JPH0374400A - 新規なペプチドならびにこれを有効成分とする利尿剤および降圧剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は新規ペプチドならびにそれを有効成分とする利
尿剤および降圧剤に関する。

（従来の技術） 心臓あるいは脳が、体液バランス調節に重要な働きをし
ているホルモンを分泌していることは実証されており、
それぞれ、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰと略
称する）、および脳すトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰと
略称する）と呼ばれている。

このＡＮＰおよびＢＮＰに関する従来の知見を以下に述
べる。

心筋細胞内に特殊な顆粒が存在しくＫ１５ｃｈ、ＩＥｘ
ｐ、Ｍｅｄ、ｓｕｒｇ、１６１：５０８−５１６．１９
５６）　、内分泌細胞内のペプチドホルモン貯蔵顆粒と
形態学的によく似ていることが指摘されていた（Ｊａｍ
ｉｅｓｏｎ、Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ。

２３：１５１−１７２．１９６４）。ｄｅ　Ｂｏｌｄ等
はラット心房抽出液を他のラットに静注し、尿量および
ナトリウム利尿の増加を観察した（Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ、
２８：８９−９４．１９８１）。

さらに、Ｃｕｒｒｉｅ等はヒト、ウザギ、ブタおよびラ
ットの心房中にナトリウム利尿作用を有するペプチド様
物質の存在を示唆し、これが、平滑筋弛緩活性をも有す
ることを見出した（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２１：７１７３
、１９８３）。平滑筋弛緩活性を目印に、窓用等によっ
て、ヒト心房より単離されたペプチドの構造決定がなさ
れた（ＢＢＲＣ１１８：１３１−１３９．１９８４．）
。その後、ラット（窓用等、ＢＢｌ？Ｃ１２１：５８５
−５９２．１９８４）　、マウス、ウサギ、イヌく及用
等、ＢＢＲＣ１３２：８９２−８９９．１９８５）、ブ
タ（Ｆｏｒｓｓｍａｎｎ等、Ｃｅ１ｌ　Ｔｉ５ｓｕｅ　
Ｒｅｓ、２３８：４２５−４３０．１９８４）、カエル
（坂田等、ＢＢＲＣ１５５：１３３８−１３４５．１９
８８）　、カエル（宮田等、ＢＢＲＣ１５５：１３３０
−１．３３７、１９８８）のＡＮＰの構造が決定された
。また、脳からも同様の活性単離同定され、構造の相違
からＢＮＰとよばれている。これまでに、ブタ（須藤等
、ＢＢＲＣ１５５：７２６−７３２．１９８４）　、ヒ
ト（須藤等、ＢＢＲＣ１５９：１４２７−１４３４．１
９８９）　、ラット（小島等、ＢＢＲＣ１５９：１４２
０−１４２６．１９８９）のＢＮＰが単離同定されてい
る。

これらはいずれも、７位のシスティンと２３位のシステ
ィンで形成された１７個のアミノ酸残基の環状構造は高
度に保存されているが、各アミノ酸残基における置換が
みられ、生物学的活性に差違がある。

ＡＮＰおよびＢＮＰの治療効用については、水、ナトリ
ウム利尿および血管平滑筋弛緩作用によって、利尿剤お
よび血管拡張剤としての利用が予想される。水分の過剰
停滞が見られるうっ血性心不全に対して利尿剤として、
また、血管拡張効果が重要な役割を果たす高血圧症の治
療、特に本態性（悪性）高血圧症の治療に利尿および血
管拡張作用の両方の特性を有するＡＮＰまたはＢＮＰが
有用であることが期待される。また、腎血流量低下のめ
られる腎機能低下症に、血管拡張作用が腎血流量増大を
もたらし、症状を改善しうることか期待される。

さらに、臓器移植時に摘出臓器の洗浄液乙こＡＮＰまた
はＢＮＰを用いれば、拡張した血管内の不用物の洗浄効
果と被提供者血液の十分な循環、順応を促し、成功率の
上昇が期待される。

具体的には、ヒ１−ＡＮＰからなる利尿剤が特公昭６３
−１９５２０号公報に、ウソｌ−ＡＮＰからなる利尿剤
が特開昭６０−１０５６９７号公報、特開昭６０−１８
４０９７号公報、特開昭６０−２１４７９７号公報に開
示されている。

しかしながら、これまでに見出された利尿ペプチドは、
いずれも血中での生理活性の消失は速やかで、例えばヒ
トΔＮＰでは血中において約１００秒で半減する（中足
等、Ｅｕｒ、Ｊ、ＣＩ　ｉｎ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、３
１：１０１−１０３．１９８６）　　。

