KR101134983B1 - 단백질 및 펩티드로의 접합을 위한 4개의 분지된덴드리머-폴리에틸렌글리콜 - Google Patents

단백질 및 펩티드로의 접합을 위한 4개의 분지된덴드리머-폴리에틸렌글리콜 Download PDF

Info

Publication number
KR101134983B1
KR101134983B1 KR1020087015901A KR20087015901A KR101134983B1 KR 101134983 B1 KR101134983 B1 KR 101134983B1 KR 1020087015901 A KR1020087015901 A KR 1020087015901A KR 20087015901 A KR20087015901 A KR 20087015901A KR 101134983 B1 KR101134983 B1 KR 101134983B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
peg
dendrimer
protein
conjugation
reaction
Prior art date
Application number
KR1020087015901A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20080072960A (ko
Inventor
호세 안겔 라몬 에르난데스
피델 라울 까스트로 오디오
비비안 마리아 사에스 마르티네스
롤란도 파에스 메이레렐스
에듀알도 페르난데스 산체스
Original Assignee
센트로 데 인제니에리아 제네티카 와이 바이오테크놀로지아
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 센트로 데 인제니에리아 제네티카 와이 바이오테크놀로지아 filed Critical 센트로 데 인제니에리아 제네티카 와이 바이오테크놀로지아
Publication of KR20080072960A publication Critical patent/KR20080072960A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101134983B1 publication Critical patent/KR101134983B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/26—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring from cyclic ethers and other compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
    • C08G65/321—Polymers modified by chemical after-treatment with inorganic compounds
    • C08G65/325—Polymers modified by chemical after-treatment with inorganic compounds containing nitrogen

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Polyethers (AREA)
  • Other Resins Obtained By Reactions Not Involving Carbon-To-Carbon Unsaturated Bonds (AREA)

Abstract

본 발명은 다음 식으로 나타낼 수 있는 모노에톡시-폴리에틸렌글리콜을 갖는 중합체 덴드리머-유사 구조에 관한 것이다:
Figure 112008046897084-pct00007
상기 구조의 카르복시기를 약학적으로 관심있는 접합체의 생산을 위해 기능화할 수 있다. 치료학적 단백질로의 이러한 덴드리머-유사 폴리에틸렌글리콜의 결합은 이들의 생체외 및 생체내 안정성을 증가시킨다.
폴리에틸렌글리콜, 덴드리머-유사 구조, 분지

