JPS6319520B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPS6319520B2 JPS6319520B2 JP58243675A JP24367583A JPS6319520B2 JP S6319520 B2 JPS6319520 B2 JP S6319520B2 JP 58243675 A JP58243675 A JP 58243675A JP 24367583 A JP24367583 A JP 24367583A JP S6319520 B2 JPS6319520 B2 JP S6319520B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hanp
- group
- peptide
- acid
- protected
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
Links
- 239000002934 diuretic Substances 0.000 claims abstract description 25
- 230000001882 diuretic effect Effects 0.000 claims abstract description 19
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 7
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims abstract description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 3
- 101800001890 Atrial natriuretic peptide Proteins 0.000 abstract 2
- 102000056614 human NPPA Human genes 0.000 abstract 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 62
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 24
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 21
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 description 20
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 20
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 20
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 230000001452 natriuretic effect Effects 0.000 description 15
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 12
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 10
- -1 etc. Chemical class 0.000 description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 8
- 210000002837 heart atrium Anatomy 0.000 description 7
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 208000004880 Polyuria Diseases 0.000 description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical class 0.000 description 5
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 5
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 5
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- CNBUSIJNWNXLQQ-NSHDSACASA-N (2s)-3-(4-hydroxyphenyl)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]propanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 CNBUSIJNWNXLQQ-NSHDSACASA-N 0.000 description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 4
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- ZZUFCTLCJUWOSV-UHFFFAOYSA-N furosemide Chemical compound C1=C(Cl)C(S(=O)(=O)N)=CC(C(O)=O)=C1NCC1=CC=CO1 ZZUFCTLCJUWOSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960003883 furosemide Drugs 0.000 description 4
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000009850 completed effect Effects 0.000 description 3
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 210000003191 femoral vein Anatomy 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 3
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N Acetamide Chemical compound CC(N)=O DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 108010001478 Bacitracin Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N ammonium formate Chemical compound [NH4+].[O-]C=O VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N anisole Chemical compound COC1=CC=CC=C1 RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002249 anxiolytic agent Substances 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000001746 atrial effect Effects 0.000 description 2
- 229960003071 bacitracin Drugs 0.000 description 2
- 229930184125 bacitracin Natural products 0.000 description 2
- CLKOFPXJLQSYAH-ABRJDSQDSA-N bacitracin A Chemical compound C1SC([C@@H](N)[C@@H](C)CC)=N[C@@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]1C(=O)N[C@H](CCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2N=CNC=2)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCCCC1 CLKOFPXJLQSYAH-ABRJDSQDSA-N 0.000 description 2
- 230000004531 blood pressure lowering effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 125000001309 chloro group Chemical group Cl* 0.000 description 2
- 125000004218 chloromethyl group Chemical group [H]C([H])(Cl)* 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 229940030606 diuretics Drugs 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 125000002795 guanidino group Chemical group C(N)(=N)N* 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229910000040 hydrogen fluoride Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000001077 hypotensive effect Effects 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 210000004731 jugular vein Anatomy 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 2
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000007922 nasal spray Substances 0.000 description 2
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N pentobarbital Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000012495 positive regulation of renal sodium excretion Effects 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000006190 sub-lingual tablet Substances 0.000 description 2
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 2
- 150000003573 thiols Chemical group 0.000 description 2
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010002199 Anaphylactic shock Diseases 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N Butyl acetate Natural products CCCCOC(C)=O DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000007530 Essential hypertension Diseases 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002211 L-ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000000069 L-ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N L-cystine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- QEFRNWWLZKMPFJ-YGVKFDHGSA-N L-methionine S-oxide Chemical group CS(=O)CC[C@H](N)C(O)=O QEFRNWWLZKMPFJ-YGVKFDHGSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010067482 No adverse event Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 159000000021 acetate salts Chemical class 0.000 description 1
- BLAKAEFIFWAFGH-UHFFFAOYSA-N acetyl acetate;pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1.CC(=O)OC(C)=O BLAKAEFIFWAFGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000266 alpha-aminoacyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000003276 anti-hypertensive effect Effects 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000000051 benzyloxy group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000009530 blood pressure measurement Methods 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- ZOAIGCHJWKDIPJ-UHFFFAOYSA-M caesium acetate Chemical compound [Cs+].CC([O-])=O ZOAIGCHJWKDIPJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N caesium atom Chemical class [Cs] TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FJDQFPXHSGXQBY-UHFFFAOYSA-L caesium carbonate Chemical compound [Cs+].[Cs+].[O-]C([O-])=O FJDQFPXHSGXQBY-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000024 caesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 150000003943 catecholamines Chemical class 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 235000015165 citric acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 230000035619 diuresis Effects 0.000 description 1
- 238000000921 elemental analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 239000012156 elution solvent Substances 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000001105 femoral artery Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229940093915 gynecological organic acid Drugs 0.000 description 1
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N hexanoic acid Chemical compound CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N methoxybenzene Substances CCCCOC=C UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920001467 poly(styrenesulfonates) Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 229910001414 potassium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 1
- 230000002040 relaxant effect Effects 0.000 description 1
- 230000036454 renin-angiotensin system Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229920000260 silastic Polymers 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 125000002088 tosyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1C([H])([H])[H])S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 230000036325 urinary excretion Effects 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/58—Atrial natriuretic factor complex; Atriopeptin; Atrial natriuretic peptide [ANP]; Cardionatrin; Cardiodilatin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/10—Antioedematous agents; Diuretics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Hematology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
(発明の分野)
この発明は、利尿作用、ナトリウム利尿作用及
び血圧降下作用を有するペプチド並びにその酸付
加塩、並びにこれらを含んで成る利尿剤に関す
る。 (発明の背景) 種々の体液性因子、すなわち生理活性物質が、
物理的因子、例えば心拍出量、血管壁の弾性等と
共に血圧を規定する重要な因子であることはよく
知られている。この体液性因子が関与する系とし
て、レニン−アンジオテンシン−アルドステロン
系、カテコラミン系、プロスタグランジン系、カ
リクレイン−キニン系と共にナトリウム利尿ホル
モン系が存在し、ウアベイン様物質といわれるナ
トリウム利尿ホルモンが血圧の上昇に関与するこ
ともすでに周知である。 なお、この明細書において「ナトリウム利尿」
とはカリウムイオンに対してナトリウムイオンを
選択的に排泄する利尿を言う。 (従来技術) 従来から、本態性高血圧の治療にナトリウムイ
オンの排泄を目的として、利尿剤、例えばフロセ
マイドが用いられている。しかしながら、この物
質とこの発明の物質とは構造が全く異る。 一方、ヒトの心房中には、ペプチドホルモン産
生細胞中に見られる顆粒と形態的に類似する顆粒
が存在することが知られている〔J.D.Jamieson
及びG.E.palade,J.Cell Biol.,23,151(1964)〕。
また、ラツトの心房のホモジネート物及びその顆
粒が、ラツトに対してナトリウム利尿を起すこと
も知られている〔A.J.DeBold等、Life Sci.,28,
89(1981);R.Keeller,Can.J.Physiol.
