JP3258639B2 - 新規生理活性ペプチド及びその用途 - Google Patents
新規生理活性ペプチド及びその用途Info
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- JP3258639B2 JP3258639B2 JP12166699A JP12166699A JP3258639B2 JP 3258639 B2 JP3258639 B2 JP 3258639B2 JP 12166699 A JP12166699 A JP 12166699A JP 12166699 A JP12166699 A JP 12166699A JP 3258639 B2 JP3258639 B2 JP 3258639B2
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- Japan
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- group
- peptide
- tbu
- ser
- gly
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- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は新規な生理活性ペプ
チド及びその用途に関し、更に詳細には、ヒト型脳性ナ
トリウム利尿ペプチド及びこれを含有する高血圧症、浮
腫性疾患、心不全、腎不全等の循環器系疾患治療剤に関
する。
チド及びその用途に関し、更に詳細には、ヒト型脳性ナ
トリウム利尿ペプチド及びこれを含有する高血圧症、浮
腫性疾患、心不全、腎不全等の循環器系疾患治療剤に関
する。
【０００２】
【従来の技術】最近、ブタ脳からペプチドが単離、構造
決定され、その構造及び生理活性作用が心房性ナトリウ
ム利尿ペプチド（以下ANPと略す）とよく似ていること
から、脳性ナトリウム利尿ペプチド（Brain Natriureti
c Peptide；以下BNPと略す）と命名された〔須藤ら，Na
ture，332，78-80(1988)〕。BNPは生体の体液容量、電
解質バランス及び血圧の調節に関与しており、これによ
り生体ではANPとBNPによる２重の調節機構が存在するこ
とが示された。
決定され、その構造及び生理活性作用が心房性ナトリウ
ム利尿ペプチド（以下ANPと略す）とよく似ていること
から、脳性ナトリウム利尿ペプチド（Brain Natriureti
c Peptide；以下BNPと略す）と命名された〔須藤ら，Na
ture，332，78-80(1988)〕。BNPは生体の体液容量、電
解質バランス及び血圧の調節に関与しており、これによ
り生体ではANPとBNPによる２重の調節機構が存在するこ
とが示された。
【０００３】一方、このブタBNPのcDNAがクローニング
され、ブタBNPの前駆体の構造が明らかにされている
〔前川ら；Biochem. Biophys. Res. Commun., 157(1),
410-416(1988)〕。更にこのブタBNPのcDNAをプローブと
してヒトBNPのcDNAがクローニングされ、その構造解析
によりヒトBNPのアミノ酸配列が推定されている。
され、ブタBNPの前駆体の構造が明らかにされている
〔前川ら；Biochem. Biophys. Res. Commun., 157(1),
410-416(1988)〕。更にこのブタBNPのcDNAをプローブと
してヒトBNPのcDNAがクローニングされ、その構造解析
によりヒトBNPのアミノ酸配列が推定されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ヒトBN
Pが単離もしくは合成された報告はなく、どのような作
用あるいは活性を有しているのか不明である。従ってこ
のヒトBNPを合成し、その生物活性を公知のナトリウム
利尿ペプチドと比較し、その有用性を探索することは、
医薬品開発上、抗体産生等の副作用を回避する意味で重
要である。
Pが単離もしくは合成された報告はなく、どのような作
用あるいは活性を有しているのか不明である。従ってこ
のヒトBNPを合成し、その生物活性を公知のナトリウム
利尿ペプチドと比較し、その有用性を探索することは、
医薬品開発上、抗体産生等の副作用を回避する意味で重
要である。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記ヒト
BNPのアミノ酸配列の推定に基づき、新規物質であるヒ