Description

단백질 및 펩티드로의 접합을 위한 4개의 분지된 덴드리머-폴리에틸렌글리콜{FOUR BRANCHED DENDRIMER-PEG FOR CONJUGATION TO PROTEINS AND PEPTIDES}
본 발명은 단백질 ,펩티드,폴리펩티드 중합체를 수득하기 위한, 폴리에틸렌글리콜 polyethylene glycol; PEG)의 4개 분지를 갖는 덴드리머-유사 중합체 구조에 관한 것이다.
여러 약리학적 특성에서의 폴리에틸렌글리콜과 치료학적 단백질의 접합체의 이익은 널리 알려져 있다. 예를 들어, 혈액 내에서의 반감기는 이들 사이의 다른 원인에 의해 증가한다: 중합체 잔기는 프로테아제의 공격 및 면역계에 의한 약물의 인식을 예방하며 천연 단백질에 대한 접합체의 상당히 높은 유체역학적 부피는 신장 여과를 상당히 감소시킨다. 많은 원인에서 폴리에틸렌글리콜화가 생체외 단백질의 생물학적 효과에 영향을 미치더라도, 혈중 수명의 상당한 증가는 이의 치료 작용에서 더 효과적이도록 한다(Harris J. M. y Chess R. B. (2003) Effect of pegylation on pharmaceuticals. Nat. Rev. Drug Discov. 2:214-21).
폴리에틸렌글리콜화는 또한 소수성 상호작용에 의해 유도된 분해의 방식을 입체적으로 차단하며 단백질의 열 불안정성에 관련된 분자내 상호작용을 감소시키는 입체적 비-특이적 장애를 생성한다. 이러한 모든 것은 폴리에틸렌글리콜화된 단 백질이 변이되지 않은 분자에서보다 더 높은 물리학적 안정성을 가지도록 하며, 최종 약학적 제제의 개발에 매우 유용하다(Harris J. M. y Chess R. B. (2003) Effect of pegylation on pharmaceuticals. Nat. Rev. Drug Discov. 2:214-21).
단백질의 접합체에서 일반적으로 사용되는 시약은 모노메톡시폴리에틸렌글리콜 (monomethoxypolyethylene glycol; mPEG)로 알려진, 양끝 중 하나에서 메틸화된 폴리에틸렌글리콜이다. 메틸기가 PEG 사슬의 말단 중 하나를 보호한다는 사실은 다른 끝 쪽에 의해서만 이의 활성화를 가능하게 하는, 단기능성 시약이다. 일반적인 이기능성 또는 다기능성 시약에 대한 이의 접합이 단백질의 생물학적 활성에 영향을 미치는 가교를 이끌어내므로 이는 치료학적 단백질의 접합에 매우 중요하다. mPEG 분자는 항상 비-메틸화 중합체의 작은 단편인 디올(diol) 단편을 갖는다. 디올 단편은 매우 긴 사슬에 있어서 중합체화 가정을 제어하기가 더 어렵다는 사실에 의해 더 큰 분자량의 mPEG에서 더 크다(Roberts M. J., Bentley M.D., Harris J.M. (2002) Chemistry for peptide and protein PEGylation. Adv. Drug Deliv. Reviews 54:459-76).
PEG로부터 유래된 첫 번째 분자 중 하나는 염화시아노겐과의 반응에 의해 합성된 것이다. 그러나 이러한 시약과의 접합 실험은 광범위한 폴리에틸렌글리콜화를 유발한다. 이는 치료학적 단백질에 대해 바람직하지 않은데, 이는 활성 부위의 직접 차단에 의해 또는 접근가능한 단백질 표면으로부터 이러한 부위를 숨기는 위상학적 변화에 의해 높은 폴리에틸렌글리콜화 정도가 생물학적 활성에서의 갑작스런 쇠퇴를 일으키기 때문이다. 일반적으로 요구되는 접합체는 각 단백질 당 오직 하나 의 PEG가 있는 것이다; 이 분자는 모노-폴리에틸렌글리콜화된 것으로 알려졌다.
1980년대 이후에 "연성(softer)" 활성기를 사용하기 시작했다. 이들은 주로 N-히드록시숙신이미드 에스테르이나 다른 기 또한 사용되었다. 대부분의 공통 기 중 셋은 다음과 같다: 숙신이미딜 숙시네이트, 트레실레이트 및 숙신이미딜 카르보네이트. 활성화 PEG의 이러한 생성은 일차 생성(First Generation)으로서 알려졌다 (Roberts M. J., Bentley M.D., Harris J.M. (2002) Chemistry for peptide and protein PEGylation. Adv. Drug Deliv. Reviews 54:459-76).
1990대 후반에서 활성화 PEG의 이차 생성(Second Generation)이 나타났다. 두 가지의 중요한 진척이 있었다: 좀 더 선택적인 폴리에틸렌글리콜화(예를 들어: 단백질의 N-말단에 의해 바람직하게 접합하는 알데히드기) 및 분지 구조를 허용하는 기(Roberts M. J., Bentley M.D., Harris J.M. (2002) Chemistry for peptide and protein PEGylation. Adv. Drug Deliv. Reviews 54:459-76). 분지된 PEG의 예는 2개 분지를 갖는 단기능성(US 5,932,462), 4개 분자를 갖는 사기능성(tetrafunctional) 및 8개 분자를 갖는 팔기능성(octafunctional)이다. 치료 단백질의 접합을 위해 좀 더 유용한 활성화 PEG는 단기능성이며, 이는 단백질 및 중합체 사이의 가교를 피하기 때문이다. 분지된 PEG는 또한 단백질 표면의 더 나은 보호를 허용하는 우산형 구조를 갖는다.
두 분지의 단기능성 PEG는 천연 단백질보다 임상학적으로 더 나은 결과를 보이는 인터페론 알파 2a와의 접합체를 수득하도록 한다(Rajender Reddy K., Modi M.W., Pedder S. (2002) Use of peginterferon alfa-2a (40 KD) (Pegasys) for the treatment of hepatitis C. Adv. Drug Deliv. Reviews 54:571-86).
mPEG 합성에 대한 현재 기술로, 오직 30 kDa 사슬이 수득될 수 있으며, 두 분지를 갖는 시약이 최대 60 kDa을 갖는 분자량을 수득하도록 하는 이유이다. 특정 단백질에서 최적 수치를 수득하기 위해 광범위한 복합체의 탐구를 허용하는 더 큰 분자량의 단기능성 PEG를 갖는 구조를 갖는 것이 바람직하다. 그러나, 이전에 기술된 보고 중 어느 것도 단기능성이고 두 PEG 사슬 이상을 갖는 폴리에틸렌글리콜화를 위한 시약을 사용하거나 특성화하거나 언급한 것이 없었다. 두 PEG 사슬보다 더 많이 갖는 시약을 수득하는 경우에서, 더 큰 분자량의 접합체를 수득할 수 있었으며, 이전에 언급된 장점 이외에, 이는 두 분지-구조와 유사한 분자량의 폴리에틸렌글리콜화 시약을 생성하기 위해 더 짧은 mPEG 선형 분지를 사용하는 것을 허용할 수 있다. 이러한 작은 크기의 분지는 더 작은 디올 단편을 가질 수 있으며, 이는 합성 과정을 더 쉽게 한다.
본 발명은 4개 mPEG 분지를 갖는 단기능성 덴드리머-유사 구조를 제공하여, 상기 언급된 문제점을 해결한다. 이 구조는 120 kDa까지의 중합체 잔기를 갖는 접합체를 수득하도록 한다. 이 사실은 고분자량인 것을 포함하는, 매우 다양한 분자량을 갖는 접합체를 탐색하는 것을 허용한다. 게다가, 이러한 접근을 사용하여 다른 분지된 단기능성 시약과 유사한 분자량을 갖는 PEG분자를 수득할 수 있으나 이는 저분자량의 선형 사슬을 갖는다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서 중합체 분자를 수득하였으며, 여기에서 PEG 사슬의 분자량은 5,000 및 30,000 Da 사이이며, 총 분자량은 20,000 및 120,000 Da 사이이다.
소형의 선형 사슬의 사용은 더 큰 선형 PEG 분자의 전형적인 디올 오염을 대부분 제거하도록. 의외로, 본 발명의 구조를 갖는 접합체는 저분자량을 갖지만 두 분지만을 갖는 접합체보다 매우 높은 물리-화학적 안정성(고온 및 프로테아제에 의한 분해에 대한 내성)을 갖는다. 또한 의외로, 이들은 혈중에서 더 긴 평균 수명을 갖는다. 다른 의외의 결과는 본 발명의 덴드리며-유사 구조를 갖는 접합체가 좀더 균질하며 유사한 분자량을 갖지만 두 분지만을 갖는 접합체보다 낮은 위치 이성체를 갖는다.
