JP2997004B2 - ポリエチレングリコール誘導体、修飾ペプチドおよびその製造方法 - Google Patents
ポリエチレングリコール誘導体、修飾ペプチドおよびその製造方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規なペプチド（特に、蛋白質）修飾試剤と
して有用なポリエチレングリコール誘導体および当該ポ
リエチレングリコール誘導体によって修飾されたグアニ
ジノ基を有するペプチドおよびその製造方法に関する。
して有用なポリエチレングリコール誘導体および当該ポ
リエチレングリコール誘導体によって修飾されたグアニ
ジノ基を有するペプチドおよびその製造方法に関する。
近年、蛋白質の研究の発展に伴い種々の作用を持つペ
プチド、特に生理活性蛋白質が数多く発見されている。
また、遺伝子組み換え技術やペプチドの有機合成法の進
歩によりこれら生理活性ペプチド、またはその類似構造
化合物を大量に入手することが可能となってきた。これ
らの特殊な活性を持つペプチドには医薬品として非常に
有用のものが多い。
プチド、特に生理活性蛋白質が数多く発見されている。
また、遺伝子組み換え技術やペプチドの有機合成法の進
歩によりこれら生理活性ペプチド、またはその類似構造
化合物を大量に入手することが可能となってきた。これ
らの特殊な活性を持つペプチドには医薬品として非常に
有用のものが多い。
しかしながら、循環系に投与されたペプチドのクリア
ランスは一般に非常に速いことが知られているので、当
該ペプチドの持続性の改善が待望される。また、ペプチ
ドが異種動物から得られたものやペプチド・蛋白質工学
にて設計されたペプチドのようにヒト由来のものとは構
造の異なるものである場合には、抗体が産生されて重篤
な症状を引き起こす危険性が懸念されるので、当該ペプ
チドの抗原性の改善が待望される。
ランスは一般に非常に速いことが知られているので、当
該ペプチドの持続性の改善が待望される。また、ペプチ
ドが異種動物から得られたものやペプチド・蛋白質工学
にて設計されたペプチドのようにヒト由来のものとは構
造の異なるものである場合には、抗体が産生されて重篤
な症状を引き起こす危険性が懸念されるので、当該ペプ
チドの抗原性の改善が待望される。
これらのペプチドを医薬品として用いるためにはこれ
らの抗原性や持続性に対する問題を解決しなければなら
ない。このような問題点を解決する手段としてペプチド
を高分子化合物により化学的に修飾する方法はきわめて
有効な手段であることが知られている。
らの抗原性や持続性に対する問題を解決しなければなら
ない。このような問題点を解決する手段としてペプチド
を高分子化合物により化学的に修飾する方法はきわめて
有効な手段であることが知られている。
しかして、ポリエチレングリコール誘導体は、それ自
体免疫原性が無く、また水溶液中でペプチド（例えば、
蛋白質）の３次構造に影響を与えないという優れた特徴
を持っているため、ペプチドの高分子修飾試剤として多
用されている。
体免疫原性が無く、また水溶液中でペプチド（例えば、
蛋白質）の３次構造に影響を与えないという優れた特徴
を持っているため、ペプチドの高分子修飾試剤として多
用されている。
一本鎖のポリエチレングリコール誘導体を用いて、ペ
プチドのＮ末端またはリジン残基側鎖のアミノ基を修飾
するに際して、その活性化法としては、ポリエチレング
リコールトリアジン誘導体による活性化法〔フランク．
エフ．デービス等、J.Biol.Chem.,252,3578−3581（197
7）〕、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドによる活性エス
テル法〔レオナルド．エム等Tetrahedron,40,1581−158
4（1984）．〕、カルボニルジイミダゾールによる活性
化法〔チャールズ．オー．ビーチャム等Anal.Biochem,1
31,25−33（1983）．〕、アルデヒドによる活性化法
〔藤野等、特開昭61−178926号公報〕等が知られてい
る。一方、二本鎖のポリエチレングリコール誘導体を用
いてアミノ基を修飾する際の活性化法としては、ポリエ
チレングリコールトリアジン誘導体による活性化法〔稲
田等Jpn.J.Cancer Res.（Gann），77,1264−1270（198
6）．〕が知られている。
プチドのＮ末端またはリジン残基側鎖のアミノ基を修飾
するに際して、その活性化法としては、ポリエチレング
リコールトリアジン誘導体による活性化法〔フランク．
エフ．デービス等、J.Biol.Chem.,252,3578−3581（197
7）〕、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドによる活性エス
テル法〔レオナルド．エム等Tetrahedron,40,1581−158
4（1984）．〕、カルボニルジイミダゾールによる活性
化法〔チャールズ．オー．ビーチャム等Anal.Biochem,1
31,25−33（1983）．〕、アルデヒドによる活性化法
〔藤野等、特開昭61−178926号公報〕等が知られてい
る。一方、二本鎖のポリエチレングリコール誘導体を用
いてアミノ基を修飾する際の活性化法としては、ポリエ
チレングリコールトリアジン誘導体による活性化法〔稲
田等Jpn.J.Cancer Res.（Gann），77,1264−1270（198
6）．〕が知られている。
しかしながら、これらの修飾法はいずれもペプチドの
Ｎ末端またはリジン残基側鎖のアミノ基を修飾するもの
である。
Ｎ末端またはリジン残基側鎖のアミノ基を修飾するもの
である。
一方、ペプチドには生理活性の発現にＮ末端アミノ基
やリジン側鎖のアミノ基が重要な役割を持つものが数多
く存在する。したがって、このようなペプチドの場合に
は、上記の様な活性化試剤を用いてアミノ基を修飾する
ことは活性の低下につながるので好ましくない。また、
リジン残基のみを修飾するものではその修飾部位が限ら
れてしまう。ペプチドの性質をコントロールするために
はアミノ基以外の種々の部位を修飾することが効果的で
あると考えられるので他の官能基を修飾する試剤を開発
する意義は極めて大きい。
やリジン側鎖のアミノ基が重要な役割を持つものが数多
く存在する。したがって、このようなペプチドの場合に
は、上記の様な活性化試剤を用いてアミノ基を修飾する
ことは活性の低下につながるので好ましくない。また、
リジン残基のみを修飾するものではその修飾部位が限ら
れてしまう。ペプチドの性質をコントロールするために
はアミノ基以外の種々の部位を修飾することが効果的で
あると考えられるので他の官能基を修飾する試剤を開発
する意義は極めて大きい。
現在迄に知られている他の官能基の高分子修飾試剤と
しては、メルカプト基を修飾するマレインイミド誘導
体、カルボキシル基を修飾するアミノ誘導体〔フラン
ク.F.デービス等、特公昭56−23587号公報〕等が知られ
ている。しかしながら、メルカプト基は分子表面にメル
カプト基の形で存在しなければ修飾困難であると考えら
れるが、実際にはそのような構造を持つペプチドは非常
に少ない。また、アミノ誘導体による修飾の場合は、ペ
プチド中のアミノ基による副反応が起きる為に修飾試剤
のみを選択的に反応させることが困難である。
しては、メルカプト基を修飾するマレインイミド誘導
体、カルボキシル基を修飾するアミノ誘導体〔フラン
ク.F.デービス等、特公昭56−23587号公報〕等が知られ
ている。しかしながら、メルカプト基は分子表面にメル
カプト基の形で存在しなければ修飾困難であると考えら
れるが、実際にはそのような構造を持つペプチドは非常
に少ない。また、アミノ誘導体による修飾の場合は、ペ
プチド中のアミノ基による副反応が起きる為に修飾試剤
のみを選択的に反応させることが困難である。
したがって、上記以外の官能基に対する高分子修飾試
剤の開発が望まれている。
剤の開発が望まれている。
一方、ペプチド中のグアニジノ基の低分子修飾試剤と
しては、フェニルグリオキザール［ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー、248巻、6171（196
8）］、2,3−ブタンジオン〔バイオケミストリー、12
巻、3915（1973）〕、1,2−シクロヘキサンジオン〔ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、250
巻、557（1975）〕などが知られているが、高分子修飾
試剤で、ペプチド中のグアニジノ基を修飾できるもの
は、未だ知られていない。
しては、フェニルグリオキザール［ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー、248巻、6171（196
8）］、2,3−ブタンジオン〔バイオケミストリー、12
巻、3915（1973）〕、1,2−シクロヘキサンジオン〔ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、250
巻、557（1975）〕などが知られているが、高分子修飾
試剤で、ペプチド中のグアニジノ基を修飾できるもの
は、未だ知られていない。
本発明の目的は、ペプチド中のグアニジノ基を選択的
に修飾することのできる高分子修飾試剤である二本鎖の
ポリエチレンゴリコール誘導体を提供することである。
に修飾することのできる高分子修飾試剤である二本鎖の
ポリエチレンゴリコール誘導体を提供することである。
本発明の他の目的は、当該ポリエチレングリコール誘
導体を使用することによって得られる修飾ペプチドを提
供することである。
導体を使用することによって得られる修飾ペプチドを提
供することである。
本発明のさらに他の目的は、当該修飾ペプチドの製造
方法を提供することである。
方法を提供することである。
本発明者らは上記目的を達成するために種々研究を重
ねて来たところ、下記ポリエチレングリコール誘導体
（Ｉ）がペプチドにおけるグアニジノ基を選択的に修飾
することを知見し、さらに研究を重ねて本発明を完成す
るに至った。
ねて来たところ、下記ポリエチレングリコール誘導体
（Ｉ）がペプチドにおけるグアニジノ基を選択的に修飾
することを知見し、さらに研究を重ねて本発明を完成す