トBNP誘導体を合成し、その薬理作用についてさらに検
討を進めたところ、これらの物質が既知のナトリウム利
尿ペプチドが有する平滑筋弛緩作用、ナトリウム利尿作
用を有することを見出し、本発明を完成した。
BNPのアミノ酸配列の推定に基づき、新規物質であるヒ
トBNP誘導体を合成し、その薬理作用についてさらに検
討を進めたところ、これらの物質が既知のナトリウム利
尿ペプチドが有する平滑筋弛緩作用、ナトリウム利尿作
用を有することを見出し、本発明を完成した。
【０００６】すなわち本発明は、式(1)
【０００７】
【化２】
【０００８】で表わされる生理活性ペプチド又はその
塩、及びこれを含有する循環器系疾患治療剤を提供する
ものである。
塩、及びこれを含有する循環器系疾患治療剤を提供する
ものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明において、ＸがH-Gly-Ser-
Gly-であるペプチド(1)をヒトBNP-26と称し、ＸがH-Ser
-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly-であるペプチド(1)
をヒトBNP-32と称することがある。
Gly-であるペプチド(1)をヒトBNP-26と称し、ＸがH-Ser
-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly-であるペプチド(1)
をヒトBNP-32と称することがある。
【００１０】なお、本明細書において、ペプチド中の略
称は、当該分野において一般に使用されるものであり、
次の意味を有する。
称は、当該分野において一般に使用されるものであり、
次の意味を有する。
【００１１】 Asp：L-アスパラギン酸 Ser：L-セリン Gly：グリシン Cys：L-システイン Phe：L-フェニルアラニン Arg：L-アルギニン Leu：L-ロイシン Ile：L-イソロイシン Asn：L-アスパラギン Val：L-バリン Tyr：L-チロシン
【００１２】本発明のペプチド(1)は、ペプチド合成に
常用される固相法又は液相法〔例えば、泉屋信夫ら著
「ペプチド合成」1984年，丸善（株）発行；日本化学会
編「生化学実験講座(Ｉ)／タンパク質の化学」４巻，20
8〜495頁，1977年，東京化学同人発行等〕によって製造
することができる。
常用される固相法又は液相法〔例えば、泉屋信夫ら著
「ペプチド合成」1984年，丸善（株）発行；日本化学会
編「生化学実験講座(Ｉ)／タンパク質の化学」４巻，20
8〜495頁，1977年，東京化学同人発行等〕によって製造
することができる。
【００１３】例えば固相法によって本発明ペプチド(1)
を合成する場合、使用するアミノ酸のα-アミノ基は9-
フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Fmoc基）、ア
スパラギン酸のβ-カルボキシル基はtert-ブチル基（tB
u基）、アルギニンのグアニジノ基は4-メトキシ-2,3,6-
トリメチルベンゼンスルホニル基（Mtr基）、セリンの
水酸基はtert-ブチル基（tBu基）、システインのチオー
ル基はアセトアミドメチル基（Acm基）、ヒスチジンの
イミダゾール基はトリチル基（Trt基）、リジンのε-ア
ミノ基はtert-ブチルオキシカルボニル基（Boc基）で保
護することが好ましい。また、使用する不溶性樹脂は、
p-アルコキシベンジルアルコール樹脂（Wang Resin）が
好ましい。保護アミノ酸の縮合はジシクロヘキシルカル
ボジイミド（DCC）法、1,3-ジイソプロピルカルボジイ
ミド（DIC）による活性エステル法、DCCによる酸無水物
法、ジフェニルリン酸アジド法（DPPA）法等を用いるの
が好ましい。しかし、アミノ酸の保護基は上記のものに
限定されるものではなく、例えば使用するアミノ酸のα
-アミノ基はtert-ブチルオキシカルボニル基（Boc基）
で保護してもよい。
を合成する場合、使用するアミノ酸のα-アミノ基は9-
フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Fmoc基）、ア
スパラギン酸のβ-カルボキシル基はtert-ブチル基（tB
u基）、アルギニンのグアニジノ基は4-メトキシ-2,3,6-
トリメチルベンゼンスルホニル基（Mtr基）、セリンの
水酸基はtert-ブチル基（tBu基）、システインのチオー
ル基はアセトアミドメチル基（Acm基）、ヒスチジンの