덴드리머-유사 4개-분지 단기능성 PEG를 두 주요 단계에서 수득하였다. 첫 번째 단계는 예를 들어 리신일 수 있는 코어로 두 선형 PEG 분자의 화합에 의한 두-분지-유도체의 합성이다. 유사한 과정이 다른 저자에 의해 좋은 결과로 사용되었다(US 5,932,462). 두 번째 단계는 4개 분지-유도체를 수득하기 위해 이전의 것과 유사한 두 분지-유도체의 두 분자의 화합이다. 첫 번째 단계에서 코어로의 두 선형 PEG 분지의 결합을 위해 활성기를 가질 필요가 있다. 이 활성기는 본 분야에서 알려진 것 중에서 선택할 수 있다. 예를 들어, 다른 것 사이에서 숙신이미딜 숙시네이트, 숙신이미딜 카르보네이트, p-니트로페닐카르보네이트, 숙신이미딜 프로피오네이트, 숙신이미딜 부타노에이트이다. 본 발명에서 바람직한 선형 활성화 PEG는 숙신이미딜 카르보네이트이다. 이는 다른 주요 이유에 의한 것이다: 시약 및 유리 아미노기를 갖는 코어 사이의 우수한 반응 산출 및 이러한 다기능성화된 PEG의 생성의 용이함. 이러한 합성 과정(Miron T., Wilchek M. (1993) A Simplified Method for the Preparation of Succinimidyl Carbonate Polyethylene Glycol for Coupling to Proteins. Bioconjugate Chem. 4:568-69)은 본 분야에서의 연구에 의해 알려졌다:
Figure 112008046897084-pct00001
선형의 활성화 PEG가 준비되면, 첫 번째 단계는 코어로서 선택된 분자와의 이의 반응에 의해 완료된다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서 코어는 나중에 활성화될 수 있는 두 유리 아미노기 및 카르복실기를 갖는, 생적합성 성질에 기인하여 L-리신이다.
두 분지-유도체는 크로마토그래피 방법에 의해 반응 혼합물로부터 쉽게 정제된다. 이러한 두 분지-유도체는 코어 분자와의 순차적 반응 및 4개 분지-유도체의 합성에 대해 활성화되었다. 이 산물을 다른 방식으로 활성화될 수 있으나, 이의 효율 및 용이함에 기인한 바람직한 것은 N-히드록시숙신이미드 에스테르의 형성이다.
Figure 112008046897084-pct00002
이 과정은 N-히드록시숙신이미드 에스테르와 같은 PEG 사슬을 포함하는 구조를 갖는 카르복실기의 활성화를 위해 성공적으로 사용되었다(US 4,732,863 y US 5,932,462).
4개 분지-유도체의 제조의 두 번째 단계는 본 발명의 첫 번째 단계에서와 마찬가지로 코어 분자와 두 개 분지-유도체의 반응으로 구성되며; 본 발명의 바람직한 실시형태는 코어로서 L-리신이다.
Figure 112008046897084-pct00003
관심있는 유도체는 크로마토그래피 방법에 의해 반응 혼합물로부터 쉽게 정제된다.
이러한 덴드리머-유사 PEG 분자를 단백질로의 이의 접합에 대한 다른 반응기를 사용하여 활성화될 수 있다. 다른 PEG 구조의 활성화에 사용된 기능기 중 어떤 것은 이 특허에서 기재된 덴드리머-유사 PEG에 대하여 사용될 수 있다. 이러한 기의 몇몇 실시예는 다음과 같다: N-히드록시숙신이미드 에스테르, 숙신이미드 에스테르, 숙신이미딜 카르보네이트, 다른 유형의 알데히드, 말레이미드 등. 단백질로의 이러한 구조의 결합을 허용하는 다른 유형의 기들은 전이 금속을 통해 펩티드에 존재하는 히스티딘 잔기를 접합할 수 있는, 킬레이트제인 니트로아세테이트(nitriloacetate; NTA)이다. 반응기의 선택은 PEG 분자에 결합하기를 원하는 단백질 잔기에 따를 것이다.
예를 들어, 유리 아미노기와의 결합에 대해 선호된다면, 덴드리머-유사 중합체는 N-히드록시숙신이미드 에스테르로서 활성화될 수 있다. 그러므로 N-히드록시숙신이미드 에스테르는 본 발명에서 단계 1의 두 개 분지-구조의 활성화에 대해 기재된 동일한 과정에 따라 구체화로서 수득되었다.
Figure 112008046897084-pct00004
활성화 PEG와 단백질의 접합은 적절한 완충작용 용액에서 일어난다. 완충작용 용액의 특성은 다른 요소 중에서 중합체의 기능기 및 접합의 목적에 따른다. 예를 들어, N-히드록시숙신이미드 에스테르로서 기능화 PEG를 갖는 유리 아미노기에 의한 접합이 요구된다면, 접합 부위는 미리 결정된 pH를 사용하여 특정 정도까지 예측될 수 있다. 약 9의 pH 수치는 리신의 e-아미노기를 통한 접합에 유리할 것이다.
Figure 112008046897084-pct00005
다른 실시예는 알데히드 기능을 갖는 접합에서 약산 pH가 폴리에틸렌글리콜화가 단백질의 N-말단에서 바람직하게 일어나도록 할 것이라는 것이다. 관심있는 접합체의 이후 정제를 다른 크로마토그래피 기술에 의해 실행할 수 있다.
본 발명의 구체화에서, 접합체는 친핵기가 단백질, 펩티드 및 폴리펩티드 중에서 선택된 생분자에 포함됨이 기술되었다.
접합체의 몇몇 화학, 물리 및 생물학적 특성은 되도록 정제된 접합체에서와 같이 완전한 특성화를 이루기 위해 분석되어야 한다. 예를 들어, 접합체의 농도는 PEG 잔기가 대부분 단백질의 흡광도 계수에 영향을 미치지 않으므로 울트라바이올렛 분광기에 의해(280nm에서의 흡광도) 일반적으로 측정될 수 있다. 정제된 단백질의 순도를 바람직하게는 소듐 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis; SDS-PAGE)에 의해 측정해야 하며, 이는 겔 여과와 같은 크로마토그래피 방법이 관심있는 접합체 및 오염물질에 상응하는 신호를 불충분하게 분석할 수 있기 때문이다. 다른 물리-화학적 특성들을 일반 방법에 의해 연구할 수 있다.
이 작업의 결과에 따라, 본 발명의 바람직한 현실화는 단백질이 다음 중에서 선택되는, 접합의 제조를 기술한다: 인터페론 알파-2b, 스트렙토키나제, 과립구 콜로니 자극 인자, 에리트로포이에틴 또는 상피 성장 인자.
도 1은 프로테아제에 의한 분해에 대한 보호를 나타낸 것이다. X-축은 시간(시)을 나타내고 Y-축은 0시에서 질량 퍼센트로 표현되는 비-분해 단백질의 양을 나타낸 것이다.
도 2는 열 저항성을 나타낸 것이다. X-측은 시간(일)을 나타낸 것이고 Y-측은 0시에서의 질량 퍼센트로 표현되는 비-분해 단백질의 양을 나타낸 것이다.
실시예 1. N-히드록시숙신이미드 에스테르로서 활성화되는 PEG의 합성
구조 및 활성화의 수득
모노메톡시폴리에틸렌글리콜의 숙신이미딜키르보네이트(SC-PEG)의 수득 12,000 Da의 분자량을 갖는 모노메톡시폴리에틸렌글리콜 분자(mPEG12K) 15g을 500 mL 의 톨루엔에 용해시키고 3시간 동안 공비적으로(azeotropically) 건조시켰다. 그런 다음 부피를 250 mL으로 감소시키고 혼합물을 실온까지 냉각시켰다. 하기 시약을 이 용액에 첨가하였다: 60 mL 의 건조 디클로로메탄, 15mL의 건조 아세톤에 용해된 2 g 의 숙신이미딜 카르보네이트(DSC) 및 3:1 혼합의 톨루엔: DCM 10 mL에 용해된 1g의 디메틸아미노피리딘. 반응을 교반하면서 밤새(16h) 실행하였다. 반응 혼합물을 1 L의 차가운 디에틸 에테르로 침전시키고 침전물을 여과하여 수집하였다. 이 산물을 아세톤에서의 용해 및 디에틸 에테르로의 침전으로 3회 재-결정화시켰다. 최종 산물을 고진공 하에서 건조시키고 -20 ℃에서 질소 하에 저장하였다. 과정의 최종 수득률은 90% 이상이다. 활성화 PEG의 분획을 글리실-글리신과의 반응 및 TNBS와의 반응에 의한 유리 아미노기의 정량에 의해 측정하였다.
이폴리에틸렌글리콜화(biPEGylated) 리신 (Lys-2PEG)의 수득 20 g의 SC-PEG12K 를 pH 8.5의 붕산염 완충용액 10mM에서 a 0.2　mg/mL 의 농도로 용해된 L-(+)-리신 46 mg와 반응시켰다. 반응을 교반시키면서 실온에서 16시간 동안 실행시켰다. 이후에, 반응 혼합물을 이-증류수(bi-distilled water)에서 5배 희석시키고 pH를 염산으로 조절하였다. PEG를 DCM의 한 부피로 3회 추출하였다. 세 추출 분획의 풀을 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과하였다. DCM 내의 PEG 용액을 20 mL 까지 회전 증발기에서 농축시켰다. 농축물을 120 mL 의 차가운 디에틸 에테르로 침전시키고 여과하여 수집하고 고진공에서 건조시켰다. Lys-2PEG를 DEAE 세파로스를 갖는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 반응 혼합물의 나머지 성분으로부터 분리하였다.
