JPH0477760B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は、ひな直腸筋標本弛緩作用、利尿作
用及び血圧降下作用を有するペプチド並びにその
塩、並びにこれらを含んで成る医薬に関する。 （従来の技術） 種々の体液性因子、すなわち生理活性物質が、
物理的因子、例えば心拍出量、血管壁の弾性等と
共に血圧を規定する重要な因子であることはよく
知られている。この体液性因子が関与する系とし
て、レニン−アンジオテンシン−アルドステロン
系、カテコラミン系、プロスタグランジン系、カ
リクレイン−キニン系と共にナトリウム利尿ホル
モン系が存在し、ウアベイン様物質といわれるナ
トリウム利尿ホルモンが血圧の上昇に関与するこ
ともすでに周知である。 なお、この明細書において「ナトリウム利尿」
とはカリウムイオンに対してナトリウムイオンを
選択的に排泄する利尿を言う。 ヒトの心房中には、ペプチドホルモン産生細胞
中に見られる顆粒と形態的に類似する顆粒が存在
することが知られている〔J.D.Jamieson及びG.
E.Palade，J.Cell Biol.，23，151（1964）〕。また、
ラツトの心房のホモジネート物及びその顆粒が、
ラツトに対してナトリウム利尿を起すことも知ら
れている〔A.J.DeBold等、Life Sei.，2889
（1981）；R.Keeller，Can.J.Physiol.Pharmacol.，
60，1078（1982）等〕。さらに、最近において、
Mark G.Currie等はヒト、ウサギ、ブタ及びラ
ツトの心房中にナトリウム利尿作用を有する分子
量２万〜３万のペプチド様物質及び分子量１万以
下のペプチド様物質が存在することを示唆した
〔Seience，221，71〜73（1983）〕。最近になつて、
アミノ酸数28個のラツト由来のペプチドが同定さ
れた〔B.B.R.C.Vol.117，No.３，859〜865頁
（1983）〕。また本発明者等は、ヒト由来のα−
hANP〔特願昭58−243675；B.B.R.C.Vol.118，No.
１，131〜139頁（1984）〕、及びβ−hANP（特願
昭59−38817）、並びにラツト由来のβ−rANP
（特願昭59−38816）を見出し、その構造及び薬理
活性を明らかにした。 本発明者等は、引き続き、効果的な利尿作用を
有する物質を見出すべく鋭意研究を行つた結果、
ヒトの心房から、126個のアミノ酸で構成され約
13000の分子量を有する全く新しいペプチドを単
離することに成功し、このペプチドの構造を決定
すると共に、このペプチドが前記のα−hANPの
前駆体であつて、顕著な、利尿作用、及び血圧降
下作用を有することを見出し、この発明を完成し
た。 （発明が解決しようとする問題点） すなわち、この発明は、顕著な利尿作用及び血
圧降下作用を有する新規なペプチド、並びに該ペ
プチドを含んで成る利尿剤、及び血圧降下剤を提
供することを目的とする。 なお、この明細書において、この新規ペプチド
をγ−hANP（γ−human atrial natriuretic
polypeptide）と称する。 （問題点を解決するための手段） 前記の目的は、次に記載するγ−hANPを提供
することにより達成される。 (A) γ−hANPの構造及び物理化学的性質 この発明のペプチドγ−hANPは次の構造式
で表わされる。 【表】 （式中、105位のCysと121位のCysはジスル
フイド結合で結合している。） 上記の構造式において、このペプチドは左側
にアミノ末端を有し右側にカルボキシ末端を有
する。式中、Asnはアスパラギン、proはプロ
ーリン、Metはメチオニン、Tyrはチロシン、
Alaはアラニン、Valはバリン、Serはセリン、
Aspはアスパラギン酸、Leuはロイシン、Phe
はフエニルアラニン、Lysはリジン、Hisはヒ
スチジン、Gluはグルタミン酸、Glnはグルタ
ミン、Glyはグリシン、Thrはスレオニン、
Argはアルギニン、Trpはトリプトフアン、
Cysはシステイン、そしてIleはイソロイシンを
それぞれ表わし、いずれもＬ−アミノ酸であ
る。 この構造はアミノ酸分析の結果、及び心房か