るに至った。
本願の第１番目の発明は式 （式中、R1およびR2は同一または異なる低級アルキル基
を有し、ｍおよびｎはポリエチレングリコール部分の平
均分子量が約1,000〜12,000となる同一または異なる任
意の正の整数であることを表す。） で表されるポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）であ
る。
を有し、ｍおよびｎはポリエチレングリコール部分の平
均分子量が約1,000〜12,000となる同一または異なる任
意の正の整数であることを表す。） で表されるポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）であ
る。
本願の第２番目の発明は、ポリエチレングリコール誘
導体（Ｉ）とグアニジノ基を有するペプチドとを反応さ
せることによって得られる修飾ペプチドである。
導体（Ｉ）とグアニジノ基を有するペプチドとを反応さ
せることによって得られる修飾ペプチドである。
本願の第３番目の発明は、ポリエチレングリコール誘
導体（Ｉ）とグアニジノ基を有するペプチドとを反応さ
せることによって得られる修飾ペプチドの製造方法であ
る。
導体（Ｉ）とグアニジノ基を有するペプチドとを反応さ
せることによって得られる修飾ペプチドの製造方法であ
る。
式（Ｉ）においてR1およびR2で表される低級アルキル
基は、直鎖状、分岐状のいずれでもよく、たとえばメチ
ル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル
等の炭素数１〜４の低級アルキル基が好適である。
基は、直鎖状、分岐状のいずれでもよく、たとえばメチ
ル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル
等の炭素数１〜４の低級アルキル基が好適である。
本発明のポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）は以下
の方法にて容易に製造することができる。
の方法にて容易に製造することができる。
即ち、式 R1OCH2CH2 mOH （II） R2OCH2CH2 nOH （II′） （式中、R1、R2およびｍ、ｎは前記と同意義） で表されるモノアルコキシポリエチレングリコールと適
当な活性化試薬とを好適には塩基の存在下で反応させる
ことにより、式 R1OCH2CH2 mX1 （III） R2OCH2CH2 nX2 （III′） 〔式中、X1およびX2は同一または異なるアルキルスルホ
ニルオキシ（たとえば、メチルスルホニルオキシ、エチ
ルスルホニルオキシ等の炭素数１〜４の低級アルキルス
ルホニルオキシ）、芳香族スルホニルオキシ（たとえ
ば、トルエンスルホニルオキシ等）またはハロゲン（塩
素、臭素、ヨウ素等）を表し、R1、R2およびｍ、ｎは前
記と同意義）。］ で表される活性体に導く。
当な活性化試薬とを好適には塩基の存在下で反応させる
ことにより、式 R1OCH2CH2 mX1 （III） R2OCH2CH2 nX2 （III′） 〔式中、X1およびX2は同一または異なるアルキルスルホ
ニルオキシ（たとえば、メチルスルホニルオキシ、エチ
ルスルホニルオキシ等の炭素数１〜４の低級アルキルス
ルホニルオキシ）、芳香族スルホニルオキシ（たとえ
ば、トルエンスルホニルオキシ等）またはハロゲン（塩
素、臭素、ヨウ素等）を表し、R1、R2およびｍ、ｎは前
記と同意義）。］ で表される活性体に導く。
この際用いられる活性化試薬としては、たとえばア
ルキルスルホニルクロリド（そのアルキル部分としては
前記と同様の低級アルキルが好ましく、たとえばメチル
スルホニルクロリド、エチルスルホニルクロリド等が例
示される）〔Ronald.K.Crossland等、J.Org.Chem.35,31
95（1970）］、芳香族スルホニルクロリド（たとえ
ば、トルエンスルホニルクロリド等）［Vladimir C.Sek
era等、J.Amer.Chem.Soc.55,345（1933）〕、ハロゲ
ン化金属（例えばヨウ化ナトリウム等）〔G.Siewert
等、Ann.,720,161（1968）、五臭化リン〔James Caso
n等、J.Org.Chem.26,3645（1961）〕などが挙げられ、
さらに式（Ｒ′）3P〔式中、Ｒ′はアルキル基（たと
えばオクチルなど）、アリル基（たとえばフェニルな
ど）またはジアルキルアミノ基（たとえばジメチルアミ
ノなど）を表す。〕で表される化合物の存在下で用いら
れる式Ｃ（Ｘ）４〔式中、Ｘはハロゲン（たとえば塩
素、臭素等）を示す〕で表される化合物〔J.Hooz等、Ca
n.J.Chem.46,86（1968）〕等が挙げられる。
ルキルスルホニルクロリド（そのアルキル部分としては
前記と同様の低級アルキルが好ましく、たとえばメチル
スルホニルクロリド、エチルスルホニルクロリド等が例
示される）〔Ronald.K.Crossland等、J.Org.Chem.35,31
95（1970）］、芳香族スルホニルクロリド（たとえ
ば、トルエンスルホニルクロリド等）［Vladimir C.Sek
era等、J.Amer.Chem.Soc.55,345（1933）〕、ハロゲ
ン化金属（例えばヨウ化ナトリウム等）〔G.Siewert
等、Ann.,720,161（1968）、五臭化リン〔James Caso
n等、J.Org.Chem.26,3645（1961）〕などが挙げられ、
さらに式（Ｒ′）3P〔式中、Ｒ′はアルキル基（たと
えばオクチルなど）、アリル基（たとえばフェニルな
ど）またはジアルキルアミノ基（たとえばジメチルアミ
ノなど）を表す。〕で表される化合物の存在下で用いら
れる式Ｃ（Ｘ）４〔式中、Ｘはハロゲン（たとえば塩
素、臭素等）を示す〕で表される化合物〔J.Hooz等、Ca
n.J.Chem.46,86（1968）〕等が挙げられる。
この際用いられる塩基としては、ピリジン、トリアル
キルアミン（例えば、トリエチルアミン）のような三級
の有機塩基もしくは水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム、炭酸ナトリウム、水素化ナトリウム等の無機塩基が
挙げられる。反応溶媒はN,N−ジメチルホルムアミド、
ベンゼン、トルエン、低級ジアルキルエーテル、四塩化
炭素、クロロホルム、塩化メチレン、ジオキサン、テト
ラヒドロフラン等自体不活性な溶媒であればいずれでも
よく、またピリジンのように上記の塩基そのものを溶媒
にすることもできる。反応温度は、通常０℃〜150℃の
範囲である。
キルアミン（例えば、トリエチルアミン）のような三級
の有機塩基もしくは水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム、炭酸ナトリウム、水素化ナトリウム等の無機塩基が
挙げられる。反応溶媒はN,N−ジメチルホルムアミド、
ベンゼン、トルエン、低級ジアルキルエーテル、四塩化
炭素、クロロホルム、塩化メチレン、ジオキサン、テト
ラヒドロフラン等自体不活性な溶媒であればいずれでも
よく、またピリジンのように上記の塩基そのものを溶媒
にすることもできる。反応温度は、通常０℃〜150℃の
範囲である。
ついで活性体（IIIおよび／またはIII′）をN,N−ジ
メチルホルムアミドやテトラヒドロフラン等の適当な溶
媒中で炭酸カリウム、炭酸ナトリウム等の適当な無機塩
基もしくはトリエチルアミン、トリノルマルブチルアミ
ン、ジアザビシクロ−2,2,2−ウンデセン等の有機塩基
を用いて60〜120℃の加熱下にてジヒドロキシアセトフ
ェノンと反応させて式 （式中、R1、R2およびｍ、ｎは前記と同意義） で表されるアセトフェノン誘導体（IV）を得る。アセト
フェノン誘導体（IV）は、前述と同様の溶媒、塩基、反
応温度を用いて、ジヒドロキシアセトフェノンを活性体
IIIあるいはIII′と反応させモノ−ポリエチレングリコ
ール誘導体として後、再びIIIあるいはIII′と反応させ
ることによっても製造することができる。
メチルホルムアミドやテトラヒドロフラン等の適当な溶
媒中で炭酸カリウム、炭酸ナトリウム等の適当な無機塩
基もしくはトリエチルアミン、トリノルマルブチルアミ
ン、ジアザビシクロ−2,2,2−ウンデセン等の有機塩基
を用いて60〜120℃の加熱下にてジヒドロキシアセトフ
ェノンと反応させて式 （式中、R1、R2およびｍ、ｎは前記と同意義） で表されるアセトフェノン誘導体（IV）を得る。アセト
フェノン誘導体（IV）は、前述と同様の溶媒、塩基、反
応温度を用いて、ジヒドロキシアセトフェノンを活性体
IIIあるいはIII′と反応させモノ−ポリエチレングリコ
ール誘導体として後、再びIIIあるいはIII′と反応させ
ることによっても製造することができる。
得られたアセトフェノン誘導体（IV）を二酸化セレン
等の適当な酸化剤を用いてN,N−ジメチルホルムアミ
ド、ジオキサン等の反応に不活性な溶媒中、60〜120℃
にて酸化して目的とするポリエチレングリコール誘導体
（Ｉ）を製造することができる。
等の適当な酸化剤を用いてN,N−ジメチルホルムアミ
ド、ジオキサン等の反応に不活性な溶媒中、60〜120℃
にて酸化して目的とするポリエチレングリコール誘導体
（Ｉ）を製造することができる。
かくして製造されたポリエチレングリコール誘導体
（Ｉ）は自体既知の手段にて任意の純度のものとして単
離、精製することができる。
（Ｉ）は自体既知の手段にて任意の純度のものとして単
離、精製することができる。
本発明において、ペプチドとは２個以上のアミノ酸が
ペプチド結合により結合したものであり、好適には蛋白
質およびその類似構造物質である。その構成アミノ酸の
少なくとも一つは、少なくとも１個のグアニジノ基を有
するもの（例えば、アルギニン）である。
ペプチド結合により結合したものであり、好適には蛋白
質およびその類似構造物質である。その構成アミノ酸の
少なくとも一つは、少なくとも１個のグアニジノ基を有
するもの（例えば、アルギニン）である。
かかるペプチド、特に蛋白質としては、たとえばサブ
スタンスＰ（視床下部ホルモン）、コルチコトロピン、
リポトロピン、メラノトロピン（下垂体腺部ホルモ
ン）、アルギニン−バソプレシン（神経下垂体ホルモ
ン）、パラチロイドホルモン（甲状腺ホルモン）、サイ