1L 의 크로마토그래피 매트릭스를 포함하는 컬럼을 pH 7.5에서 100 mM의 붕산염 완충용액의 세 부피로 평형화시킨 후 이-증류수의 다섯 부피로 세척하였다. 10 g 의 반응 혼합물을 5 mg/mL 에서 이-증류수에 용해시켜 적용하였다. 반응하지 않은 PEG를 이-증류수의 두 부피로 컬럼을 세척하여 제거하고 Lys-2PEG를 염화나트륨의 1 mM 용액으로 용출시켰다. 이 분획의 pH를 염산을 사용하여 3으로 조절하고 DCM의 한 부피로 3회 추출하였다. 세 추출 분획의 풀을 무수 황산나트륨으로 건조시키고 건조시킨 후 여과하였다. DCM 내의 PEG 용액을 회전 증발기에서 10 mL 까지 농축시켰다. 농축물을 60 mL 의 차가운 디에틸 에테르로 침전시키고 여과하여 분리하고 고진공 하에서 건조시켰다. 순도 정도를 5%에서의 염화바륨 및 100 mM 요오드를 갖는 겔을 염색하는, SDS-PAGE에 의해 결정하였다. MALDI-TOF에 의해 측정된 분자량은 23.0-24.5 kDa이다. 과정의 총 수득량은 40%이상이다.
N-히드록시숙신이미드 에스테르로서 이폴리에틸렌글리콜화 리신의 활성화(PEG2 ,12K-NHS).
6 g의 Lys-2PEG를 20 mL 의 건조 DCM에 용해시키고, 60 mg의 N-히드록시숙신이미드 및 250 mg 의 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(DCC)를 첨가하였다. 반응을 실온에서 24 시간 동안 교반하면서 유지하였다. 혼합물을 여과하고 5 mL 까지 회전 증발기에 의해 농축시켰다. 산물을 20 mL 의 차가운 디에틸 에테르로 침전시켰으며 아세톤에 용해시키고 디에틸 에테르로 침전시켜 3회 결정화하였다. 최종 산물을 고진공 하에서 건조시키고 -20 ℃에서 질소 하에 저장하였다. 과정의 총 수득률은 95% 이상이다. 활성화 PEG의 분획을 글리실-글리신과의 반응으로 측정하고 유리 아미노기의 수를 TNBS와의 반응으로 정량하였다.
덴드리머-유사 4개-분지 PEG의 수득
5 g의 PEG2 ,12K-NHS를 pH 8.5의 100 mM 붕산염 완충용액 0.1 mg/mL에 용해시킨 7 mg의 L-(+)-리신과의 반응에 추가하였다. 반응을 실온에서 16시간 동안 교반하면서 실행하였다. 이후에, 반응 혼합물을 이-증류수로 5배 희석하고 pH를 염산을 사용하여 3으로 조절하였다. PEG를 DCM의 한 부피로 3회 추출하였다. 세 추출 분획의 풀을 항산나트륨으로 건조시키고 여과하였다. DCM 내의 PEG 용액을 회전 증발기에서 5 mL까지 농축시켰다. 농축물을 30 mL의 냉 디에틸 에테르로 침전시키고 여과하여 분리하고 고진공 하에서 건조시켰다. 덴드리머-유사 4개 분지-PEG를 G3000PW 컬럼에서 크기 배재 크로마토그래피로 정제하였다. 원하는 구조를 포함하는 분획의 pH를 염산을 사용하여 3으로 조절하고 DCM의 한 부피로 3회 추출하였다. 세 추출 분획의 풀을 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과하였다. DCM 내의 PEG 용액을 회전 증발기에서 5 mL까지 농축시켰다. 농축물을 30 mL의 냉 디에틸 에테르로 침전시키고 여과하여 분리하고 고진공 하에서 건조하였다. 순도 정도를 5%에서의 염화바륨 및 100 mM 요오드를 갖는 겔을 염색하는 SDS-PAGE에 의해 결정하였다. MALDI-TOF에 의해 측정된 분자량은 45.5-50 kDa이다. 과정의 총 수득량은 30%이상이다.
N-히드록시숙신이미드 에스테르로서 덴드리머-유사 4개 분지-PEG(PEG4 ,12K-NHS)의 기능화
1.5 g의 덴드리머-유사 4개 분지 PEG를 5 mL 의 건조 DCM에 용해시키고 9 mg 의 N-히드록시숙신이미드 및 37 mg 의 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드를 첨가하였다. 반응을 실온에서 24시간 동안 교반하면서 유지시켰다. 산물을 여과한 후 20 mL의 냉 디에틸 에테르로 침전시켰다. 침전물을 아세톤에 용해시키고 디에틸 에테르로 침전시켜 3회 재-결정화하였다. 최종 산물을 고진공 하에서 건조시키고 -20 ℃에서 유지시켰다. 과정의 총 수득률은 95% 이상이다. 활성화 PEG의 분획을 글리실-글리신과의 반응에 의해 측정하고 유리 아미노기 수를 TNBS와의 반응으로 측정하였다.
실시예 2. PEG4 ,12K-NHS와 접합된 IFN-α2b의 수득
접합 반응
N-히드록시숙신이미드 에스테르로서 활성화된 4g의 덴드리머-유사 4개 분지-PEG(PEG4,12K-NHS)를 pH 8.5의 120 mM 붕산염 완충용액 내에서 6 mg/mL로 1 g 의 IFN-α2b를 포함하는 용액에 첨가하였다. 적당하게 교반하면서 4 ℃에서 1시간 동안 반응을 유지한 다음 pH 4의 10 mM 아세트산나트륨 완충용액으로 50 배 희석하여 반응을 중지시켰다. 반응의 수득률을 코마시 브리릴언트 블루(Coomassie Brilliant Blue) R-250으로 염색된 SDS-PAGE의 밀도계측 분석에 의해 분석하였다. 덴드리머-유사 4개 분지-PEG를 갖는 모노폴리에틸렌글리콜화된 IFN-α2b의 분획은 40% 이상이다.
덴드리머-유사 4개 분지-PEG를 갖는 모노폴리에틸렌글리콜화된 IFN-α2b의 정제
500 mL의 프랙토겔(Fractogel) EMD 650 (M) COO- 를 포함하는 XK 50/60 컬럼(Pharmacia)을 40 mL/분의 유속으로, pH 4의 10 mM 아세트산염 완충용액의 3 부피로 평형화시켰다. 반응 혼합물을 포함하는 용액을 같은 유속으로 컬럼 상에 공급하였다. 반응하지 않은 PEG 및 하나 이상의 PEG 잔기를 갖는 접합체를 25 mM 염화나트륨을 갖는, pH 4 의 40 mM 아세트산염 완충용액으로 2시간 세척하여 제거하였다. 모노폴리에틸렌글리콜화 접합체를 150 mM 염화나트륨을 갖는, pH 4 의 50 mM 아세트산염 완충용액으로. 순도는 96% 이상이고 주요 오염물질은 변이되지 않은 인터페론 및 이폴리에틸글리콜 접합체이다. 관심있는 분획을 The fraction of interest was concentrated until 200 mL 까지 농축시키고pH 7의 50 mM 인산염 완충용액으로 평형화된 1 L의 세파덱스 G-25을 포함하는 XK 50/60 컬럼(Pharmacia) 상에 공급하였다. 덴드리머-유사 4개 분지-PEG를 갖는 모노폴리에틸렌글리콜화 인터페론을 0.2 ㎛ 세공 크기를 갖는 셀룰로스 아세트산염 막을 통해 여과하여 4 ℃에 보관하였다.
실시예 3. PEG4 ,12K-IFN-α2b의 물리-화학적 특성화.
접합체 농도의 측정
단백질 잔기의 기능으로서 접합체의 농도를 280 nm에서 UV-흡광도에 의해 측정하였다. 한 흡광도 유닛은 1 mg/mL의 농도에 상응하는 것으로 여겨진다.
접합체의 분자량의 결정
접합체의 분자량을 MALDI-TOF에 의해 측정하였다. 덴드리머-유사 4개 분지-PEG에 대해 예상되는 평균 분자량은 48,000 Da이며 IFN-α2b에 대해 예상되는 평균 분자량은 19,200 Da이므로, 접합체의 이론상 분자량은 67,200 Da이다. PEG4 ,12K-IFN-α2b 에 대한 계산 분자량은 64,000-70,000　Da이다.
실시예 4. PEG4 ,12K-IFN-α2b 접합체의 생물학적 특성화
ELISA-유형 검정에서 접합체의 면역학적 확인
음성 대조 뿐만 아니라 다른 농도에서의 접합체의 시료를 IFN-α2b 에 대한 모노클로날 항체로 회수된 ELISA 미세역가 플레이트 상에 공급하였다. 그런 다음, 서양고추냉이 퍼옥시다제에 접합되는, IFN-α2b의 다른 에피토프를 인식하는 다른 모노클로날 항체를 첨가하였다. 접합체 시료의 흡광도가 이러한 수치의 표준 편차의 3배가 더해진 음성 시료의 흡광도보다 높을 때 시료가 면역학적으로 인식된다고 여겨진다. 시료는 모든 경우에서 인식되었다.