Pharmacol.,60,1078(1982)等〕。さらに、最
近において、Mark G.Currie S.等はヒト、ウサ
ギ、ブタ及びラツトの心房中にナトリウム利尿作
用を有する分子量2万〜3万のペプチド様物質及
び分子量1万以下のペプチド様物質が存在するこ
とを示唆した〔Science,221,71〜73(1983)〕。 本発明者等は、ナトリウム選択性が高く効果的
な利尿作用を有する物質を見出すべく鋭意研究を
行つた結果、ヒトの心房から、28個のアミノ酸で
構成され約3100の分子量を有する全く新しいペプ
チドを単離することに成功し、このペプチドの構
造を決定すると共に、このペプチドが顕著な利尿
作用、ナトリウム利尿作用及び血圧降下作用を有
することを見出し、この発明を完成した。 すなわち、この発明は、顕著な利尿作用、特に
ナトリウム利尿作用を有する新規なペプチド、及
び該ペプチドを含んで成る利尿剤を提供すること
を目的とする。 なお、この明細書において、この新規ペプチド
をα−hANP(α−human atrial natriuretic
polypeptide)と称する。 (発明の構成) (A) α−hANPの構造及び物理化学的性質 この発明のペプチドα−hANPは次の構造式
()で表わされる。 上記の構造式()において、とは直接
に結合しており、又このアミノ酸鎖は左側にア
ミノ末端を有し右側にカルボキシ末端を有す
る。式中、Aspはアスパラギン酸、Asnはアス
パラギン、Alaはアラニン、Argはアルギニ
ン、Ileはイソロイシン、Glyはグリシン、Glu
はグルタミン酸、Glnはグルタミン、Cysは1/2
シスチン、Serはセリン、Tyrはチロシン、
Pheはフエニルアラニン、Metはメチオニン、
Leuはロイシンをそれぞれ表わし、いずれもL
−アミノ酸である。 分子量:約3100(ゲル過法による。) 旋光度:〔α〕25 D=−80.0℃(c=0.16,0.1N
酢酸)。 紫外線吸収スペクトル:Max=275nm。 呈色反応:エールリツヒ反応陰性、坂口反
応、及びパウリ反応いずれも陽性。 酸性・中性・塩基性の別:塩基性 溶剤に対する溶解性:水、メタノール及び酢
酸に溶解し、酢酸エチル、酢酸ブチル、エチル
エーテル、ヘキサン、石油エーテル、ベンゼン
及びクロロホルムに難溶である。 薄層クロマトグラフイー:Rf値 0.41(n−ブタノール:酢酸:ピリジン:水=
4:1:1:2) 0.34(n−ブタノール:酢酸:ピリジン:水=
30:6:20:24) 0.08(n−ブタノール:酢酸:酢酸エチル:水
=1:1:1:1)。 アミノ酸組成(アミノ酸分析による)
び血圧降下作用を有するペプチド並びにその酸付
加塩、並びにこれらを含んで成る利尿剤に関す
る。 (発明の背景) 種々の体液性因子、すなわち生理活性物質が、
物理的因子、例えば心拍出量、血管壁の弾性等と
共に血圧を規定する重要な因子であることはよく
知られている。この体液性因子が関与する系とし
て、レニン−アンジオテンシン−アルドステロン
系、カテコラミン系、プロスタグランジン系、カ
リクレイン−キニン系と共にナトリウム利尿ホル
モン系が存在し、ウアベイン様物質といわれるナ
トリウム利尿ホルモンが血圧の上昇に関与するこ
ともすでに周知である。 なお、この明細書において「ナトリウム利尿」
とはカリウムイオンに対してナトリウムイオンを
選択的に排泄する利尿を言う。 (従来技術) 従来から、本態性高血圧の治療にナトリウムイ
オンの排泄を目的として、利尿剤、例えばフロセ
マイドが用いられている。しかしながら、この物
質とこの発明の物質とは構造が全く異る。 一方、ヒトの心房中には、ペプチドホルモン産
生細胞中に見られる顆粒と形態的に類似する顆粒
が存在することが知られている〔J.D.Jamieson
及びG.E.palade,J.Cell Biol.,23,151(1964)〕。
また、ラツトの心房のホモジネート物及びその顆
粒が、ラツトに対してナトリウム利尿を起すこと
も知られている〔A.J.DeBold等、Life Sci.,28,
89(1981);R.Keeller,Can.J.Physiol.
Pharmacol.,60,1078(1982)等〕。さらに、最
近において、Mark G.Currie S.等はヒト、ウサ
ギ、ブタ及びラツトの心房中にナトリウム利尿作
用を有する分子量2万〜3万のペプチド様物質及
び分子量1万以下のペプチド様物質が存在するこ
とを示唆した〔Science,221,71〜73(1983)〕。 本発明者等は、ナトリウム選択性が高く効果的
な利尿作用を有する物質を見出すべく鋭意研究を
行つた結果、ヒトの心房から、28個のアミノ酸で
構成され約3100の分子量を有する全く新しいペプ
チドを単離することに成功し、このペプチドの構
造を決定すると共に、このペプチドが顕著な利尿
作用、ナトリウム利尿作用及び血圧降下作用を有
することを見出し、この発明を完成した。 すなわち、この発明は、顕著な利尿作用、特に
ナトリウム利尿作用を有する新規なペプチド、及
び該ペプチドを含んで成る利尿剤を提供すること
を目的とする。 なお、この明細書において、この新規ペプチド
をα−hANP(α−human atrial natriuretic
polypeptide)と称する。 (発明の構成) (A) α−hANPの構造及び物理化学的性質 この発明のペプチドα−hANPは次の構造式
()で表わされる。 上記の構造式()において、とは直接
に結合しており、又このアミノ酸鎖は左側にア
ミノ末端を有し右側にカルボキシ末端を有す
る。式中、Aspはアスパラギン酸、Asnはアス
パラギン、Alaはアラニン、Argはアルギニ
ン、Ileはイソロイシン、Glyはグリシン、Glu
はグルタミン酸、Glnはグルタミン、Cysは1/2
シスチン、Serはセリン、Tyrはチロシン、
Pheはフエニルアラニン、Metはメチオニン、
Leuはロイシンをそれぞれ表わし、いずれもL
−アミノ酸である。 分子量:約3100(ゲル過法による。) 旋光度:〔α〕25 D=−80.0℃(c=0.16,0.1N
酢酸)。 紫外線吸収スペクトル:Max=275nm。 呈色反応:エールリツヒ反応陰性、坂口反
応、及びパウリ反応いずれも陽性。 酸性・中性・塩基性の別:塩基性 溶剤に対する溶解性:水、メタノール及び酢
酸に溶解し、酢酸エチル、酢酸ブチル、エチル
エーテル、ヘキサン、石油エーテル、ベンゼン
及びクロロホルムに難溶である。 薄層クロマトグラフイー:Rf値 0.41(n−ブタノール:酢酸:ピリジン:水=
4:1:1:2) 0.34(n−ブタノール:酢酸:ピリジン:水=
30:6:20:24) 0.08(n−ブタノール:酢酸:酢酸エチル:水
=1:1:1:1)。 アミノ酸組成(アミノ酸分析による)
【表】
【表】
なお、この化合物は前記のごとく塩基性であ
り、無機酸、例えば塩酸、硫酸、燐酸等、又は有
機酸、例えば蟻酸、酢酸、プロピオン酸、コハク
酸、クエン酸等と共に常法に従つて酸付加塩に転
換することができる。 (B) α−hANPの生物学的性質 この発明のペプチドα−hANPは顕著な利尿作
用、ナトリウム利尿作用及び血圧降下作用を有す
る。 試験方法 雄性SD系ラツト(体重300〜400g)にペント
バルビタール60mg/Kgを腹腔内投与することによ
つて麻酔し、以下Life Sciences,Vol.28,pp89
〜94に記載されている方法に準じて行つた。 気道確保のため、気管カニユーレ(PE−240
Clay−Adams)を施し、股動脈に血圧測定用の
動脈カニユーレ(PE−10にPE−50を接続)を挿
入し、股静脈にリンゲル液投与用の静脈カニユー
レを挿入した。この静脈カニユーレを通して1.2
mlのリンゲル液を10分間にわたつて注入した後
1.2ml/時の速度で定常注入(constant infusion)
を行つた。 シラステイツク・チユーブ(内径0.02インチ、
外径0.037インチ、ダウコーニング社製)の膀胱
カニユーレから試験管内に採尿した。この採尿は
被験物質を投与する前30分間と投与後5分間又は
その後経時的に行い、この尿試料の分析値を比較
することにより被験物質の作用を測定した。 被験物質α−hANPは、その所定量を5μgのバ
シトラシン(抗菌剤)と共に50μの滅菌生理食
塩水に溶解し、頚静脈から投与した。 α−hANPの投与量は0.1nモル(群)、0.2n
モル(群)及び0.4nモル(群)の3段階と
し、対照としてα−hANPを投与せずバシトラシ
ンのみを投与する群(群)、及び比較のためα
−hANPの代りに公知のナトリウム利尿剤である
フロセマイド(Furosemide)を1.21μモル投与す
る群(群)を設けた。 結 果 この試験において次表に示す結果が得られた。
り、無機酸、例えば塩酸、硫酸、燐酸等、又は有
機酸、例えば蟻酸、酢酸、プロピオン酸、コハク
酸、クエン酸等と共に常法に従つて酸付加塩に転
換することができる。 (B) α−hANPの生物学的性質 この発明のペプチドα−hANPは顕著な利尿作
用、ナトリウム利尿作用及び血圧降下作用を有す
る。 試験方法 雄性SD系ラツト(体重300〜400g)にペント
バルビタール60mg/Kgを腹腔内投与することによ
つて麻酔し、以下Life Sciences,Vol.28,pp89
〜94に記載されている方法に準じて行つた。 気道確保のため、気管カニユーレ(PE−240
Clay−Adams)を施し、股動脈に血圧測定用の
動脈カニユーレ(PE−10にPE−50を接続)を挿
入し、股静脈にリンゲル液投与用の静脈カニユー
レを挿入した。この静脈カニユーレを通して1.2
mlのリンゲル液を10分間にわたつて注入した後
1.2ml/時の速度で定常注入(constant infusion)
