JP2931622B2 - ポリエチレングリコール誘導体を得る製造方法 - Google Patents
ポリエチレングリコール誘導体を得る製造方法Info
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- JP2931622B2 JP2931622B2 JP9792390A JP9792390A JP2931622B2 JP 2931622 B2 JP2931622 B2 JP 2931622B2 JP 9792390 A JP9792390 A JP 9792390A JP 9792390 A JP9792390 A JP 9792390A JP 2931622 B2 JP2931622 B2 JP 2931622B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は高純度の蛋白質修飾試剤にて修飾された修飾
蛋白質に関するものである。
蛋白質に関するものである。
近年、遺伝子操作技術の進歩により生理活性を有する
蛋白質を大量に合成することが可能になり、医薬品とし
て使用することが期待されている。しかし、実際に医薬
品として生理活性蛋白質を使用すると体内のペプチダー
ゼなどにより分解を受けるため非常にクリアランスが速
いこと、あるいは目標とする組織への送達性あ悪いこと
などのために医薬としての有効性を示さない場合があ
る。また、異種生物から得た生理活性蛋白質をヒトに投
与した際には免疫反応のもたらす危険もあり得る。これ
らの問題を解決するために生理活性蛋白質を人工高分子
化合物、特にポリエチレングリコールを用いて化学修飾
することが試みられている。ポリエチレングリコールは
それ自体の免疫原性が非常に低く、これを蛋白質に化学
的に結合させることで抗原性の改善、免疫原性の改善、
毒性の低下やクリアランスの遅延などの効果が示されて
いる。
蛋白質を大量に合成することが可能になり、医薬品とし
て使用することが期待されている。しかし、実際に医薬
品として生理活性蛋白質を使用すると体内のペプチダー
ゼなどにより分解を受けるため非常にクリアランスが速
いこと、あるいは目標とする組織への送達性あ悪いこと
などのために医薬としての有効性を示さない場合があ
る。また、異種生物から得た生理活性蛋白質をヒトに投
与した際には免疫反応のもたらす危険もあり得る。これ
らの問題を解決するために生理活性蛋白質を人工高分子
化合物、特にポリエチレングリコールを用いて化学修飾
することが試みられている。ポリエチレングリコールは
それ自体の免疫原性が非常に低く、これを蛋白質に化学
的に結合させることで抗原性の改善、免疫原性の改善、
毒性の低下やクリアランスの遅延などの効果が示されて
いる。
また、当該結合体が有機溶媒に可溶なことから、加水
分解酵素（即ち、蛋白質）による合成反応が効果的に行
える。
分解酵素（即ち、蛋白質）による合成反応が効果的に行
える。
ポリエチレングリコールと蛋白質とを化学的に結合さ
せる方法としては、ポリエチレングリコールモノアル
キルエーテルを塩化シアヌールを介して２本鎖として蛋
白質のアミノ基に導入する方法〔稲田ら、特公昭61−42
558号公報、稲田ら、ケミストリーレタース、773（198
0）、稲田ら、ジャパニーズ ジャーナル オブ カン
サーリサーチ，77,1264（1986）、宮田ら、特開昭62−1
15280号公報〕、ポリエチレングリコールモノアルキ
ルエーテルのアシルアジド体を用いて蛋白質のアミノ基
に導入する方法（セオドゥス，ファン，エヌら、特公昭
56−23587号公報）、ポリエチレングリコールモノア
ルキルエーテルのアルデヒド体を用いる方法（藤野ら、
特開昭61−178926号公報）、ポリエチレングリコール
モノアルキルエーテルをイミドイル基を介して蛋白質の
アミノ基に導入する方法（藤野ら、特開昭63−10800号
公報）、ポリエチレングリコールモノアルキルエーテ
ルとＮ−ヒドロキシコハク酸イミドを用いる方法〔レオ
ナルド，エムら、テトラヘドロン，40,1581−1584（198
4）〕、ポリエチレングリコールモノアルキルエーテ
ルを塩化シアヌールを介して１本鎖として蛋白質のアミ
ノ基に導入する方法〔A.Abuchowskiら、J.Biol.Chem.25
2,3578（1977）〕、ポリエチレングリコールモノアル
キルエーテルをカルボニルジイミダゾールにより活性化
し、蛋白質のアミノ基に導入する方法〔チャールズ．オ
ー．ビーチャム等、Anal.Biochem.,131,25（1983）〕な
どが知られている。これらの内でも上記の方法はポリ
エチレングリコールモノアルキルエーテルと塩化シアヌ
ールから導かれる次式 〔式中、Ｒはアルキル基を表し、ｎは任意に変わりうる
正の整数を表す。〕 で表される化合物（III）をアミノ基に導入する修飾法
であり、一つのアミノ基に対して２本のポリエチレング
リコール鎖が導入可能であるという点で、他の修飾法
（上記〜の方法）にない特徴を有している。本修飾
法によった修飾蛋白質としてはアスパラキナーゼ（稲田
ら、特公昭61−42558号公報、稲田ら、ケミストリーレ
タース,773（1980）、稲田ら、ジャパニーズ ジャーナ
ル オブ カンサー リサーチ，77,1264（1986）〕、
スパーオキシドジスムターゼ（宮田ら、特開昭62−1152
80号公報）などが公知であるが、次式 〔式中、Ｒおよびｎは前記と同意義〕 で表される化合物（II）を用いた修飾法で得た修飾蛋白
質と化合物（III）を用いた修飾法で得た修飾蛋白質と
の比較が行われ、抗原性が低減、活性の保持において化
合物（III）を用いた場合の方がより優れた修飾法であ
ることが知られている。
せる方法としては、ポリエチレングリコールモノアル
キルエーテルを塩化シアヌールを介して２本鎖として蛋
白質のアミノ基に導入する方法〔稲田ら、特公昭61−42
558号公報、稲田ら、ケミストリーレタース、773（198
0）、稲田ら、ジャパニーズ ジャーナル オブ カン
サーリサーチ，77,1264（1986）、宮田ら、特開昭62−1
15280号公報〕、ポリエチレングリコールモノアルキ
ルエーテルのアシルアジド体を用いて蛋白質のアミノ基
に導入する方法（セオドゥス，ファン，エヌら、特公昭
56−23587号公報）、ポリエチレングリコールモノア
ルキルエーテルのアルデヒド体を用いる方法（藤野ら、
特開昭61−178926号公報）、ポリエチレングリコール
モノアルキルエーテルをイミドイル基を介して蛋白質の
アミノ基に導入する方法（藤野ら、特開昭63−10800号
公報）、ポリエチレングリコールモノアルキルエーテ
ルとＮ−ヒドロキシコハク酸イミドを用いる方法〔レオ
ナルド，エムら、テトラヘドロン，40,1581−1584（198
4）〕、ポリエチレングリコールモノアルキルエーテ
ルを塩化シアヌールを介して１本鎖として蛋白質のアミ
ノ基に導入する方法〔A.Abuchowskiら、J.Biol.Chem.25
2,3578（1977）〕、ポリエチレングリコールモノアル
キルエーテルをカルボニルジイミダゾールにより活性化
し、蛋白質のアミノ基に導入する方法〔チャールズ．オ
ー．ビーチャム等、Anal.Biochem.,131,25（1983）〕な
どが知られている。これらの内でも上記の方法はポリ
エチレングリコールモノアルキルエーテルと塩化シアヌ
ールから導かれる次式 〔式中、Ｒはアルキル基を表し、ｎは任意に変わりうる
正の整数を表す。〕 で表される化合物（III）をアミノ基に導入する修飾法
であり、一つのアミノ基に対して２本のポリエチレング
リコール鎖が導入可能であるという点で、他の修飾法
（上記〜の方法）にない特徴を有している。本修飾
法によった修飾蛋白質としてはアスパラキナーゼ（稲田
ら、特公昭61−42558号公報、稲田ら、ケミストリーレ
タース,773（1980）、稲田ら、ジャパニーズ ジャーナ
ル オブ カンサー リサーチ，77,1264（1986）〕、
スパーオキシドジスムターゼ（宮田ら、特開昭62−1152
80号公報）などが公知であるが、次式 〔式中、Ｒおよびｎは前記と同意義〕 で表される化合物（II）を用いた修飾法で得た修飾蛋白
質と化合物（III）を用いた修飾法で得た修飾蛋白質と
の比較が行われ、抗原性が低減、活性の保持において化
合物（III）を用いた場合の方がより優れた修飾法であ
ることが知られている。
〔発明が解決しようとする課題〕 ところで、修飾蛋白質を得るために、高純度の蛋白質
修飾試剤が有用である。しかしながら、蛋白質修飾試剤
である化合物（III）を前記の文献に記載の方法によ
って合成を試みたが、高速ゲル濾過クロマトグラフィー
による分析の結果、いずれの場合においても、反応生成
物は化合物（III）を含む混合物であることが判明し
た。即ち、平均分子量5000であるポリエチレングリコー
ルモノアルキルエーテルと塩化シアヌールを用いて平均
分子量10000の化合物（III）を得ようとする際、（ａ）
特公昭61−42558号公報に記載の方法に従い、10gの無水
炭酸ナトリウムを含む100mlの無水ベンゼンに分子量500
0のモノメトキシポリエチレングリコール20gを溶解し、
80℃で30分間還流した後、２・４・６−トリクロロ−ｓ
−トリアジン365mgを加え、80℃にて24時間還流下反応
させた。反応残留物を濾去し、石油エーテル300mlを加
えて沈澱を生ぜしめ、沈澱を数回石油エーテルで洗うと
いう操作を行なったところ、また（ｂ）特開昭62−1152
80号公報に記載の方法に従い、730mgの塩化シアヌール
を40gのポリエチレングリコールモノメチルエーテル
（平均分子量5000）、200mlのベンゼン、20gの無水炭酸
ナトリウムおよび10gのモノキュラシーブ3Aと混合物に
加え、80℃で20時間反応させた後、400mlの石油エーテ
ルで沈澱を生成させ、これをベンゼンに溶解、石油エー
テルで再沈澱させるという操作を３回繰り返したとこ
ろ、（ａ）、（ｂ）いずれの方法においても化合物（I
I）（Ｒ＝CH3）が主である分子量5000から高分子量領域
（図−2,3）までの広範囲にわたる数種の化合物からな
る混合物を得た。またケミストリーレタース,773（198
0）に記載の方法に従い、730mgの塩化シアヌールを40g
のポリエチレングリコールモノメチルエーテル（平均分
子量5000）、200mlの乾燥ベンゼン、20gの無水炭酸ナト
リウムおよび10gのモレキュラシーブ3Aの混合物に加
え、80℃で44時間反応させた後、400mlの石油エーテル
で沈澱を生成させ、これをベンゼンに溶解、石油エーテ
ルで再沈澱させるという操作を６回繰り返したところ、
化合物（II）（Ｒ＝CH3）、化合物（III）（Ｒ＝CH3）
および高分子量領域（図−４）からなる混合物を得た。
さらに、ジャパニーズ ジャーナル オブ カンサー
リサーチ，77,1264（1986）に記載の方法に従い1.12gの
塩化シアヌールを60gのポリエチレングリコールメチル
エーテル、200mlの無水ベンゼン、20gの無水炭酸ナトリ
ウムおよび20gのモレキュラシーブ4Aの混合物に加え、8
0℃で120時間反応させ、ベンゼンを留去の後、アセトン
に溶解、続いて石油エーテルで析出させるという操作を
３回繰り返したところ各種高分子領域（図−５）の化合
物が主である種々の物質を含む混合物を得た。
修飾試剤が有用である。しかしながら、蛋白質修飾試剤
である化合物（III）を前記の文献に記載の方法によ
って合成を試みたが、高速ゲル濾過クロマトグラフィー
による分析の結果、いずれの場合においても、反応生成
物は化合物（III）を含む混合物であることが判明し
た。即ち、平均分子量5000であるポリエチレングリコー
ルモノアルキルエーテルと塩化シアヌールを用いて平均
分子量10000の化合物（III）を得ようとする際、（ａ）
特公昭61−42558号公報に記載の方法に従い、10gの無水
炭酸ナトリウムを含む100mlの無水ベンゼンに分子量500
0のモノメトキシポリエチレングリコール20gを溶解し、
80℃で30分間還流した後、２・４・６−トリクロロ−ｓ
−トリアジン365mgを加え、80℃にて24時間還流下反応
させた。反応残留物を濾去し、石油エーテル300mlを加
えて沈澱を生ぜしめ、沈澱を数回石油エーテルで洗うと
いう操作を行なったところ、また（ｂ）特開昭62−1152
80号公報に記載の方法に従い、730mgの塩化シアヌール
を40gのポリエチレングリコールモノメチルエーテル
（平均分子量5000）、200mlのベンゼン、20gの無水炭酸
ナトリウムおよび10gのモノキュラシーブ3Aと混合物に
加え、80℃で20時間反応させた後、400mlの石油エーテ
ルで沈澱を生成させ、これをベンゼンに溶解、石油エー
テルで再沈澱させるという操作を３回繰り返したとこ
ろ、（ａ）、（ｂ）いずれの方法においても化合物（I
I）（Ｒ＝CH3）が主である分子量5000から高分子量領域
（図−2,3）までの広範囲にわたる数種の化合物からな
る混合物を得た。またケミストリーレタース,773（198
0）に記載の方法に従い、730mgの塩化シアヌールを40g
のポリエチレングリコールモノメチルエーテル（平均分
子量5000）、200mlの乾燥ベンゼン、20gの無水炭酸ナト
リウムおよび10gのモレキュラシーブ3Aの混合物に加
え、80℃で44時間反応させた後、400mlの石油エーテル
で沈澱を生成させ、これをベンゼンに溶解、石油エーテ
ルで再沈澱させるという操作を６回繰り返したところ、
化合物（II）（Ｒ＝CH3）、化合物（III）（Ｒ＝CH3）
および高分子量領域（図−４）からなる混合物を得た。
さらに、ジャパニーズ ジャーナル オブ カンサー
リサーチ，77,1264（1986）に記載の方法に従い1.12gの
塩化シアヌールを60gのポリエチレングリコールメチル
エーテル、200mlの無水ベンゼン、20gの無水炭酸ナトリ
ウムおよび20gのモレキュラシーブ4Aの混合物に加え、8
0℃で120時間反応させ、ベンゼンを留去の後、アセトン
に溶解、続いて石油エーテルで析出させるという操作を
３回繰り返したところ各種高分子領域（図−５）の化合
物が主である種々の物質を含む混合物を得た。
また本文献には、Sephadex G−100を担体としたゲル
濾過クロマトグラフィーを行い、本クロマトグラフィー
において分子量10000での単一のピークを示す精製品を
得、均一な化合物（III）（Ｒ＝CH3）を得たと記載され
ている。しかしながら近年、Sephadex G−100などを担
体とした低速ゲル濾過クロマトグラフィーに比べ、分離
能が優れた高速ゲル濾過クロマトグラフィーが開発さ
れ、従来分離不可能であった分離が可能になった（生化
学，56,1481（1984）。すなわち。Sephadex G−100など
を担体とした低速ゲル濾過クロマトグラフィーによる分
析は純度分析法としては不充分な方法である。事実、本
文献に従い、Sephadex G−100を担体としたゲル濾過ク
ロマトグラフィーを行い、本文献の分子量10000を示し
た主ピークで分画後、本クロマトグラフィーにおいて単
一ピークを示す部分を高速ゲル濾過クロマトグラフィー
により分析したところ、高分子量領域の化合物が主であ
る種々の化合物を含む混合物であった（図６）。
濾過クロマトグラフィーを行い、本クロマトグラフィー
において分子量10000での単一のピークを示す精製品を
得、均一な化合物（III）（Ｒ＝CH3）を得たと記載され
ている。しかしながら近年、Sephadex G−100などを担
体とした低速ゲル濾過クロマトグラフィーに比べ、分離
能が優れた高速ゲル濾過クロマトグラフィーが開発さ
れ、従来分離不可能であった分離が可能になった（生化
学，56,1481（1984）。すなわち。Sephadex G−100など
を担体とした低速ゲル濾過クロマトグラフィーによる分
析は純度分析法としては不充分な方法である。事実、本
文献に従い、Sephadex G−100を担体としたゲル濾過ク
ロマトグラフィーを行い、本文献の分子量10000を示し
た主ピークで分画後、本クロマトグラフィーにおいて単
一ピークを示す部分を高速ゲル濾過クロマトグラフィー
により分析したところ、高分子量領域の化合物が主であ
る種々の化合物を含む混合物であった（図６）。
このような広範囲にわたる分子量をもつ種々の化合物
を含む混合物から工業的な分離、精製手段（再結晶、再
沈澱、限外濾過など）によって効率的に目的物である化
合物（III）を得ることは従来なしえられていないのが
実情である。
を含む混合物から工業的な分離、精製手段（再結晶、再
沈澱、限外濾過など）によって効率的に目的物である化
合物（III）を得ることは従来なしえられていないのが
実情である。
一方、このような広範囲にわたる分子量をもつ種々の
化合物を含む混合物を使用して修飾された蛋白質は品質
が不均一性となるため、これらを医薬品として用いる場
合には不純物による副作用など種々の問題が予想され
る。
化合物を含む混合物を使用して修飾された蛋白質は品質
が不均一性となるため、これらを医薬品として用いる場
合には不純物による副作用など種々の問題が予想され
る。
従って、本発明はかかる問題点を解消することによ
り、生体内クリアランスの遅延、免疫原性の低下などの
修飾蛋白質の特性を有し、かつ非修飾蛋白質の生理活
性、その他の特性をそのまま有する修飾蛋白質を提供す
ることである。
り、生体内クリアランスの遅延、免疫原性の低下などの
修飾蛋白質の特性を有し、かつ非修飾蛋白質の生理活
性、その他の特性をそのまま有する修飾蛋白質を提供す
ることである。
本発明者らはこの度、高純度の化合物（III）を得る
ことに成功し、さらに研究を重ねたところ、当該高純度
の化合物（III）によって薬理活性を有する有用な蛋白
質、その他の蛋白質が極めて容易に修飾され、かつ当該
高純度の化合物（III）によって修飾された蛋白質は品
質が均一で、かつポリエチレングリコール修飾蛋白の特
徴である生体内クリアランスの遅延、免疫原性の低下、
有機溶媒に対する易溶性などの修飾蛋白質の特性を有
し、しかも非修飾蛋白質の有する生理活性、その他の特
性をそのまま有することを見出した。
ことに成功し、さらに研究を重ねたところ、当該高純度
の化合物（III）によって薬理活性を有する有用な蛋白
質、その他の蛋白質が極めて容易に修飾され、かつ当該
高純度の化合物（III）によって修飾された蛋白質は品
質が均一で、かつポリエチレングリコール修飾蛋白の特
徴である生体内クリアランスの遅延、免疫原性の低下、
有機溶媒に対する易溶性などの修飾蛋白質の特性を有
し、しかも非修飾蛋白質の有する生理活性、その他の特
性をそのまま有することを見出した。
本発明はかかる新知見に基づいて完成されたものであ
り、次式、 ＲOCH2CH2 nOH ……（Ｉ） 〔式中、Ｒおよびｎは前記と同意義〕 で示される化合物（Ｉ）と塩化イナヌールとをII B族金
属化合物の共存下に反応させることによって製造され
得、高分子量の生成物ならびに化合物（Ｉ）と塩化シア
ヌールの各々１分子が反応して得られる式 〔式中、Ｒおよびｎは前記と同意義〕 で表される化合物（II）等の副生成物が極めて少ない高
純度の式 〔式中、Ｒおよびｎは前記と同意義〕 で表される化合物（III）にて修飾された修飾蛋白質に
関するものである。
り、次式、 ＲOCH2CH2 nOH ……（Ｉ） 〔式中、Ｒおよびｎは前記と同意義〕 で示される化合物（Ｉ）と塩化イナヌールとをII B族金
属化合物の共存下に反応させることによって製造され
得、高分子量の生成物ならびに化合物（Ｉ）と塩化シア
ヌールの各々１分子が反応して得られる式 〔式中、Ｒおよびｎは前記と同意義〕 で表される化合物（II）等の副生成物が極めて少ない高
純度の式 〔式中、Ｒおよびｎは前記と同意義〕 で表される化合物（III）にて修飾された修飾蛋白質に
関するものである。
本発明の修飾蛋白質は式 〔式中、Ｒおよびｎは前記と同意義であり、Ｒ′はアミ
ノ基を有する蛋白質を表し、ｘは任意に変わりうる正の
整数を表す。〕 で表されるものである。
ノ基を有する蛋白質を表し、ｘは任意に変わりうる正の
整数を表す。〕 で表されるものである。
上記各式中、Ｒで示されるアルキル基としては炭素数
１〜18のものが好ましく、例えばメチル、エチル、ｎ−
プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、sc
e−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｎ−ヘキシ
ル、イソヘキシル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、イソノ
ニルｎ−デシル、イソデシル、ｎ−ウンデシル、ｎ−ド
デシル、ｎ−トリデシル、ｎ−テトラデシル、ｎ−ペン
タデシル、ｎ−ヘキサデシル、ｎ−ヘプタデシル、ｎ−
オクタデシルなどが挙げられ、中でも炭素数１〜４のも
のが特に好適である。最も好ましいものはメチルであ
る。
１〜18のものが好ましく、例えばメチル、エチル、ｎ−
プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、sc
e−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｎ−ヘキシ
ル、イソヘキシル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、イソノ
ニルｎ−デシル、イソデシル、ｎ−ウンデシル、ｎ−ド
デシル、ｎ−トリデシル、ｎ−テトラデシル、ｎ−ペン
タデシル、ｎ−ヘキサデシル、ｎ−ヘプタデシル、ｎ−
オクタデシルなどが挙げられ、中でも炭素数１〜４のも
のが特に好適である。最も好ましいものはメチルであ
る。
上記各式中、ｎで示される正の整数としては10〜700
が好ましく、とりわけ50〜350が好適である。
が好ましく、とりわけ50〜350が好適である。
式（IV）中、Ｒ′はアミノ基を有する蛋白質を表し、
当該蛋白質としては、ヒトを含む各種動物由来のもの、
微生物由来のもの、植物由来のもの、遺伝子工学産物、
合成品のいずれでもよい。例えばサイトカイン〔例、各
種インターフェロン（インターフェロン−α、インター
フェロン−β、インターフェロン−γ）、インターロイ
キン−２、インターロイキン−３など〕、ホルモン
（例、インスリン、成長ホルモン放出因子（GRF）、カ
ルシトニ、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（CGPR）、
心房性ナトリウム利尿ホルモン（ANP）、バソプレシ
ン、コルチコトロピン放出因子（CRF）、バソアクティ
ブインスティナルペプチド（VIP）、セクレチン、α−
メタニン細胞刺激ホルモン（α−MSH）、副腎皮質刺激