モポエチン（胸腺因子）、インシュリン、グルカゴン
（膵臓ホルモン）、神経成長因子、上皮成長因子、イン
シュリン様成長因子−Ｉ、インシュリン様成長因子−I
I、ヒト形質転換発育因子、成長ホルモン放出因子即ちG
RF、塩基性繊維芽細胞成長因子（成長因子）、セクレチ
ン、コレシストキニン、バソアクティブインスチナルペ
プチド、モチリン（胃腸管ホルモン）、ゴナドトロピン
（繊毛膜ホルモン）、性腺刺戟ホルモン放出ホルモン
（性腺刺戟ホルモン）、レラキシン（卵巣ホルモン）、
血液凝固因子VIII因子およびIX因子（血友病因子）、ス
トレプトキナーゼ、フィブリノリシン、デオキシリボヌ
クレアーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ即ちSOD、
エラスターゼ、アスパラギナーゼ（酵素）、組織プラス
ミノーゲン活性化因子即ちtPA、ウロキナーゼ（線溶因
子）、リンホカイン〔たとえば、インターロイキンＩお
よびII〕、顆粒球マクロファージ・コロニー刺戟因子即
ちGM−CSF（刺戟因子）、エリスロポエチン（増血因
子）、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（Ca調節ホルモ
ン）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（利尿ホルモン）
等の生理活性を有するペプチドならびにここに例示した
ペプチドと同様の生理活性を有する類似構造物質が例示
される。なお、上記の例示において（ ）内は当該ペプ
チドの用途を記載するものである。
スタンスＰ（視床下部ホルモン）、コルチコトロピン、
リポトロピン、メラノトロピン（下垂体腺部ホルモ
ン）、アルギニン−バソプレシン（神経下垂体ホルモ
ン）、パラチロイドホルモン（甲状腺ホルモン）、サイ
モポエチン（胸腺因子）、インシュリン、グルカゴン
（膵臓ホルモン）、神経成長因子、上皮成長因子、イン
シュリン様成長因子−Ｉ、インシュリン様成長因子−I
I、ヒト形質転換発育因子、成長ホルモン放出因子即ちG
RF、塩基性繊維芽細胞成長因子（成長因子）、セクレチ
ン、コレシストキニン、バソアクティブインスチナルペ
プチド、モチリン（胃腸管ホルモン）、ゴナドトロピン
（繊毛膜ホルモン）、性腺刺戟ホルモン放出ホルモン
（性腺刺戟ホルモン）、レラキシン（卵巣ホルモン）、
血液凝固因子VIII因子およびIX因子（血友病因子）、ス
トレプトキナーゼ、フィブリノリシン、デオキシリボヌ
クレアーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ即ちSOD、
エラスターゼ、アスパラギナーゼ（酵素）、組織プラス
ミノーゲン活性化因子即ちtPA、ウロキナーゼ（線溶因
子）、リンホカイン〔たとえば、インターロイキンＩお
よびII〕、顆粒球マクロファージ・コロニー刺戟因子即
ちGM−CSF（刺戟因子）、エリスロポエチン（増血因
子）、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（Ca調節ホルモ
ン）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（利尿ホルモン）
等の生理活性を有するペプチドならびにここに例示した
ペプチドと同様の生理活性を有する類似構造物質が例示
される。なお、上記の例示において（ ）内は当該ペプ
チドの用途を記載するものである。
本発明においてペプチドは遺伝子工学産物、ヒトを含
む各種動物由来のもの、合成品等のいずれの方法で製造
されたものでもよい。
む各種動物由来のもの、合成品等のいずれの方法で製造
されたものでもよい。
本発明の修飾ペプチドの製造は、ポリエチレングリコ
ール誘導体（Ｉ）とグアニジノ基を有するペプチドとを
反応させることによって行われる。
ール誘導体（Ｉ）とグアニジノ基を有するペプチドとを
反応させることによって行われる。
当該反応に際しては、ポリエチレングリコール誘導体
（Ｉ）をグアニジノ基を有するペプチド中のグアニジノ
基に対して１〜100倍モル程度用いることが好ましい。
ただし低修飾率のペプチドを得たい場合には１モル程度
以下のもの（たとえば、0.1倍モル〜１倍モル）を用い
ることができる。当該ペプチドとポリエチレングリコー
ル誘導体（Ｉ）のモル比、反応温度、pH等を調節するこ
とにより修飾の程度を任意に選択することが出来る。ま
た、反応に用いる溶媒は反応を妨害しないものであれば
いずれでもよく、たとえばトリス塩酸緩衝液、炭酸ナト
リウム水溶液、炭酸水素ナトリウム水溶液、Ｎ−エチル
モルホリン−酢酸緩衝液、マレイン酸ナトリウム緩衝
液、酢酸ナトリウム緩衝液等の緩衝液が挙げられる。ま
た、当該ペプチドを失活させず、かつ反応に不活性な有
機溶媒、たとえばメタノール、エタノール、プロパノー
ル等の低級アルコールやアセトニトリル、ジオキサン、
テトラヒドロフラン等を添加してもよい。反応のpHは一
般的に5.5〜10の範囲で選択することが好ましいが、中
性から弱塩基性が特に好ましい。ただし、アミノ末端に
保護されていないα−アミノ基を有するペプチドの場合
は、やや酸性側のpH5.5〜6.5が好ましい。反応温度は当
該ペプチドが失活しない温度であればいずれでもよく、
たとえば０〜25℃の範囲が好ましい。反応は通常暗所で
行い、反応時間は３〜72時間で充分である。
（Ｉ）をグアニジノ基を有するペプチド中のグアニジノ
基に対して１〜100倍モル程度用いることが好ましい。
ただし低修飾率のペプチドを得たい場合には１モル程度
以下のもの（たとえば、0.1倍モル〜１倍モル）を用い
ることができる。当該ペプチドとポリエチレングリコー
ル誘導体（Ｉ）のモル比、反応温度、pH等を調節するこ
とにより修飾の程度を任意に選択することが出来る。ま
た、反応に用いる溶媒は反応を妨害しないものであれば
いずれでもよく、たとえばトリス塩酸緩衝液、炭酸ナト
リウム水溶液、炭酸水素ナトリウム水溶液、Ｎ−エチル
モルホリン−酢酸緩衝液、マレイン酸ナトリウム緩衝
液、酢酸ナトリウム緩衝液等の緩衝液が挙げられる。ま
た、当該ペプチドを失活させず、かつ反応に不活性な有
機溶媒、たとえばメタノール、エタノール、プロパノー
ル等の低級アルコールやアセトニトリル、ジオキサン、
テトラヒドロフラン等を添加してもよい。反応のpHは一
般的に5.5〜10の範囲で選択することが好ましいが、中
性から弱塩基性が特に好ましい。ただし、アミノ末端に
保護されていないα−アミノ基を有するペプチドの場合
は、やや酸性側のpH5.5〜6.5が好ましい。反応温度は当
該ペプチドが失活しない温度であればいずれでもよく、
たとえば０〜25℃の範囲が好ましい。反応は通常暗所で
行い、反応時間は３〜72時間で充分である。
反応終了後に、反応液を塩析やゲル濾過、イオン交換
クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィ
ニティクロマトグラフィー、限外濾過、逆相HPLCによる
分取等の通常の蛋白質の精製法で精製して目的の修飾ペ
プチドを得ることができる。
クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィ
ニティクロマトグラフィー、限外濾過、逆相HPLCによる
分取等の通常の蛋白質の精製法で精製して目的の修飾ペ
プチドを得ることができる。
ところで、低分子修飾試剤であるフェニルグリオキザ
ールの研究において、試薬濃度を大きくするなど条件を
過酷にすると、アミノ末端のα−アミノ基が脱アミノ反
応を起こすという副反応が知られている。〔生物化学実
験法12、蛋白質の化学修飾（上）、62〜69頁、（学会出
版センター、1981）、ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー248巻6171（1968）〕本発明のポリエ
チレングリコール誘導体（Ｉ）を用いた修飾においても
同様の副反応の可能性が考えられる。そこでこのような
副反応が懸念される場合には、グアニジノ基を有するペ
プチドのアミノ基を適当な保護基で保護した後、ポリエ
チレングリコール誘導体（Ｉ）と反応させ、続いてアミ
ノ基の保護基を脱保護するという方法によって、修飾ペ
プチドを製造する方が得策な場合もある。アミノ基の保
護基は、ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）と反応性
がなく、さらに当該ペプチドを失活させることなく脱保
護されるものであれば良く、例えばスクシニル基、マレ
イル基、２−メチルマレイル基、2,3−ジメチルマレイ
ル基、エキソ−シス−3,6−エンドオキソ−△４−テト
ラヒドロフタロイル基、エキソ−シス−3,6−エンドオ
キシヘキサヒドロフタロイル基、テトラフルオロスクシ
ニル基等が挙げられる。保護基の導入は、当該分野の公
知の方法によって行うことができる。導入試剤として
は、相当する酸無水物、酸ハロゲン化物、活性エステル
等が用いられるが、一般的には相当する酸無水物が多く
用いられる。反応溶媒としては、反応を妨害しないもの
であればいずれでもよく、たとえば、炭酸ナトリウム水
溶液、炭酸水素ナトリウム水溶液、Ｎ−エチルモルホリ
ン−酢酸緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝液
等が挙げられる。また当該ペプチドを失活させず、かつ
反応に不活性な有機溶媒、たとえばメタノール、エタノ
ール、プロパノール等の低級アルコールやアセトニトリ
ル、ジオキサン、テトラヒドロフラン等を添加しても良
い。反応のpHは６〜10の範囲で選択することが好ましい
が、中性から弱塩基性が特に好ましい。反応温度は当該
ペプチドが失活しない温度であれば、いずれでも良く、
たとえば−５〜25℃の範囲が好ましい。反応時間は30分
〜36時間で充分である。
ールの研究において、試薬濃度を大きくするなど条件を
過酷にすると、アミノ末端のα−アミノ基が脱アミノ反
応を起こすという副反応が知られている。〔生物化学実
験法12、蛋白質の化学修飾（上）、62〜69頁、（学会出
版センター、1981）、ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー248巻6171（1968）〕本発明のポリエ