を行つた。 シラステイツク・チユーブ(内径0.02インチ、
外径0.037インチ、ダウコーニング社製)の膀胱
カニユーレから試験管内に採尿した。この採尿は
被験物質を投与する前30分間と投与後5分間又は
その後経時的に行い、この尿試料の分析値を比較
することにより被験物質の作用を測定した。 被験物質α−hANPは、その所定量を5μgのバ
シトラシン(抗菌剤)と共に50μの滅菌生理食
塩水に溶解し、頚静脈から投与した。 α−hANPの投与量は0.1nモル(群)、0.2n
モル(群)及び0.4nモル(群)の3段階と
し、対照としてα−hANPを投与せずバシトラシ
ンのみを投与する群(群)、及び比較のためα
−hANPの代りに公知のナトリウム利尿剤である
フロセマイド(Furosemide)を1.21μモル投与す
る群(群)を設けた。 結 果 この試験において次表に示す結果が得られた。
【表】
【表】
この表から明らかなごとく、この発明のペプチ
ドα−hANPは顕著な利尿作用及びナトリウム利
尿作用を有する。すなわち、この発明のα−
hANPを0.4nモル投与した場合、その利尿作用及
びナトリウム利尿作用は公知の利尿剤であるフロ
セマイドを1.21μモル投与した場合のそれにほぼ
匹敵する。この投与量(0.4nモル)において、こ
の発明のα−hANPは尿排泄量を約20倍に増加せ
しめ、ナトリウムの排泄量を約27倍に増加せしめ
た。又、被験化合物を投与しない場合の尿中の
Na/K比がおよそ0.3であるのに対し、α−
hANPを0.4nモル投与した場合この比は約2.0に
上昇し、この発明のα−hANPがNaを選択的に
排泄するナトリウム利尿剤として有用であること
が示唆された。 さらに、被験物質を投与した後経時的に採尿し
て経過を観察した場合の結果は第1図のようであ
つた。この図から明らかなごとく、この発明のα
−hANPの利尿作用及びナトリウム利尿作用は公
知の利尿剤であるフロセミドのそれよりも急速に
生じた。 また、第2図に示す如く、この発明のα−
hANPを1.2μg(0.4nモル)投与した後、血圧は
緩かに15〜20mmHg降下し、約45分間持続した。
この結果によりα−hANPが血圧降下作用を有す
ることも明らかとなつた。 α−hANPの利尿剤としての適性 前記のごとくこの発明のペプチドα−hANPは
顕著な利尿作用及びナトリウム利尿作用を有す
る。 このペプチドは繰返し投与しても抗体産生を惹
起せず、アナフイラキシーシヨツクを起こさな
い。また、この発明のペプチドはL−アミノ酸の
みからなり、投与後、生体内の各種プロテアーゼ
により徐々に分解されるため毒作用をほとんど有
しない。 前記のごとく、α−hANPはng/Kgのオーダ
ーで効果を発揮し、毒性が非常に低いから、1n
g/Kg〜10mg/Kgの範囲で投与することができ、
10ng/Kg〜1mg/Kgの範囲で投与するのが好ま
しい。 この発明のα−hANPは、ペプチド系医薬の投
与に一般に使用されている投与方法、すなわち非
経口的投与方法、例えば静脈内投与、筋肉内投
与、皮下投与等によつて投与するのが好ましい。
経口投与した場合、α−hANPは消化管内で分解
を受けるためこの投与方法は一般的には効果的で
ないが、消化管内で分解を受けにくい製剤、例え
ば活性成分であるα−hANPをリポゾーム中に抱
容したマイクロカプセル剤として経口投与するこ
とも可能である。又、直腸、舌下、鼻内など消化
管以外の粘膜から吸収せしめる投与方法を採用す
ることも可能であり、この場合、例えば坐剤、舌
下錠、点鼻スプレー剤等の形で投与することがで
きる。 (C) α−hANPの製造方法 この発明のペプチドα−hANPは、ヒトの心房
組織を適当な酸性溶媒、例えば燐酸緩衝液、塩酸
含有酢酸等の中でホモジネートし、雛直腸標本弛
緩活性を指標として、遠心分離、等電沈澱、溶媒
抽出、限外過、ゲル過、吸着クロマトグラフ
イー等、ペプチドの精製に常用される各種処理を
適宜組合わせて分子量約3100のペプチドを分離す
ることにより得られる。 しかしながら、α−hANPを工業的規模で得る
には合成法を用いるのがより有利であることは言
うまでもない。この発明のペプチドα−hANP
は、ペプチドの合成に常用される固相法、又は液
相法によつて製造することができる。この合成
は、例えば、矢島治明、榊原俊平著、日本生化学
会編、生化学実験講座();蛋白質の化学、4
巻、208〜495頁、(株)東京化学同人発行(1977);
及び泉屋信夫ほか著、ペプチド合成、丸善(株)発行
(1975)に記載されているメリフイールド
(Merrifield)等の方法に準じて行うことができ
る。 例えば、メリフイールド等の固相合成法によつ
てα−hANPを合成することができる。この方法
を本発明に適用する場合、α−アミノ基はいずれ
のアミノ酸についてもtert−ブチルオキシカルボ
ニル基(Boc基)で保護し、チロシンの水酸基は
2,6−ジクロロベンジル基(Cl2−Bzl基)で、
アルギニンのグアニジノ基はトシル基(Tos基)
で、セリンの水酸基はベンジル基(Bzl基)で、
アスパラギン酸β−カルボン酸基はO−ベンジル
基(O−Bzl基)でそれぞれ保護するのが好適で
ある。まず、C末端アミノ酸であるチロシンの保
護誘導体Boc−Tyr(Cl2−Bzl)をクロロメチル
樹脂に導入し、以後順次アミノ酸鎖を延長し、保
護α−hANP−樹脂を合成し、これをフツ化水素
で処理することにより保護α−hANPを樹脂から
切断し、同時に脱保護し、そしてこれを還元する
ことによりCys7,23(Acm)−α−hANP(Acmはシ
ステインのチオール基を保護するアセトアミドメ
チル基である)を得る。次に、これをヨウ素で酸
化することによりチオール基を保護基Acmを脱
離せしめると同時に7位と23位のシステインのチ
オール基によるジスルフイド結合を形成せしめる
ことにより粗合成α−hANPを得る。得られた粗
合成α−hANPはゲル過、逆相HPLC等ペプチ
ドの精製に常用される手段により精製し高純度の
この発明のペプチドα−hANPを得る。 次に実施例により、この発明をさらに具体的に
説明する。 実施例 1 ヒトの心房からのα−hANPの分離 死後10時間後にヒトの心房40gを摘出し、7倍
量の、20mM塩酸を含有する1M酢酸中で5分間
煮沸することにより内在するプロテアーゼを失活
せしめた。これを冷却した後、4℃においてポリ
トロンミキサーでホモジナイズすることにより抽
出を行つた。得られた抽出液を12000×Gで30分
間遠心分離を行い、上清200mlを得た。この上清
に12mlの氷酢酸を加えてその濃度を1規定濃度
(N)に調整した。この調整液に、アセトンを滴
加してその最終濃度を66%にすることによりアセ
トン沈澱を行い、次にこれを遠心分離することに
より424mlの上清を得た。得られた上清を減圧下
で濃縮乾固し、得られた残渣を100mlに1N酢酸溶
液に溶解し、そして50mlずつのエーテルで2回抽
出することにより脱脂した。得られた水層を凍結
乾燥し、凍結乾燥物を再度100mlの1N酢酸溶液に
溶解し、そしてこれを限外過(アミコン社製
UM−2を使用)することにより脱塩して50mlの
濃縮液を得た。この濃縮液を1N酢酸溶液で平衡
化したSP−Sephadex C−25(フアルマシア製,
8.0×22cm)でゲル過した。溶離液として1N酢
酸溶液、2Nピリジン溶液、及び2Nピリジン−
1N酢酸溶液(PH5.0)を用い、この順序で溶出を
行い、それぞれフラクシヨンSP−、SP−、
及びSP−を得た。このフラクシヨンSP−を
凍結乾燥することにより凍結乾燥物26.6mgを得、
これを1N酢酸溶液に溶解し、セフアデツクスG
−50によりゲル過(カラムサイズ1.2×103cm;
流速5.4ml/時間;フラクシヨンサイズ2ml)し
た。これにより、雛直腸標本弛緩活性を有するβ
画分(フラクシヨンNo.42〜45)及びα画分(フラ
クシヨンNo.46〜51)を得た。この溶出パターンを
第3図に示す。次に、このα画分を一緒にし陽イ
オン交換高速液体クロマトグラフイー(HPLC)
に付した。このクロマトグラフイーにおいては、
TSK−CM25W〔東洋曹達(株)製〕カラムを用い、
溶出溶媒として(A)10mM蟻酸アンモニウム(PH
6.6):アセトニトリル(90:10)、及び(B)1.0M蟻
酸アンモニウム(PH6.6):アセトニトリル(90:
10)を用い、直線グラジエント法により酢酸濃度
を10mMから0.5Mまで変化させて80分間溶出し、
唯一の雛直腸筋標本弛緩活性画分(フラクシヨン
No.57〜59を得た。次に、これを逆相HPLCに付し
た。このクロマトグラフイーにおいては、カラム
Chemcosorb 5ODSH(サイズ4.6×250mm)を使用
し、流速1.0ml/分、圧力110〜130Kg/cm2とし、
溶出溶媒として(A)水:アセトニトリル:10%トリ
フルオロ酢酸(90:10:1)、及び(B)水:アセト
ニトリル:10%トリフルオロ酢酸(40:60:1)
を使用した。(A)を8分間流した後、(A)から(B)への
直線グラジエント法で80分間溶出した。主要ピー
クを分取し、実質的に純粋なα−hANPを30μg
得た。 実施例 2 α−hANPの合成 アミノアシル樹脂 の合成 0.92ミリモル/g樹脂のクロル基を導入したク
ロロメチル樹脂3gを15mlのジメチルホルムアミ
ド中で撹拌し、これに1.22g(2.76ミリモル)の
Boc−Tyr(Cl2−Bzl)−OHと0.90g(2.76ミリモ
ル)の炭酸セシウムから調製した。 Boc−Tyr(Cl2−Bzl)−OHセシウム塩のジメ
チルホルムアミド溶液10mlを加え、ゆるやかに12
時間撹拌した。次に樹脂を取し、ジメチルホル