생체외 항바이러스 활성
생체외 항바이러스 활성을 Hep-2 세포(ATCC No. CCL23) 상의 맹고바이러스(Mengovirus)에 의해 생성되는 세포변성 효과의 저해에 의해 측정하였다. 2% 우태아혈청 및 40　㎍/mL 의 젠타마이신을 갖는 최소 기초 배지에서의 접합체의 계열 희석(1:2)을 96-웰 미세역가 플레이트에서 세포 단층으로 혼합하였다. 플레이트를 3% 이산화탄소 대기 및 95% 상대 습도 하에서 37 ℃에서 항온하였다. 바이러스(107 TCID)를 첨가하고 플레이트를 세포변성 효과(90%의 세포 용해)가 나타날 때까지 항온시켰다. 세포 파괴의 수준을 크리스탈 바이올렛의 염색에 의해 측정하였다. 각 시료의 활성을 월드 헬스 오가니제이션(World Health Organization)으로부터의 IFN-α2b 국제 표준 69/19로 평가된, 국제 유닛(international units; IU)으로 나타냈으며 수득된 결과를 표 1에 나타냈다.
천연 IFN-α2b 및 덴드리머-유사 4개 분지- PEG에 접합된 인터페론의 생체외 항바이러스 활성.
시료 제제 항바이러스 활성(IU/mg)
천연 인터페론 - 2.0 x 108
덴드리머-유사 4개 분지-PEG로 변이된 인터페론
 1 1.1 x 107
2 0.9 x 107
3 1.2 x 107
생체외 항증식 활성.
생체외 항증식 활성을 다우디(Daudi) 세포(버키트 림프종; Burkitt Lymphom)의 성장을 저해하는 접합된 IFN-α2b의 능력에 의해 측정하였다. 결과는 PEG4 ,12K-IFN-α2b 의 생체외 활성이 변이되지 않은 IFN-α2b의 생체외 활성의 5%에 상응함을 나타낸다.
실시예 5. PEG4 ,12K-IFN-α2b의 물리-화학적 안정성
프로테아제에 의한 분해에 대한 내성
400　㎍/mL 의 천연 IFN-α2b를 함유하고, 유사한 분자량을 갖는 2개 또는 4개 분지-PEG에 결합되는, 40㎕의 4% 이산화나트륨 용액 pH 8을 10 μL의 160　㎍/mL 트립신 용액과 혼합하였다. 시료를 특정 시간 동안 37 ℃에서 항온하였다. 반응을 10 μL의 트리플루오로아세트산으로 중지시켰다. 단백질(접합되거나 접합되지 않은)의 잔여량을 코마시 브릴리언트 블루로 염색하는, SDS-PAGE 분석에서 밴드의 소멸에 의해 평가하였다. 결과(도 1)는 IFN-α2b 접합체의 분해에 대한 4개-분지 PEG를 야기하는 보호가 유사한 분자량(●)의 두-분지 구조에 의해 생성된 것보다 우수함을 나타낸다.
열 안정성
덴드리머-유사 4개 분지-PEG와의 IFN-α2b 접합의 안정성에서의 효과를 측정하기 위해, 천연 및 접합 단백질의 시료를 인산염 완충 식염수 내에서 60　℃에서 항온하였다. 유사한 분자량을 갖는 두 개-분지-PEG에 접합된 IFN-α2b의 시료를 대조로서 사용하였다. 시료를 특정 시간에 회수하고 단백질(접합되거나 접합되지 않은)의 잔여량을 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색된 SDS-PAGE 분석에서 밴드의 소실에 의해 평가하였다. 결과(도 2)는 4개-분지 구조와의 접합체(▲)의 열 안정성이 다른 두 경우[천연 IFN (■), 두 개 분지 구조에 접합된 IFN (●)]보다 더 높음을 나타낸다.
실시예 6. PEG4 ,12K-IFN-α2b의 약력학
변이되지 않은 인터페론 및 덴드리머-유사 4개 분지-PEG 사이의 비교 약력학 연구을 2 kg의 평균 무게를 갖는 뉴질랜드 토끼에서 수행하였다. 두 개 분지- PEG에 접합된 IFN-α2b를 대조로서 사용하였다. 생체분자를 무게당 150 ㎍의 단백질로 피하 경로로 주입하였다. 혈액 시료를 미리 결정된 시간에서 144 시간 간격으로 수집하였다. 시료를 원심분리하여 혈청을 분리하고 분석하기 전까지 -20 ℃에서 저장하였다. IFN-α2b 농도(접합되거나 접합되지 않은)를 이 사이토카인에 대해 특이적인 모노클로날 항체를 갖는 ELISA-유형 검정으로 측정하였다. 해석은 전형적인 구획 유두상 모델(compartment mammillary model)을 기초로 하였다. 결과를 표2에 나타냈다.
천연 IFN-α2b 및 두 개 분지-PEG 및 PEG4 ,12K-IFN-α2b에 접합된 IFN-α2b의 비교 약력학.
파라미터 천연 IFN-α2b 두 개 분지 IFN-PEG PEG4 ,12K-IFN-α2b
AUC, ㎍.h/mL 339.12 74907.38 88952.15
t1 /2 , h 2.38 50.48 63.58
MRT, h 4.33 90.68 105.23
실시예 7. 덴드리머-유사 4개 분지-PEG로의 치료학적 단백질의 접합
재조합 스트렙토키나제 (r-SK), 에리트로포이에틴 (EPO), 과립구-콜로니 자극 인자 (G-CSF) 및 상피 성장 인자 (EGF)와 같은 다른 치료학적 단백질을 덴드리머-유사 4 개 분지-PEG와 접합시켰다. 프로테아제에 의한 변성율에서의 접합의 효과를 평가하였다.
N-히드록시숙신이미드로서 활성화된 덴드리머-유사 4 개 분지-PEG의 접합.
100 mg의 N-히드록시숙신이미드로서 활성화된 덴드리머-유사 4 개 분지-PEG(PEG4 ,12K-NHS)를 pH 8.5의 120 mM 붕산염 완충용액에 6 mg/mL로 25 mg의 치료학적 단백질을 포함하는 용액에 첨가하였다. 적당하게 교반하면서 4 ℃ 에서 1시간 동안 반응을 유지시켰다. pH 4의 10 mM 아세트산나트륨 완충용액으로 50배 희석하여 반응을 중단시켰다. 반응 수득률을 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250으로 염색된 시료의 SDS-PAGE로부터 밀도계측 분석으로 결정하였다. 덴리리머-유사 4개 분지-PEG를 갖는 모노폴리에틸렌글리콜화된 단백질의 분획이 모든 경우에서 30% 더 높다.
알데히드로서 활성화된 덴드리머-유사 PEG와의 접합.
100 mg 의 알데히드로서 활성화된 덴드리머-유사 4개 분지-PEG(PEG4 ,12K-ALD)를 20 mM의 시아노보노하이드라이드를 갖는, pH 5의 100 mM 아세트산염 완충용액 내에서 4 mg/mL로 치료학적 단백질 15 mg을 포함하는 용액에 첨가하였다. 적당하게 교반하면서 4 ℃에서 24시간 동안 반응을 지속시키고 1 mM HCl으로 20배 희석하여 반응을 중지시켰다. 반응의 수득률을 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250으로 염색된 시료의 SDS-PAGE로부터 밀도계측 분석하여 결정하였다. 덴드리머-유사 4개 분지- PEG를 갖는 모노폴리에틸렌글리콜화 단백질의 분획이 모든 경우에서 30 % 더 높았다.
프로테아제에 의한 단백질의 분해에서 덴드리머-유사 4개 분지-PEG의 효과
400 ㎍/mL 의 천연 단백질 또는 4개 분지-PEG에 접합된 단백질을 포함하는, 40 ㎕ 의 a 4% 중탄산염 pH 8을 10 μL 의 160　㎍/mL 트립신 용액과 혼합하였다. 적당히 교반하면서 37 ℃ 에서 4시간 동안 시료를 항온하였다. 그 후에 10 μL의 트리플루오로아세트산으로 반응을 중단시켰다. 단백질(접합되거나 접합되지 않은)의 잔여량을 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색된 SDS-PAGE에서 밴드의 소실로 평가하였다. 결과(표 3)는 덴드리머-유사 4개 분지-PEG로의 접합이 트립신에 의한 분해로부터 접합된 단백질을 보호함을 나타낸다. 모든 경우에서 단백질의 35% 이상이 트립신과의 4 시간 반응 후에 분해되지 않았으며, 독립적으로 사용된 화학적 접합 방법이다. 그러나, 천연 단백질에서는 이 반응 후에 이러한 사인은 검출되지 않았다.
반응 전 단백질량에 대한 비분해 단백질의 분획(%)
단백질 천연 PEG4 ,12K-NHS와 접합 PEG4 ,12K-ALD와 접합
r-SK 0 % 38.2 ± 1.5 % 41.5 ± 0.9 %
EPO 0 % 39.8±2.3 % 37.5 ± 1.7 %
G-CSF 0 % 45.6 ±3.4 % 42.1 ± 2.9 %
EGF 0 % 35.1 ± 4.4 % 37.6 ± 4.8 %