ホルモン（ACTH）、コレシストキニン（CCK）、グルカ
ゴン、副甲状腺ホルモン（PTH）、副甲状腺ホルモン関
連蛋白質（PTHrP）、ソマトスタチン、エンケファリ
ン、エンドセリン、サブスタンスＰ、ダイノルフィン、
オキシトシン、成長ホルモン放出ペプチド（GHRP,例え
ばEndocrinology 114,1537（1984）参照）など）、成長
因子（例、成長ホルモン（GH）、インスリン様成長因子
（IGF−Ｉ、IGF−II）、β−神経成長因子（β−NG
F）、塩基性繊維芽細胞成長因子（bFGF）、トランスフ
ォーミング成長因子−β（TGF−β）、エリスロポイエ
チン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−CSF）、顆粒球マ
クロファージコロニー刺激因子（GM−CSF）、血小板由
来成長因子（PDGF）、上皮細胞成長因子（EGF）な
ど）、酵素（例、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ
−PA）、エラスターゼ、スーパーオキシドジスムターゼ
（SOD）、ビリルビンオキシダーゼ、カタラーゼ、ウリ
カーゼ、ウロキナーゼ、サーモライシン、トリプシン、
キモトリプシン、V8プロテアーゼ、ペプシン、パパイ
ン、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチンABCリアーゼ、
アスパラギナーゼなど）、その他の蛋白質（例、ユビキ
チン、インスリン分泌活性化蛋白（IAP）、血清胸腺因
子（STF）、ペプチド−Ｔ、アルブミン、グロブリン、
トランスフェリン、リポ蛋白、リピドＡ誘導体、家ダニ
蛋白、トリプシンインヒビターなど）およびこれらの誘
導体が挙げられる。
当該蛋白質としては、ヒトを含む各種動物由来のもの、
微生物由来のもの、植物由来のもの、遺伝子工学産物、
合成品のいずれでもよい。例えばサイトカイン〔例、各
種インターフェロン（インターフェロン−α、インター
フェロン−β、インターフェロン−γ）、インターロイ
キン−２、インターロイキン−３など〕、ホルモン
（例、インスリン、成長ホルモン放出因子（GRF）、カ
ルシトニ、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（CGPR）、
心房性ナトリウム利尿ホルモン（ANP）、バソプレシ
ン、コルチコトロピン放出因子（CRF）、バソアクティ
ブインスティナルペプチド（VIP）、セクレチン、α−
メタニン細胞刺激ホルモン（α−MSH）、副腎皮質刺激
ホルモン（ACTH）、コレシストキニン（CCK）、グルカ
ゴン、副甲状腺ホルモン（PTH）、副甲状腺ホルモン関
連蛋白質（PTHrP）、ソマトスタチン、エンケファリ
ン、エンドセリン、サブスタンスＰ、ダイノルフィン、
オキシトシン、成長ホルモン放出ペプチド（GHRP,例え
ばEndocrinology 114,1537（1984）参照）など）、成長
因子（例、成長ホルモン（GH）、インスリン様成長因子
（IGF−Ｉ、IGF−II）、β−神経成長因子（β−NG
F）、塩基性繊維芽細胞成長因子（bFGF）、トランスフ
ォーミング成長因子−β（TGF−β）、エリスロポイエ
チン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−CSF）、顆粒球マ
クロファージコロニー刺激因子（GM−CSF）、血小板由
来成長因子（PDGF）、上皮細胞成長因子（EGF）な
ど）、酵素（例、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ
−PA）、エラスターゼ、スーパーオキシドジスムターゼ
（SOD）、ビリルビンオキシダーゼ、カタラーゼ、ウリ
カーゼ、ウロキナーゼ、サーモライシン、トリプシン、
キモトリプシン、V8プロテアーゼ、ペプシン、パパイ
ン、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチンABCリアーゼ、
アスパラギナーゼなど）、その他の蛋白質（例、ユビキ
チン、インスリン分泌活性化蛋白（IAP）、血清胸腺因
子（STF）、ペプチド−Ｔ、アルブミン、グロブリン、
トランスフェリン、リポ蛋白、リピドＡ誘導体、家ダニ
蛋白、トリプシンインヒビターなど）およびこれらの誘
導体が挙げられる。
式（IV）中、ｘはに任意に変わりうる正の整数である
が、修飾される蛋白質のアミノ基の数を超える数ではな
い。
が、修飾される蛋白質のアミノ基の数を超える数ではな
い。
前記した高純度の化合物（III）は、例えば以下のよ
うにして製造することができる。
うにして製造することができる。
即ち、化合物（Ｉ）と塩化シアヌールとをII B族金属
化合物の共存下に、適当な溶媒中で反応させることによ
って製造される。反応時間は通常１〜300時間であり、
反応温度は50〜140℃、好適には70〜110℃程度である。
ここで用いられる溶媒は本反応に用いる試剤に対し不活
性な溶媒ならいずれでも良く、例えばベンゼン、トルエ
ンなどの芳香族炭化水素系溶媒および1,2−ジクロロエ
タンなどのハロゲン化炭化水素系溶媒が挙げられる。共
存させるII B族金属化合物としては好ましくは酸化亜
鉛、酸化カドミウム、酸化水銀のII B族金属酸化物があ
げられる。また、反応系内より水分を除去する手段を講
じることが望ましく、例えばモレキュラシーブなどが用
いられる。
化合物の共存下に、適当な溶媒中で反応させることによ
って製造される。反応時間は通常１〜300時間であり、
反応温度は50〜140℃、好適には70〜110℃程度である。
ここで用いられる溶媒は本反応に用いる試剤に対し不活
性な溶媒ならいずれでも良く、例えばベンゼン、トルエ
ンなどの芳香族炭化水素系溶媒および1,2−ジクロロエ
タンなどのハロゲン化炭化水素系溶媒が挙げられる。共
存させるII B族金属化合物としては好ましくは酸化亜
鉛、酸化カドミウム、酸化水銀のII B族金属酸化物があ
げられる。また、反応系内より水分を除去する手段を講
じることが望ましく、例えばモレキュラシーブなどが用
いられる。
本発明によって得られる高純度ポリエチレングリコー
ル誘導体の純度は高速ゲル濾過クロマトグラフ法を用
い、以下の条件にて測定した。
ル誘導体の純度は高速ゲル濾過クロマトグラフ法を用
い、以下の条件にて測定した。
条件 カラム:TSK−gel G 3000SW 7.5mmφ×60cm（東ソー社
製） 溶出液：エタノール／〔0.01Mリン酸緩衝液（pH7）＋
0.2M食塩水〕＝1/19 流速:0.7ml/分， 検出波長:254nm 後記図−１〜６に示した分析はこの条件によった。
製） 溶出液：エタノール／〔0.01Mリン酸緩衝液（pH7）＋
0.2M食塩水〕＝1/19 流速:0.7ml/分， 検出波長:254nm 後記図−１〜６に示した分析はこの条件によった。
図−１に示されるように、本発明で使用されるポリエ
チレングリコール誘導体は従来技術によって得られたい
ずれのもの（図−２〜６）に比しても遥かに高純度であ
り、少なくとも面積百分率法による純度は75％を超える
ものである。
チレングリコール誘導体は従来技術によって得られたい
ずれのもの（図−２〜６）に比しても遥かに高純度であ
り、少なくとも面積百分率法による純度は75％を超える
ものである。
即ち、本願発明で使用されるポリエチレングリコール
誘導体は高速ゲル濾過クロマトグラフィーによる純度75
％を越えるものである。
誘導体は高速ゲル濾過クロマトグラフィーによる純度75
％を越えるものである。
ここに高速ゲル濾過クロマトグラフィーによる純度と
は、高速ゲル濾過クロマトグラフィーのチャートによっ
て形成される面積に対して、化合物（III）によって形
成されるピークの占める面積百分率である。通常データ
処理は例えばクロマトパックＣ−R6A（島津）などのデ
ータ処理機を用いて行う。
は、高速ゲル濾過クロマトグラフィーのチャートによっ
て形成される面積に対して、化合物（III）によって形
成されるピークの占める面積百分率である。通常データ
処理は例えばクロマトパックＣ−R6A（島津）などのデ
ータ処理機を用いて行う。
上記方法によって得られら反応生成物は既に化合物
（III）を極めて高純度に含めため、そのまま修飾試剤
として使用可能であるが、さらに高純度の化合物（II
I）を得ることを所望するならば、再結晶、再沈澱、限
外濾過などの工業的な分離、精製手段によって容易に得
ることが可能である。
（III）を極めて高純度に含めため、そのまま修飾試剤
として使用可能であるが、さらに高純度の化合物（II
I）を得ることを所望するならば、再結晶、再沈澱、限
外濾過などの工業的な分離、精製手段によって容易に得
ることが可能である。
本発明の高純度の化合物（III）による蛋白質の化学
修飾は従来と同様の方法により行なうことができる。即
ち、pH約８〜10のホウ酸、リン酸、酢酸などの緩衝溶液
中、室温以下の温度で約１〜72時間反応させればよい。
修飾試剤は所望の修飾度合いに応じて変化させて用い
る。反応液は必要に応じて透析、塩析、限外濾過、ゲル
濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ
ー、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィ
ー、アフィニティクロマトグラフィー、電気泳動などの
蛋白質の精製に通常用いられる手段によって精製し、目
的の修飾蛋白質を得ることができる。
修飾は従来と同様の方法により行なうことができる。即
ち、pH約８〜10のホウ酸、リン酸、酢酸などの緩衝溶液
中、室温以下の温度で約１〜72時間反応させればよい。
修飾試剤は所望の修飾度合いに応じて変化させて用い
る。反応液は必要に応じて透析、塩析、限外濾過、ゲル
濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ
ー、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィ
ー、アフィニティクロマトグラフィー、電気泳動などの
蛋白質の精製に通常用いられる手段によって精製し、目
的の修飾蛋白質を得ることができる。
本発明の修飾蛋白質はそれ自体公知の担体、希釈剤な
どを用い、適宜の医薬品組成物よりなる製剤（例えば、
カプセル剤、注射剤など）として経口的または非経口的
に哺乳動物（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヒト
など）に投与される。
どを用い、適宜の医薬品組成物よりなる製剤（例えば、
カプセル剤、注射剤など）として経口的または非経口的
に哺乳動物（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヒト
など）に投与される。
その投与に際して、例えば実施例46で得た修飾組織プ
ラスミノーゲン活性化因子を心筋梗塞の治療のために投
与する場合には、通常１〜100mgを１日１回から数回に
分けて投与される。
ラスミノーゲン活性化因子を心筋梗塞の治療のために投
与する場合には、通常１〜100mgを１日１回から数回に
分けて投与される。
また、修飾蛋白質が、修飾加水分解酵素である場合に
は、これを使用して、効果的に合成反応を行いうる。
は、これを使用して、効果的に合成反応を行いうる。
以下に実施例、実験例および参考例をもって本発明を
より具体的に説明するが、これらは本発明を限定するも
のではない。
より具体的に説明するが、これらは本発明を限定するも
のではない。
なお、以下の記載において各略号はそれぞれ次のこと
を意味する。
を意味する。
Asx:アスパラギン酸またはアスパラギン Glx:グルタミン酸またはグルタミン Ser:セリン Gly:グリシン His:ヒスチジ Arg:アルギニン Thr:スレオニン Ala:アラニン Pro:プロリン Tyr:チロシン Val:バリン Met:メチオニン Ile:イソロイソン Leu:ロイシン Phe:フェニルアラニン Lys:リジン TFA:トリフルオロ酢酸 Z :カルボベンゾキシ HPLC:高速液体クロマトグラフィー Bz :ベンゾイル 参考例１ 2,4−ビス−メトキシポリエチレングリコール−６−ク
ロロ−ｓ−トリアジン〔PEG2〕の製造 平均分子量が5000であるポリエチレングリコールモノ
メチルエーテル110gとモレキュラシーブ4A25gをベンゼ
ン0.5中で６時間、80℃にて還流した。室温まで放冷
後、酸化亜鉛50gと塩化シアヌール1.85gを加え、53時
間、80℃にて加熱還流した。室温まで冷却後、ベンゼン
0.5を加えて濾過した後、濾液を濃縮乾固し、標記化
合物（III）の一種であるPEG2108gを得た。
ロロ−ｓ−トリアジン〔PEG2〕の製造 平均分子量が5000であるポリエチレングリコールモノ
メチルエーテル110gとモレキュラシーブ4A25gをベンゼ
ン0.5中で６時間、80℃にて還流した。室温まで放冷
後、酸化亜鉛50gと塩化シアヌール1.85gを加え、53時
間、80℃にて加熱還流した。室温まで冷却後、ベンゼン
0.5を加えて濾過した後、濾液を濃縮乾固し、標記化
合物（III）の一種であるPEG2108gを得た。
物性値 ・高速ゲル濾過クロマトグラフィー 条件 カラム:TSK−gel G3000SW φ7.5mm×60cm（東ソー
社製） 溶出液：エタノール／〔0.01Mリン酸緩衝液（pH7）＋
0.2M食塩水〕＝1/19 流速 :0.7ml/分 検出波長:254nm 保持時間:20,967分 純度 :91.5％（面積百分率） チャート：図１の通り ・シリカゲル薄層クロマトグラフィー シリカゲル：キーセルゲル60（メルク社製） 展開溶媒：塩化メチレン／メタノール＝15/2 Rf値:0.5 実施例１ PEG2修飾パパイン（PEG2−Pa）の調製 9mlの0.2M酢酸塩緩衝液（pH4.5）に45mgのパパインを
溶解し、0.9gのPEG2を添加する。この溶液のpHを0.1Nの
カセイソーダで10まで上げ、28℃で１時間反応させる。
この反応液に200mlの冷却した0.2M酢酸塩緩衝液（pH6.2
5）を加えて反応を中止させる。限外濾過装置（分子量3
0000カット）で過剰のPEG2を除去し、0.1mMEDTAと1mMジ
メチオスライトール（DTT）を含む溶液に対して透析す
る。
社製） 溶出液：エタノール／〔0.01Mリン酸緩衝液（pH7）＋
0.2M食塩水〕＝1/19 流速 :0.7ml/分 検出波長:254nm 保持時間:20,967分 純度 :91.5％（面積百分率） チャート：図１の通り ・シリカゲル薄層クロマトグラフィー シリカゲル：キーセルゲル60（メルク社製） 展開溶媒：塩化メチレン／メタノール＝15/2 Rf値:0.5 実施例１ PEG2修飾パパイン（PEG2−Pa）の調製 9mlの0.2M酢酸塩緩衝液（pH4.5）に45mgのパパインを
溶解し、0.9gのPEG2を添加する。この溶液のpHを0.1Nの
カセイソーダで10まで上げ、28℃で１時間反応させる。
この反応液に200mlの冷却した0.2M酢酸塩緩衝液（pH6.2
5）を加えて反応を中止させる。限外濾過装置（分子量3
0000カット）で過剰のPEG2を除去し、0.1mMEDTAと1mMジ
メチオスライトール（DTT）を含む溶液に対して透析す
る。
修飾率:37.4％ 活性:19.7U/mg蛋白（70.3％）（一単位がpH6.2、25℃
で１分間にＮα−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエ
ステル（BAEE）を1.0μmol加水分解する） 実施例２ PEG2修飾キモトリプシン（PEG2−Ch）の調製 840mlの0.1Mホウ酸塩緩衝液（pH10.0）にα−キモト
リプシノーゲン1gを溶解し、４℃に冷却する。この溶液
に、24.2gのPEG2を１時間かけて添加し、４℃で20時間
反応した。反応液を0.1N塩酸で中和し、限外濾過装置
（分子量30000カット）で過剰のPEG2を除去した。この
反応でアミノ機はトリニトロベンゼンスルホン酸法で測
定したところ27％修飾されていた。修飾α−キモトリプ
シノーゲンを常法に従い、トリプシンで活性化して水で
透析し、PEG2−Chを得た。
で１分間にＮα−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエ
ステル（BAEE）を1.0μmol加水分解する） 実施例２ PEG2修飾キモトリプシン（PEG2−Ch）の調製 840mlの0.1Mホウ酸塩緩衝液（pH10.0）にα−キモト
リプシノーゲン1gを溶解し、４℃に冷却する。この溶液
に、24.2gのPEG2を１時間かけて添加し、４℃で20時間
反応した。反応液を0.1N塩酸で中和し、限外濾過装置
（分子量30000カット）で過剰のPEG2を除去した。この
反応でアミノ機はトリニトロベンゼンスルホン酸法で測
定したところ27％修飾されていた。修飾α−キモトリプ
シノーゲンを常法に従い、トリプシンで活性化して水で
透析し、PEG2−Chを得た。
修飾率:27.0％ 活性:30.51U/mg蛋白（67.8％）（一単位がpH7.8、25
℃で１分間にＮ−ベンゾイル−Ｌ−チロシンエチルエス
テル（BTEE）を1.0μmol加水分解する） 実施例３ PEG2修飾サーモライシン（PEG2−Th）の調製 68.8mlの0.1Mホウ酸塩緩衝液（pH10.0）に344mgのサ
ーモライシンを溶解し、４℃に冷却する。この溶液に、
1.1gのPEG2を１時間かけて添加し、４℃で17時間反応し
た。反応液を0.1N塩酸で中和し、限外濾過装置（分子量
30000カット）で過剰のPEG2を除去して目的物を製造し
た。この反応でアミノ基は26.9％修飾されていた。
℃で１分間にＮ−ベンゾイル−Ｌ−チロシンエチルエス
テル（BTEE）を1.0μmol加水分解する） 実施例３ PEG2修飾サーモライシン（PEG2−Th）の調製 68.8mlの0.1Mホウ酸塩緩衝液（pH10.0）に344mgのサ
ーモライシンを溶解し、４℃に冷却する。この溶液に、
1.1gのPEG2を１時間かけて添加し、４℃で17時間反応し
た。反応液を0.1N塩酸で中和し、限外濾過装置（分子量
30000カット）で過剰のPEG2を除去して目的物を製造し
た。この反応でアミノ基は26.9％修飾されていた。
修飾率:26.9％ 活性:4870U/mg蛋白質（71.0％）（一単位がpH7.2、35
℃で１分間に乳カゼインを加水分解して1.0μｇチロシ
ンを生成する） 実施例４ 実施例１〜３と同様の操作により表−１に記載のPEG2
修飾酵素を合成した。
℃で１分間に乳カゼインを加水分解して1.0μｇチロシ
ンを生成する） 実施例４ 実施例１〜３と同様の操作により表−１に記載のPEG2
修飾酵素を合成した。
実施例５ PEG2修飾酵素によるペプチドの合成 Ｎ−保護アミノ酸およびＣ−保護アミノ酸それぞれ1m
Mを緩衝液（有機溶媒を含んでもよい）に溶解し、PEG2
修飾酵素を加えて20〜50℃で一夜反応した。反応液に結
晶が析出している場合は、水を加えて濾取し、析出しな
い場合は濃縮後酢酸エチルで抽出し、酢酸エチルは濃縮
して、残渣にエーテル、ヘキサン等を加えて固化させ、
反応生成物を得た。このようにして、各種PEG2修飾酵素
を用いて表−２に記載の生成物を得た。
Mを緩衝液（有機溶媒を含んでもよい）に溶解し、PEG2
修飾酵素を加えて20〜50℃で一夜反応した。反応液に結
晶が析出している場合は、水を加えて濾取し、析出しな
い場合は濃縮後酢酸エチルで抽出し、酢酸エチルは濃縮
して、残渣にエーテル、ヘキサン等を加えて固化させ、
反応生成物を得た。このようにして、各種PEG2修飾酵素
を用いて表−２に記載の生成物を得た。
実施例６ PEG2修飾ヒトインシュリン（PEG2−ヒトインシュリン） ヒトインシュリン10mgを2mlの0.1Mほう酸塩緩衝液（p
H9.5）に溶解し、PEG2の400mgを加え一夜撹拌後、pH7.0
に調製する。未反応のPEG2はセファデックスＧ−50を通
して除きこれに水を加えて10000カットの限外濾過膜で
全量2mlまで濃縮し、冷凍室に保存する。一部凍結乾燥
後、元素分析し、その炭素と窒素の比率（N/C×100）を
測定する（以後N/C値という）。N/C値＝6.5 PEG2−ヒトインシュリン検定 ヒトインシュリンおよび同量のヒトインシュリンを含
むPEG2−ヒトインシュリンを試験ウサギに注射し、血糖
レベルをニュージャージー州フリーホールド市、ワシン
トンバイオケミカル社のグルコスタット法で測定した。
その結果は表−３の通りである。
H9.5）に溶解し、PEG2の400mgを加え一夜撹拌後、pH7.0
に調製する。未反応のPEG2はセファデックスＧ−50を通
して除きこれに水を加えて10000カットの限外濾過膜で
全量2mlまで濃縮し、冷凍室に保存する。一部凍結乾燥
後、元素分析し、その炭素と窒素の比率（N/C×100）を
測定する（以後N/C値という）。N/C値＝6.5 PEG2−ヒトインシュリン検定 ヒトインシュリンおよび同量のヒトインシュリンを含
むPEG2−ヒトインシュリンを試験ウサギに注射し、血糖
レベルをニュージャージー州フリーホールド市、ワシン
トンバイオケミカル社のグルコスタット法で測定した。
その結果は表−３の通りである。
実施例７ PEG2修飾ヒトインシュリン インシュリン（ヒト）0.42mgを含む0.05Mホウ酸緩衝
溶液（pH10）280μに４℃にて参考例１にて製造した
高純度のPEG2の8.6mgを加え、４℃にて放置した。さら
に6.5時間後PEG2の2.9mgを加え、４℃にて29時間放置し
た。これを0.1M酢酸にて中和後、逆相高速クロマトグラ
フィー〔YMC−ODS,4.6mmφ×250mm;溶出液Ａ液＝0.1％T
FA水とＢ液アセトニトリル（0.1％TFA）によるグラジエ
ント（初期Ｂ液濃度25％、勾配１％／分）；流速1ml/
分〕により精製を行い、目的物を含む画分を凍結乾燥し
た後、水200μを加え、目的物を含む水溶液として得
た。
溶液（pH10）280μに４℃にて参考例１にて製造した
高純度のPEG2の8.6mgを加え、４℃にて放置した。さら
に6.5時間後PEG2の2.9mgを加え、４℃にて29時間放置し
た。これを0.1M酢酸にて中和後、逆相高速クロマトグラ
フィー〔YMC−ODS,4.6mmφ×250mm;溶出液Ａ液＝0.1％T
FA水とＢ液アセトニトリル（0.1％TFA）によるグラジエ
ント（初期Ｂ液濃度25％、勾配１％／分）；流速1ml/
分〕により精製を行い、目的物を含む画分を凍結乾燥し
た後、水200μを加え、目的物を含む水溶液として得
た。