イミダゾール基はトリチル基（Trt基）、リジンのε-ア
ミノ基はtert-ブチルオキシカルボニル基（Boc基）で保
護することが好ましい。また、使用する不溶性樹脂は、
p-アルコキシベンジルアルコール樹脂（Wang Resin）が
好ましい。保護アミノ酸の縮合はジシクロヘキシルカル
ボジイミド（DCC）法、1,3-ジイソプロピルカルボジイ
ミド（DIC）による活性エステル法、DCCによる酸無水物
法、ジフェニルリン酸アジド法（DPPA）法等を用いるの
が好ましい。しかし、アミノ酸の保護基は上記のものに
限定されるものではなく、例えば使用するアミノ酸のα
-アミノ基はtert-ブチルオキシカルボニル基（Boc基）
で保護してもよい。
【００１４】固相法による本発明ペプチド(1)の製造
は、例えば以下のようにして行なわれる。まずＣ末端ア
ミノ酸であるHisの保護誘導体Fmoc-His(Trt)-OHをp-ア
ルコキシベンジルアルコール樹脂に導入し、以後対応す
る保護アミノ酸を順次結合させ、保護ペプチド樹脂を合
成する。次いで、ピペリジン及びトリフルオロ酢酸（TF
A）による処理、ピペリジン及びトリメチルシリルブロ
マイド（TMSBr）による処理〔Chem. Pharm. Bull., 35
(9), 3880(1987)〕等により、樹脂からのペプチドの切
断とAcm基以外の保護基の除去を同時に行ない、システ
インのチオール基にAcm基を有するペプチド〔CYS(Acm)-
ペプチド〕を得る。次にこれをヨウ素で酸化することに
より、チオールの保護基を脱離させると同時に、ペプチ
ド分子内の２つのシステインのチオール基によるジスル
フィド結合を形成させることにより、粗合成ペプチドを
得る。
は、例えば以下のようにして行なわれる。まずＣ末端ア
ミノ酸であるHisの保護誘導体Fmoc-His(Trt)-OHをp-ア
ルコキシベンジルアルコール樹脂に導入し、以後対応す
る保護アミノ酸を順次結合させ、保護ペプチド樹脂を合
成する。次いで、ピペリジン及びトリフルオロ酢酸（TF
A）による処理、ピペリジン及びトリメチルシリルブロ
マイド（TMSBr）による処理〔Chem. Pharm. Bull., 35
(9), 3880(1987)〕等により、樹脂からのペプチドの切
断とAcm基以外の保護基の除去を同時に行ない、システ
インのチオール基にAcm基を有するペプチド〔CYS(Acm)-
ペプチド〕を得る。次にこれをヨウ素で酸化することに
より、チオールの保護基を脱離させると同時に、ペプチ
ド分子内の２つのシステインのチオール基によるジスル
フィド結合を形成させることにより、粗合成ペプチドを
得る。
【００１５】得られた粗合成ペプチドの精製は、常法、
例えばゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、逆相
高速液体クロマトグラフィー（HPLC）等により行うこと
ができる。
例えばゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、逆相
高速液体クロマトグラフィー（HPLC）等により行うこと
ができる。
【００１６】なお、本発明ペプチド(1)は、塩酸、硫
酸、燐酸等の無機酸や蟻酸、酢酸、クエン酸、酒石酸、
フマル酸、マレイン酸等の有機酸を用いて、常法に従っ
て酸付加塩とすることができる。
酸、燐酸等の無機酸や蟻酸、酢酸、クエン酸、酒石酸、
フマル酸、マレイン酸等の有機酸を用いて、常法に従っ
て酸付加塩とすることができる。
【００１７】本発明のペプチド又はその塩の投与に際し
ては、ペプチド系医薬の投与に使用されている方法、す
なわち静脈注射、筋肉内注射、皮下注射、あるいは舌下
投与、鼻内投与、直腸投与を採用することができる。ま
たこのペプチドを危険な又は有害な副作用を生じさせる
ことなく投与できる量は、0.5μg/kg〜100mg/kgの範囲
が好ましい。
ては、ペプチド系医薬の投与に使用されている方法、す
なわち静脈注射、筋肉内注射、皮下注射、あるいは舌下
投与、鼻内投与、直腸投与を採用することができる。ま
たこのペプチドを危険な又は有害な副作用を生じさせる
ことなく投与できる量は、0.5μg/kg〜100mg/kgの範囲
が好ましい。
【００１８】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１９】実施例１ 〔Ａ〕ペプチドヒトBNP-26及びヒトBNP-32の合成：
【００２０】(1) 保護ペプチド樹脂の合成 保護ペプチド樹脂の合成においては、各構成アミノ酸の