チレングリコール誘導体（Ｉ）を用いた修飾においても
同様の副反応の可能性が考えられる。そこでこのような
副反応が懸念される場合には、グアニジノ基を有するペ
プチドのアミノ基を適当な保護基で保護した後、ポリエ
チレングリコール誘導体（Ｉ）と反応させ、続いてアミ
ノ基の保護基を脱保護するという方法によって、修飾ペ
プチドを製造する方が得策な場合もある。アミノ基の保
護基は、ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）と反応性
がなく、さらに当該ペプチドを失活させることなく脱保
護されるものであれば良く、例えばスクシニル基、マレ
イル基、２−メチルマレイル基、2,3−ジメチルマレイ
ル基、エキソ−シス−3,6−エンドオキソ−△４−テト
ラヒドロフタロイル基、エキソ−シス−3,6−エンドオ
キシヘキサヒドロフタロイル基、テトラフルオロスクシ
ニル基等が挙げられる。保護基の導入は、当該分野の公
知の方法によって行うことができる。導入試剤として
は、相当する酸無水物、酸ハロゲン化物、活性エステル
等が用いられるが、一般的には相当する酸無水物が多く
用いられる。反応溶媒としては、反応を妨害しないもの
であればいずれでもよく、たとえば、炭酸ナトリウム水
溶液、炭酸水素ナトリウム水溶液、Ｎ−エチルモルホリ
ン−酢酸緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝液
等が挙げられる。また当該ペプチドを失活させず、かつ
反応に不活性な有機溶媒、たとえばメタノール、エタノ
ール、プロパノール等の低級アルコールやアセトニトリ
ル、ジオキサン、テトラヒドロフラン等を添加しても良
い。反応のpHは６〜10の範囲で選択することが好ましい
が、中性から弱塩基性が特に好ましい。反応温度は当該
ペプチドが失活しない温度であれば、いずれでも良く、
たとえば−５〜25℃の範囲が好ましい。反応時間は30分
〜36時間で充分である。
反応終了後、反応液を塩析やゲル濾過、イオン交換ク
ロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニ
ティクロマトグラフィー、限外濾過、逆相HPLCによる分
取等の通常のペプチドおよび蛋白質の精製法で精製して
目的のアミノ基が保護されたペプチドを得ることができ
るが、単離精製することなく引き続いてポリエチレング
リコール誘導体（Ｉ）と反応させアミノ基が保護された
ポリエチレングリコール修飾ペプチドを得ることもでき
る。
ロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニ
ティクロマトグラフィー、限外濾過、逆相HPLCによる分
取等の通常のペプチドおよび蛋白質の精製法で精製して
目的のアミノ基が保護されたペプチドを得ることができ
るが、単離精製することなく引き続いてポリエチレング
リコール誘導体（Ｉ）と反応させアミノ基が保護された
ポリエチレングリコール修飾ペプチドを得ることもでき
る。
アミノ基が保護されたグアニジノ基を有するペプチド
とポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）との反応および
反応終了後の精製は、前述の反応条件および精製法と同
様の反応条件および精製法で行うことができる。
とポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）との反応および
反応終了後の精製は、前述の反応条件および精製法と同
様の反応条件および精製法で行うことができる。
アミノ基の保護基の脱保護は反応液を酸性に保つこと
によって行うことができる。反応のpHは１〜６の範囲で
選択することが好ましい。酸性に保つ方法としては、当
該ペプチドが失活しない方法ならばどのような方法でも
良く、たとえば酸（酢酸、トリフルオロ酢酸、有機スル
ホン酸等の有機酸、塩酸等の無機酸等）を用いる方法、
ダウエックス50W等の酸性樹脂を用いる方法、リン酸緩
衝液、クエン酸緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等の緩衝
液を用いる方法、およびこれらを組み合わせた方法等が
挙げられる。反応は一般的には水溶液のみで行うが、場
合によっては、当該ペプチドを失活させず、かつ反応に
不活性な有機溶媒、たとえばメタノール、エタノール、
プロパノール等の低級アルコールやアセトニトリル、ジ
オキサン、テトラヒドロフラン等を添加しても良い。反
応温度は当該ペプチドが失活しない温度であればいずれ
でも良く、たとえば０〜40℃の範囲が好ましい。反応時
間は５分〜60時間で充分である。
によって行うことができる。反応のpHは１〜６の範囲で
選択することが好ましい。酸性に保つ方法としては、当
該ペプチドが失活しない方法ならばどのような方法でも
良く、たとえば酸（酢酸、トリフルオロ酢酸、有機スル
ホン酸等の有機酸、塩酸等の無機酸等）を用いる方法、
ダウエックス50W等の酸性樹脂を用いる方法、リン酸緩
衝液、クエン酸緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等の緩衝
液を用いる方法、およびこれらを組み合わせた方法等が
挙げられる。反応は一般的には水溶液のみで行うが、場
合によっては、当該ペプチドを失活させず、かつ反応に
不活性な有機溶媒、たとえばメタノール、エタノール、
プロパノール等の低級アルコールやアセトニトリル、ジ
オキサン、テトラヒドロフラン等を添加しても良い。反
応温度は当該ペプチドが失活しない温度であればいずれ
でも良く、たとえば０〜40℃の範囲が好ましい。反応時
間は５分〜60時間で充分である。
反応終了後、反応液を塩析やゲル濾過、イオン交換ク
ロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニ
ティクロマトグラフィー、限外濾過、逆相HPLCによる分
取等の通常の蛋白質の精製法で精製した目的の修飾ペプ
チドを得ることができる。
ロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニ
ティクロマトグラフィー、限外濾過、逆相HPLCによる分
取等の通常の蛋白質の精製法で精製した目的の修飾ペプ
チドを得ることができる。
本修飾ペプチドは通常の製剤、たとえば皮下的、筋肉
内的もしくは静脈内的適用のための注射溶液のような適
切な通常の投与形態に調製することが出来る。かかる製
剤は自体既知の方法によって製造される。
内的もしくは静脈内的適用のための注射溶液のような適
切な通常の投与形態に調製することが出来る。かかる製
剤は自体既知の方法によって製造される。
調製された修飾ペプチドは医薬品組成物として哺乳動
物（ヒト、サル、ウシ、ウマ、イヌ、ブタ等）に投与す
ることができる。
物（ヒト、サル、ウシ、ウマ、イヌ、ブタ等）に投与す
ることができる。
その投与量は、例えば実施例２で得た化学修飾SODを
急性心筋梗塞の治療のために投与する場合、通常１〜10
0mgを１日１回から数回に分けて投与することができ
る。
急性心筋梗塞の治療のために投与する場合、通常１〜10
0mgを１日１回から数回に分けて投与することができ
る。
本発明のポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）はペプ
チド中のグアニジノ基を選択的に修飾することができる
ものである。
チド中のグアニジノ基を選択的に修飾することができる
ものである。
当該ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）にて修飾さ
れたペプチドは対応する非修飾ペプチドと比較すると、
非常に安定な化合物であり、さらに生体内クリアランス
も著しく遅延（即ち、持続性が延長）され、長時間有効
にその生理活性を示す。しかも本修飾ペプチドは非修飾
ペプチドの有する生理活性をそのまま有するものであ
り、当該修飾ペプチドは医薬品、動物薬として極めて有
効である。
れたペプチドは対応する非修飾ペプチドと比較すると、
非常に安定な化合物であり、さらに生体内クリアランス
も著しく遅延（即ち、持続性が延長）され、長時間有効
にその生理活性を示す。しかも本修飾ペプチドは非修飾
ペプチドの有する生理活性をそのまま有するものであ
り、当該修飾ペプチドは医薬品、動物薬として極めて有
効である。
以下の実施例により本発明をより具体的に説明する
が、本発明はこれらによって制限されるものではない。
が、本発明はこれらによって制限されるものではない。
なお、以下の記載において各略号はそれぞれ次のこと
を意味する。
を意味する。
Asx:アスパラギン酸またはアスパラギン Glx:グルタミン酸またはグルタミン Ser:セリン Gly:グリシン His:ヒスチジン Arg:アルギニン Thr:スレオニン Ala:アラニン Pro:プロリン Tyr:チロシン Val:バリン Met:メチオニン Ile:イソロイシン Leu:ロイシン Phe:フエニルアラニン Lys:リジン 実施例１ （１） モノメトキシポリエチレングリコールトシレー
ト ポリエチレングリコールモノメチルエーテル（平均分
子量5000、40g）をトルエン160mlおよび塩化メチレン80
mlの混合溶媒に溶解した。
ト ポリエチレングリコールモノメチルエーテル（平均分
子量5000、40g）をトルエン160mlおよび塩化メチレン80
mlの混合溶媒に溶解した。
塩化パラトルエンスルホニル（8.0g）、ついでトリエ
チルアミン5.8mlを加え室温で６時間攪拌した。次に塩
化パラトルエンスルホニル（8.0g）を追加し、10時間撹
拌した。不溶物を濾別し濾液を減圧濃縮した。得られた
残渣をシリカゲルカラムで精製し標記モノメトキシポリ
エチレングリコールトシレート32.4gを得た。（収率78.
6％）、m.p.55〜57℃。
チルアミン5.8mlを加え室温で６時間攪拌した。次に塩
化パラトルエンスルホニル（8.0g）を追加し、10時間撹
拌した。不溶物を濾別し濾液を減圧濃縮した。得られた
残渣をシリカゲルカラムで精製し標記モノメトキシポリ
エチレングリコールトシレート32.4gを得た。（収率78.