物性値 ・逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS AM303 4.6mmφ×250mm（山村化学社製） 溶出液：グラジエント Ａ液：水（0.1％トリフルオロ酢酸） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％トリフルオロ
酢酸） 初期Ｂ液濃度:25％ 濃度勾配:1％／分 流速:1ml/分 検出波長:220nm 保持時間:25.4分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例８ PEG2修飾エルカトニン（PEG2−エルカトニン） エルカトニン10mgを2mlの0.1Mのほう酸塩緩衝液（pH
9.5）に溶解し、PEG2の300mgを加え一夜撹拌後、pH7.0
に調製する。未反応のPEG2はセファデックスＧ−50を通
して除き、これに水10mlを加え分子量10000カットの限
外濾過膜で全量2mlまで濃縮し、冷凍室に保存する。一
部凍結乾燥後、元素分析して、そのN/C値を求める。N/C
＝4.5 PEG2−エルカトニン検定 エルカトニン（５μg/kg）およびPEG2−エルカトニン
（エルカトニン含量５μg/kg）をラット尾静脈内投与し
たこのときの血中カルシウム低下量を100とし、血中カ
ルシウム低下量が50となる時間を測定した。その結果は
表−４に示す通りである。
酢酸） 初期Ｂ液濃度:25％ 濃度勾配:1％／分 流速:1ml/分 検出波長:220nm 保持時間:25.4分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例８ PEG2修飾エルカトニン（PEG2−エルカトニン） エルカトニン10mgを2mlの0.1Mのほう酸塩緩衝液（pH
9.5）に溶解し、PEG2の300mgを加え一夜撹拌後、pH7.0
に調製する。未反応のPEG2はセファデックスＧ−50を通
して除き、これに水10mlを加え分子量10000カットの限
外濾過膜で全量2mlまで濃縮し、冷凍室に保存する。一
部凍結乾燥後、元素分析して、そのN/C値を求める。N/C
＝4.5 PEG2−エルカトニン検定 エルカトニン（５μg/kg）およびPEG2−エルカトニン
（エルカトニン含量５μg/kg）をラット尾静脈内投与し
たこのときの血中カルシウム低下量を100とし、血中カ
ルシウム低下量が50となる時間を測定した。その結果は
表−４に示す通りである。
RIA法による家兎血中濃度の半減期測定 エルカトニン（５μg/kg）およびPEG2−エルカトニン
（エルカトニン含量５μg/kg）を家兎に静脈内投与し、
２分後の血中濃度を100として半減期を求めた。その結
果は表−５に示す通りである。
（エルカトニン含量５μg/kg）を家兎に静脈内投与し、
２分後の血中濃度を100として半減期を求めた。その結
果は表−５に示す通りである。
実施例９ PEG2修飾ヒトカルシトニン ヒトカルシトニン0.59mgを0.1Mホウ酸緩衝液（pH10）
180μに溶かし、その溶液に参考例１で製造した高純
度のPEG2の6.90mgを４℃にて加え、４℃にて８時間放置
した。0.1M酢酸にて中和後、逆相高速液体クロマトグラ
フィー〔YMC−ODS,4.6mmφ×250mm;溶出液Ａ液＝01％TF
A水とＢ液＝アセトニトリル（0.1％TFA）を用いたグラ
ジエント（初期Ｂ液濃度25％，勾配１％／分）；流速1m
l/分〕により精製を行い、目的物を含む分画を凍結乾燥
し目的物を得た。
180μに溶かし、その溶液に参考例１で製造した高純
度のPEG2の6.90mgを４℃にて加え、４℃にて８時間放置
した。0.1M酢酸にて中和後、逆相高速液体クロマトグラ
フィー〔YMC−ODS,4.6mmφ×250mm;溶出液Ａ液＝01％TF
A水とＢ液＝アセトニトリル（0.1％TFA）を用いたグラ
ジエント（初期Ｂ液濃度25％，勾配１％／分）；流速1m
l/分〕により精製を行い、目的物を含む分画を凍結乾燥
し目的物を得た。
物性値 ・逆相高速得液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS AM303 4.6mmφ×250mm（山村化学社製） 溶出液：グラジエント Ａ液：水（0.1％TFA） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％TFA） 初期Ｂ液濃度:25％ 濃度勾配:1％／分 流速:1ml/分 検出波長:220nm 保持時間:24.89分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例10 実施例６および８と同様にして表−６のPEG2−ペプチ
ドを得た。また、これらを家兎を用いて実施例８と同様
にして血中半減期の延長を確認した（表−７）。
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例10 実施例６および８と同様にして表−６のPEG2−ペプチ
ドを得た。また、これらを家兎を用いて実施例８と同様
にして血中半減期の延長を確認した（表−７）。
本実施例で使用したセクレチン、VIPはブタ型、イン
シュリン、バソプレシン、cGRP、エンケファリン、PTHr
P（７−34）、CRF、GRFはヒト型のものである。
シュリン、バソプレシン、cGRP、エンケファリン、PTHr
P（７−34）、CRF、GRFはヒト型のものである。
セクレチンの抗体は第一ラジオアイソトープ社、カル
シトニン、VIP、アルギニンバソプレシン、cGRP、エン
ケファリン、PTHrP（７−34）、CRF、GRFの抗体はPenin
sula社、rEGF、hEGFの抗体は大塚アッセイ社の製品を使
用した。
シトニン、VIP、アルギニンバソプレシン、cGRP、エン
ケファリン、PTHrP（７−34）、CRF、GRFの抗体はPenin
sula社、rEGF、hEGFの抗体は大塚アッセイ社の製品を使
用した。
実施例11 PEG2修飾ヒト〔Arg8〕−バソピレシン ヒト〔Arg8〕−バソピレシン0.55mgを0.1Mホウ酸緩衝
液450μに溶かし、その溶液に参考例１で製造した高
純度のPEG2の20.0mgを４℃にて加え、４℃にて25.5時間
放置した。0.1M酢酸にて中和後、逆相高速液体クラムト
グラフィー〔YMC−ODS、4.6mmφ×250mm;溶出液、Ａ液
＝0.1％TFA水とＢ液＝アセトニトリル（0.1％TFA）を用
いたグラジェント（初期Ｂ液濃度25％、勾配１％／
分）；流速1ml/分〕により精製を行い、目的物を含む分
画を凍結乾燥し、目的物を得た。
液450μに溶かし、その溶液に参考例１で製造した高
純度のPEG2の20.0mgを４℃にて加え、４℃にて25.5時間
放置した。0.1M酢酸にて中和後、逆相高速液体クラムト
グラフィー〔YMC−ODS、4.6mmφ×250mm;溶出液、Ａ液
＝0.1％TFA水とＢ液＝アセトニトリル（0.1％TFA）を用
いたグラジェント（初期Ｂ液濃度25％、勾配１％／
分）；流速1ml/分〕により精製を行い、目的物を含む分
画を凍結乾燥し、目的物を得た。
物性値 ・逆相高速液体クラマトグラフィー カラム:YMC−ODS AM303 4.6mmφ×250mm（山村化学製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％TFA） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％TFA） 初期Ｂ液濃度:25％ 濃度勾配:1％／分 流速:1ml/分、 検出波長:220nm 保持時間:25.00分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例12 PEG2修飾CGRP ヒトCGRPの1mgを0.1Mホウ酸緩衝液（pH10）300μに
溶かし、その後溶液に参考例１で製造した高純度のPEG2
の16mgを４℃で加え、４℃にて31時間放置した。0.1M酢
酸で中和後、逆相高速液体クロマトグラフィー〔YMC−O
DS、4.6mmφ×250mm;溶出液 Ａ液＝0.1％TFA水とＢ液
＝アセトニトリル（0.1％TFA）を用いたグラジェント
（初期Ｂ液濃度25％、勾配１％／分）；流速1ml/分〕に
より精製を行い、目的物を含む分画を凍結乾燥し、目的
物を得た。
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例12 PEG2修飾CGRP ヒトCGRPの1mgを0.1Mホウ酸緩衝液（pH10）300μに
溶かし、その後溶液に参考例１で製造した高純度のPEG2
の16mgを４℃で加え、４℃にて31時間放置した。0.1M酢
酸で中和後、逆相高速液体クロマトグラフィー〔YMC−O
DS、4.6mmφ×250mm;溶出液 Ａ液＝0.1％TFA水とＢ液
＝アセトニトリル（0.1％TFA）を用いたグラジェント
（初期Ｂ液濃度25％、勾配１％／分）；流速1ml/分〕に
より精製を行い、目的物を含む分画を凍結乾燥し、目的
物を得た。
・逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−DOS AM303 4.6mmφ×250mm（山村化学製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％TFA） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％TFA） 初期Ｂ液濃度:25％ 濃度勾配:1％／分 流速:1ml/分、 検出波長:220nm 保持時間:21.25分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例13 PEG2修飾マウスEGF（PEG2−mEGF） マウスEGFの150μｇを含む0.07Mホウ酸緩衝液（pH1
0）60μに参考例１で製造した高純度のPEG2の2mgを加
え、４℃にて30時間放置した。0.5N酢酸にて中和後、逆
相高速液体クラマトグラフィー〔YMC−ODS、4.6mmφ×2
50mm;溶出液 Ａ液＝0.1％TFA水とＢ液＝アセトニトリ
ル（0.1％TFA）を用いたグラジェント（初期Ｂ液濃度25
％、勾配１％／分）；流速1ml/分〕により精製を行い、
目的物を含む分画を凍結乾燥し、目的物を得た。
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例13 PEG2修飾マウスEGF（PEG2−mEGF） マウスEGFの150μｇを含む0.07Mホウ酸緩衝液（pH1
0）60μに参考例１で製造した高純度のPEG2の2mgを加
え、４℃にて30時間放置した。0.5N酢酸にて中和後、逆
相高速液体クラマトグラフィー〔YMC−ODS、4.6mmφ×2
50mm;溶出液 Ａ液＝0.1％TFA水とＢ液＝アセトニトリ
ル（0.1％TFA）を用いたグラジェント（初期Ｂ液濃度25
％、勾配１％／分）；流速1ml/分〕により精製を行い、
目的物を含む分画を凍結乾燥し、目的物を得た。
・逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS AM303 4.6mmφ×250mm（山村化学製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％TFA） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％TFA） 初期Ｂ液濃度:25％ 濃度勾配:1％／分 流速:1ml/分、 検出波長220nm 保持時間:20.73分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例14 PEG2修飾ヒトGRF（１−44）NH2 ヒトGRF（１−44）NH25mgを0.1Mホウ酸緩衝液（pH1
0）2mlに溶かし、この溶液に参考例１で製造した高純度
のPEG2の59.5mgを４℃にて加え、４℃で18時間放置し
た。0.1M酢酸で中和後、逆相高速液体クロマトグラフィ
ー〔YMC−ODS、1cmφ×30cm;溶出液 Ａ液＝0.1％TFA水
とＢ液＝アセトニトリル（0.1％TFA）を用いたグラジェ
ント（初期Ｂ液濃度32％、勾配0.25％／分；流速3ml/
分〕により精製を行い、目的物Ａ、目的物Ｂ、目的物Ｃ
をそれぞれ含む３つの分画を凍結乾燥し、目的物A5mg、
目的物B25mg、目的物C14mgを得た。
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例14 PEG2修飾ヒトGRF（１−44）NH2 ヒトGRF（１−44）NH25mgを0.1Mホウ酸緩衝液（pH1
0）2mlに溶かし、この溶液に参考例１で製造した高純度
のPEG2の59.5mgを４℃にて加え、４℃で18時間放置し
た。0.1M酢酸で中和後、逆相高速液体クロマトグラフィ
ー〔YMC−ODS、1cmφ×30cm;溶出液 Ａ液＝0.1％TFA水
とＢ液＝アセトニトリル（0.1％TFA）を用いたグラジェ
ント（初期Ｂ液濃度32％、勾配0.25％／分；流速3ml/
分〕により精製を行い、目的物Ａ、目的物Ｂ、目的物Ｃ
をそれぞれ含む３つの分画を凍結乾燥し、目的物A5mg、
目的物B25mg、目的物C14mgを得た。
目的物Ａの物性値 ・逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS AM303 4.6mmφ×250mm（山村化学製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％TFA） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％TFA） 初期Ｂ液濃度:32％ 濃度勾配:0.5％／分 流速:1ml/分、 検出波長:220nm 保持時間:22.63分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 目的物Ｂの物性値 ・逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS AM303 4.6mmφ×250mm（山村化学製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％TFA） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％TFA） 初期Ｂ液濃度:32％ 濃度勾配:0.5％／分 流速:1ml/分、 検出波長:220nm 保持時間:26.25分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 目的物Ｃの物性値 ・逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS AM303 4.6mmφ×250mm（山村化学製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％TFA） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％TFA） 初期Ｂ液濃度:32％ 濃度勾配:0.5％／分 流速:1ml/分、 検出波長:220nm 保持時間:28.61分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例15 PEG2修飾ヒトGRF（１−29）NH2 ヒトGRF（１−29）NH25mgを0.1Mホウ酸緩衝液（pH1
0）2mlに溶かし、この溶液に参考例１で製造した高純度
のPEG2の86mgを４℃にて加え、４℃にて20.5時間放置し
た。0.1M酢酸にて中和後、逆相高速液体クロマトグラフ
ィー〔YMC−ODS、1cmφ×30cm;溶出液 Ａ液＝0.1％TFA
水とＢ液＝アセトニトリル（0.1％TFA）を用いたグラジ
ェト（初期Ｂ液濃度32％、勾配0.25％／分）；流速3ml/
分〕により精製を行い、目的物Ａ、目的物Ｂ、目的物
Ｃ、目的物Ｄをそれぞれ含む４つの分画を凍結乾燥した
後、各々分画に水500μを加え、目的物を含む水溶液
として得た（蛋白含量；目的物Ａ 121μg/500μ、目
的物Ｂ 178μg/500μ、目的物Ｃ 472μg/500μ、
目的物Ｄ 195μg/500μ）。
後の分解物）中のアミノ酸分析値 目的物Ｂの物性値 ・逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS AM303 4.6mmφ×250mm（山村化学製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％TFA） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％TFA） 初期Ｂ液濃度:32％ 濃度勾配:0.5％／分 流速:1ml/分、 検出波長:220nm 保持時間:26.25分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 目的物Ｃの物性値 ・逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS AM303 4.6mmφ×250mm（山村化学製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％TFA） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％TFA） 初期Ｂ液濃度:32％ 濃度勾配:0.5％／分 流速:1ml/分、 検出波長:220nm 保持時間:28.61分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例15 PEG2修飾ヒトGRF（１−29）NH2 ヒトGRF（１−29）NH25mgを0.1Mホウ酸緩衝液（pH1
0）2mlに溶かし、この溶液に参考例１で製造した高純度
のPEG2の86mgを４℃にて加え、４℃にて20.5時間放置し
た。0.1M酢酸にて中和後、逆相高速液体クロマトグラフ
ィー〔YMC−ODS、1cmφ×30cm;溶出液 Ａ液＝0.1％TFA
水とＢ液＝アセトニトリル（0.1％TFA）を用いたグラジ
ェト（初期Ｂ液濃度32％、勾配0.25％／分）；流速3ml/
分〕により精製を行い、目的物Ａ、目的物Ｂ、目的物
Ｃ、目的物Ｄをそれぞれ含む４つの分画を凍結乾燥した
後、各々分画に水500μを加え、目的物を含む水溶液
として得た（蛋白含量；目的物Ａ 121μg/500μ、目
的物Ｂ 178μg/500μ、目的物Ｃ 472μg/500μ、
目的物Ｄ 195μg/500μ）。
目的物Ａの物性値 ・逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS AM303 4.6mmφ×250mm（山村化学製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％TFA） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％TFA） 初期Ｂ液濃度:35％ 濃度勾配:0.5％／分 流速:1ml/分、 検出波長:220nm 保持時間:19.34分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 目的物Ｂの物性値 ・逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS AM303 4.6mmφ×250mm（山村化学製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％TFA） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％TFA） 初期Ｂ液濃度:35％ 濃度勾配:0.5％／分 流速:1ml/分、 検出波長:220nm 保持時間:20.05分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 目的物Ｃの物性値 ・逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS AM303 4.6mmφ×250mm（山村化学製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％TFA） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％TFA） 初期Ｂ液濃度:35％ 濃度勾配:0.5％／分 流速:1ml/分、 検出波長:220nm 保持時間:21.72分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 目的物Ｄの物性値 ・逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS AM303 4.6mmφ×250mm（山村化学製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％TFA） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％TFA） 初期Ｂ液濃度:35％ 濃度勾配:0.5％／分 流速:1ml/分、 検出波長:220nm 保持時間:22.53分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例16 PEG2修飾ヒトインターフェロンα ヒトインターフェロンα 80.4μｇを含む0.1Mホウ酸
緩衝液（pH10）100μに参考例１で製造した高純度のP
EG2の3mg加え、さらに２時間45分後、2.5mgを加え、24
時間放置した。（反応温度は４℃）TSKG3000SW〔7.5mm
φ×600mm、0.1M食塩水（５％エタノール含有）〕を用
いたゲル濾過精製を行い、目的物を含む分画を脱塩し、
凍結乾燥を行った後、水50μを加え、目的物を含む水
溶液として得た（蛋白含量41.3μg/50μ）。