α-アミノ基はすべて9-フルオレニルメチルオキシカル
ボニル基（Fmoc基）で保護し、活性な側鎖のうち、アス
パラギン酸のβ-カルボキシル基はtert-ブチル基（tBu
基）で、アルギニンのグアニジノ基は4-メトキシ-2,3,6
-トリメチルベンゼンスルホニル基（Mtr基）で、セリン
の水酸基はtert-ブチル基（tBu基）で、システインのチ
オール基はアセトアミドメチル基（Acm基）で、ヒスチ
ジンのイミダゾール基はトリチル基（Trt基）で、リジ
ンのε-アミノ基はtert-ブチルオキシカルボニル基（BO
C基）で保護した。また、樹脂としては、保護Hisを導入
したｐ-アルコキシベンジルアルコール樹脂1.0gを用い
た。
α-アミノ基はすべて9-フルオレニルメチルオキシカル
ボニル基（Fmoc基）で保護し、活性な側鎖のうち、アス
パラギン酸のβ-カルボキシル基はtert-ブチル基（tBu
基）で、アルギニンのグアニジノ基は4-メトキシ-2,3,6
-トリメチルベンゼンスルホニル基（Mtr基）で、セリン
の水酸基はtert-ブチル基（tBu基）で、システインのチ
オール基はアセトアミドメチル基（Acm基）で、ヒスチ
ジンのイミダゾール基はトリチル基（Trt基）で、リジ
ンのε-アミノ基はtert-ブチルオキシカルボニル基（BO
C基）で保護した。また、樹脂としては、保護Hisを導入
したｐ-アルコキシベンジルアルコール樹脂1.0gを用い
た。
【００２１】保護アミノ酸の縮合にあたっては、樹脂に
結合している保護ペプチドの末端のアミノ基の保護基で
あるFmoc基をピペリジンで室温下６分間処理することを
２回繰り返し、ほぼ完全に除去した。ついでこの脱Fmoc
化で遊離したアミノ基を目的のペプチドのアミノ酸配列
における次に位置するアミノ酸のFmoc保護誘導体のカル
ボキシル基と縮合した。この保護アミノ酸の縮合におい
ては、Fmoc-アミノ酸１mmolを1-ヒドロキシベンズトリ
アゾールの存在下、1,3-ジイソプロピルカルボジイミド
（DIC）と処理することにより縮合した。この操作によ
って反応が完結してしない場合は、同じ操作を繰り返し
た。なお、反応の進行及び完結はニンヒドリンによるカ
イザーテストでモニターした。
結合している保護ペプチドの末端のアミノ基の保護基で
あるFmoc基をピペリジンで室温下６分間処理することを
２回繰り返し、ほぼ完全に除去した。ついでこの脱Fmoc
化で遊離したアミノ基を目的のペプチドのアミノ酸配列
における次に位置するアミノ酸のFmoc保護誘導体のカル
ボキシル基と縮合した。この保護アミノ酸の縮合におい
ては、Fmoc-アミノ酸１mmolを1-ヒドロキシベンズトリ
アゾールの存在下、1,3-ジイソプロピルカルボジイミド
（DIC）と処理することにより縮合した。この操作によ
って反応が完結してしない場合は、同じ操作を繰り返し
た。なお、反応の進行及び完結はニンヒドリンによるカ
イザーテストでモニターした。
【００２２】このようにして、Fmoc-Gly-Ser(tBu)-Gly-
Cys(Acm)-Phe-Gly-Arg(Mtr)-Lys(Boc)-Met-Asp(tBu)-Ar
g(Mtr)-Ile-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly
-Leu-Gly-Cys(Acm)-Lys(Boc)-Val-Leu-Arg(Mtr)-Arg(Mt
r)-His(Trt)-樹脂を合成した。この段階でこのものを一
部取り出し、前述の方法に従って保護ペプチドの末端の
アミノ基の保護基であるFmoc基を除去し、H-Gly-Ser(tB
u)-Gly-Cys(Acm)-Phe-Gly-Arg(Mtr)-Lys(Boc)-Met-Asp
(tBu)-Arg(Mtr)-Ile-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser
(tBu)-Gly-Leu-Gly-Cys(Acm)-Lys(Boc)-Val-Leu-Arg(Mt
r)-Arg(Mtr)-His(Trt)-樹脂（以下、保護ヒトBNP-26樹
脂という）を670mg得た。
Cys(Acm)-Phe-Gly-Arg(Mtr)-Lys(Boc)-Met-Asp(tBu)-Ar
g(Mtr)-Ile-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly
-Leu-Gly-Cys(Acm)-Lys(Boc)-Val-Leu-Arg(Mtr)-Arg(Mt
r)-His(Trt)-樹脂を合成した。この段階でこのものを一