6％）、m.p.55〜57℃。
1H−NMR（CDCl3）,TMS,90（MHz），δ2.18（ｓ），δ
3.38（ｓ），δ3.62（ｓ），δ7.3（ABq） （２） モノメトキシポリエチレングリコールヨウド体 CH3OCH2CH2 nIの製造： モノメトキシポリエチレングリコールトシレート（平
均分子量5,000,5g）をN,N−ジメチルホルムアミド50ml
に溶解した。
3.38（ｓ），δ3.62（ｓ），δ7.3（ABq） （２） モノメトキシポリエチレングリコールヨウド体 CH3OCH2CH2 nIの製造： モノメトキシポリエチレングリコールトシレート（平
均分子量5,000,5g）をN,N−ジメチルホルムアミド50ml
に溶解した。
ヨウ化ナトリウム（766mg）を加え、75〜85℃で１時
間撹拌した。不溶物を濾別し、濾液を減圧濃縮した。得
られた残渣をシリカゲルカラムで精製し標記モノメトキ
シポリエチレングリコールヨウド体2.7gを得た。
間撹拌した。不溶物を濾別し、濾液を減圧濃縮した。得
られた残渣をシリカゲルカラムで精製し標記モノメトキ
シポリエチレングリコールヨウド体2.7gを得た。
m.p. 55〜57℃ シリカゲル薄層クロマトグラフィー シリカゲル：キーゼルゲル60F254（メルク社製） 展開溶媒：クロロホルム／メタノール＝7/1 Rf値:0.45 （３） 3,5−ビス−メトキシポリエチレングリコール
アセトフェノン （２）で得たモノメトキシポリエチレングリコールヨ
ウド体（330mg）および3,5−ジヒドロキシアセトフェノ
ン（5mg）をN,N−ジメチルホルムアミド2mlに溶解し
た。炭酸カリウム（18mg）を加え90〜95℃の油浴中で１
時間撹拌した。
アセトフェノン （２）で得たモノメトキシポリエチレングリコールヨ
ウド体（330mg）および3,5−ジヒドロキシアセトフェノ
ン（5mg）をN,N−ジメチルホルムアミド2mlに溶解し
た。炭酸カリウム（18mg）を加え90〜95℃の油浴中で１
時間撹拌した。
次に、モノメトキシポリエチレングリコールヨウド体
（330mg）および炭酸カリウム（18mg）を追加し、90〜9
5℃の油浴中で2.5時間撹拌した。
（330mg）および炭酸カリウム（18mg）を追加し、90〜9
5℃の油浴中で2.5時間撹拌した。
次にモノメトキシポリエチレングリコールヨウド体
（330mg）および炭酸カリウム（18mg）を追加し、90〜9
5℃の油浴中で1.5時間撹拌した。沈でんを濾別後、濾液
を減圧濃縮した。
（330mg）および炭酸カリウム（18mg）を追加し、90〜9
5℃の油浴中で1.5時間撹拌した。沈でんを濾別後、濾液
を減圧濃縮した。
残渣をシリカゲルカラム精製し、標記3,5−ビス−メ
トキシポリエチレングリコール アセトフェノン 655m
gを得た。
トキシポリエチレングリコール アセトフェノン 655m
gを得た。
逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS ５μ 4.6mmφ×250mm（山村化学社製） 溶出液：グラジエント 初期Ｂ液濃度:20％ 濃度勾配:1％／分 流速:1ml/分，検出波長:214nm 保持時間:27.4分 （４） 3,5−ビス−メトキシポリエチレングリコール
フェニルグリオキザール （３）で得た3,5−ビス−メトキシポリエチレングリ
コール アセトフェノン（400mg）を、1,4−ジオキサン
6mlおよびH2O 0.2mlに溶解した。二酸化セレン（332m
g）を加え２時間加熱還流した。不溶物を濾別し濾液を
減圧濃縮した。得られた残渣をゲル濾過カラム精製（Se
phadex LH−60,35mmφ×350mm）し、3,5−ビス−メトキ
シポリエチレングリコール フェニルグリオキザール20
1mgを得た。
フェニルグリオキザール （３）で得た3,5−ビス−メトキシポリエチレングリ
コール アセトフェノン（400mg）を、1,4−ジオキサン
6mlおよびH2O 0.2mlに溶解した。二酸化セレン（332m
g）を加え２時間加熱還流した。不溶物を濾別し濾液を
減圧濃縮した。得られた残渣をゲル濾過カラム精製（Se
phadex LH−60,35mmφ×350mm）し、3,5−ビス−メトキ
シポリエチレングリコール フェニルグリオキザール20
1mgを得た。
m.p. 58〜60℃ 逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS ５μ 4.6mmφ×250mm（山村化学社製） 溶出液：グラジェント 初期Ｂ液濃度:30％ 濃度勾配:1％／分 流速:1ml/分，検出波長:214nm 保持時間:17.4分 高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK gel G3000 SW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.2M NaCl（５％ EtOH含有） 流速:0.6ml/分，検出波長:220nm 保持時間:25.0分 実施例２ ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）修飾スーパーオキ
シドジスムターゼ（SOD）の製造： ヒト由来Cu,Zn−SOD（5.04mg）を0.2M NaHCO3−0.02M
Na2CO3（pH9.2）2.5mlに溶解させた後、実施例１で得
た3,5−ビス−メトキシポリエチレングリコール フェ
ニルグリオキザール64.5mg（Argに対して5eq.）を加え
遮光下20時間放置した。さらに、修飾試剤32mg（計7.5e
q.）を追加し、遮光下22時間放置した。2N AcOHでpH6.4
に調整した後セファクリルＳ−200（ファルマシア社
製、2.6cmφ×94cm）を用いてゲル濾過精製した。目的
とする分画を限外濾過（アミコン社製、膜YM−30）によ
り脱塩・濃縮して目的物の水溶液1.8ml（蛋白含量521μ
g/ml）を得た。
シドジスムターゼ（SOD）の製造： ヒト由来Cu,Zn−SOD（5.04mg）を0.2M NaHCO3−0.02M
Na2CO3（pH9.2）2.5mlに溶解させた後、実施例１で得
た3,5−ビス−メトキシポリエチレングリコール フェ
ニルグリオキザール64.5mg（Argに対して5eq.）を加え
遮光下20時間放置した。さらに、修飾試剤32mg（計7.5e
q.）を追加し、遮光下22時間放置した。2N AcOHでpH6.4
に調整した後セファクリルＳ−200（ファルマシア社
製、2.6cmφ×94cm）を用いてゲル濾過精製した。目的
とする分画を限外濾過（アミコン社製、膜YM−30）によ
り脱塩・濃縮して目的物の水溶液1.8ml（蛋白含量521μ
g/ml）を得た。
酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 Ask 31.1（36）; Glx 26.4（26）; Ser 16.9（20） Gly 47.3（50）; His 14.2（16）; Arg 6.14（８） Thr 14.2（16）; Ala 20.4（20）; Pro 9.05（10） Val 25.7（28）; Ile 13.6（18）; Leu＊18.0（18） Phe 7.93（８）; Lys 21.3（22） ＊基準アミノ酸 逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS ５μ 4.6mmφ×250mm（山村化学製） 溶出液：グラジェント 初期Ｂ液濃度:30％ 濃度勾配:1％／分 流速:1ml/分，検出波長:214nm 保持時間:14.2分 高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK gel G3000SW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.2M NaCl（５％EtOH含有） 流速:0.6ml/分，検出波長:220nm 保持時間:21.1分 実施例３ ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）修飾インシュリン
様成長因子−Ｉ（IGF−Ｉ）の製造： IGF−Ｉ（1.00mg）を0.2M NaHCO3−0.02M Na2CO3（pH
9.01）800μに溶解させた後、10％NaOHで反応液のpH
を８〜９に保持しながら撹拌下無水シトラコン酸2.5μ
を５分間隔で計５回（合計12.5μ）加えた。更に30
分間1N NaOHでpH8〜９に保持した後、pH8.99に調整し
た。次いで実施例１で得た3,5−ビス−メトキシポリエ
チレングリコール フェニルグリオキザール122mg（Arg
に対して15eq.）を加え、遮光下室温で3.5時間撹拌し
た。反応混合物をセファクリルＳ−200（ファルマシア
社製、2.6cmφ×81cm）を用いてゲル濾過精製した。目
的とする分画を限外濾過（アミコン社製、膜YM−10）に
より脱塩・濃縮して1.8mlの水溶液とした。次いでAcOH
を加えpH3.0に調整し、40℃で４時間加熱後、限外濾過
（アミコン社製、膜YM−10）により精製・濃縮して目的
物の水溶液1.8ml（蛋白含量376μg/ml）を得た。
後の分解物）中のアミノ酸分析値 Ask 31.1（36）; Glx 26.4（26）; Ser 16.9（20） Gly 47.3（50）; His 14.2（16）; Arg 6.14（８） Thr 14.2（16）; Ala 20.4（20）; Pro 9.05（10） Val 25.7（28）; Ile 13.6（18）; Leu＊18.0（18） Phe 7.93（８）; Lys 21.3（22） ＊基準アミノ酸 逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS ５μ 4.6mmφ×250mm（山村化学製） 溶出液：グラジェント 初期Ｂ液濃度:30％ 濃度勾配:1％／分 流速:1ml/分，検出波長:214nm 保持時間:14.2分 高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK gel G3000SW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.2M NaCl（５％EtOH含有） 流速:0.6ml/分，検出波長:220nm 保持時間:21.1分 実施例３ ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）修飾インシュリン