ムアミド、エタノール、水、エタノール及び塩化
メチレンにより記載の順序で洗浄し、そして乾燥
した。次に過剰の酢酸セシウムと共に、ジメチル
ホルムアミド中50℃にて24時間撹拌し、未反応の
残存クロル基をアセチル化し、そして前記のよう
に洗浄した。こうして樹脂1g当り0.7ミリモル
のBoc−Tyr(Cl2−Bzl)−OHが導入された。 樹脂3gを得た。なお、導入率はHF法、及び
HCl−プロピオン酸加水分解法により求めた。 保護α−hANP−樹脂の合成 各構成アミノ酸のα−アミノ基はすべてBoc基
で保護し、チロシンの水酸基はCl2−Bzl基で保護
し、アルギニンのグアニジノ基はTos基で保護
し、セリンの水酸基はBzl基で保護し、アスパラ
ギン酸のβ−カルボン酸基はO−Bzl基で保護し
た。また、システインのチオール基はAcm基で
保護した。これらの保護基の内、Boc基は50%ト
リフルオロ酢酸により容易に除去される。他の保
護基は50%トリフルオロ酢酸に対しては安定であ
るがAcm基を除き弗化水素により除去される。
システインのチオール保護基Acm基は50%トリ
フルオロ酢酸及び弗化水素に対して安定であり、
ヨウ素による酸化により除去され同時にスルフイ
ド結合が形成される。 保護アミノ酸の縮合に当つては、樹脂に結合し
ている保護ペプチドの末端アミノ基のアミノ保護
基、すなわちBoc基をまず除去して末端アミノ基
を遊離せしめた。この脱Boc基反応は、塩化メチ
レン中50%トリフルオロ酢酸により保護ペプチド
−樹脂を30分間処理することにより完全に進行し
た。この脱Boc基反応の進行、完結はカイザ−試
薬(ニンヒドリン試薬)により確認した。 このようにして保護ペプチド−樹脂の末端アミ
ノ酸のアミノ基を遊離せしめた後、この遊離アミ
ノ基を、α−hANPのアミノ酸配列における次に
位置するアミノ酸のBoc保護誘導体の遊離カルボ
キシル基と縮合せしめた。 この保護アミノ酸の縮合においては、Boc−
Asn−OHの縮合は、これを10当量用い24時間反
応せしめることによりp−ニトロフエノールエス
テル法に従つて行つた。そのほかのすべてのBoc
−アミノ酸は、その6当量を6当量のジシクロヘ
キシルカルボジイミド縮合剤と共に用いて縮合せ
しめた。この操作によつて反応が完了しない場合
は同じ操作を反復した。同じ操作を3回反復して
も反応が完結しない場合には、塩化メチレン中10
%無水酢酸−ピリジン(9:1)により10分間処
理して未反応のアミノ基をアセチル化し次のBoc
−アミノ酸の縮合操作に進んだ。なお上記の縮合
の進行及び完結も、脱Boc基反応の確認と同様に
カイザー試薬(ニンヒドリン試薬)により行つ
た。 このようにして、 樹脂(0.70ミリモル/g樹脂)3gから出発し
て、 樹脂6.6gを得た。 樹脂の切離し、脱保護、ペプチドの精製、及
びS−S結合の形成 前記のようにして得られた保護ペプチド−樹脂
3gを5mlのアニソールにより湿潤せしめ、そし
て0℃にて60分間弗化水素酸により処理し、次に
過剰の弗化水素酸を留去した。この処理により保
護ペプチドが樹脂から切断されると共に、チオー
ル保護基Acm以外の保護基が除去された。次に
200mlの1N酢酸を加えて30分間撹拌した後過す
ることにより樹脂を除去した。 次に液をエーテルで洗浄し、5%水酸化アン
モニウム溶液でPH8.0に調整し、そして2.3gのジ
チオスレイトールを加え40℃にて24時間インキユ
ベートすることにより還元を行つた。この還元操
作によりMet(O)体がほとんど還元されたこと
が逆相HPLCにより確認された。又、Ser又は
Thrを含むペプチドを弗化水素酸により処理した
ときに生じる可能性があるO−ペプチド結合も上
記の還元操作で正常なペプチド結合にもどる。 上記の反応液(約300ml)をオクターデカ−シ
リカ(ODS)を充填したカラム(φ4cm×5cm)
に吸着させ、水で洗浄し、次に60%アセトニトリ
ル水溶液でペプチドを溶出し、無機塩を含まない
ペプチド850mgを得た。次にこのペプチド650mgを
CM−セフアロースを用いるイオン交換クロマト
グラフイーにより精製した。すなわち、50mM酢
酸アンモニウム緩衝液(PH4.0)で平衡化たCM−
セフアロースカラム(φ1.5cm×75cm)に前記ペプ
チド試料を適用し、50mM酢酸アンモニウム(PH
4.0)500mlから0.5M酢酸アンモニウム(PH7.0)
500mlへの直線グラジエント法により溶出し、主
ピークを採取した。これをODSカラム(φ4cm×
5cm)を通して脱塩し、そして凍結乾燥すること
により逆相HPLCにおいてほぼ単一のペプチド
7,23Cys(Acm)−α−hANPを127mg(乾燥重
量)得た。 次に、6mlの酢酸及び1.6mlの水中50mg(乾燥
重量)の7,23Cys(Acm)−α−hANPの溶液
と、40mlの酢酸、18mlの水及び80μの1N塩酸中
170mgのヨウ素の溶液中に、一挙に加え、そして
激しく撹拌した。10分後、反応液が透明になるま
でL−アスコルビン酸緩衝液を加え、この反応液
を水で10倍に稀釈し、ODSカラム(φ4cm×5cm)
を通して脱塩し、そして凍結乾燥した。こうして
α−hANP、7,23Cys(Acm)−α−hANP、及
びMet(O)−7,23Cys(Acm)−α−hANPが約
3:1:1の比率で混在している粗凍結乾燥物
30.2mg(乾燥重量)を得た。 この粗凍結乾燥物17.2mgをTSK−CM 2 SW
〔東洋曹達(株)製〕を用いた陽イオン交換HPLCに
より前記の3成分に分離し(第4図)、α−
hANP画分を採取することにより約95%純度のα
−hANPを4.5mg得た。 得られたα−hANPをダウエツクス(酢酸
型)処理し、酢酸塩としたときの元素分析値を示
す。 (C127H203N45O39S3・5CH3COOH・8H2O) C H N 計算値 46.67 6.83 17.88 測定値 46.74 6.41 17.75 (D) 利尿剤の製造 前述のように、本発明のα−hANPは、他のペ
プチド系医薬と同様に、経口投与した場合消化管
内で分解されるので、注射薬として、静脈内、筋
肉内、皮下等に非経口的に投与することが好まし
い。しかし、リポゾーム中に抱容したマイクロカ
プセル剤にすれば、経口投与剤とすることも可能
であり、坐剤、舌下錠、点鼻スプレー剤等の形に
すれば、消化管以外の粘膜から吸収させることも
可能である。 次に、注射薬としての実施例を示す。なお、注
射薬として薬効が充分に維持されることを、ラツ
トを用いて確認した。 実施例 α−hANPの製剤化 パシトラシン含有生理食塩液製剤 α−hANP9.36nmoleを、パシトラシン5%
(w/v)を含む生理食塩液936μ1にて溶解し、
α−hANP濃度が10nmole/ml(30.92μg/ml)
の溶液を注射用製剤とした。 上記の製剤の10,20,40および100μ1を、8〜
10週令のラツトに頚静脈より注射筒を用いて急速
注入した。(N=7/群) その結果、尿量は10μ1群で222±44%に、20μ1
群で281±41%に、40μ1群で507±58%に、100μ1
群で433±34%増加し、利尿作用が証明された。 生理食塩液製剤 α−hANPを生理食塩液936μ1にて溶解し、α
−hANP濃度が1.5μg/mlの溶液を注射用製剤と
した。 上記の製剤を20μ1/minの速度で8週令のラツ
トに大腿静脈より1時間45分持続注入した(N=
1)結果、尿量が増加し、利尿作用が証明され
た。 凍結乾燥製剤 α−hANP1.0mgを0.1N酢酸水溶液にて溶解し、
この50μ1をポリスチレン試験管にとり凍結乾燥
した。 上記の凍結乾燥製剤(50μ1/tube)に0.5mlの
生理食塩液を加えて溶解し、この35μ1を生理食
塩液50μ1とともに10週令の(体重350g)のラツ
トに大腿静脈より注射筒を用いて急速注入した
(N=5)結果、尿量は1178%に増加し、利尿作
用が認められた。
ドα−hANPは顕著な利尿作用及びナトリウム利
尿作用を有する。すなわち、この発明のα−
hANPを0.4nモル投与した場合、その利尿作用及
びナトリウム利尿作用は公知の利尿剤であるフロ
セマイドを1.21μモル投与した場合のそれにほぼ
匹敵する。この投与量(0.4nモル)において、こ
の発明のα−hANPは尿排泄量を約20倍に増加せ
しめ、ナトリウムの排泄量を約27倍に増加せしめ
た。又、被験化合物を投与しない場合の尿中の
Na/K比がおよそ0.3であるのに対し、α−
hANPを0.4nモル投与した場合この比は約2.0に
上昇し、この発明のα−hANPがNaを選択的に
排泄するナトリウム利尿剤として有用であること
が示唆された。 さらに、被験物質を投与した後経時的に採尿し
て経過を観察した場合の結果は第1図のようであ
つた。この図から明らかなごとく、この発明のα
−hANPの利尿作用及びナトリウム利尿作用は公
知の利尿剤であるフロセミドのそれよりも急速に
生じた。 また、第2図に示す如く、この発明のα−
hANPを1.2μg(0.4nモル)投与した後、血圧は
緩かに15〜20mmHg降下し、約45分間持続した。
この結果によりα−hANPが血圧降下作用を有す
ることも明らかとなつた。 α−hANPの利尿剤としての適性 前記のごとくこの発明のペプチドα−hANPは
顕著な利尿作用及びナトリウム利尿作用を有す
る。 このペプチドは繰返し投与しても抗体産生を惹
起せず、アナフイラキシーシヨツクを起こさな
い。また、この発明のペプチドはL−アミノ酸の
みからなり、投与後、生体内の各種プロテアーゼ
により徐々に分解されるため毒作用をほとんど有
しない。 前記のごとく、α−hANPはng/Kgのオーダ
ーで効果を発揮し、毒性が非常に低いから、1n
g/Kg〜10mg/Kgの範囲で投与することができ、