Claims (6)

  1. 다음과 같은 식으로 표현될 수 있는 단백질 ,펩티드,폴리펩티드 중합체를 수득하기 위한 모노에톡시-폴리에틸렌글리콜의 4개 분지를 포함하는 중합체 덴드리머-유사 구조:
    Figure 112011057729826-pct00006
  2. 제1항에 있어서, 각 PEG사슬의 분자량이 5,000 및 30,000 Da 사이이고 총 분자량이 20,000 및 120,000 Da 사이인 중합체 구조.
  3. 제2항에 있어서, 카르복시기의 기능화에 의해 수득되는, 친핵성기와의 접합에서 활성화되는 중합체 구조.
  4. 제1항의 중합체 구조 및 친핵성기를 포함하는 접합체.
  5. 제4항에 있어서, 친핵성기는 단백질, 펩티드 및 폴리펩티드 중에서 선택된 생체분자인 접합체.
  6. 제5항에 있어서, 단백질은 인터페론 알파-2b, 스트렙토키나제, 과립구 콜로니 자극 인자, 에리트로포이에틴 또는 상피 성장인자 중에서 선택한 접합제.
KR1020087015901A 2005-11-30 2006-11-20 단백질 및 펩티드로의 접합을 위한 4개의 분지된덴드리머-폴리에틸렌글리콜 KR101134983B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CU2005-0241 2005-11-30
CU20050241A CU23556A1 (es) 2005-11-30 2005-11-30 Estructura polimérica semejante a dendrímero para la obtención de conjugados de interés farmacéutico
PCT/CU2006/000014 WO2007062610A2 (es) 2005-11-30 2006-11-20 Dendrímero con peg de cuatro ramas para la conjugación a proteínas y péptidos