様成長因子−Ｉ（IGF−Ｉ）の製造： IGF−Ｉ（1.00mg）を0.2M NaHCO3−0.02M Na2CO3（pH
9.01）800μに溶解させた後、10％NaOHで反応液のpH
を８〜９に保持しながら撹拌下無水シトラコン酸2.5μ
を５分間隔で計５回（合計12.5μ）加えた。更に30
分間1N NaOHでpH8〜９に保持した後、pH8.99に調整し
た。次いで実施例１で得た3,5−ビス−メトキシポリエ
チレングリコール フェニルグリオキザール122mg（Arg
に対して15eq.）を加え、遮光下室温で3.5時間撹拌し
た。反応混合物をセファクリルＳ−200（ファルマシア
社製、2.6cmφ×81cm）を用いてゲル濾過精製した。目
的とする分画を限外濾過（アミコン社製、膜YM−10）に
より脱塩・濃縮して1.8mlの水溶液とした。次いでAcOH
を加えpH3.0に調整し、40℃で４時間加熱後、限外濾過
（アミコン社製、膜YM−10）により精製・濃縮して目的
物の水溶液1.8ml（蛋白含量376μg/ml）を得た。
酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 Asx 4.82 （５）; Glx 5.41 （６）; Ser 4.18 （５） Gly 6.73 （７）; Arg 3.84 （６）; Thr 2.12 （３） Ala＊6.00 （６）; Pro 4.50 （５）; Tyr 2.81 （３） Val 2.34 （３）; Met 0.79 （１）; Ile 0.75 （１） Leu 5.55 （６）; Phe 3.86 （４）; Lys 2.87 （３） ＊基準アミノ酸 逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS 5μ 4.6mmφ×250mm（山村化学製） 溶出液：グラジェント 初期Ｂ液濃度:25％ 濃度勾配:1％／分 流 速:1ml/分，検出波長:214nm 保持時間:24.39分 高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK gel G3000 SW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.2M NaCl（５％EtOH含有） 流 速:0.6ml/分，検出波長:220nm 保持時間:22.95分 カラム:TSK gel G3000 PW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.2M NaCl 流 速:0.6ml/分，検出波長:220nm 保持時間:19.73分 実施例４ ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）修飾インシュリン
様成長因子−II（IGF−II）の製造： IGF−II（1.0mg）を0.2M NaHCO3−0.02M Na2CO3（pH
9.01）800μに溶解させた後、10％ NaOHで反応液のp
Hを８〜９に保持しながら、撹拌下無水シトラコン酸2.5
μを５分間隔で計５回（合計1.25μ）加えた。更に
30分間IN NaOHをpH8〜９に保持した後、pH8.99に調整し
た。次いで実施例１で得た3,5−ビス−メトキシポリエ
チレングリコール フェニルグリオキザール107.1mg（A
rgに対して10eq.）を加え、遮光下室温で５時間撹拌し
た。さらに、修飾試剤107.1mg（計20eq.）を追加し、遮
光下室温で24時間撹拌した。反応混合液をセファクリル
Ｓ−200（ファルマシア社製、2.6cmφ×81cm）を用いて
ゲル濾過精製した。目的とする分画を限外濾過（アミコ
ン社製、膜YM−10）により脱塩・濃縮した。次いで50％
AcOH水を加えpH2.98に調整し、40℃で４時間加熱後、限
外濾過（アミコン社製、膜YM−10）により精製・濃縮し
て目的物の水溶液1ml（蛋白含量393μg/ml）を得た。
後の分解物）中のアミノ酸分析値 Asx 4.82 （５）; Glx 5.41 （６）; Ser 4.18 （５） Gly 6.73 （７）; Arg 3.84 （６）; Thr 2.12 （３） Ala＊6.00 （６）; Pro 4.50 （５）; Tyr 2.81 （３） Val 2.34 （３）; Met 0.79 （１）; Ile 0.75 （１） Leu 5.55 （６）; Phe 3.86 （４）; Lys 2.87 （３） ＊基準アミノ酸 逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS 5μ 4.6mmφ×250mm（山村化学製） 溶出液：グラジェント 初期Ｂ液濃度:25％ 濃度勾配:1％／分 流 速:1ml/分，検出波長:214nm 保持時間:24.39分 高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK gel G3000 SW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.2M NaCl（５％EtOH含有） 流 速:0.6ml/分，検出波長:220nm 保持時間:22.95分 カラム:TSK gel G3000 PW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.2M NaCl 流 速:0.6ml/分，検出波長:220nm 保持時間:19.73分 実施例４ ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）修飾インシュリン
様成長因子−II（IGF−II）の製造： IGF−II（1.0mg）を0.2M NaHCO3−0.02M Na2CO3（pH
9.01）800μに溶解させた後、10％ NaOHで反応液のp
Hを８〜９に保持しながら、撹拌下無水シトラコン酸2.5
μを５分間隔で計５回（合計1.25μ）加えた。更に
30分間IN NaOHをpH8〜９に保持した後、pH8.99に調整し
た。次いで実施例１で得た3,5−ビス−メトキシポリエ
チレングリコール フェニルグリオキザール107.1mg（A
rgに対して10eq.）を加え、遮光下室温で５時間撹拌し
た。さらに、修飾試剤107.1mg（計20eq.）を追加し、遮
光下室温で24時間撹拌した。反応混合液をセファクリル
Ｓ−200（ファルマシア社製、2.6cmφ×81cm）を用いて
ゲル濾過精製した。目的とする分画を限外濾過（アミコ
ン社製、膜YM−10）により脱塩・濃縮した。次いで50％
AcOH水を加えpH2.98に調整し、40℃で４時間加熱後、限
外濾過（アミコン社製、膜YM−10）により精製・濃縮し
て目的物の水溶液1ml（蛋白含量393μg/ml）を得た。
酸加水分解物（6N塩酸−フェノール,110℃、24時間処
理後の分解物）中のアミノ酸分析値 Asx 2.57 （３）; Glx 6.22 （７）; Ser 6.48 （７） Gly 4.37 （５）; Arg 6.58 （８）; Thr 3.27 （４） Ala＊5.00 （５）; Pro 2.70 （３）; Tyr 2.53 （３） Val 3.06 （４）; Met 0.19 （１）; Ile 0.72 （１） Leu 4.98 （６）; Phe 3.90 （４）; Lys 1.05 （１） ＊基準アミノ酸 高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK G3000 SW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.2M NaCl（５％EtOH含有） 流 速:0.6ml/分，検出波長:220nm 保持時間:21.0分 実施例５ ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）修飾カルシトニン
遺伝子関連ペプチド（CGRP）の製造： ヒト由来CGRP（1.00mg）を0.2M NaHCO3−0.02M Na2CO
3（pH9.01）500μに溶解させた後、10％NaOHで反応液
のpHを８〜９に保持しながら撹拌下無水シトラコン酸2.
5μを５分間隔で計５回（合計12.5ml）加える。更に3
0分間1N NaOHでpH8〜９に保持した後、pH8.99に調整し
た。次いで実施例１で得た3,5−ビス−メトキシポリエ
チレングリコール フェニルグリオキザール26.4mg（Ar
gに対して5eq.）を加え遮光下室温で６時間撹拌した。
さらに修飾試剤26.4mgを２回加え（計15eq.）遮光下室
温で60時間撹拌した。反応混合物をセファクリルＳ−20
0（ファルマシア社製、2.6cmφ×81cm）を用いてゲル濾
過精製した。目的とする分画を限外濾過（アミコン社
製、膜YM−10）により脱塩・濃縮した。ついで50％AcOH
水を加えpH3.12に調整し、40℃で４時間加熱後、限外濾
過（アミコン社製、膜YM−10）により精製・濃縮して目
的物の水溶液1.8ml（蛋白含量164μg/ml）を得た。
理後の分解物）中のアミノ酸分析値 Asx 2.57 （３）; Glx 6.22 （７）; Ser 6.48 （７） Gly 4.37 （５）; Arg 6.58 （８）; Thr 3.27 （４） Ala＊5.00 （５）; Pro 2.70 （３）; Tyr 2.53 （３） Val 3.06 （４）; Met 0.19 （１）; Ile 0.72 （１） Leu 4.98 （６）; Phe 3.90 （４）; Lys 1.05 （１） ＊基準アミノ酸 高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK G3000 SW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.2M NaCl（５％EtOH含有） 流 速:0.6ml/分，検出波長:220nm 保持時間:21.0分 実施例５ ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）修飾カルシトニン
遺伝子関連ペプチド（CGRP）の製造： ヒト由来CGRP（1.00mg）を0.2M NaHCO3−0.02M Na2CO
3（pH9.01）500μに溶解させた後、10％NaOHで反応液
のpHを８〜９に保持しながら撹拌下無水シトラコン酸2.