後の分解物）中のアミノ酸分析値 目的物Ｂの物性値 ・逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS AM303 4.6mmφ×250mm（山村化学製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％TFA） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％TFA） 初期Ｂ液濃度:35％ 濃度勾配:0.5％／分 流速:1ml/分、 検出波長:220nm 保持時間:20.05分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 目的物Ｃの物性値 ・逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS AM303 4.6mmφ×250mm（山村化学製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％TFA） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％TFA） 初期Ｂ液濃度:35％ 濃度勾配:0.5％／分 流速:1ml/分、 検出波長:220nm 保持時間:21.72分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 目的物Ｄの物性値 ・逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS AM303 4.6mmφ×250mm（山村化学製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％TFA） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％TFA） 初期Ｂ液濃度:35％ 濃度勾配:0.5％／分 流速:1ml/分、 検出波長:220nm 保持時間:22.53分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例16 PEG2修飾ヒトインターフェロンα ヒトインターフェロンα 80.4μｇを含む0.1Mホウ酸
緩衝液（pH10）100μに参考例１で製造した高純度のP
EG2の3mg加え、さらに２時間45分後、2.5mgを加え、24
時間放置した。（反応温度は４℃）TSKG3000SW〔7.5mm
φ×600mm、0.1M食塩水（５％エタノール含有）〕を用
いたゲル濾過精製を行い、目的物を含む分画を脱塩し、
凍結乾燥を行った後、水50μを加え、目的物を含む水
溶液として得た（蛋白含量41.3μg/50μ）。
物性値 ・高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK gel G3000SW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.1M食塩水（５％エタノール含有） 流速:0.6ml/分、 検出波長:220nm 保持時間:15.94分 実施例17 PEG2修飾ブタα−MSH α−MSH（ブタ）0.51mgを0.05ホウ酸緩衝液（pH10）3
60μに溶かし、その溶液に参考例１にて製造した高純
度のPEG2の12mgを加え、４℃にて16時間放置した。0.1M
酢酸にて中和後、逆相高速液体クロマトグラフィー〔YM
C−ODS、4.6mmφ×250mm;溶出液 Ａ液＝0.1％TFA水と
Ｂ液＝アセトニトリル（0.1％TFA）によるグラジェント
（初期Ｂ液濃度30％、勾配１％／分）；流速1ml/分〕に
より精製を行い、目的物を含む分画を凍結乾燥した後、
水200μを加え、目的物を含む水溶物として得た（蛋
白含量:49.2μg/200μ）。
60μに溶かし、その溶液に参考例１にて製造した高純
度のPEG2の12mgを加え、４℃にて16時間放置した。0.1M
酢酸にて中和後、逆相高速液体クロマトグラフィー〔YM
C−ODS、4.6mmφ×250mm;溶出液 Ａ液＝0.1％TFA水と
Ｂ液＝アセトニトリル（0.1％TFA）によるグラジェント
（初期Ｂ液濃度30％、勾配１％／分）；流速1ml/分〕に
より精製を行い、目的物を含む分画を凍結乾燥した後、
水200μを加え、目的物を含む水溶物として得た（蛋
白含量:49.2μg/200μ）。
物性値 ・逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS AM303 4.6mmφ×250mm（山村化学製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％TFA） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％TFA） 初期Ｂ液濃度:30％ 濃度勾配:1％／分 流速:1ml/分、 検出波長:220nm 保持時間:18.52分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例18 PEG2修飾ヒトACTH（４−10） ヒトACTH（４−10）0.50mgを0.1Mホウ酸緩衝液（pH1
0）130μに溶かし、参考例１で製造した高純度のPEG2
を5.2mg、５時間後15.6mg、さら２時間後20.8mgを加
え、17時間放置した。反応未完了のため、0.1Mホウ酸緩
衝液（pH10）を135μ加え、PEG2をさらに20.8mg加
え、９時間放置した（反応温度は４℃）。0.1M酢酸にて
中和後、逆相高速液体クロマトグラフィー〔YMC−ODS、
4.6mmφ×250mm;溶出液 Ａ液＝0.1％TFA水とＢ液＝ア
セトニトリル（0.1％TFA）を用いたグラジェント（初期
Ｂ液濃度20％、勾配１％／分）；流速1ml/分）；流速1m
l/分〕により精製を行い、目的物を含む分画を凍結乾燥
した後、水200μを加え、目的物を含む水溶液として
得た（蛋白含量;19.1μg/200μ）。
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例18 PEG2修飾ヒトACTH（４−10） ヒトACTH（４−10）0.50mgを0.1Mホウ酸緩衝液（pH1
0）130μに溶かし、参考例１で製造した高純度のPEG2
を5.2mg、５時間後15.6mg、さら２時間後20.8mgを加
え、17時間放置した。反応未完了のため、0.1Mホウ酸緩
衝液（pH10）を135μ加え、PEG2をさらに20.8mg加
え、９時間放置した（反応温度は４℃）。0.1M酢酸にて
中和後、逆相高速液体クロマトグラフィー〔YMC−ODS、
4.6mmφ×250mm;溶出液 Ａ液＝0.1％TFA水とＢ液＝ア
セトニトリル（0.1％TFA）を用いたグラジェント（初期
Ｂ液濃度20％、勾配１％／分）；流速1ml/分）；流速1m
l/分〕により精製を行い、目的物を含む分画を凍結乾燥
した後、水200μを加え、目的物を含む水溶液として
得た（蛋白含量;19.1μg/200μ）。
物性値 ・逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS AM303 4.6mmφ×250mm（山村化学製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％TFA） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％TFA） 初期Ｂ液濃度:20％ 濃度勾配:1％／分 流速:1ml/分、 検出波長:220nm 保持時間:29.83分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例19 PEG2修飾マウスβ−NGF マウスβ−NGF350μｇを含む50mM酢酸ナトリウム緩衝
液（pH5.0）850μに0.5N−NaOHを加え、pHを約10とし
た。その溶液に参考例１にて製造した高純度のPEG2の25
mgを４℃にて加え、４℃にて3.5時間放置した。その間
0.1N−NaOHで、pHを９〜10に保った。0.5N酢酸で中和
後、TSKG3000SW（7.5mmφ×600mm、５％エタノール含有
0.2M食塩水）にてゲル濾過を行い、目的物Ａを含む分画
および目的物Ｂを含む分画を得、各々脱塩し、凍結乾燥
を行った後、200μの水を加え、目的物Ａ、目的物Ｂ
を含む水溶液として得た（蛋白含量；目的物Ａ 0.73μ
g/μ、目的物Ｂ １μg/μ）。
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例19 PEG2修飾マウスβ−NGF マウスβ−NGF350μｇを含む50mM酢酸ナトリウム緩衝
液（pH5.0）850μに0.5N−NaOHを加え、pHを約10とし
た。その溶液に参考例１にて製造した高純度のPEG2の25
mgを４℃にて加え、４℃にて3.5時間放置した。その間
0.1N−NaOHで、pHを９〜10に保った。0.5N酢酸で中和
後、TSKG3000SW（7.5mmφ×600mm、５％エタノール含有
0.2M食塩水）にてゲル濾過を行い、目的物Ａを含む分画
および目的物Ｂを含む分画を得、各々脱塩し、凍結乾燥
を行った後、200μの水を加え、目的物Ａ、目的物Ｂ
を含む水溶液として得た（蛋白含量；目的物Ａ 0.73μ
g/μ、目的物Ｂ １μg/μ）。
このようにして得られた目的物Ｂは、100ng（蛋白）/
mlの濃度でPC12細胞に作用させたところ、突起を持つ細
胞の数がコントロールに比べ約２倍に増えた。
mlの濃度でPC12細胞に作用させたところ、突起を持つ細
胞の数がコントロールに比べ約２倍に増えた。
目的物Ａの物性値 ・高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK gel G3000SW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.1M食塩水（５％エタノール含有） 流速:0.6ml/分、 検出波長:220nm 保持時間:18.74分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 目的物Ｂの物性値 ・高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK gel G3000SW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.1M食塩水（５％エタノール含有） 流速:0.6ml/分、 検出波長:220nm 保持時間:20.41分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例20 PEG2修飾ヒトANP（１−28） ヒトANP（１−28）0.54mgを含む0.1Mホウ酸緩衝液（p
H10）80μに参考例１で製造した高純度のPEG2の7mgを
含む水溶液54μを４℃にて加え、４℃にて6.5時間放
置した。水1mlで希釈後、2N酢酸で中和し、逆相高速液
体クロマトグラフィー〔YMC−ODS、4.6mmφ×250mm;溶
出液 Ａ液＝0.1％TFA水とＢ液＝アセトニトリル（0.1
％TFA）を用いたグラジェント（初期Ｂ液濃度25％、勾
配１％／分）；流速1ml/分〕により精製を行い、目的物
を含む分画を凍結乾燥し、目的物を得た。
後の分解物）中のアミノ酸分析値 目的物Ｂの物性値 ・高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK gel G3000SW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.1M食塩水（５％エタノール含有） 流速:0.6ml/分、 検出波長:220nm 保持時間:20.41分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例20 PEG2修飾ヒトANP（１−28） ヒトANP（１−28）0.54mgを含む0.1Mホウ酸緩衝液（p
H10）80μに参考例１で製造した高純度のPEG2の7mgを
含む水溶液54μを４℃にて加え、４℃にて6.5時間放
置した。水1mlで希釈後、2N酢酸で中和し、逆相高速液
体クロマトグラフィー〔YMC−ODS、4.6mmφ×250mm;溶
出液 Ａ液＝0.1％TFA水とＢ液＝アセトニトリル（0.1
％TFA）を用いたグラジェント（初期Ｂ液濃度25％、勾
配１％／分）；流速1ml/分〕により精製を行い、目的物
を含む分画を凍結乾燥し、目的物を得た。
物性値 ・逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS AM303 4.6mmφ×250mm（山村化学製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％TFA） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％TFA） 初期Ｂ液濃度:25％ 濃度勾配:1％／分 流速:1ml/分、 検出波長:220nm 保持時間:22.77分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例21 PEG2修飾ブタエラスターゼ ブタエラスターゼ1.04mgを0.1Mホウ酸緩衝液（pH10）
540μに溶かし、その溶液に参考例１で製造した高純
度のPEG2の6.90mgを４℃にて加え、４℃にて6.5時間放
置した。0.1M酢酸で中和後、TSKG3000PWXL〔（7.8mmφ
×300mm）×2:0.2M食塩水〕を用いたゲル濾過により精
製を行い、目的物を含む分画を脱塩し、凍結乾燥した
後、水100μを加え、目的物を含む水溶液として得た
（蛋白含量;64.5μg/μ。） このようにして得られた修飾体は２μｇ（蛋白）/ml
の濃度で未修飾体と同等の酵素活性を示した。
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例21 PEG2修飾ブタエラスターゼ ブタエラスターゼ1.04mgを0.1Mホウ酸緩衝液（pH10）
540μに溶かし、その溶液に参考例１で製造した高純
度のPEG2の6.90mgを４℃にて加え、４℃にて6.5時間放
置した。0.1M酢酸で中和後、TSKG3000PWXL〔（7.8mmφ
×300mm）×2:0.2M食塩水〕を用いたゲル濾過により精
製を行い、目的物を含む分画を脱塩し、凍結乾燥した
後、水100μを加え、目的物を含む水溶液として得た
（蛋白含量;64.5μg/μ。） このようにして得られた修飾体は２μｇ（蛋白）/ml
の濃度で未修飾体と同等の酵素活性を示した。
物性値 ・高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK gel G3000PLXL （7.8mmφ×300mm）×２（東ソー社製） 溶出液:0.2M食塩水（５％エタノール含有） 流速:0.6ml/分、 検出波長:220nm 保持時間:20.89分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例22 PEG2修飾ヒトインターロイキン−３ ヒトインターロイキン−３ 50μｇを0.1Mホウ酸緩衝
液（pH10）200μに溶かし、この溶液に参考例１で製
造した高純度のPEG2の8mgを４℃にて加え、４℃にて24
時間放置した。1N酢酸にて中和後、TSKG3000SW〔7.5mm
φ×600mm;0.1M食塩水（５％エタノール含有）〕にてゲ
ル濾過精製し、目的物を含む分画を脱塩濃縮し、目的物
を含む水溶液30μを得た。
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例22 PEG2修飾ヒトインターロイキン−３ ヒトインターロイキン−３ 50μｇを0.1Mホウ酸緩衝
液（pH10）200μに溶かし、この溶液に参考例１で製
造した高純度のPEG2の8mgを４℃にて加え、４℃にて24
時間放置した。1N酢酸にて中和後、TSKG3000SW〔7.5mm
φ×600mm;0.1M食塩水（５％エタノール含有）〕にてゲ
ル濾過精製し、目的物を含む分画を脱塩濃縮し、目的物
を含む水溶液30μを得た。
物性値 ・高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK gel G3000SW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.1M食塩水（５％エタノール含有） 流速:0.6ml/分、 検出波長:220nm 保持時間:17.67分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例23 PEG2修飾ウシ膵臓トリプシンインヒビター ウシ膵臓トリプシンインヒビター 500μｇを0.07Mホ
ウ酸緩衝液（pH10）350μに溶かし、その溶液に参考
例１で製造した高純度のPEG2の15mgを４℃にて加え、４
℃にて44時間放置した。1N酢酸にて中和後、TSKG3000SW
〔7.5mmφ×600mm;0.1M食塩水（５％エタノール含
有）〕にてゲル濾過精製し、目的物を含む分画を脱塩濃
縮し、目的物を含む水溶液60μを得た。
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例23 PEG2修飾ウシ膵臓トリプシンインヒビター ウシ膵臓トリプシンインヒビター 500μｇを0.07Mホ
ウ酸緩衝液（pH10）350μに溶かし、その溶液に参考
例１で製造した高純度のPEG2の15mgを４℃にて加え、４
℃にて44時間放置した。1N酢酸にて中和後、TSKG3000SW
〔7.5mmφ×600mm;0.1M食塩水（５％エタノール含
有）〕にてゲル濾過精製し、目的物を含む分画を脱塩濃
縮し、目的物を含む水溶液60μを得た。
物性値 ・高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK gel G3000SW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.1M食塩水（５％エタノール含有） 流速:0.6ml/分、 検出波長:220nm 保持時間:18.44分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例24 PEG2修飾IAP IAP 150μｇを0.1Mホウ酸緩衝液（pH10）150μに
溶かし、この溶液を参考例１で製造した高純度のPEG2の
6mgを４℃にて加え、４℃にて44時間放置した。1N酢酸
にて中和後、TSKG3000SW〔7.5mmφ×600mm;0.1M食塩水
（５％エタノール含有）〕にてゲル濾過精製を行い、目
的物を含む分画を脱塩し、目的物を含む水溶液75μを
得た。
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例24 PEG2修飾IAP IAP 150μｇを0.1Mホウ酸緩衝液（pH10）150μに
溶かし、この溶液を参考例１で製造した高純度のPEG2の
6mgを４℃にて加え、４℃にて44時間放置した。1N酢酸
にて中和後、TSKG3000SW〔7.5mmφ×600mm;0.1M食塩水
（５％エタノール含有）〕にてゲル濾過精製を行い、目
的物を含む分画を脱塩し、目的物を含む水溶液75μを
得た。
物性値 ・高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK gel G3000SW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.1M食塩水（５％エタノール含有） 流速:0.6ml/分、 検出波長:220nm 保持時間:15.9分 実施例25 PEG2修飾ヒトソマトスタチン ヒトソマトスタチン0.45mgを0.1Mホウ酸緩衝液（pH1
0）400μに溶かし、その溶液に参考例１で製造した高
純度のPEG2の16.2mgを４℃にて加え、４℃にて26時間放
置後、PEG2をさらに16mg加え、４℃にて１時間放置し
た。0.1M酢酸にて中和後、逆相高速液体クラマトグラフ
ィー〔YMC−ODS、4.6mmφ×250mm;溶出液 Ａ液＝0.1％
TFA水とＢ液＝アセトニトリル（0.1％TFA）を用いたグ
ラジェント（初期Ｂ液濃度25％、勾配１％／分）；流速
1ml/分〕により精製を行い、目的物を含む分画を凍結乾
燥した後、水75μを加え、目的物を含む水溶液として
得た（蛋白含量;0.70μg/μ）。
0）400μに溶かし、その溶液に参考例１で製造した高
純度のPEG2の16.2mgを４℃にて加え、４℃にて26時間放
置後、PEG2をさらに16mg加え、４℃にて１時間放置し
た。0.1M酢酸にて中和後、逆相高速液体クラマトグラフ
ィー〔YMC−ODS、4.6mmφ×250mm;溶出液 Ａ液＝0.1％
TFA水とＢ液＝アセトニトリル（0.1％TFA）を用いたグ
ラジェント（初期Ｂ液濃度25％、勾配１％／分）；流速
1ml/分〕により精製を行い、目的物を含む分画を凍結乾
燥した後、水75μを加え、目的物を含む水溶液として
得た（蛋白含量;0.70μg/μ）。
物性値 ・逆相高速液体クラマトグラフィー カラム:YMC−ODS AM303 4.6mmφ×250mm（山村化学製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％TFA） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％TFA） 初期Ｂ液濃度:25％ 濃度勾配:1％／分 流速:1ml/分、 検出波長:220nm 保持時間:25.23分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例26 PEG2修飾SOD（PEG2−SOD） SODを5mg/mlになるように0.1Mホウ酸塩緩衝液に溶解
し、４℃で冷却してPEG2を加えて15〜20時間反応させ
る。反応液を中和して、分子量30000カットの限外濾過
装置で過剰のPEG2を除去する。調製例を表−８に示す。
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例26 PEG2修飾SOD（PEG2−SOD） SODを5mg/mlになるように0.1Mホウ酸塩緩衝液に溶解
し、４℃で冷却してPEG2を加えて15〜20時間反応させ
る。反応液を中和して、分子量30000カットの限外濾過
装置で過剰のPEG2を除去する。調製例を表−８に示す。
実験例１ 実施例26で合成したPEG2−SOD−５について抗原性の
低下を検討した。
低下を検討した。
Swiss−Webster系雌のマウスを一群として、腹腔（in
traperitoneal以下i.p.）に週に一回、12週間、0.05Mリ
ン酸緩衝液pH7.0（以下PBS）に溶解したSODまたはPEG2
−SODを0.1mg蛋白を投与した。０、３、６、９、12週目
に眼窩後の血管から採血し、−20℃に保存した。それぞ
れの血清をELISA（enzyme−linked immunosorbent assa
y）で力価を測定した。その結果は表−９に示す通りで
ある。
traperitoneal以下i.p.）に週に一回、12週間、0.05Mリ