部取り出し、前述の方法に従って保護ペプチドの末端の
アミノ基の保護基であるFmoc基を除去し、H-Gly-Ser(tB
u)-Gly-Cys(Acm)-Phe-Gly-Arg(Mtr)-Lys(Boc)-Met-Asp
(tBu)-Arg(Mtr)-Ile-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser
(tBu)-Gly-Leu-Gly-Cys(Acm)-Lys(Boc)-Val-Leu-Arg(Mt
r)-Arg(Mtr)-His(Trt)-樹脂（以下、保護ヒトBNP-26樹
脂という）を670mg得た。
【００２３】残りをさらにＮ端延長の反応にかけ、Fmoc
-Ser(tBu)-Pro-Lys(Boc)-Met-Val-Gln-Gly-Ser(tBu)-Gl
y-Cys(Acm)-Phe-Gly-Arg(Mtr)-Lys(Boc)-Met-Asp(tBu)-
Arg(Mtr)-Ile-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-G
ly-Leu-Gly-Cys(Acm)-Lys(Boc)-Val-Leu-Arg(Mtr)-Arg
(Mtr)-His(Trt)-樹脂を得た。次いで前述の方法に従っ
て保護ペプチドの末端のアミノ基の保護基であるFmoc基
を除去し、H-Ser(tBu)-Pro-Lys(Boc)-Met-Val-Gln-Gly-
Ser(tBu)-Gly-Cys(Acm)-Phe-Gly-Arg(Mtr)-Lys(Boc)-Me
t-Asp(tBu)-Arg(Mtr)-Ile-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)
-Ser(tBu)-Gly-Leu-Gly-Cys(Acm)-Lys(Boc)-Val-Leu-Ar
g(Mtr)-Arg(Mtr)-His(Trt)-樹脂（以下保護ヒトBNP-32
樹脂という）を1.5g得た。
-Ser(tBu)-Pro-Lys(Boc)-Met-Val-Gln-Gly-Ser(tBu)-Gl
y-Cys(Acm)-Phe-Gly-Arg(Mtr)-Lys(Boc)-Met-Asp(tBu)-
Arg(Mtr)-Ile-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-G
ly-Leu-Gly-Cys(Acm)-Lys(Boc)-Val-Leu-Arg(Mtr)-Arg
(Mtr)-His(Trt)-樹脂を得た。次いで前述の方法に従っ
て保護ペプチドの末端のアミノ基の保護基であるFmoc基
を除去し、H-Ser(tBu)-Pro-Lys(Boc)-Met-Val-Gln-Gly-
Ser(tBu)-Gly-Cys(Acm)-Phe-Gly-Arg(Mtr)-Lys(Boc)-Me
t-Asp(tBu)-Arg(Mtr)-Ile-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)
-Ser(tBu)-Gly-Leu-Gly-Cys(Acm)-Lys(Boc)-Val-Leu-Ar
g(Mtr)-Arg(Mtr)-His(Trt)-樹脂（以下保護ヒトBNP-32
樹脂という）を1.5g得た。
【００２４】(2) Cys(Acm)-ヒトBNP-26の合成 保護ヒトBNP-26樹脂600mgをチオアニソール2.4mlと共に
反応器中に入れ、トリフルオロ酢酸（TFA）20ml、トリ
メチルシリルブロマイド（TMSBr）2.6ml及びエタンジチ
オール2.4mlを加え、０℃で３時間反応させた。反応終
了後、エーテル200mlで洗ってアニソールを除去し、１
Ｎ酢酸20mlで生成物を抽出した。樹脂及び不溶物を遠心
分離でとりのぞき、氷冷しながら１Ｍフッ化ナトリウム
（NaF）１mlを加え、５％アンモニア水でユニバーサル
試験紙上pH約８に調整して30分放置した。その後、再び
１Ｎ酢酸を加えてpH５に再調整し、更に水で10倍に希釈
した。これを60mlのODS樹脂〔LC-Sorb（ケムコ製）〕を
充填したカラム（φ３cm×8.5cm）に吸着させ、0.1Ｎ酢
酸でよく洗浄した後、0.1％TFAを含む60％アセトニトリ
ル200mlで溶出した。アセトニトリルを減圧下留去後、
凍結乾燥して300mgの粗Cys(Acm)-ヒトBNP-26を得た。
反応器中に入れ、トリフルオロ酢酸（TFA）20ml、トリ
メチルシリルブロマイド（TMSBr）2.6ml及びエタンジチ