5μを５分間隔で計５回（合計12.5ml）加える。更に3
0分間1N NaOHでpH8〜９に保持した後、pH8.99に調整し
た。次いで実施例１で得た3,5−ビス−メトキシポリエ
チレングリコール フェニルグリオキザール26.4mg（Ar
gに対して5eq.）を加え遮光下室温で６時間撹拌した。
さらに修飾試剤26.4mgを２回加え（計15eq.）遮光下室
温で60時間撹拌した。反応混合物をセファクリルＳ−20
0（ファルマシア社製、2.6cmφ×81cm）を用いてゲル濾
過精製した。目的とする分画を限外濾過（アミコン社
製、膜YM−10）により脱塩・濃縮した。ついで50％AcOH
水を加えpH3.12に調整し、40℃で４時間加熱後、限外濾
過（アミコン社製、膜YM−10）により精製・濃縮して目
的物の水溶液1.8ml（蛋白含量164μg/ml）を得た。
酸加水分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間
処理後の分解物）中のアミノ酸分析値 Asx 3.45 （４）; Ser 2.75 （３）; Gly 4.15 （４） His 0.77 （１）; Arg 0.87 （２）; Thr 3.68 （４） Ala＊4.00 （４）; Pro 0.93 （１）; Val 3.70 （５） Leu 2.66 （３）; Phe 1.69 （２）; Lys 1.90 （２） ＊基準アミノ酸 高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK gel G3000 SW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.2M NaCl（５％EtOH含有） 流 速:0.6ml/分，検出波長:220nm 保持時間:28.04分 実施例６ ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）修飾エラスターゼ
の製造： ブタエラスターゼ（1.00mg）を0.2M NaHCO3−0.02M N
a2CO3（pH9.01）800μに溶解させた後、10％ NaOHで
反応液のpHを８〜９に保持しながら撹拌下無水シトラコ
ン酸2.5μを５分間隔で計５回（12.5μ）加えた。
更に30分間1N NaOHでpH8〜９に保持した後、pH8.99に調
整した。次いで実施例１で得た3,5−ビス−メトキシポ
リエチレングリコール フェニルグリオキザール46.4mg
（Argに対して10eq.）を加え遮光下室温で36時間撹拌し
た。反応混合物をセファクリルＳ−200（ファルマシア
社製、2.6cmφ×81cm）を用いてゲル濾過精製した。目
的とする分画は限外濾過（アミコン社製、膜YM−30）に
より脱塩・濃縮した。次いで10％AcOH水でpH3.09とし40
℃で４時間加熱後、限外濾過（アミコン社製、膜YM−3
0）により精製・濃縮して目的物の水溶液1ml（蛋白含量
389μg/ml）を得た。
処理後の分解物）中のアミノ酸分析値 Asx 3.45 （４）; Ser 2.75 （３）; Gly 4.15 （４） His 0.77 （１）; Arg 0.87 （２）; Thr 3.68 （４） Ala＊4.00 （４）; Pro 0.93 （１）; Val 3.70 （５） Leu 2.66 （３）; Phe 1.69 （２）; Lys 1.90 （２） ＊基準アミノ酸 高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK gel G3000 SW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.2M NaCl（５％EtOH含有） 流 速:0.6ml/分，検出波長:220nm 保持時間:28.04分 実施例６ ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）修飾エラスターゼ
の製造： ブタエラスターゼ（1.00mg）を0.2M NaHCO3−0.02M N
a2CO3（pH9.01）800μに溶解させた後、10％ NaOHで
反応液のpHを８〜９に保持しながら撹拌下無水シトラコ
ン酸2.5μを５分間隔で計５回（12.5μ）加えた。
更に30分間1N NaOHでpH8〜９に保持した後、pH8.99に調
整した。次いで実施例１で得た3,5−ビス−メトキシポ
リエチレングリコール フェニルグリオキザール46.4mg
（Argに対して10eq.）を加え遮光下室温で36時間撹拌し
た。反応混合物をセファクリルＳ−200（ファルマシア
社製、2.6cmφ×81cm）を用いてゲル濾過精製した。目
的とする分画は限外濾過（アミコン社製、膜YM−30）に
より脱塩・濃縮した。次いで10％AcOH水でpH3.09とし40
℃で４時間加熱後、限外濾過（アミコン社製、膜YM−3
0）により精製・濃縮して目的物の水溶液1ml（蛋白含量
389μg/ml）を得た。
酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 Asx 21.6（24）; Glx 17.9（19）; Ser 20.3（22） Gly 24.4（25）; His 5.95（６）; Arg 7.93（12） Thr 17.5（19）; Ala＊17.0（17）; Pro 6.80（７） Tyr 10.7（11）; Val 23.2（27）; Met 1.50（２） Ile 8.73（10）; Leu 15.5（18）; Phe 2.97（３） Lys 3.18（３） ＊基準アミノ酸 高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK gel G3000 SW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.2M NaCl（５％EtOH含有） 流 速:0.6ml/分，検出波長:220nm 保持時間:28.40分 実施例７ ポリエチレングリコールモノメチルエーテル（平均分
子量4,500,100g）をトルエン400mlおよび塩化メチレン2
00mlの混合液に溶解した。
後の分解物）中のアミノ酸分析値 Asx 21.6（24）; Glx 17.9（19）; Ser 20.3（22） Gly 24.4（25）; His 5.95（６）; Arg 7.93（12） Thr 17.5（19）; Ala＊17.0（17）; Pro 6.80（７） Tyr 10.7（11）; Val 23.2（27）; Met 1.50（２） Ile 8.73（10）; Leu 15.5（18）; Phe 2.97（３） Lys 3.18（３） ＊基準アミノ酸 高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK gel G3000 SW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.2M NaCl（５％EtOH含有） 流 速:0.6ml/分，検出波長:220nm 保持時間:28.40分 実施例７ ポリエチレングリコールモノメチルエーテル（平均分
子量4,500,100g）をトルエン400mlおよび塩化メチレン2
00mlの混合液に溶解した。
トリエチルアミン20mlついで塩化パラトルエンスルホ
ニル（36g）を加え室温で５時間撹拌した。次にトリエ
チルアミン20mlおよび塩化パラトルエンスルホニル（30
g）を追加し、７時間撹拌した。不溶物を濾別し、濾液
を減圧乾固した。得られた残渣をシリカゲルカラムで精
製し、標記モノメトキシポリエチレングリコールトシレ
ート100.5gを得た。（収率97.2％） 逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS 5μ 4.6mmφ×250mm（山村化学製） 溶出液：グラジェント 初期Ｂ液濃度:30％ 濃度勾配:1％／分 流 速:1ml/分，検出波長:214nm 保持時間:21.8分 ポリエチレングリコールモノメチルエーテル（平均分
子量2,000,50g）をトルエン200mlおよび塩化メチレン10
0mlの混合溶媒に溶解した。
ニル（36g）を加え室温で５時間撹拌した。次にトリエ
チルアミン20mlおよび塩化パラトルエンスルホニル（30
g）を追加し、７時間撹拌した。不溶物を濾別し、濾液
を減圧乾固した。得られた残渣をシリカゲルカラムで精
製し、標記モノメトキシポリエチレングリコールトシレ
ート100.5gを得た。（収率97.2％） 逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS 5μ 4.6mmφ×250mm（山村化学製） 溶出液：グラジェント 初期Ｂ液濃度:30％ 濃度勾配:1％／分 流 速:1ml/分，検出波長:214nm 保持時間:21.8分 ポリエチレングリコールモノメチルエーテル（平均分
子量2,000,50g）をトルエン200mlおよび塩化メチレン10
0mlの混合溶媒に溶解した。
トリエチルアミン10mlおよび塩化パラトルエンスルホ
ニル（18g）を加え室温で５時間撹拌した。トリエチル
アミン10mlおよび塩化パラトルエンスルホニル（15g）
を追加し、５時間撹拌した。不溶物を濾別し、濾液を減
圧乾固した。得られた残渣をシリカゲルカラムで精製
し、標記モノメトキシポリエチレングリコールトシレー
ト40gを得た。（収率74.3％） 逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS 5μ 4.6mmφ×250mm（山村化学製） 溶出液：グラジェント 初期Ｂ液濃度:30％ 濃度勾配:1％／分 流 速:1ml/分，検出波長:214nm 保持時間:20.7分 3,5−ジヒドロキシアセトフェノン（200mg）のN,N−
ジメチルホルムアミド（10ml）溶液に炭酸カリウム（36
4mg、2eq.）を加え100〜110℃に加熱撹拌した。この懸
濁液に（１）で得たモノメトキシポリエチレングリコー
ルトシレート体（2.97g、0.5eq.）のN,N−ジメチルホル
ムアミド（10ml）溶液を１時間かけて滴下後、更に100
〜110℃で1.5時間撹拌した。不溶物を濾別後、濾液を減
圧乾固した。得られた残渣をシリカゲルカラム精製、つ
いでゲル濾過精製（LH−60,35mmφ×600mm塩化メチレン
−テトラヒドロフラン＝6:1）し標記化合物1.40gを得
た。
ニル（18g）を加え室温で５時間撹拌した。トリエチル
アミン10mlおよび塩化パラトルエンスルホニル（15g）
を追加し、５時間撹拌した。不溶物を濾別し、濾液を減
圧乾固した。得られた残渣をシリカゲルカラムで精製
し、標記モノメトキシポリエチレングリコールトシレー
ト40gを得た。（収率74.3％） 逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS 5μ 4.6mmφ×250mm（山村化学製） 溶出液：グラジェント 初期Ｂ液濃度:30％ 濃度勾配:1％／分 流 速:1ml/分，検出波長:214nm 保持時間:20.7分 3,5−ジヒドロキシアセトフェノン（200mg）のN,N−
ジメチルホルムアミド（10ml）溶液に炭酸カリウム（36
4mg、2eq.）を加え100〜110℃に加熱撹拌した。この懸
濁液に（１）で得たモノメトキシポリエチレングリコー
ルトシレート体（2.97g、0.5eq.）のN,N−ジメチルホル
ムアミド（10ml）溶液を１時間かけて滴下後、更に100
〜110℃で1.5時間撹拌した。不溶物を濾別後、濾液を減
圧乾固した。得られた残渣をシリカゲルカラム精製、つ
いでゲル濾過精製（LH−60,35mmφ×600mm塩化メチレン
−テトラヒドロフラン＝6:1）し標記化合物1.40gを得
た。
逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS 5μ 4.6mmφ×250mm（山村化学製） 溶出液：グラジェント 初期Ｂ液濃度:30％ 濃度勾配:1％／分 流 速:1ml/分，検出波長:214nm 保持時間:18.95分 高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK gel G3000 PW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.2M NaCl 流 速:0.6ml/分，検出波長:214nm 保持時間:25.81分 （３）で得た３−ヒドロキシ−５−モノメトキシポリ
エチレングリコール アセトフェノン（1.35g）のN,N−
ジメチルホルムアミド（30ml）溶液に、炭酸カリウム
（82.8mg）および（２）で得たモノメトキシポリエチレ
ングリコールトシレート体（720mg、1.2eq.）を加え90
〜100℃で5.5時間撹拌した。次に（２）で得たモノメト
キシポリエチレングリコールトシレート体（300mg、0.5
eq.）を追加し同温度で1.5時間撹拌した。不溶物を濾別
後、濾液を減圧乾固した。残渣をシリカゲルカラム精製
し、標記化合物1.215gを得た。
エチレングリコール アセトフェノン（1.35g）のN,N−
ジメチルホルムアミド（30ml）溶液に、炭酸カリウム
（82.8mg）および（２）で得たモノメトキシポリエチレ
ングリコールトシレート体（720mg、1.2eq.）を加え90
〜100℃で5.5時間撹拌した。次に（２）で得たモノメト
キシポリエチレングリコールトシレート体（300mg、0.5
eq.）を追加し同温度で1.5時間撹拌した。不溶物を濾別
後、濾液を減圧乾固した。残渣をシリカゲルカラム精製
し、標記化合物1.215gを得た。
逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS 5μ 4.6mmφ×250mm（山村化学製） 溶出液：グラジェント 初期Ｂ液濃度:30％ 濃度勾配:1％／分 流 速:1ml/分，検出波長:214nm 保持時間:19.96分 高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK gel G3000 PW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.2M NaCl 流 速:0.6ml/分，検出波長:220nm 保持時間:23.31分 （４）で得た３−モノメトキシポリエチレングリコール
−５−モノメトキシポリエチレングリコール アセトフ
ェノン（600mg）を、1,4−ジオキサン9mlおよびH2O 0.3
mlに溶解した。二酸化ゼレン（614mg）を加え５時間加
熱還流した。不溶物を濾別し、濾液を減圧乾固した。得
られた残渣をシリカゲルカラム精製することによって標
記化合物400mgを得た。
−５−モノメトキシポリエチレングリコール アセトフ
ェノン（600mg）を、1,4−ジオキサン9mlおよびH2O 0.3
mlに溶解した。二酸化ゼレン（614mg）を加え５時間加
熱還流した。不溶物を濾別し、濾液を減圧乾固した。得
られた残渣をシリカゲルカラム精製することによって標