10ng/Kg〜1mg/Kgの範囲で投与するのが好ま
しい。 この発明のα−hANPは、ペプチド系医薬の投
与に一般に使用されている投与方法、すなわち非
経口的投与方法、例えば静脈内投与、筋肉内投
与、皮下投与等によつて投与するのが好ましい。
経口投与した場合、α−hANPは消化管内で分解
を受けるためこの投与方法は一般的には効果的で
ないが、消化管内で分解を受けにくい製剤、例え
ば活性成分であるα−hANPをリポゾーム中に抱
容したマイクロカプセル剤として経口投与するこ
とも可能である。又、直腸、舌下、鼻内など消化
管以外の粘膜から吸収せしめる投与方法を採用す
ることも可能であり、この場合、例えば坐剤、舌
下錠、点鼻スプレー剤等の形で投与することがで
きる。 (C) α−hANPの製造方法 この発明のペプチドα−hANPは、ヒトの心房
組織を適当な酸性溶媒、例えば燐酸緩衝液、塩酸
含有酢酸等の中でホモジネートし、雛直腸標本弛
緩活性を指標として、遠心分離、等電沈澱、溶媒
抽出、限外過、ゲル過、吸着クロマトグラフ
イー等、ペプチドの精製に常用される各種処理を
適宜組合わせて分子量約3100のペプチドを分離す
ることにより得られる。 しかしながら、α−hANPを工業的規模で得る
には合成法を用いるのがより有利であることは言
うまでもない。この発明のペプチドα−hANP
は、ペプチドの合成に常用される固相法、又は液
相法によつて製造することができる。この合成
は、例えば、矢島治明、榊原俊平著、日本生化学
会編、生化学実験講座();蛋白質の化学、4
巻、208〜495頁、(株)東京化学同人発行(1977);
及び泉屋信夫ほか著、ペプチド合成、丸善(株)発行
(1975)に記載されているメリフイールド
(Merrifield)等の方法に準じて行うことができ
る。 例えば、メリフイールド等の固相合成法によつ
てα−hANPを合成することができる。この方法
を本発明に適用する場合、α−アミノ基はいずれ
のアミノ酸についてもtert−ブチルオキシカルボ
ニル基(Boc基)で保護し、チロシンの水酸基は
2,6−ジクロロベンジル基(Cl2−Bzl基)で、
アルギニンのグアニジノ基はトシル基(Tos基)
で、セリンの水酸基はベンジル基(Bzl基)で、
アスパラギン酸β−カルボン酸基はO−ベンジル
基(O−Bzl基)でそれぞれ保護するのが好適で
ある。まず、C末端アミノ酸であるチロシンの保
護誘導体Boc−Tyr(Cl2−Bzl)をクロロメチル
樹脂に導入し、以後順次アミノ酸鎖を延長し、保
護α−hANP−樹脂を合成し、これをフツ化水素
で処理することにより保護α−hANPを樹脂から
切断し、同時に脱保護し、そしてこれを還元する
ことによりCys7,23(Acm)−α−hANP(Acmはシ
ステインのチオール基を保護するアセトアミドメ
チル基である)を得る。次に、これをヨウ素で酸
化することによりチオール基を保護基Acmを脱
離せしめると同時に7位と23位のシステインのチ
オール基によるジスルフイド結合を形成せしめる
ことにより粗合成α−hANPを得る。得られた粗
合成α−hANPはゲル過、逆相HPLC等ペプチ
ドの精製に常用される手段により精製し高純度の
この発明のペプチドα−hANPを得る。 次に実施例により、この発明をさらに具体的に
説明する。 実施例 1 ヒトの心房からのα−hANPの分離 死後10時間後にヒトの心房40gを摘出し、7倍
量の、20mM塩酸を含有する1M酢酸中で5分間
煮沸することにより内在するプロテアーゼを失活
せしめた。これを冷却した後、4℃においてポリ
トロンミキサーでホモジナイズすることにより抽
出を行つた。得られた抽出液を12000×Gで30分
間遠心分離を行い、上清200mlを得た。この上清
に12mlの氷酢酸を加えてその濃度を1規定濃度
(N)に調整した。この調整液に、アセトンを滴
加してその最終濃度を66%にすることによりアセ
トン沈澱を行い、次にこれを遠心分離することに
より424mlの上清を得た。得られた上清を減圧下
で濃縮乾固し、得られた残渣を100mlに1N酢酸溶
液に溶解し、そして50mlずつのエーテルで2回抽
出することにより脱脂した。得られた水層を凍結
乾燥し、凍結乾燥物を再度100mlの1N酢酸溶液に
溶解し、そしてこれを限外過(アミコン社製
UM−2を使用)することにより脱塩して50mlの
濃縮液を得た。この濃縮液を1N酢酸溶液で平衡
化したSP−Sephadex C−25(フアルマシア製,
8.0×22cm)でゲル過した。溶離液として1N酢
酸溶液、2Nピリジン溶液、及び2Nピリジン−
1N酢酸溶液(PH5.0)を用い、この順序で溶出を
行い、それぞれフラクシヨンSP−、SP−、
及びSP−を得た。このフラクシヨンSP−を
凍結乾燥することにより凍結乾燥物26.6mgを得、
これを1N酢酸溶液に溶解し、セフアデツクスG
−50によりゲル過(カラムサイズ1.2×103cm;
流速5.4ml/時間;フラクシヨンサイズ2ml)し
た。これにより、雛直腸標本弛緩活性を有するβ
画分(フラクシヨンNo.42〜45)及びα画分(フラ
クシヨンNo.46〜51)を得た。この溶出パターンを
第3図に示す。次に、このα画分を一緒にし陽イ
オン交換高速液体クロマトグラフイー(HPLC)
に付した。このクロマトグラフイーにおいては、
TSK−CM25W〔東洋曹達(株)製〕カラムを用い、
溶出溶媒として(A)10mM蟻酸アンモニウム(PH
6.6):アセトニトリル(90:10)、及び(B)1.0M蟻
酸アンモニウム(PH6.6):アセトニトリル(90:
10)を用い、直線グラジエント法により酢酸濃度
を10mMから0.5Mまで変化させて80分間溶出し、
唯一の雛直腸筋標本弛緩活性画分(フラクシヨン
No.57〜59を得た。次に、これを逆相HPLCに付し
た。このクロマトグラフイーにおいては、カラム
Chemcosorb 5ODSH(サイズ4.6×250mm)を使用
し、流速1.0ml/分、圧力110〜130Kg/cm2とし、
溶出溶媒として(A)水:アセトニトリル:10%トリ
フルオロ酢酸(90:10:1)、及び(B)水:アセト
ニトリル:10%トリフルオロ酢酸(40:60:1)
を使用した。(A)を8分間流した後、(A)から(B)への
直線グラジエント法で80分間溶出した。主要ピー
クを分取し、実質的に純粋なα−hANPを30μg
得た。 実施例 2 α−hANPの合成 アミノアシル樹脂 の合成 0.92ミリモル/g樹脂のクロル基を導入したク
ロロメチル樹脂3gを15mlのジメチルホルムアミ
ド中で撹拌し、これに1.22g(2.76ミリモル)の
Boc−Tyr(Cl2−Bzl)−OHと0.90g(2.76ミリモ
ル)の炭酸セシウムから調製した。 Boc−Tyr(Cl2−Bzl)−OHセシウム塩のジメ
チルホルムアミド溶液10mlを加え、ゆるやかに12
時間撹拌した。次に樹脂を取し、ジメチルホル
ムアミド、エタノール、水、エタノール及び塩化
メチレンにより記載の順序で洗浄し、そして乾燥
した。次に過剰の酢酸セシウムと共に、ジメチル
ホルムアミド中50℃にて24時間撹拌し、未反応の
残存クロル基をアセチル化し、そして前記のよう
に洗浄した。こうして樹脂1g当り0.7ミリモル
のBoc−Tyr(Cl2−Bzl)−OHが導入された。 樹脂3gを得た。なお、導入率はHF法、及び
HCl−プロピオン酸加水分解法により求めた。 保護α−hANP−樹脂の合成 各構成アミノ酸のα−アミノ基はすべてBoc基
で保護し、チロシンの水酸基はCl2−Bzl基で保護
し、アルギニンのグアニジノ基はTos基で保護
し、セリンの水酸基はBzl基で保護し、アスパラ
ギン酸のβ−カルボン酸基はO−Bzl基で保護し
た。また、システインのチオール基はAcm基で
保護した。これらの保護基の内、Boc基は50%ト
リフルオロ酢酸により容易に除去される。他の保
護基は50%トリフルオロ酢酸に対しては安定であ
るがAcm基を除き弗化水素により除去される。
システインのチオール保護基Acm基は50%トリ
フルオロ酢酸及び弗化水素に対して安定であり、
ヨウ素による酸化により除去され同時にスルフイ
ド結合が形成される。 保護アミノ酸の縮合に当つては、樹脂に結合し
ている保護ペプチドの末端アミノ基のアミノ保護
基、すなわちBoc基をまず除去して末端アミノ基
を遊離せしめた。この脱Boc基反応は、塩化メチ
レン中50%トリフルオロ酢酸により保護ペプチド
−樹脂を30分間処理することにより完全に進行し
た。この脱Boc基反応の進行、完結はカイザ−試
薬(ニンヒドリン試薬)により確認した。 このようにして保護ペプチド−樹脂の末端アミ
ノ酸のアミノ基を遊離せしめた後、この遊離アミ
ノ基を、α−hANPのアミノ酸配列における次に
位置するアミノ酸のBoc保護誘導体の遊離カルボ
キシル基と縮合せしめた。 この保護アミノ酸の縮合においては、Boc−
Asn−OHの縮合は、これを10当量用い24時間反
応せしめることによりp−ニトロフエノールエス
テル法に従つて行つた。そのほかのすべてのBoc
−アミノ酸は、その6当量を6当量のジシクロヘ
キシルカルボジイミド縮合剤と共に用いて縮合せ
しめた。この操作によつて反応が完了しない場合
は同じ操作を反復した。同じ操作を3回反復して
も反応が完結しない場合には、塩化メチレン中10
%無水酢酸−ピリジン(9:1)により10分間処
理して未反応のアミノ基をアセチル化し次のBoc
−アミノ酸の縮合操作に進んだ。なお上記の縮合
の進行及び完結も、脱Boc基反応の確認と同様に
カイザー試薬(ニンヒドリン試薬)により行つ
た。 このようにして、 樹脂(0.70ミリモル/g樹脂)3gから出発し
て、 樹脂6.6gを得た。 樹脂の切離し、脱保護、ペプチドの精製、及