ン酸緩衝液pH7.0（以下PBS）に溶解したSODまたはPEG2
−SODを0.1mg蛋白を投与した。０、３、６、９、12週目
に眼窩後の血管から採血し、−20℃に保存した。それぞ
れの血清をELISA（enzyme−linked immunosorbent assa
y）で力価を測定した。その結果は表−９に示す通りで
ある。
実施例27 PEG2修飾カタラーゼ（PEG2−カララーゼ） 実施例26と同様にして表−10に記載のPEG2修飾カタラ
ーゼを合成した。
ーゼを合成した。
実験例２ 実験例１と同様にしてPEG2修飾カタラーゼの抗原性を
検討した。その結果は表−11に示す通りである。
検討した。その結果は表−11に示す通りである。
実験例３ マウス虚血足浮腫に及ぼす影響（後肢虚血再流によるO2
-産生試験） ８週齢のddy系雄のマウスを保定器にて保定し、縫合
糸（プレイン２号）で右後肢を一周縛り、一方を固定
し、もう一方に500gのオモリを吊るして、一定時間虚血
を行う。実験は虚血前、60分後の足蹠厚をノギスで測定
する。その後、足蹠を切断し足蹠重量も測定する。投与
群はコントロール群（生理食塩を虚血直前に静注）、SO
D（Bovine erythrocytes）投与群およびPEG2−SOD投与
群とし、虚血開始前30分、虚血直前にSODは10000U/kg、
PEG2−SODは500U/kgiv投与した。カタラーゼ、PEG2−カ
タラーゼも同様の要領で投与した。一群５匹ずつ用い
た。効果の測定は、コントロールに対する検体の〔虚血
足の足蹠厚（mm）−対照足の足蹠厚（mm）〕で表す。ま
た、コントロールに対する検体の〔虚血足の足蹠重量
（mg）−対照足の足蹠重量（mg）〕で表す。即ち、 その結果を表−12に示した。
-産生試験） ８週齢のddy系雄のマウスを保定器にて保定し、縫合
糸（プレイン２号）で右後肢を一周縛り、一方を固定
し、もう一方に500gのオモリを吊るして、一定時間虚血
を行う。実験は虚血前、60分後の足蹠厚をノギスで測定
する。その後、足蹠を切断し足蹠重量も測定する。投与
群はコントロール群（生理食塩を虚血直前に静注）、SO
D（Bovine erythrocytes）投与群およびPEG2−SOD投与
群とし、虚血開始前30分、虚血直前にSODは10000U/kg、
PEG2−SODは500U/kgiv投与した。カタラーゼ、PEG2−カ
タラーゼも同様の要領で投与した。一群５匹ずつ用い
た。効果の測定は、コントロールに対する検体の〔虚血
足の足蹠厚（mm）−対照足の足蹠厚（mm）〕で表す。ま
た、コントロールに対する検体の〔虚血足の足蹠重量
（mg）−対照足の足蹠重量（mg）〕で表す。即ち、 その結果を表−12に示した。
実施例28 PEG2修飾ヒト赤血球由来Cu,Zn−SOD ヒト赤血球由来Cu,Zn−SOD 10.0mgに0.1Mホウ酸緩衝
液（pH10.0）2.5mlを加えた後、参考例１にて製造した
高純度のPEG2の70.0mgを５℃にて加え、５℃にて22時間
放置した。ついで２規定酢酸水にてpH6.8に調整した
後、限外濾過により脱塩、濃縮した。このものをセファ
クリルＳ−200カラム（2.6cmφ×94cm、0.2M食塩水）に
かけ、ゲル濾過精製を行った。目的物を含む画分を集
め、限外濾過により脱塩濃縮後、目的物を含む水溶液1.
8mlを得た。このようにして得られた修飾体は、未修飾
のSODの81％の酵素活性（シトクロムＣ法、J.Biol.Che
m.,224,6049（1969））を有した。
液（pH10.0）2.5mlを加えた後、参考例１にて製造した
高純度のPEG2の70.0mgを５℃にて加え、５℃にて22時間
放置した。ついで２規定酢酸水にてpH6.8に調整した
後、限外濾過により脱塩、濃縮した。このものをセファ
クリルＳ−200カラム（2.6cmφ×94cm、0.2M食塩水）に
かけ、ゲル濾過精製を行った。目的物を含む画分を集
め、限外濾過により脱塩濃縮後、目的物を含む水溶液1.
8mlを得た。このようにして得られた修飾体は、未修飾
のSODの81％の酵素活性（シトクロムＣ法、J.Biol.Che
m.,224,6049（1969））を有した。
物性値 ・逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS AM303 4.6mmφ×250mm（山村化学製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％トリフルオロ酢酸） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％TFA） 初期Ｂ液濃度:30％ 濃度勾配:1％／分 流速:1ml/分， 検出波長:214nm 保持時間:16.66分 ・高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK gel G3000SW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.2M食塩水（５％EtOH含有） 流速:0.6ml/分、 検出波長:220nm 保持時間:18.27分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 ・修飾率20％（トリニトロベンゼンスルホン酸法） 実施例29 PEG2修飾ヒト赤血球由来Cu,Zn−SOD ヒト赤血球由来Cu,Zn−SOD 5.20mgに0.1Mホウ酸緩衝
液（pH10.0）2.5mlを加えた後、参考例１にて製造した
高純度のPEG2の185mgを５℃にて加え、５℃にて24時間
放置した。反応終了後、２規定酢酸水にてpH6.7に調整
した。この反応液をそのままセファクリルＳ−200カラ
ム（2.6cmφ×94cm、0.2M食塩水）にかけ、ゲル濾過精
製を行った。目的物を含む画分を集め、限外濾過により
脱塩濃縮後、目的物を含む水溶液1.8mlを得た。このよ
うにして得られた修飾体は、未修飾のSODの59％の酵素
活性（シトクロムＣ法）を有した。
後の分解物）中のアミノ酸分析値 ・修飾率20％（トリニトロベンゼンスルホン酸法） 実施例29 PEG2修飾ヒト赤血球由来Cu,Zn−SOD ヒト赤血球由来Cu,Zn−SOD 5.20mgに0.1Mホウ酸緩衝
液（pH10.0）2.5mlを加えた後、参考例１にて製造した
高純度のPEG2の185mgを５℃にて加え、５℃にて24時間
放置した。反応終了後、２規定酢酸水にてpH6.7に調整
した。この反応液をそのままセファクリルＳ−200カラ
ム（2.6cmφ×94cm、0.2M食塩水）にかけ、ゲル濾過精
製を行った。目的物を含む画分を集め、限外濾過により
脱塩濃縮後、目的物を含む水溶液1.8mlを得た。このよ
うにして得られた修飾体は、未修飾のSODの59％の酵素
活性（シトクロムＣ法）を有した。
物性値 ・逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS AM303 4.6mmφ×250mm（山村化学製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％トリフルオロ酢酸） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％トリフルオロ
酢酸） 初期Ｂ液濃度:30％ 濃度勾配:1％／分 流速:1ml/分， 検出波長:214nm 保持時間:18.42分 ・高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK gel G3000SW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.2M食塩水（５％EtOH含有） 流速:0.6ml/分， 検出波長:220nm 保持時間:16.69分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 ・修飾率52％（トリニトロベンゼンスルホン酸法） 実施例30 PEG2修飾ヒト赤血球由来Cu,Zn−SOD ヒト赤血球由来Cu,Zn−SOD 5.20mgに0.1Mホウ酸緩衝
液（pH10.0）5.0mlを加えた後、参考例１にて製造した
高純度のPEG2の740mgを５℃にて加え、５℃にて14時間
放置した。更に、PEG2の740mgを追加し、５℃にて５時
間放置した。反応終了後、水3mlを加え、２規定酢酸水
にてpH6.8に調整した。この反応液をそのままセファク
リルＳ−200カラム（2.6cmφ×94cm、0.2M食塩水）にか
け、ゲル濾過精製を行った。目的物を含む画分を集め、
限外濾過により脱塩濃縮後、目的物を含む水溶液1.8ml
を得た。このようにして得られた修飾体は、未修飾のSO
Dの36％の酵素完成（シトクロムＣ法）を有した。
酢酸） 初期Ｂ液濃度:30％ 濃度勾配:1％／分 流速:1ml/分， 検出波長:214nm 保持時間:18.42分 ・高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK gel G3000SW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.2M食塩水（５％EtOH含有） 流速:0.6ml/分， 検出波長:220nm 保持時間:16.69分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 ・修飾率52％（トリニトロベンゼンスルホン酸法） 実施例30 PEG2修飾ヒト赤血球由来Cu,Zn−SOD ヒト赤血球由来Cu,Zn−SOD 5.20mgに0.1Mホウ酸緩衝
液（pH10.0）5.0mlを加えた後、参考例１にて製造した
高純度のPEG2の740mgを５℃にて加え、５℃にて14時間
放置した。更に、PEG2の740mgを追加し、５℃にて５時
間放置した。反応終了後、水3mlを加え、２規定酢酸水
にてpH6.8に調整した。この反応液をそのままセファク
リルＳ−200カラム（2.6cmφ×94cm、0.2M食塩水）にか
け、ゲル濾過精製を行った。目的物を含む画分を集め、
限外濾過により脱塩濃縮後、目的物を含む水溶液1.8ml
を得た。このようにして得られた修飾体は、未修飾のSO
Dの36％の酵素完成（シトクロムＣ法）を有した。
物性値 ・高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK gel G3000SW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.2M食塩水（５％EtOH含有） 流速:0.6ml/分、 検出波長:220mm 保持時間:15.91分 ・高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK gel G3000PW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.2M食塩水 流速:0.6ml/分、 検出波長:254nm 保持時間:18.13分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 ・修飾率77％（トリニトロベンゼンスルホン酸法） 実施例31 PEG2修飾ウシCu,Zn−SOD ウシCu,Zn−SOD 7.5mgを0.1Mホウ酸緩衝液（pH10）
1.875mlに溶かし、この溶液に参考例１で製造した高純
度のPEG2の240mgを４℃にて加え、４℃にて２時間放置
した。水3mlを加え、塩酸にて中和後、セファクリルＳ
−200（2.6cmφ×80cm、0.2M食塩水）にて、ゲル濾過精
製を行い、目的物を含む分画を限外濾過し、脱塩濃縮を
行い、目的物を含む水溶液10ml（蛋白含量0.28mg/ml）
を得た。
後の分解物）中のアミノ酸分析値 ・修飾率77％（トリニトロベンゼンスルホン酸法） 実施例31 PEG2修飾ウシCu,Zn−SOD ウシCu,Zn−SOD 7.5mgを0.1Mホウ酸緩衝液（pH10）
1.875mlに溶かし、この溶液に参考例１で製造した高純
度のPEG2の240mgを４℃にて加え、４℃にて２時間放置
した。水3mlを加え、塩酸にて中和後、セファクリルＳ
−200（2.6cmφ×80cm、0.2M食塩水）にて、ゲル濾過精
製を行い、目的物を含む分画を限外濾過し、脱塩濃縮を
行い、目的物を含む水溶液10ml（蛋白含量0.28mg/ml）
を得た。
物性値 ・高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK gel G3000SW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.1M食塩水（５％エタノール含有） 流速:0.6ml/分、 検出波長:220nm 保持時間:17.03分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例32 PEG2修飾牛肝臓カタラーゼ 牛肝臓カタラーゼ5mgを0.1Mホウ酸緩衝液（pH10）1.5
mlに溶かし、４℃にて参考例１にて製造した高純度のPE
G2の90mgを加え、４℃にて24時間放置した。これを0.1M
酢酸にて中和後セファクリルＳ−200カラム（2.6cmφ×
84cm、0.2M食塩水）にかけ、ゲル濾過精製を行った。目
的物を含む画分を集め、限外濾過により脱塩後凍結乾燥
し、目的物4.7mgを得た。
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例32 PEG2修飾牛肝臓カタラーゼ 牛肝臓カタラーゼ5mgを0.1Mホウ酸緩衝液（pH10）1.5
mlに溶かし、４℃にて参考例１にて製造した高純度のPE
G2の90mgを加え、４℃にて24時間放置した。これを0.1M
酢酸にて中和後セファクリルＳ−200カラム（2.6cmφ×
84cm、0.2M食塩水）にかけ、ゲル濾過精製を行った。目
的物を含む画分を集め、限外濾過により脱塩後凍結乾燥
し、目的物4.7mgを得た。
物性値 ・高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK gel G3000SW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.1M食塩水＋５％エタノール 流速:0.6ml/分、 検出波長:220nm 保持時間:25.7分 実施例33 PEG2修飾ウリカーゼ ウリカーゼ（カンジダ）5mgを0.1Mホウ酸塩緩衝液（p
H10.0）2mlに溶解し、PEG2の100mgを加えて４℃、20時
間反応した。反応液を10万カットの限外濾過膜で未反応
PEG2を除去しPEG2修飾ウリカーゼを得た。
H10.0）2mlに溶解し、PEG2の100mgを加えて４℃、20時
間反応した。反応液を10万カットの限外濾過膜で未反応
PEG2を除去しPEG2修飾ウリカーゼを得た。
修飾率:46.5％ 活性:17.8％（未修飾ウリカーゼの活性を100とした
時） 分子量:43.3万 ウリカーゼに対する抗血清との反応：未修飾ウリカー
ゼの1/1000 実施例34 PEG2修飾ウリカーゼ ウリカーゼ（カンジダ）1mgを0.1Mホウ酸緩衝液（pH1
0）500μに溶かし、４℃にて参考例１にて製造した高
純度のPEG2の30mgを加え、４℃にて25時間放置した。こ
れを0.1M酢酸にて中和後セファクリルＳ−200カラム（2
6cmφ×84cm、0.2M食塩水）にかけ、ゲル濾過精製を行
った。目的物を含む画分を集め、限外濾過により脱塩濃
縮後、目的物を含む水溶液200μを得た。
時） 分子量:43.3万 ウリカーゼに対する抗血清との反応：未修飾ウリカー
ゼの1/1000 実施例34 PEG2修飾ウリカーゼ ウリカーゼ（カンジダ）1mgを0.1Mホウ酸緩衝液（pH1
0）500μに溶かし、４℃にて参考例１にて製造した高
純度のPEG2の30mgを加え、４℃にて25時間放置した。こ
れを0.1M酢酸にて中和後セファクリルＳ−200カラム（2
6cmφ×84cm、0.2M食塩水）にかけ、ゲル濾過精製を行
った。目的物を含む画分を集め、限外濾過により脱塩濃
縮後、目的物を含む水溶液200μを得た。
物性値 ・高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK gel G3000SW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.1M食塩水＋５％エタノール 流速:0.6ml/分， 検出波長:220nm 保持時間:25.1分 実施例35 PEG2修飾ビリルビンオキシダーゼ ビリルビンオキシダーゼ（Myrothecium verrucaria）
5mgを水0.5mlに溶解し、pHを6.0に保持しつつ1,6ヘキシ
ルジアミン塩酸塩を30mgと水溶性カルボジイミド（１−
エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミ
ドヒドロクロリド）0.6mgを加えて４℃、20時間反応す
る。分子量１万カットの限外濾過膜で過剰の1,6へキシ
ルジアミンと水溶性カルボジイミドを除去し凍結乾燥す
る。得られたアミノビリルビンオキシダーゼ2.5mgを0.1
Mホウ酸塩緩衝液（pH10.0）0.5mlに溶解し、12mgのPEG2
を加えて４℃、20時間反応する。反応液を分子量３万カ
ットの限外濾過膜で未反応のPEG2を除去しPEG2修飾ビリ
ルビンオキシダーゼを得た。
5mgを水0.5mlに溶解し、pHを6.0に保持しつつ1,6ヘキシ
ルジアミン塩酸塩を30mgと水溶性カルボジイミド（１−
エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミ
ドヒドロクロリド）0.6mgを加えて４℃、20時間反応す
る。分子量１万カットの限外濾過膜で過剰の1,6へキシ
ルジアミンと水溶性カルボジイミドを除去し凍結乾燥す
る。得られたアミノビリルビンオキシダーゼ2.5mgを0.1
Mホウ酸塩緩衝液（pH10.0）0.5mlに溶解し、12mgのPEG2
を加えて４℃、20時間反応する。反応液を分子量３万カ
ットの限外濾過膜で未反応のPEG2を除去しPEG2修飾ビリ
ルビンオキシダーゼを得た。
分子量:113000 活性:27.8％（未修飾ビリルビンオキシダーゼの活性
を100とした時） 半減期 300万（未修飾ビリルビンオキシダーゼ15
分） 実施例36 PEG2修飾牛血清アルブミン 10mgの血清アルブミン（Bovine）を0.1Mホウ酸塩緩衝
液（pH9.20）に溶解し、100mgのPEG2を加えて４℃、20
時間反応する。分子量５万カットの限外濾過膜で処理し
未反応のPEG2を除去して目的物を得た。
を100とした時） 半減期 300万（未修飾ビリルビンオキシダーゼ15
分） 実施例36 PEG2修飾牛血清アルブミン 10mgの血清アルブミン（Bovine）を0.1Mホウ酸塩緩衝
液（pH9.20）に溶解し、100mgのPEG2を加えて４℃、20
時間反応する。分子量５万カットの限外濾過膜で処理し
未反応のPEG2を除去して目的物を得た。
修飾率:42.0％ 牛血清アルブミンに対する抗血清との反応： 未修飾牛血清アルブミンの1/1000 実施例37 PEG2修飾ウロキナーゼ ウロキナーゼ（ヒト尿）10mgを0.1Mホウ酸塩緩衝液
（pH10.0）に溶解し、PEG2の200mgを加えて４℃、20時
間反応する。反応液を３万カットの限外濾過膜で処理
し、未反応のPEG2を除去して目的物を得た。
（pH10.0）に溶解し、PEG2の200mgを加えて４℃、20時
間反応する。反応液を３万カットの限外濾過膜で処理
し、未反応のPEG2を除去して目的物を得た。
活性:17.8％（未修飾ウロキナーゼを100とした時） 実施例38 PEG2修飾ヒアルロニダーゼ ヒアルロニダーゼ（Bovine Testes）100mgを0.1Mホウ
酸塩緩衝液（pH10.0）20mlに溶解し、PEG2の2gを加えて
４℃、20時間反応する。反応液を分子量３万カットの限
外濾過膜で処理し、未反応のPEG2を除去して目的物を得
た。
酸塩緩衝液（pH10.0）20mlに溶解し、PEG2の2gを加えて
４℃、20時間反応する。反応液を分子量３万カットの限
外濾過膜で処理し、未反応のPEG2を除去して目的物を得
た。
修飾率:47.6％ 活性:22.9％（未修飾ヒアルロニダーゼを100とした
時） 実施例39 PEG2修飾コンドロイチンABCリアーゼ 1mgのコンドロイチンABCリアーゼ（Proteusvulgari
s）を0.1Mホウ酸塩緩衝液（pH10.0）に溶解し、20mgのP
EG2を加えて４℃、20時間反応する。分子量３万カット
の限外濾過膜で処理し、未反応のPEG2を除去して目的物
を得た。
時） 実施例39 PEG2修飾コンドロイチンABCリアーゼ 1mgのコンドロイチンABCリアーゼ（Proteusvulgari
s）を0.1Mホウ酸塩緩衝液（pH10.0）に溶解し、20mgのP
EG2を加えて４℃、20時間反応する。分子量３万カット
の限外濾過膜で処理し、未反応のPEG2を除去して目的物
を得た。
分子量:220000 活性:21.4％（未修飾コンドロイチンABCリアーゼを10
0とした時） 実施例40 PEG21修飾家塵ダニアレルゲン（PEG2−HDMA） 分子量17000の家ダニの抽出精製物を主成分とする蛋
白を2mgを0.1Mホウ酸塩緩衝液（pH10.0）3mlに溶解し、
PEG2の63.5mgを加えて４℃、20時間反応した。この反応
液を0.015Mリン酸塩緩衝液（pH7.0）で10倍に希釈して
３万カットの限外濾過膜で未反応のPEG2を除去したPEG2
−HDMAを得た。
0とした時） 実施例40 PEG21修飾家塵ダニアレルゲン（PEG2−HDMA） 分子量17000の家ダニの抽出精製物を主成分とする蛋
白を2mgを0.1Mホウ酸塩緩衝液（pH10.0）3mlに溶解し、
PEG2の63.5mgを加えて４℃、20時間反応した。この反応
液を0.015Mリン酸塩緩衝液（pH7.0）で10倍に希釈して
３万カットの限外濾過膜で未反応のPEG2を除去したPEG2
−HDMAを得た。
修飾率:48.0％（TNBS法） 電気泳動：アセチルセルロース膜 0.069Mベロナール緩衝液（pH8.6） 0.5mA/cm Coomassie Blue染色 電気泳動の結果は図−６に示した。
実施例41 PEG2修飾ヒトCRF ヒト−CRF 0.46mgの0.05Mホウ酸塩緩衝液（pH10）30
5μに４℃にて参考例１にて製造した高純度のPEG2の1
1.6mgを加え４℃にて放置した。さらに７時間後0.1Mホ
ウ酸塩緩衝液（pH10）100μを加え、23.5時間後と45.