オール2.4mlを加え、０℃で３時間反応させた。反応終
了後、エーテル200mlで洗ってアニソールを除去し、１
Ｎ酢酸20mlで生成物を抽出した。樹脂及び不溶物を遠心
分離でとりのぞき、氷冷しながら１Ｍフッ化ナトリウム
（NaF）１mlを加え、５％アンモニア水でユニバーサル
試験紙上pH約８に調整して30分放置した。その後、再び
１Ｎ酢酸を加えてpH５に再調整し、更に水で10倍に希釈
した。これを60mlのODS樹脂〔LC-Sorb（ケムコ製）〕を
充填したカラム（φ３cm×8.5cm）に吸着させ、0.1Ｎ酢
酸でよく洗浄した後、0.1％TFAを含む60％アセトニトリ
ル200mlで溶出した。アセトニトリルを減圧下留去後、
凍結乾燥して300mgの粗Cys(Acm)-ヒトBNP-26を得た。
【００２５】このものを１Ｎ酢酸９mlに溶かし、９回に
分けて逆相HPLCにかけた〔カラム：ヌクレオシル120-5C
18，φ20mm×250mm，流速５ml／分，溶媒系：(A) 水：
アセトニトリル：10％TFA＝90：10：１，(B) 水：アセ
トニトリル：10％TFA＝40：60：１，(A)：(B)＝90：10
から(A)：(B)＝55：45までの120分間の直線グラジエン
ト〕。この操作を９回繰り返し57〜61分のところに溶出
されるメインピークを分取した。この分画を、減圧下ア
セトニトリルを留去後、凍結乾燥を行ない、Cys(Acm)-
ヒトBNP-26を96.0mg得た。
分けて逆相HPLCにかけた〔カラム：ヌクレオシル120-5C
18，φ20mm×250mm，流速５ml／分，溶媒系：(A) 水：
アセトニトリル：10％TFA＝90：10：１，(B) 水：アセ
トニトリル：10％TFA＝40：60：１，(A)：(B)＝90：10
から(A)：(B)＝55：45までの120分間の直線グラジエン
ト〕。この操作を９回繰り返し57〜61分のところに溶出
されるメインピークを分取した。この分画を、減圧下ア
セトニトリルを留去後、凍結乾燥を行ない、Cys(Acm)-
ヒトBNP-26を96.0mg得た。
【００２６】(3) ヒトBNP-26の合成 ヨウ素227mgを95％酢酸50mlに溶かし、１Ｎ塩酸80μlを
加えたもの（以下Ａ液という）を用意した。
加えたもの（以下Ａ液という）を用意した。
【００２７】また、クエン酸2.1g、L-アスコルビン酸57
5mgを２Ｎ水酸化ナトリウム10mlに溶かし、水を加えて5
0mlとしたもの（以下Ｂ液という）を用意した。
5mgを２Ｎ水酸化ナトリウム10mlに溶かし、水を加えて5
0mlとしたもの（以下Ｂ液という）を用意した。
【００２８】89.0mgのCys(Acm)-ヒトBNP-26を90％酢酸
５mlに溶かしたものをＡ液30mlに室温下撹拌しながら滴
下し、20分間さらに撹拌した。その後、Ｂ液をヨウ素の
かっ色が消えるまで滴下した。このものに水500mlを加
えて希釈し、30mlのODS樹脂〔LC-Sorb（ケムコ製）〕を
充填したカラム（φ２cm×9.5cm）に吸着させた。これ
を0.1Ｎ酢酸でよく洗浄した後、0.1％TFAを含む60％ア
セトニトリル60mlで溶出した。アセトニトリルを減圧留
去後、凍結乾燥し、粗ヒトBNP-26を60.0mg得た。このも
のを１Ｎ酢酸４mlに溶かし、４回に分けて逆相HPLCにか
けた〔カラム：ヌクレオシル120-5C18，φ20mm×250m
m，流速５ml／分，溶媒系；(A) 水：アセトニトリル：1
0％TFA＝90：10：１，(B) 水：アセトニトリル：10％TF
A＝40：60：１，(A)：(B)＝90：10から(A)：(B)＝55：4
5までの120分間の直線グラジエント〕。この操作を４回
繰り返し、62〜66分のメインピークを分取した。この分
画を、減圧下アセトニトリルを留去後、凍結乾燥して、
25mgのヒトBNP-26を得た。
５mlに溶かしたものをＡ液30mlに室温下撹拌しながら滴
下し、20分間さらに撹拌した。その後、Ｂ液をヨウ素の
かっ色が消えるまで滴下した。このものに水500mlを加
えて希釈し、30mlのODS樹脂〔LC-Sorb（ケムコ製）〕を
充填したカラム（φ２cm×9.5cm）に吸着させた。これ
を0.1Ｎ酢酸でよく洗浄した後、0.1％TFAを含む60％ア
セトニトリル60mlで溶出した。アセトニトリルを減圧留
去後、凍結乾燥し、粗ヒトBNP-26を60.0mg得た。このも
のを１Ｎ酢酸４mlに溶かし、４回に分けて逆相HPLCにか
けた〔カラム：ヌクレオシル120-5C18，φ20mm×250m
m，流速５ml／分，溶媒系；(A) 水：アセトニトリル：1