ら得られたmRNAからのcDNAの解析から得
られた遺伝子の同定結果から決定されたもので
ある（同日出願に係る「新規DNAおよびその
用途」を参照のこと）。 分子量：約13000（ゲル過法による。）理論
分子量 13679。 紫外線吸収スペクトル：Max＝276nm。 呈色反応：エールリツヒ反応陰性、坂口反
応、及びパウリ反応いずれも陽性。 酸性・中性・塩基性の別：塩基性 溶剤に対する溶解性：水、メタノール及び酢
酸に溶解し、酢酸エチル、酢酸ブチル、エチル
エーテル、ヘキサン、石油エーテル、ベンゼン
及びクロロホルムに難溶である。 アミノ酸組成 アミノ酸 実測値（モル比） 理論値（モル比） Asx 13.69 14 Ala 11.98 11 Arg 10.24 10 Ile 1.45 １ Gly 11.61 11 Glx 13.22 12 （Cys）₂ 0.16 １ Ser 12.37 13 Tyr 2.01 ２ Phe 3.48 ３ Met 3.61 ４ Leu 17.22 16 Val 5.98 ６ Thr 2.68 ２ His 1.43 １ Lys 5.14 ４ なお、この化合物は前記のごとく塩基性であ
り、無機酸、例えば塩酸、硫酸、燐酸等、又は有
機酸、例えば蟻酸、酢酸、プロピオン酸、コハク
酸、クエン酸等と共に常法に従つて酸付加塩に転
換することができる。 (B) γ−hANPの生物学的性質 この発明のペプチドγ−hANPは顕著な利尿作
用、及び血圧降下作用を有する。 試験方法 雄性SD系ラツト（体重300〜400ｇ）にペント
バルビタール60mg／Kgを腹腔内投与することによ
つて麻酔し、以下Life Sciences，Vol.28，pp89
−94（1981）に記載されている方法に準じて行つ
た。 気道確保のため、気管カニユーレ（PE−
240Clay−Adams）を施し、股動脈に血圧測定用
の動脈カニユーレ（PE−10にPE−50を接続）を
挿入し、股静脈にリンゲル液投与用の静脈カニユ
ーレを挿入した。この静脈カニユーレを通して
1.2mlのリンゲル液を約10分間にわたつて注入し
た後1.2ml／時の速度で定常注入（constant
infusion）を行つた。 シラステイツク・チユーブ（内径0.02インチ、
外径0.037インチ、ダウコーニング社製）の膀胱
カニユーレから試験管内に採尿した。この採尿は
被験物質を投与する前30分間と投与後５分間又は
その後経時的に行い、この尿試料の分析値を比較
することにより被験物質の作用を測定した。 被験物質γ−hANPは、その1nモルを5μｇの
バシトラシン（抗菌剤）と共に50μの滅菌生理
食塩水に溶解し、頚静脈から投与した。 被験物質を投与した後経時的に採尿して経過を
観察した場合の結果は第１図のようであつた。こ
の図から明らかなごとく、この発明のγ−hANP
の利尿作用は、微量の投与により生じる。 また、第２図に示すごとく、この発明γ−
hANPを投与した後、血圧は緩かに約20mmHg降
下し、約１時間持続した。この結果によりγ−
hANPがα−hANPより顕著に持続する血圧降下
作用を有することが明らかになつた。 γ−hANPの医薬としての適性 前記のごとくこの発明のペプチドγ−hANPは
顕著な利尿作用及び血圧降下作用を有する。 このペプチドは繰返し投与しても抗体産生を惹
起せず、アナフイラキシーシヨツクを起こさな
い。また、この発明のペプチドはＬ−アミノ酸の
みからなり、投与後、生体内の各種プロテアーゼ
により徐々に分解されるため毒作用をほとんど有
しない。 前記のごとく、γ−hANPはμｇ／Kgのオーダ
ーで効果を発揮し、毒性が非常に低いから、1μ
ｇ／Kg〜10mg／Kgの範囲で投与することができ、
10μｇ／Kg〜１mg／Kgの範囲で投与するのが好ま
しい。 この発明のγ−hANPは、ペプチド系医薬の投
与に一般に使用されている投与方法、すなわち非
経口的投与方法、例えば静脈内投与、筋肉内投
与、皮下投与等によつて投与するのが好ましい。
経口投与した場合、γ−hANPは消化管内で分解
を受けるためこの投与方法は一般的には効果的で
ないが、消化管内で分解を受けにくい製剤、例え
ば活性成分であるγ−hANPをリポゾーム中に抱