びS−S結合の形成 前記のようにして得られた保護ペプチド−樹脂
3gを5mlのアニソールにより湿潤せしめ、そし
て0℃にて60分間弗化水素酸により処理し、次に
過剰の弗化水素酸を留去した。この処理により保
護ペプチドが樹脂から切断されると共に、チオー
ル保護基Acm以外の保護基が除去された。次に
200mlの1N酢酸を加えて30分間撹拌した後過す
ることにより樹脂を除去した。 次に液をエーテルで洗浄し、5%水酸化アン
モニウム溶液でPH8.0に調整し、そして2.3gのジ
チオスレイトールを加え40℃にて24時間インキユ
ベートすることにより還元を行つた。この還元操
作によりMet(O)体がほとんど還元されたこと
が逆相HPLCにより確認された。又、Ser又は
Thrを含むペプチドを弗化水素酸により処理した
ときに生じる可能性があるO−ペプチド結合も上
記の還元操作で正常なペプチド結合にもどる。 上記の反応液(約300ml)をオクターデカ−シ
リカ(ODS)を充填したカラム(φ4cm×5cm)
に吸着させ、水で洗浄し、次に60%アセトニトリ
ル水溶液でペプチドを溶出し、無機塩を含まない
ペプチド850mgを得た。次にこのペプチド650mgを
CM−セフアロースを用いるイオン交換クロマト
グラフイーにより精製した。すなわち、50mM酢
酸アンモニウム緩衝液(PH4.0)で平衡化たCM−
セフアロースカラム(φ1.5cm×75cm)に前記ペプ
チド試料を適用し、50mM酢酸アンモニウム(PH
4.0)500mlから0.5M酢酸アンモニウム(PH7.0)
500mlへの直線グラジエント法により溶出し、主
ピークを採取した。これをODSカラム(φ4cm×
5cm)を通して脱塩し、そして凍結乾燥すること
により逆相HPLCにおいてほぼ単一のペプチド
7,23Cys(Acm)−α−hANPを127mg(乾燥重
量)得た。 次に、6mlの酢酸及び1.6mlの水中50mg(乾燥
重量)の7,23Cys(Acm)−α−hANPの溶液
と、40mlの酢酸、18mlの水及び80μの1N塩酸中
170mgのヨウ素の溶液中に、一挙に加え、そして
激しく撹拌した。10分後、反応液が透明になるま
でL−アスコルビン酸緩衝液を加え、この反応液
を水で10倍に稀釈し、ODSカラム(φ4cm×5cm)
を通して脱塩し、そして凍結乾燥した。こうして
α−hANP、7,23Cys(Acm)−α−hANP、及
びMet(O)−7,23Cys(Acm)−α−hANPが約
3:1:1の比率で混在している粗凍結乾燥物
30.2mg(乾燥重量)を得た。 この粗凍結乾燥物17.2mgをTSK−CM 2 SW
〔東洋曹達(株)製〕を用いた陽イオン交換HPLCに
より前記の3成分に分離し(第4図)、α−
hANP画分を採取することにより約95%純度のα
−hANPを4.5mg得た。 得られたα−hANPをダウエツクス(酢酸
型)処理し、酢酸塩としたときの元素分析値を示
す。 (C127H203N45O39S3・5CH3COOH・8H2O) C H N 計算値 46.67 6.83 17.88 測定値 46.74 6.41 17.75 (D) 利尿剤の製造 前述のように、本発明のα−hANPは、他のペ
プチド系医薬と同様に、経口投与した場合消化管
内で分解されるので、注射薬として、静脈内、筋
肉内、皮下等に非経口的に投与することが好まし
い。しかし、リポゾーム中に抱容したマイクロカ
プセル剤にすれば、経口投与剤とすることも可能
であり、坐剤、舌下錠、点鼻スプレー剤等の形に
すれば、消化管以外の粘膜から吸収させることも
可能である。 次に、注射薬としての実施例を示す。なお、注
射薬として薬効が充分に維持されることを、ラツ
トを用いて確認した。 実施例 α−hANPの製剤化 パシトラシン含有生理食塩液製剤 α−hANP9.36nmoleを、パシトラシン5%
(w/v)を含む生理食塩液936μ1にて溶解し、
α−hANP濃度が10nmole/ml(30.92μg/ml)
の溶液を注射用製剤とした。 上記の製剤の10,20,40および100μ1を、8〜
10週令のラツトに頚静脈より注射筒を用いて急速
注入した。(N=7/群) その結果、尿量は10μ1群で222±44%に、20μ1
群で281±41%に、40μ1群で507±58%に、100μ1
群で433±34%増加し、利尿作用が証明された。 生理食塩液製剤 α−hANPを生理食塩液936μ1にて溶解し、α
−hANP濃度が1.5μg/mlの溶液を注射用製剤と
した。 上記の製剤を20μ1/minの速度で8週令のラツ
トに大腿静脈より1時間45分持続注入した(N=
1)結果、尿量が増加し、利尿作用が証明され
た。 凍結乾燥製剤 α−hANP1.0mgを0.1N酢酸水溶液にて溶解し、
この50μ1をポリスチレン試験管にとり凍結乾燥
した。 上記の凍結乾燥製剤(50μ1/tube)に0.5mlの
生理食塩液を加えて溶解し、この35μ1を生理食
塩液50μ1とともに10週令の(体重350g)のラツ
トに大腿静脈より注射筒を用いて急速注入した
(N=5)結果、尿量は1178%に増加し、利尿作
用が認められた。
第1図は利尿作用及びナトリウム利尿作用の経
時変化を示し、第2図はこの発明のα−hANPの
血圧降下作用を示すチヤート図であり、第3図は
心房からα−hANPを分離する場合のα成分とβ
成分の分離を示すクロマトグラムであり、そして
第4図はα−hANPの化学合成の最後段階におけ
るS−S体(α−hANP)の分離を示すクロマト
グラムである。
時変化を示し、第2図はこの発明のα−hANPの
血圧降下作用を示すチヤート図であり、第3図は
心房からα−hANPを分離する場合のα成分とβ
成分の分離を示すクロマトグラムであり、そして
第4図はα−hANPの化学合成の最後段階におけ
るS−S体(α−hANP)の分離を示すクロマト
グラムである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 次の構造式() (式中とは直接に結合している) で表わされるペプチド、及びその酸付加塩。 2 次の構造式()、 (式中とは直接に結合している) で表わされるペプチド又はその酸付加塩を含んで
成る利尿剤。
Priority Applications (12)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP58243675A JPS60136596A (ja) | 1983-12-26 | 1983-12-26 | ペプチド及びこれを有効成分とする利尿剤 |
EP84308974A EP0147193B1 (en) | 1983-12-26 | 1984-12-20 | Peptide production and use thereof |
AT84308974T ATE62252T1 (de) | 1983-12-26 | 1984-12-20 | Herstellung von peptiden und deren verwendung. |
EP19900201387 EP0398451A1 (en) | 1983-12-26 | 1984-12-20 | Vasorelaxant substance obtainable from human atrium |
DE8484308974T DE3484391D1 (de) | 1983-12-26 | 1984-12-20 | Herstellung von peptiden und deren verwendung. |
US06/685,151 US5354900A (en) | 1983-12-26 | 1984-12-21 | An H-ANP peptide, pharmaceutical composition and method of use |
CA000470937A CA1245635A (en) | 1983-12-26 | 1984-12-21 | .alpha.-HUMAN ATRIAL NATRIURETIC POLYPEPTIDE AND PHARMACEUTICAL USE THEREOF |
DK624884A DK170618B1 (da) | 1983-12-26 | 1984-12-21 | Alfa-Humant atrium-natriuretisk polypeptid, fremgangsmåde til fremstilling af polypeptidet og diuretisk præparat eller hypotensorpræparat indeholdende polypeptidet |
ZA8410044A ZA8410044B (en) | 1983-12-26 | 1984-12-21 | Peptide production and use thereof |
AU37133/84A AU578057B2 (en) | 1983-12-26 | 1984-12-24 | Alpha-human atrial natriuretic polypeptide |
NZ210750A NZ210750A (en) | 1983-12-26 | 1985-01-04 | Naturetic peptide #a#-lanp |
US06/905,968 US4748232A (en) | 1983-12-26 | 1986-09-11 | Peptide production and use thereof |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP58243675A JPS60136596A (ja) | 1983-12-26 | 1983-12-26 | ペプチド及びこれを有効成分とする利尿剤 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS60136596A JPS60136596A (ja) | 1985-07-20 |