0％TFA＝90：10：１，(B) 水：アセトニトリル：10％TF
A＝40：60：１，(A)：(B)＝90：10から(A)：(B)＝55：4
5までの120分間の直線グラジエント〕。この操作を４回
繰り返し、62〜66分のメインピークを分取した。この分
画を、減圧下アセトニトリルを留去後、凍結乾燥して、
25mgのヒトBNP-26を得た。
【００２９】(4) Cys(Acm)-ヒトBNP-32の合成 保護ヒトBNP-32樹脂700mgを前記(2)と同様に、チオアニ
ソールと共にTFA、TMSBr及びエタンジオールにより、樹
脂からの脱離、脱保護を行ない、さらに逆相HPLCによる
精製によりCys(Acm)-ヒトBNP-32を60.0mg得た。
ソールと共にTFA、TMSBr及びエタンジオールにより、樹
脂からの脱離、脱保護を行ない、さらに逆相HPLCによる
精製によりCys(Acm)-ヒトBNP-32を60.0mg得た。
【００３０】(5) ヒトBNP-32の合成 60.0mgのCys(Acm)-ヒトBNP-32を前記(3)と同様に、ヨー
ドによる脱Acm、環化を行ない、粗ヒトBNP-32を20.0mg
得た。次にこのものを１Ｎ酢酸４mlに溶かし、４回に分
けて逆相HPLCにかけた〔カラム：ヌクレオシル120-5C1
8，φ20mm×250mm，流速５ml／分，溶媒系；(A) 水：ア
セトニトリル：10％TFA＝90：10：１，(B) 水：アセト
ニトリル：10％TFA＝40：60：１，(A)：(B)＝90：10か
ら(A)：(B)＝55：45までの120分間の直線グラジエン
ト〕。この操作を４回繰り返し、61〜64分のメインピー
クを分取した。減圧下アセトニトリルを留去後、凍結乾
燥し、５mgのヒトBNP-32を得た。
ドによる脱Acm、環化を行ない、粗ヒトBNP-32を20.0mg
得た。次にこのものを１Ｎ酢酸４mlに溶かし、４回に分
けて逆相HPLCにかけた〔カラム：ヌクレオシル120-5C1
8，φ20mm×250mm，流速５ml／分，溶媒系；(A) 水：ア
セトニトリル：10％TFA＝90：10：１，(B) 水：アセト
ニトリル：10％TFA＝40：60：１，(A)：(B)＝90：10か
ら(A)：(B)＝55：45までの120分間の直線グラジエン
ト〕。この操作を４回繰り返し、61〜64分のメインピー
クを分取した。減圧下アセトニトリルを留去後、凍結乾
燥し、５mgのヒトBNP-32を得た。
【００３１】〔Ｂ〕物理化学的性質 上記〔Ａ〕において得られたヒトBNP-26及び32の物理化
学的性質は、次の通りであった。
学的性質は、次の通りであった。
【００３２】(a) 性状：白色粉末
【００３３】(b) 溶媒に対する溶解性：水、酸性水溶
液、酢酸に可溶。クロロホルム、ベンゼン、エチルエー
テル、ヘキサンに不溶。
液、酢酸に可溶。クロロホルム、ベンゼン、エチルエー
テル、ヘキサンに不溶。
【００３４】(c) 酸性、中性、塩基性の別：塩基性
【００３５】(d) アミノ酸組成：表１の通り。
【００３６】
【表１】
【００３７】試験例１ ＜平滑筋弛緩作用＞ 本発明のペプチドの平滑筋弛緩作用について検討した結
果を次に示す。
果を次に示す。
【００３８】(1) 試験方法 ４〜７日齢のヒヨコの直腸を摘出し、長さ1.5cmの筋標
本とした。これを、３mlオルガンバス中、95％O2−５％
CO2ガスを通じ、32℃に保温したクレブス−ヘンスレイ
ト栄養液〔カルバコール（２×108Ｍ）を含む〕2.5ml中
に浸した。この筋標本に0.5gの静圧をかけ、約30分静置
して筋の自動運動が安定したところで被験物質としてヒ
トBNP-26を100ng投与し、投与後６〜８分間の筋の弛緩
を測定した。測定後すみやかにオルガンバスを洗い、20
〜30分おいて、被験物質としてヒトBNP-32を200ng用い
て上記操作を繰り返した。被験物質は所定量を生理食塩
水に溶解して用いた。
本とした。これを、３mlオルガンバス中、95％O2−５％
CO2ガスを通じ、32℃に保温したクレブス−ヘンスレイ
ト栄養液〔カルバコール（２×108Ｍ）を含む〕2.5ml中
に浸した。この筋標本に0.5gの静圧をかけ、約30分静置
して筋の自動運動が安定したところで被験物質としてヒ
トBNP-26を100ng投与し、投与後６〜８分間の筋の弛緩
を測定した。測定後すみやかにオルガンバスを洗い、20
〜30分おいて、被験物質としてヒトBNP-32を200ng用い
て上記操作を繰り返した。被験物質は所定量を生理食塩
水に溶解して用いた。