容したマイクロカプセル剤として経口投与するこ
とも可能である。又、直腸，舌下，鼻内など消化
管以外の粘膜から吸収せしめる投与方法を採用す
ることも可能であり、この場合、例えば坐剤，舌
下錠，点鼻スプレー剤等の形で投与することがで
きる。 (C) γ−hANPの製造方法 この発明のペプチドγ−hANPは、ラツトの心
房組織を適当な酸性溶媒、例えば燐酸緩衝液，塩
酸含有酢酸等の中でホモジネートし、ヒナ直腸標
本弛緩活性を指標として、遠心分離，等電点沈
澱，溶媒抽出，限外過，ゲル過，吸着クロマ
トグラフイー等、ペプチドの精製に常用される各
種処理を適宜組合わせて分子量約13000のペプチ
ドを分離することにより得られる。 次に実施例により、この発明をさらに具体的に
説明する。 実施例１ γ−hANPの製造 ヒトの心房37.7ｇを摘出し、10倍量の1N酢酸
を加え、ホモジナイズし、さらに冷却アセトンを
加え、２倍量になし、ホモジナイズすることによ
り抽出を行つた。これを16000×ｇで30分間遠心
分離し、その上清から、減圧蒸留によりアセトン
を除去し、150mlの抽出液を得た。 得られた抽出液に水を加え１となし逆層カラ
ムLCSORB SP−Ｃ−ODS（Chemco製）90mlに
附し、0.1N酢酸溶液450mlを流し、ついで水：ア
セトニトリル：10％トリフルオロ酢酸（40：60：
１）450mlで溶出する。溶出においては、前期に
緑色、後期に茶色の画分が溶出されるが、その緑
色の画分225mlを採取し、凍結乾固させ、90mgの
乾固物を得た。 得られた乾固物を５mlの1N酢酸に溶解し、1N
酢酸溶液で平衡化したSephadex Ｇ−75（フアル
マシア製；カラムサイズ1.8×135cm；流速10.3
ml／時間；フラクシヨンサイズ５ml）によりゲル
過した。この結果を第３図に示す。ヒナ回腸標
本弛緩作用画分（フラクシヨン番号39〜44）30ml
を得、これの250μずつを試料として液体高速
クロマトグラフイーに付した。このクロマトグラ
フイーにおいては、TSKODS〔東洋曹達(株)製〕カ
ラム（サイズ4.0×250mm）を使用し、流速1.0
ml／分、圧力110〜130Kg／cm²とし、溶出溶媒とし
て、(A)水：アセトニトリル：10％トリフルオロ酢
酸（90：10：１）、及び(B)水：アセトニトリル：
10％トリフルオロ酢酸（40：60：１）を使用し
た。カラムを(A)で平衡化した後、試料を注入し、
(A)から(B)への直線グラジエント法で80分間溶出し
た。この結果を第４図に示す。ヒナ回腸標本弛緩
画分（保持時間50分）のピークを分取し、得られ
た画分を上記と同じカラムにて(A)水：アセトニト
リル：10％トリフルオロ酢酸（70：30：１）及び
(B)水：アセトニトリル：10％トリフルオロ酢酸
（40：60：１）で同様に再クロマトグラフイーを
行つた。この結果を第５図に示す。主要ピーク
（保持時間18分）を分取し、純粋なγ−hANPを
得た。１回につき3.37nモルのγ−hANPが得ら
れ、これを反復することにより合計404nモルの
γ−hANPが得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明のγ−hANPの利尿作用を示
し、第２図は血圧降下作用を示すグラフであり、
第３図はSephadex Ｇ−75を使用するクロマトグ
ラフイーの溶出経過を示し、第４図及び第５図は
液体高速クロマトグラフイーにおける溶出経過を
示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 次の構造式 【表】 【表】 （式中、105位のCysと121位のCysはジスルフ
   イド結合により結合している、） で表わされるペプチド及びその酸付加塩。 ２ 次の構造式 【表】 【表】 （式中、105位のCysと121位のCysはジスルフ
   イド結合により結合している、） で表わされるペプチド又はその酸付加塩を含んで
   成る利尿剤。 ３ 次の構造式 【表】 （式中、105位のCysと121位のCysはジスルフ
   イド結合により結合している、） で表わされるペプチド又はその酸付加塩を含んで
   成る血圧降下剤。