JPS6319520B2 true JPS6319520B2 (ja) | 1988-04-22 |
Family
ID=17107313
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP58243675A Granted JPS60136596A (ja) | 1983-12-26 | 1983-12-26 | ペプチド及びこれを有効成分とする利尿剤 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US5354900A (ja) |
EP (2) | EP0147193B1 (ja) |
JP (1) | JPS60136596A (ja) |
AT (1) | ATE62252T1 (ja) |
AU (1) | AU578057B2 (ja) |
CA (1) | CA1245635A (ja) |
DE (1) | DE3484391D1 (ja) |
DK (1) | DK170618B1 (ja) |
NZ (1) | NZ210750A (ja) |
ZA (1) | ZA8410044B (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0771875A1 (en) | 1990-07-13 | 1997-05-07 | Suntory Limited | Porcine CNP gene and precursor protein |
Families Citing this family (27)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0116784B1 (en) * | 1982-02-22 | 1992-06-10 | Queen's University At Kingston | Atrial natriuretic factor |
AU572173B2 (en) * | 1983-08-29 | 1988-05-05 | Institut De Recherches Cliniques De Montreal | Natriuretic factors |
JPS60184098A (ja) * | 1984-03-02 | 1985-09-19 | Suntory Ltd | 新規なペプチド及びこれを有効成分とする利尿剤 |
AU600652B2 (en) * | 1984-06-08 | 1990-08-23 | Hisayuki Matsuo | Human atrial natriuretic peptide and gene encoding same |
JPH0672155B2 (ja) * | 1984-08-24 | 1994-09-14 | 塩野義製薬株式会社 | α−hANP抗血清作製用ポリペプチド |
JPH0672157B2 (ja) * | 1984-08-29 | 1994-09-14 | 味の素株式会社 | 新規ペプチド |
DE3443257A1 (de) * | 1984-11-28 | 1986-05-28 | Bissendorf Peptide GmbH, 3002 Wedemark | Mittel enthaltend vollsynthetisches alpha-humanes atriales natriuretisches peptid (alpha-hanap) |
IT1216865B (it) | 1987-02-03 | 1990-03-14 | Eniricerche Spa | Derivato argininico, procedimento per la sua preparazione e suo impiego nelle sintesi peptidiche. |
US5461142A (en) * | 1987-11-07 | 1995-10-24 | Pharma Bissendorf Peptide Gmbh | Phosphorylated derivatives of cardiodilatin/ANF peptides |
US5204327A (en) * | 1988-11-18 | 1993-04-20 | Ashi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha | Treatment of cerebral edema with anp pharmaceutical compositions |
JP2925391B2 (ja) * | 1992-01-09 | 1999-07-28 | サントリー株式会社 | Ards治療用医薬組成物 |
WO2000018422A1 (fr) * | 1998-09-28 | 2000-04-06 | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | Promoteurs de secretion lacrymale ou gouttes ophtalmologiques contenant des peptides natriuretiques comme principes actifs pour traiter la keratoconjonctivite |
US6689566B1 (en) | 1999-01-14 | 2004-02-10 | Scantibodies Laboratory, Inc. | Methods, kits, and antibodies for detecting parathyroid hormone |
US7820393B2 (en) * | 1999-01-14 | 2010-10-26 | Scantibodies Laboratory, Inc. | Methods, kits and antibodies for detecting parathyroid hormone |
US20040266673A1 (en) * | 2002-07-31 | 2004-12-30 | Peter Bakis | Long lasting natriuretic peptide derivatives |
US7601691B2 (en) * | 1999-05-17 | 2009-10-13 | Conjuchem Biotechnologies Inc. | Anti-obesity agents |
CA2405557C (en) | 2000-04-12 | 2013-09-24 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
IL145926A0 (en) | 2001-10-15 | 2002-07-25 | Mor Research Applic Ltd | Peptide epitopes of mimotopes useful in immunomodulation |
US20080194481A1 (en) * | 2001-12-21 | 2008-08-14 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin Fusion Proteins |
IL155136A0 (en) | 2003-02-10 | 2003-10-31 | Enzymotec Ltd | A composition for reducing blood cholesterol and triglycerides |
US20060233863A1 (en) | 2003-02-10 | 2006-10-19 | Enzymotec Ltd. | Oils enriched with diacylglycerols and phytosterol esters and unit dosage forms thereof for use in therapy |
EP1776159A1 (en) * | 2004-08-09 | 2007-04-25 | Enzymotec Ltd. | Food products for diabetics |
JP5118965B2 (ja) | 2004-08-10 | 2013-01-16 | エンジモテック リミテッド | 植物成分を必要とする治療方法 |
US20100129288A1 (en) * | 2005-06-28 | 2010-05-27 | Elior Peles | Gliomedin, Fragments Thereof and Methods of Using Same |
BRPI0712383A2 (pt) | 2006-06-07 | 2012-07-10 | Human Genome Sciences Inc | proteìnas de fusão da albumina |
US20090099074A1 (en) * | 2007-01-10 | 2009-04-16 | Conjuchem Biotechnologies Inc. | Modulating food intake |