5時間後にそれぞれPEG2の5.8mgを加え、４℃にて都合72
時間放置した。これを0.1M酢酸にて中和後、TSK gel G
−3000SW（7.5mmφ×600mm、0.1M食塩水＋５％エタノー
ル、流速0.6ml/分）にてゲル濾過精製を行った。目的物
を含む画分を集め、限外濾過により脱塩、濃縮し、目的
物を含む水溶液200μを得た。
5μに４℃にて参考例１にて製造した高純度のPEG2の1
1.6mgを加え４℃にて放置した。さらに７時間後0.1Mホ
ウ酸塩緩衝液（pH10）100μを加え、23.5時間後と45.
5時間後にそれぞれPEG2の5.8mgを加え、４℃にて都合72
時間放置した。これを0.1M酢酸にて中和後、TSK gel G
−3000SW（7.5mmφ×600mm、0.1M食塩水＋５％エタノー
ル、流速0.6ml/分）にてゲル濾過精製を行った。目的物
を含む画分を集め、限外濾過により脱塩、濃縮し、目的
物を含む水溶液200μを得た。
物性値 ・高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK gel G3000SW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.1M食塩水＋５％エタノール 流速:0.6ml/分、 検出波長:220nm 保持時間:19.5分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例42 PEG2修飾ヒトIGF−Ｉ ヒト−IGF−Ｉの5mgを0.1Mホウ酸緩衝液（pH10）2.5m
lに溶かし、４℃にて、参考例１にて製造した高純度のP
EG2の50mgを４回に分け４時間かけて加えた。さらに、
４℃にて１時間30分撹拌後、水2mlを加え、続いて１規
定塩酸水にてpH7とした。この反応液をそのまま、セフ
ァクリルＳ−200（2.6cmφ×93cm、0.2M食塩水）にか
け、ゲル濾過精製を行った。目的物を含む画分を集め、
限外濾過により脱塩、濃縮し、目的物を含む水溶液4.5m
lを得た。
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例42 PEG2修飾ヒトIGF−Ｉ ヒト−IGF−Ｉの5mgを0.1Mホウ酸緩衝液（pH10）2.5m
lに溶かし、４℃にて、参考例１にて製造した高純度のP
EG2の50mgを４回に分け４時間かけて加えた。さらに、
４℃にて１時間30分撹拌後、水2mlを加え、続いて１規
定塩酸水にてpH7とした。この反応液をそのまま、セフ
ァクリルＳ−200（2.6cmφ×93cm、0.2M食塩水）にか
け、ゲル濾過精製を行った。目的物を含む画分を集め、
限外濾過により脱塩、濃縮し、目的物を含む水溶液4.5m
lを得た。
物性値 ・逆相高速液体クロマトグラフィー カラム：マイクロボンダスフェアーC18 3.9mmφ×150mm（ウォーターズ社製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％トリフルオロ酢酸） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％トリフルオロ
酢酸） 初期Ｂ液濃度:30％ 濃度勾配:1％／分 流速 :1ml/分，検出波長:220nm 保持時間:23.2分 ・高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK gel G3000PW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.2M食塩水 流速:0.6ml/分、 検出波長:254nm 保持時間:20.4分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例43 PEG2修飾ヒトIGF−Ｉ ヒトIGF−Ｉ 5.0mgを1Mホウ酸緩衝液（pH10）500μ
に溶かし、その溶液に参考例１で製造した高純度のPE
G2の13.4mgを４℃にて加え、４℃にて22時間放置した。
0.1M酢酸にて中和後、セファクリルＳ−200（2.6cmφ×
94cm、0.2M食塩水）にてゲル濾過精製し、目的物Ａ、目
的物Ｂを含む分画をそれぞれ限外濾過により脱塩濃縮
し、目的物Ａ、目的物Ｂを含む水溶液を各々250μ得
た。（蛋白含量；目的物A753μg/250μ、目的物B341
μg/250μ） このようにして得られた目的物Ｂは、ニワトリ胚大腿
骨原基（軟骨）の器官培養における軟骨組織の重量増加
を指標にした成長促進活性測定において、未修飾体の約
1/100の軟骨の成長促進活性を有した。
酢酸） 初期Ｂ液濃度:30％ 濃度勾配:1％／分 流速 :1ml/分，検出波長:220nm 保持時間:23.2分 ・高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK gel G3000PW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.2M食塩水 流速:0.6ml/分、 検出波長:254nm 保持時間:20.4分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例43 PEG2修飾ヒトIGF−Ｉ ヒトIGF−Ｉ 5.0mgを1Mホウ酸緩衝液（pH10）500μ
に溶かし、その溶液に参考例１で製造した高純度のPE
G2の13.4mgを４℃にて加え、４℃にて22時間放置した。
0.1M酢酸にて中和後、セファクリルＳ−200（2.6cmφ×
94cm、0.2M食塩水）にてゲル濾過精製し、目的物Ａ、目
的物Ｂを含む分画をそれぞれ限外濾過により脱塩濃縮
し、目的物Ａ、目的物Ｂを含む水溶液を各々250μ得
た。（蛋白含量；目的物A753μg/250μ、目的物B341
μg/250μ） このようにして得られた目的物Ｂは、ニワトリ胚大腿
骨原基（軟骨）の器官培養における軟骨組織の重量増加
を指標にした成長促進活性測定において、未修飾体の約
1/100の軟骨の成長促進活性を有した。
目的物Ａの物性値 ・高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK gel G3000SW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.1M食塩水（５％エタノール含有） 流速:0.6ml/分， 検出波長:220nm 保持時間:20.76分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 目的物Ｂの物性値 ・高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK gel G3000SW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.1M食塩水（５％エタノール含有） 流速:0.6ml/分、 検出波長:220nm 保持時間:21.15分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例44 PEG2修飾ヒトIGF−II ヒトIGF−II 200μｇを0.1Mホウ酸緩衝液（pH10）84
μに溶かし、その溶液に参考例１で製造した高純度の
PEG2の2mgを含む水溶液16μを加え、４℃にて16時間
放置した。さらにPEG2の2mgを含む水溶液16μを加
え、４℃にて20時間放置した、1N酢酸にて中和後、TSK
G3000 SW〔7.5mmφ×600mm;0.2M食塩水（５％エタノー
ル）〕にてゲル濾過精製を行い、目的物を含む分画を脱
塩し、凍結乾燥した後、水80μを加え、目的物を含む
水溶液として得た。（蛋白含量73μg/80μ） 物性値 ・高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK gel G3000SW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.2M食塩水（５％エタノール含有） 流速:0.6ml/分、 検出波長:220nm 保持時間:19.51分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例45 PEG2修飾ヒトGH ヒトGH25μｇを含む0.05Mホウ酸緩衝液（pH10）15μ
に参考例１で製造した高純度のPEG2を0.9mg加え、反
応温度３℃にて22時間放置した。TSK G3000 SW〔7.5mm
φ×600mm、0.1M食塩水（５％エタノール含有）〕を用
いたゲル濾過精製を行い、目的物を含む分画を脱塩し、
濃縮し、目的物を含む水溶液100μを得た。（蛋白含
量７μg/100μ） 物性値 ・高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK gel G3000SW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.1M食塩水（５％エタノール含有） 流速:0.6ml/分， 検出波長:220nm 保持時間:16.3分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例46 PEG2修飾ヒトｔ−PA ヒトｔ−PAを含む溶液（ｔ−PA29.3mg/ml、pH3）340
μに0.1Mホウ酸緩衝液（pH9.5、1Mチオシアン酸カリ
ウムを含有）9.6mlを加えた後、参考例１にて製造した
高純度のPEG2の164.2mgを４℃にて加え、４℃にて19時
間放置した。反応終了後、１規定塩酸水にてpH3に調整
した。遠心分離後、得られた上清をそのまま、セファク
リルＳ−200カラム（2.6cmφ×8.4cm、0.2M食塩水、pH
3）にかけ、ゲル濾過精製を行った。目的物を含む画分
を集め、限外濾過により脱塩濃縮後、目的物を含む水溶
液100μ（蛋白含量3.53mg/ml）を得た。
後の分解物）中のアミノ酸分析値 目的物Ｂの物性値 ・高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK gel G3000SW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.1M食塩水（５％エタノール含有） 流速:0.6ml/分、 検出波長:220nm 保持時間:21.15分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例44 PEG2修飾ヒトIGF−II ヒトIGF−II 200μｇを0.1Mホウ酸緩衝液（pH10）84
μに溶かし、その溶液に参考例１で製造した高純度の
PEG2の2mgを含む水溶液16μを加え、４℃にて16時間
放置した。さらにPEG2の2mgを含む水溶液16μを加
え、４℃にて20時間放置した、1N酢酸にて中和後、TSK
G3000 SW〔7.5mmφ×600mm;0.2M食塩水（５％エタノー
ル）〕にてゲル濾過精製を行い、目的物を含む分画を脱
塩し、凍結乾燥した後、水80μを加え、目的物を含む
水溶液として得た。（蛋白含量73μg/80μ） 物性値 ・高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK gel G3000SW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.2M食塩水（５％エタノール含有） 流速:0.6ml/分、 検出波長:220nm 保持時間:19.51分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例45 PEG2修飾ヒトGH ヒトGH25μｇを含む0.05Mホウ酸緩衝液（pH10）15μ
に参考例１で製造した高純度のPEG2を0.9mg加え、反
応温度３℃にて22時間放置した。TSK G3000 SW〔7.5mm
φ×600mm、0.1M食塩水（５％エタノール含有）〕を用
いたゲル濾過精製を行い、目的物を含む分画を脱塩し、
濃縮し、目的物を含む水溶液100μを得た。（蛋白含
量７μg/100μ） 物性値 ・高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK gel G3000SW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.1M食塩水（５％エタノール含有） 流速:0.6ml/分， 検出波長:220nm 保持時間:16.3分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例46 PEG2修飾ヒトｔ−PA ヒトｔ−PAを含む溶液（ｔ−PA29.3mg/ml、pH3）340
μに0.1Mホウ酸緩衝液（pH9.5、1Mチオシアン酸カリ
ウムを含有）9.6mlを加えた後、参考例１にて製造した
高純度のPEG2の164.2mgを４℃にて加え、４℃にて19時
間放置した。反応終了後、１規定塩酸水にてpH3に調整
した。遠心分離後、得られた上清をそのまま、セファク
リルＳ−200カラム（2.6cmφ×8.4cm、0.2M食塩水、pH
3）にかけ、ゲル濾過精製を行った。目的物を含む画分
を集め、限外濾過により脱塩濃縮後、目的物を含む水溶
液100μ（蛋白含量3.53mg/ml）を得た。
このようにして得られた修飾体のＳ−2288（Ile−Pro
−Arg−pNA）を基質としたamidolytic活性を測定したと
ころ、4.0×105IU/mlの値を示した。
−Arg−pNA）を基質としたamidolytic活性を測定したと
ころ、4.0×105IU/mlの値を示した。
物性値 ・逆相高速液体クラムトグラフィー カラム:YMC−ODS AM303 4.6mmφ×250mm（山村化学製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％トリフルオロ酢酸） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％トリフルオロ
酢酸） 初期Ｂ液濃度:20％ 濃度勾配:1％／分 流速:1ml/分， 検出波長:214nm 保持時間:26.0分 ・高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK gel G3000PW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.2M食塩水 流速:0.6ml/分， 検出波長:254nm 保持時間:20.8分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例47 PEG2修飾ユビキチン ユビキチン（ヒト）6mgを0.1Mホウ酸緩衝液（pH10）3
mlに溶かし、４℃にて、参考例１にて製造した高純度の
PEG2の520mgを３回に分け１時間30分をかけて加えた。
さらに、４℃にて３時間撹拌後、水2mlを加え、続いて
１規定塩酸水にてpH7とした。この反応液をそのまま、
セファクリルＳ−200（2.6cmφ×93cm、0.2M食塩水）に
かけ、ゲル濾過精製を行った。目的物を含む画分を集
め、限外濾過により脱塩、濃縮し、目的物を含む水溶液
4.5mlを得た。
酢酸） 初期Ｂ液濃度:20％ 濃度勾配:1％／分 流速:1ml/分， 検出波長:214nm 保持時間:26.0分 ・高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK gel G3000PW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.2M食塩水 流速:0.6ml/分， 検出波長:254nm 保持時間:20.8分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例47 PEG2修飾ユビキチン ユビキチン（ヒト）6mgを0.1Mホウ酸緩衝液（pH10）3
mlに溶かし、４℃にて、参考例１にて製造した高純度の
PEG2の520mgを３回に分け１時間30分をかけて加えた。
さらに、４℃にて３時間撹拌後、水2mlを加え、続いて
１規定塩酸水にてpH7とした。この反応液をそのまま、
セファクリルＳ−200（2.6cmφ×93cm、0.2M食塩水）に
かけ、ゲル濾過精製を行った。目的物を含む画分を集
め、限外濾過により脱塩、濃縮し、目的物を含む水溶液
4.5mlを得た。
物性値 ・逆相高速液体クロマトグラフィー カラム：マイクロボンダスフェアーC4 3.9mmφ×150mm（ウォーターズ社製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％トリフルオロ酢酸） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％トリフルオロ
酢酸） 初期Ｂ液濃度:25％ 濃度勾配:1％／分 流速 :1ml/分，検出波長:220nm 保持時間:23.5分 ・高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK gel G3000 PW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.2M食塩水 流速:0.6ml/分、 検出波長:254nm 保持時間:20.3分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例48 PEG2修飾マウスGM−CSF マウスGM−CSF 500μｇを含む水溶液500μに参考
例１で製造した高純度のPEG2の36mgを含む0.1Mホウ酸緩
衝液（pH10）500μを加え、室温にて2.5時間放置し
た。逆相高速液体クロマトグラフィー〔マイクロボンダ
スフェアーC18 3.9mmφ×15cm;溶出液Ａ液＝0.1％TFA
水とＢ液＝アセトニトリル0.1％TFA）を用いたグラジェ
ント（初期Ｂ液濃度０％、15分後30％、75分後90％）；
流速1ml/分〕により精製を行い、目的物を含む分画を再
び逆相高速液体クロマトグラフィー〔マイクロボンダス
フェアーC18 3.9mmφ×15cm;溶出液Ａ液＝0.1％TFA水
とＢ液＝アセトニトリル（0.1％TFA）を用いたグラジェ
ント（初期Ｂ液濃度36％、勾配１％／分）;1ml/分〕に
より精製を行い、目的物を含む分画を凍結乾燥後、水20
0μを加え、目的物を含む水溶液として得た。（蛋白
含量85μg/200μ） 得られた修飾体はマウス骨髄細胞の3H−チミジン取り
込み法にて８×107U/mgの活性を示した。また、本修飾
体をC3H/Heマウスの腹腔内に投与すると半減期約７時間
（マウスGM−CSFは約40分）で減少していった。
酢酸） 初期Ｂ液濃度:25％ 濃度勾配:1％／分 流速 :1ml/分，検出波長:220nm 保持時間:23.5分 ・高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK gel G3000 PW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.2M食塩水 流速:0.6ml/分、 検出波長:254nm 保持時間:20.3分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例48 PEG2修飾マウスGM−CSF マウスGM−CSF 500μｇを含む水溶液500μに参考
例１で製造した高純度のPEG2の36mgを含む0.1Mホウ酸緩
衝液（pH10）500μを加え、室温にて2.5時間放置し
た。逆相高速液体クロマトグラフィー〔マイクロボンダ
スフェアーC18 3.9mmφ×15cm;溶出液Ａ液＝0.1％TFA
水とＢ液＝アセトニトリル0.1％TFA）を用いたグラジェ
ント（初期Ｂ液濃度０％、15分後30％、75分後90％）；
流速1ml/分〕により精製を行い、目的物を含む分画を再
び逆相高速液体クロマトグラフィー〔マイクロボンダス
フェアーC18 3.9mmφ×15cm;溶出液Ａ液＝0.1％TFA水
とＢ液＝アセトニトリル（0.1％TFA）を用いたグラジェ
ント（初期Ｂ液濃度36％、勾配１％／分）;1ml/分〕に
より精製を行い、目的物を含む分画を凍結乾燥後、水20
0μを加え、目的物を含む水溶液として得た。（蛋白
含量85μg/200μ） 得られた修飾体はマウス骨髄細胞の3H−チミジン取り
込み法にて８×107U/mgの活性を示した。また、本修飾
体をC3H/Heマウスの腹腔内に投与すると半減期約７時間
（マウスGM−CSFは約40分）で減少していった。
物性値 ・逆相高速液体クロマトグラフィー カラム：マイクロボンダスフェアーC18 3.9mmφ×150mm（ウォーターズ社製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％TFA） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％TFA） 初期Ｂ液濃度:36％ 濃度勾配:1％／分 流速 :1ml/分，検出波長:220nm 保持時間:13.63分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例49 PEG2修飾ペプチドＴ ペプチドT0.56mgを0.1Mホウ酸緩衝液（pH10）500μ
に溶かし、４℃にて、参考例１にて製造した高純度のPE
G2の19.6mgを加え、４℃にて25時間放置した。これを、
0.1M酢酸にて中和後、逆相高速クロマトグラフィー〔YM
C−ODS,4.6mmφ×250mm;溶出液Ａ液＝0.1％TFA水とＢ液
＝アセトニトリル（0.1％TFA）によるグラジェント（初
期Ｂ液濃度25％、勾配１％／分）；流速1ml/分〕により
精製を行い、目的物を含む画分を凍結乾燥した後、水20
0μを加え、目的物を含む水溶液として得た。
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例49 PEG2修飾ペプチドＴ ペプチドT0.56mgを0.1Mホウ酸緩衝液（pH10）500μ
に溶かし、４℃にて、参考例１にて製造した高純度のPE
G2の19.6mgを加え、４℃にて25時間放置した。これを、
0.1M酢酸にて中和後、逆相高速クロマトグラフィー〔YM
C−ODS,4.6mmφ×250mm;溶出液Ａ液＝0.1％TFA水とＢ液
＝アセトニトリル（0.1％TFA）によるグラジェント（初
期Ｂ液濃度25％、勾配１％／分）；流速1ml/分〕により
精製を行い、目的物を含む画分を凍結乾燥した後、水20
0μを加え、目的物を含む水溶液として得た。
物性値 ・逆相高速液体クラムトグラフィー カラム:YMC−ODS AM303 4.6mmφ×250mm（山村化学社製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％トリフルオロ酢酸） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％トリフルオロ
酢酸） 初期Ｂ液濃度:25％ 濃度勾配１％／分 流速:1ml/分， 検出波長:220nm 保持時間25.1分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例50 PEG2修飾STF STF 0.58mgを0.1Mホウ酸緩衝液（pH10）500μに溶
かし、４℃にて参考例１にて製造した高純度のPEG2の2
0.3mgを加え、４℃にて25時間放置した。これを0.1M酢
酸にて中和後、逆相高速クロマトグラフィー〔YMC−OD
S,4.6mmφ×250mm;溶出液 Ａ液＝0.1％TFA水とＢ液＝
アセトニトリル（0.1％TFA）によるグラジェント（初期
Ｂ液濃度25％、勾配１％／分；流速1ml/分〕により精製
を行い、目的物を含む画分を凍結乾燥した後、水200μ
を加え、目的物を含む水溶液として得た。
酢酸） 初期Ｂ液濃度:25％ 濃度勾配１％／分 流速:1ml/分， 検出波長:220nm 保持時間25.1分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例50 PEG2修飾STF STF 0.58mgを0.1Mホウ酸緩衝液（pH10）500μに溶
かし、４℃にて参考例１にて製造した高純度のPEG2の2
0.3mgを加え、４℃にて25時間放置した。これを0.1M酢
酸にて中和後、逆相高速クロマトグラフィー〔YMC−OD
S,4.6mmφ×250mm;溶出液 Ａ液＝0.1％TFA水とＢ液＝
アセトニトリル（0.1％TFA）によるグラジェント（初期
Ｂ液濃度25％、勾配１％／分；流速1ml/分〕により精製
を行い、目的物を含む画分を凍結乾燥した後、水200μ
を加え、目的物を含む水溶液として得た。
物性値 ・逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS AM303 4.6mmφ×250mm（山村化学社製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％トリフルオロ酢酸） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％トリフルオロ
酢酸） 初期Ｂ液濃度:25％ 濃度勾配:1％／分 流速:1ml/分， 検出波長:220nm 保持時間:24.4分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例51 PEG2修飾ヒトACTH（１−24） ヒトACTH（１−24）0.47mgの0.05Mホウ酸緩衝液（pH1
0）305μに４℃にて参考例１にて製造した高純度のPE
G2の48.0mgを加え４℃にて放置した。さらに７時間後0.