記化合物400mgを得た。
逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS 5μ 4.6mmφ×250mm（山村化学製） 溶出液：グラジェント 初期Ｂ液濃度:30％ 濃度勾配:1％／分 流 速:1ml/分，検出波長:214nm 保持時間:18.51分 高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK gel G3000 PW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.2M NaCl 流 速:0.6ml/分，検出波長:220nm 保持時間:23.41分 実施例８ ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）修飾 スーパーオ
キシドジスムターゼ（SOD）の製造： ヒト由来Cu、Zn−SOD（5.0mg）を0.1Mホウ酸緩衝液
（pH8.21）2mlに溶解させた後、実施例７で得た３−モ
ノメトキシポリエチレングリコール−５−モノメトキシ
ポリエチレングリコール フェニルグリオキザール164m
g（Argに対して20eq.）を加え遮光下30時間放置した。1
0％AcOHでpH6に調整した後セファクリルＳ−200（ファ
ルマシア社製、2.6cmφ×81cm）を用いてゲル濾過精製
した。目的とする分画を限外濾過（アミコン社製、膜YM
−30）により脱塩・濃縮して目的物の水溶液1.8ml（蛋
白含量168μg/ml）を得た。
キシドジスムターゼ（SOD）の製造： ヒト由来Cu、Zn−SOD（5.0mg）を0.1Mホウ酸緩衝液
（pH8.21）2mlに溶解させた後、実施例７で得た３−モ
ノメトキシポリエチレングリコール−５−モノメトキシ
ポリエチレングリコール フェニルグリオキザール164m
g（Argに対して20eq.）を加え遮光下30時間放置した。1
0％AcOHでpH6に調整した後セファクリルＳ−200（ファ
ルマシア社製、2.6cmφ×81cm）を用いてゲル濾過精製
した。目的とする分画を限外濾過（アミコン社製、膜YM
−30）により脱塩・濃縮して目的物の水溶液1.8ml（蛋
白含量168μg/ml）を得た。
酸分解物（6N塩酸−フェノール、110℃、24時間処理
後の分解物）中のアミノ酸分析値 Asx 37.6（36）; Glx 24.8（26）; Ser 20.8（20） Gly 48.0（50）; His 18.7（16）; Arg 6.03（８） Thr 15.1（16）; Ala＊20.0（20）; Pro 10.2（10） Val 22.4（28）; Ile 10.8（18）; Leu 17.0（18） Phe 5.80（８）; Lys 16.4（22） ＊基準アミノ酸 高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK gel G3000 SW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.2M NaCl（５％EtOH含有） 流 速:0.6ml/分，検出波長:220nm 保持時間:24.14分 カラム:TSK gel G3000 PW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.2M NaCl 流 速:0.6ml/分，検出波長:220nm 保持時間:21.12分
後の分解物）中のアミノ酸分析値 Asx 37.6（36）; Glx 24.8（26）; Ser 20.8（20） Gly 48.0（50）; His 18.7（16）; Arg 6.03（８） Thr 15.1（16）; Ala＊20.0（20）; Pro 10.2（10） Val 22.4（28）; Ile 10.8（18）; Leu 17.0（18） Phe 5.80（８）; Lys 16.4（22） ＊基準アミノ酸 高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSK gel G3000 SW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.2M NaCl（５％EtOH含有） 流 速:0.6ml/分，検出波長:220nm 保持時間:24.14分 カラム:TSK gel G3000 PW 7.5mmφ×600mm（東ソー社製） 溶出液:0.2M NaCl 流 速:0.6ml/分，検出波長:220nm 保持時間:21.12分
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 小野 圭一 大阪府大阪市此花区春日出中３丁目１番 98号 住友製薬株式会社内 (56)参考文献 Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，「Ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｅｙｌ ｇｌｙｏｘａｌ ｗｉｔｈ ａｒｇｉｎ ｉｎｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ Ｐｒ ｏｔａｉｎｓ」，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａ ｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈ ｅｗｉｓｔｒｙ，243巻，28号，ｐ. 6171−6179（1968) Ｔ．Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａ ｌ．，「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉ ｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｖｅ ｇｌｙｃｏｌ−ｗｏｄｉｆｉｅｄ Ｌ −ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ ｆｒｏｍ ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏ ｎ ｔｏ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｌｅ ｕｋｅｍｉａ」，Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｊ ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｕｃｅｒ Ｒ ｅｓｅｒｃｈ ，77巻，12号 ，ｐ. 1264−1270（1986) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C08G 65/00 - 65/48 ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (4)
- 【請求項１】式 （式中、R1およびR2は同一または異なる低級アルキル基
を表し、ｍおよびｎはポリエチレングリコール部分の平
均分子量が1,000〜12,000となる同一または異なる任意
の正の整数であることを表す。） で表されるポリエチレングリコール誘導体。 - 【請求項２】ペプチド中のグアニジノ基が請求項（１）
記載のポリエチレングリコール誘導体によって修飾され
ている修飾ペプチド。 - 【請求項３】請求項（１）記載のポリエチレングリコー
ル誘導体とグアニジノ基を有するペプチドとを反応させ
ることを特徴とする修飾ペプチドの製造方法。 - 【請求項４】グアニジノ基を有するペプチドのアミノ基
を保護した後、請求項（１）記載のポリエチレングリコ
ール誘導体を反応させ、続いてアミノ基の保護基を脱保
護することを特徴とする修飾ペプチドの製造方法。
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|---|---|---|---|
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|---|---|
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|---|---|---|---|
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| FR2675807B1 (fr) * | 1991-04-23 | 1994-07-01 | Medgenix Group Sa | Conjugue de calcitonine et de polyethylene glycol. |
| US5578496A (en) * | 1991-12-19 | 1996-11-26 | Board Of Regents, Baylor College Of Medicine | Detection of autoantibodies associated with the disease myasthenia gravis |
| AU3423293A (en) * | 1991-12-19 | 1993-07-19 | Baylor College Of Medicine | Pva or peg conjugates of peptides for epitope-specific immunosuppression |
| US5932462A (en) * | 1995-01-10 | 1999-08-03 | Shearwater Polymers, Inc. | Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces |
| JP2001508783A (ja) * | 1997-01-29 | 2001-07-03 | ポリマスク・ファーマシューティカルズ・パブリック・リミテッド・カンパニー | Ｐｅｇ化法 |
| JP4593048B2 (ja) | 1999-12-24 | 2010-12-08 | 協和発酵キリン株式会社 | 分岐型ポリアルキレングリコール類 |
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| US7208145B2 (en) | 2002-12-31 | 2007-04-24 | Nektar Therapeutics Al, Corporation | Polymeric reagents comprising a ketone or a related functional group |
| AU2004264818B2 (en) * | 2003-08-01 | 2011-09-29 | Biocon, Ltd | Aryl carbamate oligomers for hydrolyzable prodrugs and prodrugs comprising same |
| WO2005108463A2 (en) * | 2004-05-03 | 2005-11-17 | Nektar Therapeutics Al, Corporation | Branched polyethylen glycol derivates comprising an acetal or ketal branching point |
| EP2175878A4 (en) * | 2007-07-11 | 2014-12-03 | Belrose Pharma Inc | POLYMER DRUG DISPENSING SYSTEM WITH A MULTIPLE SUBSTITUTED AROMATIC PART |
| US20110009446A1 (en) * | 2008-01-11 | 2011-01-13 | Nektar Therapeutics | Oligomer-guanidine class conjugates |
| US9327034B2 (en) | 2011-12-14 | 2016-05-03 | University Of Tsukuba, A Japanese National University | Branched polyethylene glycol and use thereof |
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|---|---|---|---|---|
| US4179337A (en) * | 1973-07-20 | 1979-12-18 | Davis Frank F | Non-immunogenic polypeptides |
| WO1985003934A1 (en) * | 1984-03-06 | 1985-09-12 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Chemically modified protein and process for its preparation |
-
1990
- 1990-04-04 JP JP9063790A patent/JP2997004B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-05-24 EP EP19900109907 patent/EP0400486A3/en not_active Ceased
- 1990-05-25 CA CA002017541A patent/CA2017541A1/en not_active Abandoned
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，「Ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｅｙｌ ｇｌｙｏｘａｌ ｗｉｔｈ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔａｉｎｓ」，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｗｉｓｔｒｙ，２４３巻，２８号，ｐ．６１７１−６１７９（１９６８） |
| Ｔ．Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｖｅ ｇｌｙｃｏｌ−ｗｏｄｉｆｉｅｄ Ｌ−ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ ｆｒｏｍ ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｌｅｕｋｅｍｉａ」，Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｕｃｅｒ Ｒｅｓｅｒｃｈ ，７７巻，１２号 ，ｐ．１２６４−１２７０（１９８６） |
Also Published As
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