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20080072960A KR20080072960A (ko) 2008-08-07
KR101134983B1 true KR101134983B1 (ko) 2012-04-09

Family

ID=37672068

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020087015901A KR101134983B1 (ko) 2005-11-30 2006-11-20 단백질 및 펩티드로의 접합을 위한 4개의 분지된덴드리머-폴리에틸렌글리콜

Country Status (17)

Country Link
US (1) US8703893B2 (ko)
EP (1) EP1967212B1 (ko)
JP (1) JP5123201B2 (ko)
KR (1) KR101134983B1 (ko)
CN (2) CN104906594B (ko)
AR (1) AR058841A1 (ko)
AU (1) AU2006319636B2 (ko)
BR (1) BRPI0604313A (ko)
CA (1) CA2631335C (ko)
CU (1) CU23556A1 (ko)
EG (1) EG26619A (ko)
MY (1) MY150739A (ko)
RU (1) RU2409389C2 (ko)
UA (1) UA91575C2 (ko)
UY (1) UY29981A1 (ko)
WO (1) WO2007062610A2 (ko)
ZA (1) ZA200804694B (ko)

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5989294B2 (ja) * 2006-01-20 2016-09-07 スターファーマ・プロプライエタリー・リミテッドＳｔａｒｐｈａｒｍａ Ｐｔｙ Ｌｔｄ 修飾高分子
US8252834B2 (en) 2008-03-12 2012-08-28 The Regents Of The University Of Michigan Dendrimer conjugates
WO2010039861A2 (en) 2008-09-30 2010-04-08 The Regents Of The University Of Michigan Dendrimer conjugates
WO2010054321A2 (en) 2008-11-07 2010-05-14 The Regents Of The University Of Michigan Methods of treating autoimmune disorders and/or inflammatory disorders
WO2010075423A2 (en) * 2008-12-23 2010-07-01 The Regents Of The University Of Michigan Dendrimer based modular platforms
CN102917699A (zh) * 2009-10-13 2013-02-06 密执安大学评议会 树枝状聚合物组合物和合成方法
US8912323B2 (en) 2009-10-30 2014-12-16 The Regents Of The University Of Michigan Multifunctional small molecules
US9402911B2 (en) 2011-12-08 2016-08-02 The Regents Of The University Of Michigan Multifunctional small molecules
CN107652438B (zh) * 2011-12-21 2021-10-12 加利福尼亚大学董事会 药物递送增强的末端树枝状聚合物
US9642916B2 (en) 2012-12-12 2017-05-09 The Regents Of The University Of California Porphyrin modified telodendrimers
US10660940B2 (en) * 2013-03-05 2020-05-26 Hanmi Pharm. Co., Ltd Preparation method for high-yield production of physiologically active polypeptide conjugate
EP2786766A1 (en) * 2013-04-05 2014-10-08 Ufpeptides S.r.l. Supramolecular aggregates comprising maleimido cores
WO2014207769A1 (en) 2013-06-27 2014-12-31 Mylan Laboratories Ltd Process for the preparation of nepafenac
CU20140003A7 (es) * 2014-01-08 2015-08-27 Ct De Inmunología Molecular Biofarmacuba Conjugado que comprende eritropoyetina y una estructura polimérica ramificada
ES2824028T3 (es) 2014-08-19 2021-05-11 Biogen Ma Inc Método de PEGilación
KR20180017104A (ko) * 2015-06-11 2018-02-20 앰비오 파마슈티컬스, 엘엘씨 Peg화된 과립세포 콜로니 자극 인자(gcsf)
EP3385383B1 (en) 2015-12-04 2021-04-07 Zenyaku Kogyo Co., Ltd. Anti-il-17 aptamer having improved retention in blood
CN114306629B (zh) 2016-01-08 2023-11-10 阿森迪斯药物生长障碍股份有限公司 具有增加的nep稳定性的控制释放cnp激动剂
WO2017118698A1 (en) 2016-01-08 2017-07-13 Ascendis Pharma Growth Disorders A/S Cnp prodrugs with carrier attachment at the ring moiety
CA3007982C (en) 2016-01-08 2023-12-19 Ascendis Pharma Growth Disorders A/S Controlled-release cnp agonists with low initial npr-b activity
CA3007976C (en) 2016-01-08 2023-09-26 Ascendis Pharma Growth Disorders A/S Cnp prodrugs with large carrier moieties
SG11201805026SA (en) 2016-01-08 2018-07-30 Ascendis Pharma Growth Disorders As Controlled-release cnp agonists with low npr-c binding
IL259658B2 (en) 2016-01-08 2024-06-01 Ascendis Pharma Growth Disorders As Controlled-release CNP agonists with reduced side effects
US11369688B2 (en) 2016-09-15 2022-06-28 The Regents Of The University Of California Hybrid telodendrimers
HRP20230385T1 (hr) 2016-09-29 2023-06-23 Ascendis Pharma Growth Disorders A/S Kombinirana terapija sa cnp agonistima s kontroliranim oslobađanjem
WO2019001473A1 (zh) * 2017-06-28 2019-01-03 北京键凯科技股份有限公司 一种树状多缩乙二醇衍生物及其制备方法和应用
CN109134282B (zh) * 2017-06-28 2021-03-16 北京键凯科技股份有限公司 一种树状多缩乙二醇衍生物及其制备方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996021469A1 (en) * 1995-01-10 1996-07-18 Shearwater Polymers, Inc. Multi-armed, monofunctional, and hydrolytically stable derivatives of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
WO2003040211A2 (en) * 2001-11-07 2003-05-15 Nektar Therapeutics Al, Corporation Branched polymers and their conjugates