1Mホウ酸緩衝液（pH10）100μを加え、27時間後と45.
5時間後にそれぞれPEG2の24.0mgを加え、４℃にて都合7
2時間放置した。これを0.1M酢酸にて中和後、TSK gel G
3000 SW（7.5mmφ×600mm;0.1M食塩水＋５％エタノー
ル、流速0.6ml/分）にてゲル濾過精製を行った。目的物
を含む画分を集め、限外濾過により脱塩濃縮し、目的物
を含む水溶液200μを得た。
酢酸） 初期Ｂ液濃度:25％ 濃度勾配:1％／分 流速:1ml/分， 検出波長:220nm 保持時間:24.4分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例51 PEG2修飾ヒトACTH（１−24） ヒトACTH（１−24）0.47mgの0.05Mホウ酸緩衝液（pH1
0）305μに４℃にて参考例１にて製造した高純度のPE
G2の48.0mgを加え４℃にて放置した。さらに７時間後0.
1Mホウ酸緩衝液（pH10）100μを加え、27時間後と45.
5時間後にそれぞれPEG2の24.0mgを加え、４℃にて都合7
2時間放置した。これを0.1M酢酸にて中和後、TSK gel G
3000 SW（7.5mmφ×600mm;0.1M食塩水＋５％エタノー
ル、流速0.6ml/分）にてゲル濾過精製を行った。目的物
を含む画分を集め、限外濾過により脱塩濃縮し、目的物
を含む水溶液200μを得た。
物性値 ・高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK gel G3000 SW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.1M食塩水＋５％エタノール 流速:0.6ml/分， 検出波長:220nm 保持時間:17.4分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例52 PEG2修飾ヒトPTH（１−34） ヒトPTH（１−34）0.49mgの0.05Mホウ酸緩衝溶液（pH
10）305μに４℃にて参考例１にて製造した高純度のP
EG2の28.4mgを加え、４℃にて放置した。さらに７時間
後0.1Mホウ酸塩緩衝（pH10）100μを加え、23.5時間
後と45.5時間後にそれぞれPEG2の14.2mgを加え、４℃に
て都合72時間放置した。これを0.1M酢酸にて中和後、TS
K gel G3000 SW（7.5mmφ×600mm、0.1M食塩水＋５％エ
タノール、流速0.6ml/分）にてゲル濾過精製を行った。
目的物を含む画分を集め限外濾過により脱塩濃縮し、目
的物を含む水溶液200μを得た。
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例52 PEG2修飾ヒトPTH（１−34） ヒトPTH（１−34）0.49mgの0.05Mホウ酸緩衝溶液（pH
10）305μに４℃にて参考例１にて製造した高純度のP
EG2の28.4mgを加え、４℃にて放置した。さらに７時間
後0.1Mホウ酸塩緩衝（pH10）100μを加え、23.5時間
後と45.5時間後にそれぞれPEG2の14.2mgを加え、４℃に
て都合72時間放置した。これを0.1M酢酸にて中和後、TS
K gel G3000 SW（7.5mmφ×600mm、0.1M食塩水＋５％エ
タノール、流速0.6ml/分）にてゲル濾過精製を行った。
目的物を含む画分を集め限外濾過により脱塩濃縮し、目
的物を含む水溶液200μを得た。
物性値 ・高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK gel G3000 SW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.1M食塩水＋５％エタノール 流速:0.6ml/分， 検出波長:220nm 保持時間:19.2分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例53 PEG2修飾ヒトグルカゴン グルカゴン（ヒト）0.51mgの0.05Mホウ酸緩衝溶液（p
H10）305μに４℃にて参考例１にて製造した高純度の
PEG2の17.7mgを加え４℃にて放置した。さらに７時間後
0.1Mホウ酸緩衝液（pH10）100μを加え、23.5時間後
と45.5時間後にそれぞれPEG2の8.9mgを加え、４℃にて
都合72時間放置した。これを0.1M酢酸にて中和後、TSO
gel G3000 SW（7.5mmφ×600mm;0.1M食塩水＋５％エタ
ノール、流速0.6ml/分）にてゲル濾過精製を行った。目
的物を含む画分を集め限外濾過により脱塩濃縮し、目的
物を含む水溶液200μを得た。
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例53 PEG2修飾ヒトグルカゴン グルカゴン（ヒト）0.51mgの0.05Mホウ酸緩衝溶液（p
H10）305μに４℃にて参考例１にて製造した高純度の
PEG2の17.7mgを加え４℃にて放置した。さらに７時間後
0.1Mホウ酸緩衝液（pH10）100μを加え、23.5時間後
と45.5時間後にそれぞれPEG2の8.9mgを加え、４℃にて
都合72時間放置した。これを0.1M酢酸にて中和後、TSO
gel G3000 SW（7.5mmφ×600mm;0.1M食塩水＋５％エタ
ノール、流速0.6ml/分）にてゲル濾過精製を行った。目
的物を含む画分を集め限外濾過により脱塩濃縮し、目的
物を含む水溶液200μを得た。
物性値 ・高速ゲル濾過クロマトグラフィー ２カラム:TSK gel G3000 SW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.1M食塩水＋５％エタノール 流速:0.6ml/分， 検出波長:220nm 保持時間:19.8分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例54 PEG2修飾ヒトCCK−オクタペプチド（26−33） ヒトCCK−オクタペプチド（26−33）（Sulfated For
m）0.46mgの0.05Mホウ酸緩衝溶液（pH10）305μに４
℃にて参考例１にて製造した高純度のPEG2の24.2mgを加
え、４℃にて放置した。さらに７時間後0.1Mホウ酸緩衝
液（pH10）100μを加え、23.5時間後と45.5時間後に
それぞれPEG2の12.1mgを加え、４℃にて都合72時間放置
した。これを0.1M酢酸にて中和後、逆相高速クロマトグ
ラフィー〔YMC−ODS,4.6mmφ×250mm;溶出液Ａ液＝0.1
％TFA水とＢ液＝アセトニトリル（0.1％TFA）によるグ
ラジェント（初期Ｂ液濃度25％、勾配１％／分）；流速
1ml/分〕により精製を行い、目的物を含む画分を凍結乾
燥した後、水200μを加え、目的物を含む水溶液とし
て得た。
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例54 PEG2修飾ヒトCCK−オクタペプチド（26−33） ヒトCCK−オクタペプチド（26−33）（Sulfated For
m）0.46mgの0.05Mホウ酸緩衝溶液（pH10）305μに４
℃にて参考例１にて製造した高純度のPEG2の24.2mgを加
え、４℃にて放置した。さらに７時間後0.1Mホウ酸緩衝
液（pH10）100μを加え、23.5時間後と45.5時間後に
それぞれPEG2の12.1mgを加え、４℃にて都合72時間放置
した。これを0.1M酢酸にて中和後、逆相高速クロマトグ
ラフィー〔YMC−ODS,4.6mmφ×250mm;溶出液Ａ液＝0.1
％TFA水とＢ液＝アセトニトリル（0.1％TFA）によるグ
ラジェント（初期Ｂ液濃度25％、勾配１％／分）；流速
1ml/分〕により精製を行い、目的物を含む画分を凍結乾
燥した後、水200μを加え、目的物を含む水溶液とし
て得た。
物性値 ・逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS AM303 4.6mmφ×250mm（山村化学社製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％トリフルオロ酢酸） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％トリフルオロ
酢酸） 初期Ｂ液濃度:25％ 濃度勾配:1％／分 流速:1ml/分，検出波長:220nm 保持時間:26.7分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例55 PEG2修飾α−グロブリン α−グロブリンフラクションIV（ブタ）100mgを0.1M
ホウ酸塩緩衝液（pH10.0）20mlに溶解し、PEG2の2000mg
を加えて４℃、20時間反応した。反応後を分子量３万カ
ットの限外濾過膜で処理し、未反応のPEG2を除去した。
酢酸） 初期Ｂ液濃度:25％ 濃度勾配:1％／分 流速:1ml/分，検出波長:220nm 保持時間:26.7分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例55 PEG2修飾α−グロブリン α−グロブリンフラクションIV（ブタ）100mgを0.1M
ホウ酸塩緩衝液（pH10.0）20mlに溶解し、PEG2の2000mg
を加えて４℃、20時間反応した。反応後を分子量３万カ
ットの限外濾過膜で処理し、未反応のPEG2を除去した。
修飾率:4.47％ 実施例56 PEG2修飾γ−グロブリン γ−グロブリンフラクションII（ブタ）100mgを0.1M
ホウ酸塩緩衝液（pH10.0）20mlに溶解し、PEG2の2000mg
を加えて４℃、20時間反応した。反応液を分子量３万カ
ットの限外濾過膜で処理し、未反応のPEG2を除去した。
ホウ酸塩緩衝液（pH10.0）20mlに溶解し、PEG2の2000mg
を加えて４℃、20時間反応した。反応液を分子量３万カ
ットの限外濾過膜で処理し、未反応のPEG2を除去した。
修飾率:38.9％ 実施例57 PEG2修飾トランスフェリン トランスフェリン、鉄部分飽和（マウス）5mgを0.1M
ホウ酸塩緩衝液（pH10.0）1mlに溶解し、PEG2の100mgを
加えて４℃、20時間反応した。反応液を分子量10万カッ
トの限外濾過膜で処理し、未反応のPEG2を除去した。
ホウ酸塩緩衝液（pH10.0）1mlに溶解し、PEG2の100mgを
加えて４℃、20時間反応した。反応液を分子量10万カッ
トの限外濾過膜で処理し、未反応のPEG2を除去した。
修飾率:33.9％ 実施例58 PEG2修飾リポ蛋白 リポ蛋白コレステロール溶液（リポ蛋白50％）10ml
（約100mg）に0.1Mホウ酸塩緩衝液（pH10.0）10ml加え
て、更にPEG2の2gを加えて４℃、20時間反応させた。反
応液を分子量３万カットの限外濾過膜で処理し、未反応
のPEG2を除去した。
（約100mg）に0.1Mホウ酸塩緩衝液（pH10.0）10ml加え
て、更にPEG2の2gを加えて４℃、20時間反応させた。反
応液を分子量３万カットの限外濾過膜で処理し、未反応
のPEG2を除去した。
修飾率:21.4％ 実施例59 PEG2修飾エンドトキシン エンドトキシン（E.coll 0111;B）10mgを0.1Mホウ酸
塩緩衝液（pH10.0）20mlに溶解し、PEG2の200mgを加え
て４℃、20時間反応させた。反応液を分子量30万カット
の限外濾過膜で処理し、未反応のPEG2を除去した。
塩緩衝液（pH10.0）20mlに溶解し、PEG2の200mgを加え
て４℃、20時間反応させた。反応液を分子量30万カット
の限外濾過膜で処理し、未反応のPEG2を除去した。
エタノールアミン基の修飾率:38.7％ エンドトキシン活性（比色法リムルステスト試薬によ
る）：エンドトキシン（E.coll 0111:B）の1/100 実施例60 PEG2修飾エラスターゼ エラスターゼ（ブタ）100mgを水20mlに溶解し、PEG2
の2gを加える。４℃で0.1N−水酸化ナトリウムで徐々に
pHを上げ、最終的にpHを10.0として４℃で20時間反応さ
せる。反応液を分子量３万カットの限外濾過膜で処理
し、未反応のPEG2を除去する。
る）：エンドトキシン（E.coll 0111:B）の1/100 実施例60 PEG2修飾エラスターゼ エラスターゼ（ブタ）100mgを水20mlに溶解し、PEG2
の2gを加える。４℃で0.1N−水酸化ナトリウムで徐々に
pHを上げ、最終的にpHを10.0として４℃で20時間反応さ
せる。反応液を分子量３万カットの限外濾過膜で処理
し、未反応のPEG2を除去する。
修飾率:39.9％ 活性:27.8％（未修飾エラスターゼの活性を100とした
時） 実施例61 PEG2修飾ヒトｔ−PA ヒトｔ−PAを含む溶液（ｔ−PA29.3mg/ml、pH3）171
μに0.1Mホウ酸緩衝液（pH10、1Mチオシアン酸カリウ
ムを含有）547μを加えた後、参考例１にて製造した
高純度のPEG2の16.4mgを４℃にて加え、４℃にて24時間
放置した。反応終了後、0.1M酢酸にて中和した。遠心分
離後、得られた上清をそのまま、セファクリルＳ−200
カラム（2.6cmφ×84cm、0.2M食塩水）にかけ、ゲル濾
過精製を行った。目的物Ａ、目的物Ｂのそれぞれの画分
を集め、限外濾過により脱塩濃縮し、目的物Ａを含む水
溶液150μ（蛋白濃度5.63mg/ml）、目的物Ｂを含む水
溶液200μ（蛋白濃度3.46mg/ml）を得た。
時） 実施例61 PEG2修飾ヒトｔ−PA ヒトｔ−PAを含む溶液（ｔ−PA29.3mg/ml、pH3）171
μに0.1Mホウ酸緩衝液（pH10、1Mチオシアン酸カリウ
ムを含有）547μを加えた後、参考例１にて製造した
高純度のPEG2の16.4mgを４℃にて加え、４℃にて24時間
放置した。反応終了後、0.1M酢酸にて中和した。遠心分
離後、得られた上清をそのまま、セファクリルＳ−200
カラム（2.6cmφ×84cm、0.2M食塩水）にかけ、ゲル濾
過精製を行った。目的物Ａ、目的物Ｂのそれぞれの画分
を集め、限外濾過により脱塩濃縮し、目的物Ａを含む水
溶液150μ（蛋白濃度5.63mg/ml）、目的物Ｂを含む水
溶液200μ（蛋白濃度3.46mg/ml）を得た。
このようにして得られた修飾体のＳ−2288（Ile−Pro
−Arg−pNA）を基質としたamidolytic活性を測定したと
ころ、目的物Ａは1.2×106IU/ml、目的物Ｂは9.3×105I
U/mlの値を示した。
−Arg−pNA）を基質としたamidolytic活性を測定したと
ころ、目的物Ａは1.2×106IU/ml、目的物Ｂは9.3×105I
U/mlの値を示した。
物性値 目的物Ａ ・高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK gel G3000 PW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.2M食塩水 流速:0.6ml/分、検出波長:254nm 保持時間:19.1分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 目的物Ｂ ・高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK gel G3000 PW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.2M食塩水 流速:0.6ml/分，検出波長:254nm 保持時間:20.6分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例62 PEG2修飾ヒトエンドセリン ヒトンエンドセリン250μｇを0.1Mホウ酸緩衝液（pH1
0）150μに溶かし、この溶液に参考例１で製造した高
純度のPEG2の6mgを４℃にて加え、４℃にて５時間放置
した。1N酢酸にて中和後、TSK G3000SW〔7.5mmφ×600
mm;0.1M食塩水（５％エタノール含有）〕にてゲル濾過
精製し、目的物を含む分画を脱塩濃縮し、目的物を含む
水溶液60μを得た。
後の分解物）中のアミノ酸分析値 目的物Ｂ ・高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK gel G3000 PW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.2M食塩水 流速:0.6ml/分，検出波長:254nm 保持時間:20.6分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例62 PEG2修飾ヒトエンドセリン ヒトンエンドセリン250μｇを0.1Mホウ酸緩衝液（pH1
0）150μに溶かし、この溶液に参考例１で製造した高
純度のPEG2の6mgを４℃にて加え、４℃にて５時間放置
した。1N酢酸にて中和後、TSK G3000SW〔7.5mmφ×600
mm;0.1M食塩水（５％エタノール含有）〕にてゲル濾過
精製し、目的物を含む分画を脱塩濃縮し、目的物を含む
水溶液60μを得た。
物性値 ・高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK gel G3000 SW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.1M食塩水（５％エタノール含有） 流速:0.7ml/分，検出波長:220nm 保持時間:19.1分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例63 PEG2修飾オキシトシン オキシトシン0.46mgを水40μに溶かし、0.1Mホウ酸
緩衝液（pH10）210μを加えた後、４℃にて、参考例
１にて製造した高純度のPEG2の22.6mgを加え、４℃にて
175時間放置した。これに水200μを加えた後、9N酢酸
にて中和後、逆相高速クロマトグラフィー〔YMC−ODS,
4.6mmφ×250mm;溶出液Ａ液＝0.1％TFA水とＢ液＝アセ
トニトリル（0.1％TFA）によるグラジェント（初期Ｂ液
濃度25％、勾配１％／分）；流速1ml/分〕により精製を
行い、目的物を含む分画を凍結乾燥した後、水100μ
を加え、目的物を含む水溶液として得た。
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例63 PEG2修飾オキシトシン オキシトシン0.46mgを水40μに溶かし、0.1Mホウ酸
緩衝液（pH10）210μを加えた後、４℃にて、参考例
１にて製造した高純度のPEG2の22.6mgを加え、４℃にて
175時間放置した。これに水200μを加えた後、9N酢酸
にて中和後、逆相高速クロマトグラフィー〔YMC−ODS,
4.6mmφ×250mm;溶出液Ａ液＝0.1％TFA水とＢ液＝アセ
トニトリル（0.1％TFA）によるグラジェント（初期Ｂ液
濃度25％、勾配１％／分）；流速1ml/分〕により精製を
行い、目的物を含む分画を凍結乾燥した後、水100μ
を加え、目的物を含む水溶液として得た。
物性値 ・逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS AM303 4.6mmφ×250mm（山村化学社製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％トリフルオロ酢酸） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％トリフルオロ
酢酸） 初期Ｂ液濃度:25％ 濃度勾配:1％／分 流速:1ml/分，検出波長:220nm 保持時間:27.5分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例64 PEG2修飾〔His1,Lys6〕−GHRP（Ｈ−His−Ｄ−Trp−Ala
−Trp−Ｄ−Phe−Lys−NH2） 〔His1,Lys6〕−GHRP3mgを0.1Mホウ酸緩衝液（pH10）
1mlに溶かし、４℃にて、参考例１にて製造した高純度
のPEG2の206mgを加え、４℃にて6.5時間放置した。これ
に0.1Mホウ酸緩衝液（pH10）500μおよびPEG2の50mg
を加え、さらに20.5時間後にアセトニトリル500μ、
0.1Mホウ酸緩衝液（pH10）500μおよびPEG2の50mgを
加え、その24時間後にPEG2の50mgを加えて、４℃にて21
