO中在环境温度下在碘化亚铜(I)、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)以及三[(1-苯甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺(TBTA)存在下在氩气氛下将所述点击反应进行7天。

17.根据权利要求16所述的方法，所述方法进一步包括以下步骤：

(i)使由所述点击反应产生的反应混合物从THF/甲醇混合物中沉淀；

(ii)使所述反应混合物转化成它们的钠盐形式；以及

(iii)通过尺寸排阻色谱对所述盐进行纯化。

18.根据权利要求14至17中任一项所述的方法，其中所述碳水化合物分子是炔烃官能化的硫酸软骨素二糖。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述炔烃官能化的硫酸软骨素二糖是通过以下步骤合成的：

(i)使用三甲基甲硅烷基三氟甲磺酸酯使三氯乙酰亚胺酯8转化成受充分保护的二糖9

(ii)使用正三丁基锡烷和AIBN，通过自由基介导的还原将N-三氯乙酰基还原为N-乙酰基同类物，得到乙酰胺10

(iii)将所述苯亚甲基缩醛水解，继而去除所述TMS基团，产生二醇11

(iv)任选地将所述二醇11用SO₃·三甲胺复合物处理；以及

(v)将所得的混合物用LiOOH和NaOH处理。

20.根据权利要求14至17、19中任一项所述的方法，所述方法包括经由液相肽合成来合成所述聚脯氨酸主链。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述液相肽合成包括以下步骤：

(i)使用O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)作为偶合试剂来使受Boc保护的氨基酸与氨基酸甲酯进行偶合；

(ii)在随后的偶合反应之前分别通过用CF₃CO₂H/CH₂Cl₂混合物和NaOH水溶液处理来去除所得肽的Boc和甲酯保护基；

(iii)重复步骤(i)和(ii)直到获得所述所期望的聚脯氨酸衍生物为止；以及(iv)通过二氧化硅快速柱色谱或反相HPLC来纯化所述聚脯氨酸衍生物。

22.根据权利要求1至13中任一项所述的糖肽在制备用于治疗需要靶标特异性疗法的患者的癌症和神经退行性疾病的药物中的用途。

23.根据权利要求22所述的用途，其中所述糖肽结合选自由以下各项组成的组的靶标：选择素和神经生长因子。

24.一种靶标特异性治疗剂，所述靶标特异性治疗剂包含根据权利要求1至13中任一项所述的糖肽。

25.根据权利要求1至13中任一项所述的糖肽在制备靶标特异性生物聚合物中的用途。

26.根据权利要求1至13中任一项所述的糖肽在制备基于糖胺聚糖(GAG)的药物中的用途。

27.一种控制糖肽对一种或多种结合分子的结合亲和力的方法，所述方法包括使一个或多个炔烃官能化的碳水化合物分子沿叠氮基官能化的聚脯氨酸主链通过形成1,2,3-三唑连接在预定的位置处，其中所述一个或多个碳水化合物分子选自由以下各项组成的组：硫酸软骨素、肝素、硫酸肝素、硫酸皮肤素、透明质酸以及硫酸角质素。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述聚脯氨酸主链具有以下通式(I)：

其中R独立地是H或N₃；其中至少一个R是N₃；n是1与50之间的整数；并且其中当R为N₃时所述一个或多个碳水化合物分子在R处通过形成1,2,3-三唑连接至所述聚脯氨酸主链。

29.根据权利要求28所述的方法，其中n是8与50之间的整数。

30.根据权利要求27至29中任一项所述的方法，所述方法包括使所述碳水化合物分子沿所述聚脯氨酸主链连接在预定的位置处。

31.根据权利要求30所述的方法，所述方法包括使所述碳水化合物分子沿所述聚脯氨酸主链以彼此相等的距离连接。

32.根据权利要求27至29、31中任一项所述的方法，其中所述碳水化合物分子沿所述聚脯氨酸主链的同一面被连接。

33.根据权利要求27至29、31中任一项所述的方法，其中所述聚脯氨酸主链是刚性的或半柔性的。

34.根据权利要求1-13任一项所述的糖肽，其中所述糖肽能够结合选择素。

35.根据权利要求34所述的糖肽，其中所述糖肽选自由(P_E)₁₂、(PP_E)₁₂和(PPP_E)₁₂组成的组，其中P是脯氨酸；并且

P_E是

36.一种抑制选择素的体外方法，其包括使根据权利要求1-13任一项所述的糖肽与选择素接触。

37.根据权利要求36所述的体外方法，其中所述糖肽选自由(P_E)₁₂、(PP_E)₁₂和(PPP_E)₁₂组成的组，其中P是脯氨酸；并且

P_E是

38.根据权利要求1至13中任一项所述的糖肽在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

39.根据权利要求38所述的用途，其中所述用途包括所述糖肽与选择素结合。

40.根据权利要求38所述的用途，其中所述糖肽选自由(P_E)₁₂、(PP_E)₁₂和(PPP_E)₁₂组成的组，其中P是脯氨酸；并且

P_E是

41.一种糖肽，其包含聚脯氨酸主链和一个或多个碳水化合物分子，其中所述一个或多个碳水化合物分子选自由以下各项组成的组：硫酸软骨素、肝素、硫酸肝素、硫酸皮肤素、透明质酸以及硫酸角质素，

其中所述糖肽进一步在所述聚脯氨酸主链的一端处包含聚乙二醇(PEG)，其中所述PEG是与生物素缀合的，

其中所述糖肽具有以下通式(II)：

其中X是(P_E)₄G(P_E)₄G(P_E)₄，

其中P是脯氨酸；G是甘氨酸；

以及

P_E是