【００３９】(2) 結果 その結果、図１及び２に示すように、本発明ペプチドは
100〜200ngの投与で強い平滑筋弛緩活性を示した。
100〜200ngの投与で強い平滑筋弛緩活性を示した。
【００４０】
【発明の効果】本発明のペプチド又はその塩は優れた平
滑筋弛緩作用を有し、さらに利尿及びナトリウム利尿作
用、血圧降下作用を有し、かつヒト由来であるため安全
性が高く、例えば心臓性浮腫、腎臓性浮腫、肝性浮腫、
肺浮腫、高血圧症、うっ血性心不全、急性及び慢性腎不
全等の治療薬として有用である。
滑筋弛緩作用を有し、さらに利尿及びナトリウム利尿作
用、血圧降下作用を有し、かつヒト由来であるため安全
性が高く、例えば心臓性浮腫、腎臓性浮腫、肝性浮腫、
肺浮腫、高血圧症、うっ血性心不全、急性及び慢性腎不
全等の治療薬として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒヨコ直腸標本に本発明のヒトBNP-26を100ng
投与した場合の弛緩長さの経時変化を示す図である。
投与した場合の弛緩長さの経時変化を示す図である。
【図２】ヒヨコ直腸標本に本発明のヒトBNP-32を200ng
投与した場合の弛緩長さの経時変化を示す図である。
投与した場合の弛緩長さの経時変化を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 高島 美加 東京都墨田区業平５丁目５番12号 第一 化学薬品株式会社 東京技術センター内 (72)発明者 松尾 壽之 宮崎県宮崎郡清武町大字木原6653番地 (56)参考文献 特表 平３−505280（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 14/575 A61K 38/16 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (2)
- 【請求項１】 式(1) 【化１】 で表わされる生理活性ペプチド又はその塩。
- 【請求項２】 請求項１記載の生理活性ペプチド又はそ
の塩を含有する循環器系疾患治療剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12166699A JP3258639B2 (ja) | 1999-04-28 | 1999-04-28 | 新規生理活性ペプチド及びその用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12166699A JP3258639B2 (ja) | 1999-04-28 | 1999-04-28 | 新規生理活性ペプチド及びその用途 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10131506A Division JP3025672B2 (ja) | 1998-05-14 | 1998-05-14 | 新規生理活性ペプチド及びその用途 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000103212A Division JP3264439B2 (ja) | 1989-03-10 | 2000-04-05 | 新規生理活性ペプチド及びその用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11343299A JPH11343299A (ja) | 1999-12-14 |
| JP3258639B2 true JP3258639B2 (ja) | 2002-02-18 |
Family
ID=14816898
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12166699A Expired - Lifetime JP3258639B2 (ja) | 1999-04-28 | 1999-04-28 | 新規生理活性ペプチド及びその用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3258639B2 (ja) |
-
1999
- 1999-04-28 JP JP12166699A patent/JP3258639B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH11343299A (ja) | 1999-12-14 |
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