時間放置した。これに水3mlを加えた後、9N酢酸にて中
和後、逆相高速クロマトグラフィー〔YMC−ODS,10mmφ
×250mm;溶出液Ａ液＝0.1％TFA水とＢ液＝アセトニトリ
ル（0.1％TFA）によるグラジエント（初期Ｂ液濃度25
％、勾配１％／分）；流速3ml/分〕により精製を行い、
目的物を含む分画を凍結乾燥した後、水500μを加
え、目的物を含む水溶液として得た。
酢酸） 初期Ｂ液濃度:25％ 濃度勾配:1％／分 流速:1ml/分，検出波長:220nm 保持時間:27.5分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例64 PEG2修飾〔His1,Lys6〕−GHRP（Ｈ−His−Ｄ−Trp−Ala
−Trp−Ｄ−Phe−Lys−NH2） 〔His1,Lys6〕−GHRP3mgを0.1Mホウ酸緩衝液（pH10）
1mlに溶かし、４℃にて、参考例１にて製造した高純度
のPEG2の206mgを加え、４℃にて6.5時間放置した。これ
に0.1Mホウ酸緩衝液（pH10）500μおよびPEG2の50mg
を加え、さらに20.5時間後にアセトニトリル500μ、
0.1Mホウ酸緩衝液（pH10）500μおよびPEG2の50mgを
加え、その24時間後にPEG2の50mgを加えて、４℃にて21
時間放置した。これに水3mlを加えた後、9N酢酸にて中
和後、逆相高速クロマトグラフィー〔YMC−ODS,10mmφ
×250mm;溶出液Ａ液＝0.1％TFA水とＢ液＝アセトニトリ
ル（0.1％TFA）によるグラジエント（初期Ｂ液濃度25
％、勾配１％／分）；流速3ml/分〕により精製を行い、
目的物を含む分画を凍結乾燥した後、水500μを加
え、目的物を含む水溶液として得た。
物性値 ・逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS AM303 4.6mmφ×250mm（山村化学社製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％トリフルオロ酢酸） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％トリフルオロ
酢酸） 初期Ｂ液濃度:25％ 濃度勾配:1％／分 流速:1ml/分，検出波長:220nm 保持時間:28.6分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例65 PEG2修飾〔Ｄ−Arg1,D−Pro2,D−Trp7,9,Leu11〕−サブ
スタンスＰ 〔Ｄ−Arg1,D−Pro2,D−Trp7,9,Leu11〕−サブスタン
スＰ 1mgを0.1Mホウ酸緩衝液（pH10）500μに溶か
し、４℃にて、参考例１にて製造した高純度のPEG2の4
0.1mgを加え、４℃にて30時間放置した。これに水500μ
を加えた後、9N酢酸にて中和後、逆相高速クロムトグ
ラフィー〔YMC−ODS,10mmφ×250mm;溶出液Ａ液＝0.1％
TFA水とＢ液＝アセトニトリル（0.1％TFA）によるグラ
ジェント（初期Ｂ液濃度25％、勾配１％／分）；流速3m
l/分〕により精製を行ない、目的物Ａを含む分画および
目的物Ｂを含む分画を得、各々凍結乾燥した後、100μ
の水を加え、目的物Ａ、目的物Ｂをそれぞれ含む水溶
液として得た。
酢酸） 初期Ｂ液濃度:25％ 濃度勾配:1％／分 流速:1ml/分，検出波長:220nm 保持時間:28.6分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例65 PEG2修飾〔Ｄ−Arg1,D−Pro2,D−Trp7,9,Leu11〕−サブ
スタンスＰ 〔Ｄ−Arg1,D−Pro2,D−Trp7,9,Leu11〕−サブスタン
スＰ 1mgを0.1Mホウ酸緩衝液（pH10）500μに溶か
し、４℃にて、参考例１にて製造した高純度のPEG2の4
0.1mgを加え、４℃にて30時間放置した。これに水500μ
を加えた後、9N酢酸にて中和後、逆相高速クロムトグ
ラフィー〔YMC−ODS,10mmφ×250mm;溶出液Ａ液＝0.1％
TFA水とＢ液＝アセトニトリル（0.1％TFA）によるグラ
ジェント（初期Ｂ液濃度25％、勾配１％／分）；流速3m
l/分〕により精製を行ない、目的物Ａを含む分画および
目的物Ｂを含む分画を得、各々凍結乾燥した後、100μ
の水を加え、目的物Ａ、目的物Ｂをそれぞれ含む水溶
液として得た。
目的物Ａの物性値 ・逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS AM303 4.6mmφ×250mm（山村化学社製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％トリフルオロ酢酸） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％トリフルオロ
酢酸） 初期Ｂ液濃度:25％ 濃度勾配:1％／分 流速:1ml/分，検出波長:220nm 保持時間:31.2分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 目的物Ｂの物性値 ・逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS AM303 4.6mmφ×250mm（山村化学社製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％トリフルオロ酢酸） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％トリフルオロ
酢酸） 初期Ｂ液濃度:25％ 濃度勾配:1％／分 流速:1ml/分，検出波長:220nm 保持時間:31.5分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例66 PEG2修飾アスパラギナーゼ アスパラギナーゼ975mgをpH10.0に調製した0.1Mホウ
酸緩衝液195mlに溶解し、参考例１で得た高純度のPEG2
29.0gを60分間に３回に分けて４℃で加えた。４℃で2
2時間撹拌した後、水を加えて4.5とし、５％酢酸水溶
液にて中和後、限外濾過によって標記目的物を蛋白含量
0.14mg/mlの水溶液として6.5を得た。
酢酸） 初期Ｂ液濃度:25％ 濃度勾配:1％／分 流速:1ml/分，検出波長:220nm 保持時間:31.2分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 目的物Ｂの物性値 ・逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS AM303 4.6mmφ×250mm（山村化学社製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％トリフルオロ酢酸） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％トリフルオロ
酢酸） 初期Ｂ液濃度:25％ 濃度勾配:1％／分 流速:1ml/分，検出波長:220nm 保持時間:31.5分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 実施例66 PEG2修飾アスパラギナーゼ アスパラギナーゼ975mgをpH10.0に調製した0.1Mホウ
酸緩衝液195mlに溶解し、参考例１で得た高純度のPEG2
29.0gを60分間に３回に分けて４℃で加えた。４℃で2
2時間撹拌した後、水を加えて4.5とし、５％酢酸水溶
液にて中和後、限外濾過によって標記目的物を蛋白含量
0.14mg/mlの水溶液として6.5を得た。
物性値 ・高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK−gel G4000PWXL φ7.8mmφ×30cm2本連結、ガードカラムTSKg
uard columnPWXL φ6.0mm×4cm）（東ソー社製） 溶出液:0.2M食塩水 流速 :0.6ml/分 検出波長:25.4nm 保持時間:24.3分 実施例67 PEG2修飾ヒト赤血球由来Cu,Zn−SOD ヒト赤血球由来Cu,Zn−SOD 100mgに0.1Mホウ酸緩衝
液（pH10.0）40mlを加えた後、５℃に冷却し、参考例１
にて製造した高純度のPEG2 7.0gを５℃にて加え、激し
く撹拌後、５℃にて９時間放置した。反応終了後、２規
定酢酸水にてpH6.2に調整し、限外濾過（アミコン社
製、膜YM−30）により精製した。得られた水溶液（40m
l）を４分割し、セファクリルＳ−200カラム（2.6cmφ
×81cm、0.2M食塩水）にかけ、ゲル濾過精製を行った。
目的物を含む画分を集め、限外濾過（アミコン社製、膜
YM−30）により脱塩濃縮後、目的物を含む水溶液25mlを
得た。このようにして得られた修飾体は、未修飾のSOD
の61％の酵素隔成（シトクロムＣ法）を有した。
uard columnPWXL φ6.0mm×4cm）（東ソー社製） 溶出液:0.2M食塩水 流速 :0.6ml/分 検出波長:25.4nm 保持時間:24.3分 実施例67 PEG2修飾ヒト赤血球由来Cu,Zn−SOD ヒト赤血球由来Cu,Zn−SOD 100mgに0.1Mホウ酸緩衝
液（pH10.0）40mlを加えた後、５℃に冷却し、参考例１
にて製造した高純度のPEG2 7.0gを５℃にて加え、激し
く撹拌後、５℃にて９時間放置した。反応終了後、２規
定酢酸水にてpH6.2に調整し、限外濾過（アミコン社
製、膜YM−30）により精製した。得られた水溶液（40m
l）を４分割し、セファクリルＳ−200カラム（2.6cmφ
×81cm、0.2M食塩水）にかけ、ゲル濾過精製を行った。
目的物を含む画分を集め、限外濾過（アミコン社製、膜
YM−30）により脱塩濃縮後、目的物を含む水溶液25mlを
得た。このようにして得られた修飾体は、未修飾のSOD
の61％の酵素隔成（シトクロムＣ法）を有した。
物性値 ・高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK gel G3000 PW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.2M食塩水 流速 :0.6ml/分、 検出波長:220nm 保持時間:18.55分 ・酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 ・修飾率 65％（トリニトロベンゼンスルホン酸法） 実施例68 PEG2修飾ヒト尿エリスロポイエチン 0.1mgをヒト尿エリスロポイエチンを含む0.05Mホウ酸
緩衝液（pH9.5）50μに参考例１で製造した高純度のP
EG2の2mgを４℃にて加えた。反応液を２時間、４℃にて
放置後、PEG2の1mgをさらに加え、４℃にて16時間放置
した。0.1M酢酸にて中和後、限外濾過により脱塩、濃縮
した。濃縮液をSephacryl S−200（2.6cmφ×94cm:0.2M
食塩水）を用いたゲル濾過により精製を行った。目的物
を含む画分を集め、限外濾過により脱塩、濃縮を行い、
目的物を含む水溶液を1.0ml得た。このようにして得ら
れた目的物の活性を、British Journal of Haematolog
y,1981,47,461〜468に記載の胎児マウス肝培養における
in vitro検定に準じて測定したところ、未修飾のヒト尿
エリスロポイエチンの65％の活性を示した。
後の分解物）中のアミノ酸分析値 ・修飾率 65％（トリニトロベンゼンスルホン酸法） 実施例68 PEG2修飾ヒト尿エリスロポイエチン 0.1mgをヒト尿エリスロポイエチンを含む0.05Mホウ酸
緩衝液（pH9.5）50μに参考例１で製造した高純度のP
EG2の2mgを４℃にて加えた。反応液を２時間、４℃にて
放置後、PEG2の1mgをさらに加え、４℃にて16時間放置
した。0.1M酢酸にて中和後、限外濾過により脱塩、濃縮
した。濃縮液をSephacryl S−200（2.6cmφ×94cm:0.2M
食塩水）を用いたゲル濾過により精製を行った。目的物
を含む画分を集め、限外濾過により脱塩、濃縮を行い、
目的物を含む水溶液を1.0ml得た。このようにして得ら
れた目的物の活性を、British Journal of Haematolog
y,1981,47,461〜468に記載の胎児マウス肝培養における
in vitro検定に準じて測定したところ、未修飾のヒト尿
エリスロポイエチンの65％の活性を示した。
物性値 ・逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS AM303 4.6mmφ×250mm（山村化学製） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（0.1％TFA） Ｂ液：アセトニトリル（0.1％TFA） 初期Ｂ液濃度:30％ 濃度勾配:1％／分 流速:1ml/分 検出波長:214nm 保持時間15.02分
図−1:参考例１の方法によって得られる高純度ポリエチ
レングリコール誘導体の高速ゲル濾過クロマトグラフィ
ー。 図−2:特公昭61−42558号公報に記載の方法に従って得
られるポリエチレングリコール誘導体の高速ゲル濾過ク
ロマトグラフィー。 図−3:特開昭62−115280号公報に記載の方法に従って得
られるポリエチレングリコール誘導体の高速ゲル濾過ク
ロマトグラフィー。 図−4:ケミストリーレタース、773（1980）に記載の方
法に従って得られるポリエチレングリコール誘導体の高
速ゲル濾過クロマトグラフィー。 図−5:ジャパニーズ ジャーナル オブ カンサー リ
サーチ 77 1264（1986）に記載の方法に従って得られ
るポリエチレングリコール誘導体の高速ゲル濾過クロマ
トグラフィー。 図−6:ジャパニーズ ジャーナル オブ カンサー リ
サーチ 77 1264（1986）に記載の方法に従い、合成し
た後、同文献に従いゲル濾過クロマトグラフィーにより
精製して得られるポリエチレングリコール誘導体の高速
ゲル濾過クロマトグラフィー。 図−7:実施例40で得られたPEG−HDMAの電気泳動。
レングリコール誘導体の高速ゲル濾過クロマトグラフィ
ー。 図−2:特公昭61−42558号公報に記載の方法に従って得
られるポリエチレングリコール誘導体の高速ゲル濾過ク
ロマトグラフィー。 図−3:特開昭62−115280号公報に記載の方法に従って得
られるポリエチレングリコール誘導体の高速ゲル濾過ク
ロマトグラフィー。 図−4:ケミストリーレタース、773（1980）に記載の方
法に従って得られるポリエチレングリコール誘導体の高
速ゲル濾過クロマトグラフィー。 図−5:ジャパニーズ ジャーナル オブ カンサー リ
サーチ 77 1264（1986）に記載の方法に従って得られ
るポリエチレングリコール誘導体の高速ゲル濾過クロマ
トグラフィー。 図−6:ジャパニーズ ジャーナル オブ カンサー リ
サーチ 77 1264（1986）に記載の方法に従い、合成し
た後、同文献に従いゲル濾過クロマトグラフィーにより
精製して得られるポリエチレングリコール誘導体の高速
ゲル濾過クロマトグラフィー。 図−7:実施例40で得られたPEG−HDMAの電気泳動。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 池田 善治 大阪府大阪市此花区春日出中３丁目１番 98号 住友製薬株式会社内 (72)発明者 前田 弘雄 大阪府大阪市此花区春日出中３丁目１番 98号 住友製薬株式会社内 (72)発明者 櫻井 勝清 東京都東大和市蔵敷２―527―６ (72)発明者 田中 義勝 東京都東大和市上北台３―411―４ サ ニコーポ403 (72)発明者 久保田 道雄 東京都西多摩郡五日市町小中野341―１ (72)発明者 樫本 和久 東京都武蔵村山市学園１―28―１ シャ トー藤野301 (56)参考文献 特開 平３−72469（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−316739（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−316400（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−291794（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−126900（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−115280（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−104099（ＪＰ，Ａ) 特開 昭64−60375（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−219374（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C08G 65/32 C07D 251/26 C07K 17/00 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (3)
- 【請求項１】式 ＲOCH2CH2 nOH 〔式中、Ｒは炭素数１〜18のアルキル基を表し、ｎは10
〜700の整数を表す。〕で表されるポリエチレングリコ
ールモノアルキルエーテル化合物と塩化シアヌールとを
II B族金属化合物の共存下に反応させることによって式 〔式中、Ｒ及びｎは前記と同じ意味を表す。〕で表され
る純度が75％以上であるポリエチレングリコール誘導体
を得る製造方法。 - 【請求項２】前記II B族金属化合物が酸化亜鉛、酸化カ
ドニウムまたは酸化水銀である請求項（１）記載の製造
方法。 - 【請求項３】ｎが50〜350であるポリエチレングリコー
ル誘導体を得る請求項（１）または（２）記載の製造方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13419189 | 1989-05-27 | ||
| JP1-134191 | 1989-05-27 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0395200A JPH0395200A (ja) | 1991-04-19 |
| JP2931622B2 true JP2931622B2 (ja) | 1999-08-09 |
Family
ID=15122565
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9792390A Expired - Lifetime JP2931622B2 (ja) | 1989-05-27 | 1990-04-13 | ポリエチレングリコール誘導体を得る製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2931622B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5359030A (en) * | 1993-05-10 | 1994-10-25 | Protein Delivery, Inc. | Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same |
| ATE257844T1 (de) * | 1995-03-10 | 2004-01-15 | Nakamura Toshikazu | Menschlicher wachstumsfaktor (hgf), verändert durch polyethylenglykol |
| WO1998055500A1 (fr) | 1997-06-06 | 1998-12-10 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Polypeptides chimiquement modifies |
-
1990
- 1990-04-13 JP JP9792390A patent/JP2931622B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0395200A (ja) | 1991-04-19 |
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