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4732863A (en) 1984-12-31 1988-03-22 University Of New Mexico PEG-modified antibody with reduced affinity for cell surface Fc receptors
US5951974A (en) * 1993-11-10 1999-09-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates
US5985263A (en) * 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
US20040082765A1 (en) 2000-10-16 2004-04-29 Teruo Nakamura Peg-modified erythropoietin
US7144978B2 (en) * 2002-01-15 2006-12-05 Pan Asia Bio Co., Ltd. Multidrop tree branching functional polyethylene glycol, methods of preparing and using same
CN1569892A (zh) * 2004-04-30 2005-01-26 新峰生物科技（上海）有限公司 多臂树杈型聚乙二醇与蛋白质或多肽的结合物及其制备方法
CN1176137C (zh) * 2002-01-15 2004-11-17 泛亚生物技术有限公司 多臂树杈型功能化聚乙二醇制备方法及它在药物中的应用
ITMI20020951A1 (it) * 2002-05-06 2003-11-06 Univ Degli Studi Trieste Derivati multifunzionali del polietilenglicole loro preparazione ed impiego
CN1747748B (zh) * 2003-05-23 2011-01-19 尼克塔治疗公司 具有特定原子排列的聚合物衍生物
EP1653996A2 (en) * 2003-08-08 2006-05-10 Novo Nordisk Health Care AG Use of galactose oxidase for selective chemical conjugation of protractor molecules to proteins of therapeutic interest
CN101072789B (zh) * 2004-01-08 2013-05-15 生物种属学股份公司 肽的o-连接的糖基化
JP2008506704A (ja) * 2004-07-16 2008-03-06 ネクター セラピューティクス アラバマ，コーポレイション Ｇｍ−ｃｓｆ成分およびポリマーの複合体
EP1848461A2 (en) * 2005-02-16 2007-10-31 Nektar Therapeutics Al, Corporation Conjugates of an epo moiety and a polymer
RU2007128983A (ru) * 2005-02-16 2009-03-27 Ново Нордиск А/С (DK) Инсулинотропные агенты, конъюгированные со структурно определенными разветвленными полимерами

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996021469A1 (en) * 1995-01-10 1996-07-18 Shearwater Polymers, Inc. Multi-armed, monofunctional, and hydrolytically stable derivatives of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
WO2003040211A2 (en) * 2001-11-07 2003-05-15 Nektar Therapeutics Al, Corporation Branched polymers and their conjugates

Also Published As

Publication number Publication date
WO2007062610A3 (es) 2007-09-20
EG26619A (en) 2014-04-08
UA91575C2 (ru) 2010-08-10
JP5123201B2 (ja) 2013-01-23
UY29981A1 (es) 2007-06-29
CU23556A1 (es) 2010-07-20
CN104906594A (zh) 2015-09-16
EP1967212B1 (en) 2016-09-21
MY150739A (en) 2014-02-28
US8703893B2 (en) 2014-04-22
RU2008126209A (ru) 2010-01-10
KR20080072960A (ko) 2008-08-07
CA2631335C (en) 2013-07-16
AR058841A1 (es) 2008-02-27
CA2631335A1 (en) 2007-06-07
WO2007062610A2 (es) 2007-06-07
BRPI0604313A (pt) 2007-01-30
AU2006319636A1 (en) 2007-06-07
RU2409389C2 (ru) 2011-01-20
JP2009517414A (ja) 2009-04-30
US20090082537A1 (en) 2009-03-26
AU2006319636B2 (en) 2012-10-18
ZA200804694B (en) 2009-03-25
CN104906594B (zh) 2016-12-28
CN101389354A (zh) 2009-03-18
EP1967212A2 (en) 2008-09-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101134983B1 (ko) 단백질 및 펩티드로의 접합을 위한 4개의 분지된덴드리머-폴리에틸렌글리콜
AU2022268401B2 (en) Conjugates of an IL-2 moiety and a polymer
AU675798B2 (en) Low diol polyalkylene oxide biologically active proteinaceous substances
JP3177449B2 (ja) 水溶性ポリマーで修飾したコンセンサスインターフェロン
Payne et al. Product development issues for PEGylated proteins
KR20060135887A (ko) 신규의 ｇ-ｃｓｆ 콘쥬게이트
EP0576589A1 (en) Hydrazine containing conjugates of polypeptides and glycopolypeptides with polymers
EP1725583B1 (en) Methods for increasing protein polyethylene glycol (peg) conjugation
NO872227L (no) Tumornekrosefaktorformulering.
WO2006094530A1 (en) Di-polymer protein conjugates and processes for their preparation
CA2710841C (en) Y-shaped polyethylene glycol modified g-csf, the preparation and use thereof
US20230272001A1 (en) Novel processes for preparing conjugates of the il-2 protein
JP2002531529A (ja) 検出可能なリポーター部分を有する生物学的に活性な接合体、及びその同定方法
González et al. Novel reactive PEG for amino group conjugation
González et al. Reagents for the Covalent Attachment of mPEG to Peptides and Proteins
Bonora et al. Reactive PEGs for protein conjugation
JPWO2003000278A1 (ja) 軟膏剤
JPH10509208A (ja) 部位特異的結合のための官能化されたポリマー
González et al. Journal Name RSCPublishing

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150226

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160303

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170308

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180221

Year of fee payment: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190313

Year of fee payment: 8