WO2008142693A2 (en) * | 2007-05-22 | 2008-11-27 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Regulation of myelination by nectin-like (necl) molecules |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS60105697A (ja) * | 1983-08-29 | 1985-06-11 | インステイテユト ドウ ルシエルシユ クリニツク ドウ モントリオ−ル | ペプチド及びその製造方法並びに該ペプチドを含有する医薬 |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0116784B1 (en) * | 1982-02-22 | 1992-06-10 | Queen's University At Kingston | Atrial natriuretic factor |
AU572173B2 (en) * | 1983-08-29 | 1988-05-05 | Institut De Recherches Cliniques De Montreal | Natriuretic factors |
US4496544A (en) * | 1983-11-10 | 1985-01-29 | Washington University | Atrial Peptides |
DE3346953A1 (de) * | 1983-12-24 | 1985-08-14 | Organogen Medizinisch-Molekularbiologische Forschungsgesellschaft mbH, 6900 Heidelberg | Cardiodilatin, ein neues peptidhormon und verfahren zu seiner herstellung |
US4508712A (en) * | 1984-01-10 | 1985-04-02 | Washington University | Atrial peptide |
JPS60184098A (ja) * | 1984-03-02 | 1985-09-19 | Suntory Ltd | 新規なペプチド及びこれを有効成分とする利尿剤 |
AU4292785A (en) * | 1984-04-24 | 1985-11-15 | Salk Institute For Biological Studies, The | Atrial peptide analogs |
DE3443257A1 (de) * | 1984-11-28 | 1986-05-28 | Bissendorf Peptide GmbH, 3002 Wedemark | Mittel enthaltend vollsynthetisches alpha-humanes atriales natriuretisches peptid (alpha-hanap) |
-
1983
- 1983-12-26 JP JP58243675A patent/JPS60136596A/ja active Granted
-
1984
- 1984-12-20 AT AT84308974T patent/ATE62252T1/de not_active IP Right Cessation
- 1984-12-20 EP EP84308974A patent/EP0147193B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-12-20 EP EP19900201387 patent/EP0398451A1/en not_active Withdrawn
- 1984-12-20 DE DE8484308974T patent/DE3484391D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-12-21 DK DK624884A patent/DK170618B1/da active IP Right Grant
- 1984-12-21 CA CA000470937A patent/CA1245635A/en not_active Expired
- 1984-12-21 US US06/685,151 patent/US5354900A/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-12-21 ZA ZA8410044A patent/ZA8410044B/xx unknown
- 1984-12-24 AU AU37133/84A patent/AU578057B2/en not_active Expired
-
1985
- 1985-01-04 NZ NZ210750A patent/NZ210750A/en unknown
-
1986
- 1986-09-11 US US06/905,968 patent/US4748232A/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS60105697A (ja) * | 1983-08-29 | 1985-06-11 | インステイテユト ドウ ルシエルシユ クリニツク ドウ モントリオ−ル | ペプチド及びその製造方法並びに該ペプチドを含有する医薬 |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0771875A1 (en) | 1990-07-13 | 1997-05-07 | Suntory Limited | Porcine CNP gene and precursor protein |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
NZ210750A (en) | 1991-05-28 |
AU3713384A (en) | 1985-07-04 |
EP0398451A1 (en) | 1990-11-22 |
EP0147193A3 (en) | 1987-08-12 |
EP0147193B1 (en) | 1991-04-03 |
AU578057B2 (en) | 1988-10-13 |
DK170618B1 (da) | 1995-11-13 |
DK624884A (da) | 1985-06-27 |
DK624884D0 (da) | 1984-12-21 |
US5354900A (en) | 1994-10-11 |
DE3484391D1 (de) | 1991-05-08 |
ATE62252T1 (de) | 1991-04-15 |
US4748232A (en) | 1988-05-31 |
EP0147193A2 (en) | 1985-07-03 |
JPS60136596A (ja) | 1985-07-20 |
CA1245635A (en) | 1988-11-29 |
ZA8410044B (en) | 1985-08-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JPS6319520B2 (ja) | ||
EP0477885B1 (en) | Parathyroid hormone derivatives | |
WO1994020534A1 (en) | Vasonatrin peptide and analogs thereof | |
US5049654A (en) | Calcitonin gene related peptide derivatives | |
US4656158A (en) | Peptide, and production and use thereof | |
JPH0273100A (ja) | 医薬用化合物 | |
JP2544929B2 (ja) | 新規生理活性ペプチド | |
EP0283956B1 (en) | Fluorine containing atrial natriuretic peptides | |
JPH0794473B2 (ja) | 新規なペプチド及びこれを有効成分とする利尿剤 | |
RU2067586C1 (ru) | Производные вазотоцина | |
IE53488B1 (en) | Crf and analogues | |
EP0300737B1 (en) | Calcitonin gene related peptide derivatives | |
JP3025672B2 (ja) | 新規生理活性ペプチド及びその用途 | |
JP2883903B2 (ja) | 新規生理活性ペプチド及びその用途 | |
US7211380B1 (en) | Physiologically active polypeptide and DNA | |
JP3264439B2 (ja) | 新規生理活性ペプチド及びその用途 | |
JPS6120560B2 (ja) | ||
JPH0477760B2 (ja) | ||
JP3258639B2 (ja) | 新規生理活性ペプチド及びその用途 | |
JPH0676436B2 (ja) | 新規な生理活性ペプチド | |
JP2714430B2 (ja) | Na,K―ATPase阻害作用を有する新規ペプタイド | |
JPS617298A (ja) | 新規なペプチド及びこれを有効成分とする医薬 | |
JPH0678356B2 (ja) | カルシトニン遺伝子関連ペプチド誘導体 | |
JPH0377899A (ja) | ナトリウム排泄亢進性ペプチド化合物 | |
JPS6110598A (ja) | ペプチド化合物 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090422 Year of fee payment: 21 |