（発明が解決しようとする課題） 上述のように、従来の利尿ペプチドは、血中での生理活
性の持続性が不十分であった。

本発明は、持続的生理活性を有する利尿ペプチド、およ
び、それを有効成分とする治療薬を提供することを目的
とする。

（課廊を解決するための手段） 本発明者等は、薬理活性スペクトルを変化させることな
く、持続的生理活性を有する利尿ペプチドを見出して、
実用性の高い薬剤を得るための１つの方法として、この
ようなペプチドを自然界より見出し単離同定する方法を
採用した。単離同定の対象としては、ウナギが海水およ
び淡水の両相に生息し、外界のナトリウム濃度の激変に
適応しろる体液バランス調節機能を有していることが推
測されるため、強力な活性をもつ利尿ペプチドの存在が
期待されることに注目し、ウナギのＡＮＰを選択した。

本発明者等は、ウナギの心房より利尿ペプチドを単離し
、これが従来の利尿ペプチドと異なった構造を有し、そ
の違いにより生理活性の持続作用力を有することを見出
し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、アミノ酸残基、 Ｈ−５ｅｒ−Ｌｙｓ−５ｅｒ−３ｅｒ−３ｅｒ−Ｐｒｏ
−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−ＧｌｙＬｙｓ−Ｌｅｕ−Ａ
ｓｐ−Ａｒｇ−１１ｅ−Ｇ　１ｙ−５ｅｒ−Ｔｙｒ−５
ｅｒ−Ｇ　ｌｙ−１，ｅｕＧｌｙ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−５
ｅｒ−へｒｇ−Ｌｙｓ−Ｏｆｔ（但し、７位のシスティ
ン残基と２３位のシスティン残基はジスルフィド結合し
ている） を有するペプチドまたはその塩、ならびにこれを有効成
分とする利尿剤および降圧剤である。

上記アミノ酸配列において、７位のシスティン残基と２
３位のシスティン残基の結合はジカルボキシル結合であ
ってもよい。

この明細書で使用するアミノ酸の略字は以下の通りであ
る。

アミノ酸　　三文字 アスパラギン　　Ａｓｎ アスパラギン酸　Ａｓｐ アルギニン　　　Ａｒｇ イソロイシン　　ＩＩｅ グリシン　　　　Ｇｌｙ システィン　　　　Ｃｙｓ セリン　　　　　Ｓｅｒ チロシン　　　　Ｔｙｒ フェニルアラニンＰｈｅ プロリン　　　　　Ｐｒ。

リシン　　　　　Ｌｙｓ ロイシン　　　　Ｌｅｕ 本発明のペプチドは、ウナギの心房から単離精製するか
、あるいはアごノ酸からの化学合成によって製造できる
。

ウナギ心房から単離精製するには、ウナギより摘出した
心房を凍結させ粉砕後、例えば窓用等のＮａｔｕｒｅ　
３１３：３９７−４００．１９８５に示された方法に準
拠して素抽出を行ない、素抽出液を分子ふるいクロマ）
・グラフィー、イオン交換クロマトグラフィー逆相高速
りロマＩ・グラフィーに順次実行させることにより行な
うことができる。これはヒト、ラット、カエル、ニワト
リＡＮＰの単離方法に準じた方法であるが、これらのＩ
ＩＮＰに比較してウナギは高脂肪であるため、脱脂操作
を加えることが望ましい。各単離精製段階においては、
Ｃｕｒｒｉｅ等の発見した平滑筋弛緩作用（Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ　２２１：５８５−５９２．１９８４）および丸茂
等が開発したラジオイムノアッセイ（ＢＢＲＣ１３７：
２３１−２３６．１９８６　）を目印とした。

本発明のウナギＡＮＰを化学合成するには、例えば渡辺
等がヒｌ−ＡＮＰ類似体を化学合成した方法に準した溶
液化学合成法によって行なうことができる。その他、遺
伝子導入による発現を利用した生物学的合成のような方
法も使用できる。このようにして合成したペプチドをヨ
ウ素による酸化によってをジスルフィド結合させる。あ
るいはジカルボキシル結合させても良い。その後、例え
ばイオン交換クロマトグラフィー等の精製手段によって
精製する。精製度の確認ば、薄層クロマ１−グラフィー
、逆相高速クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグ
ラフィー乙こて実施することができる。

上述のようにして得られた、本発明のペプチドの構造お
よび物理化学的性質は、以下に示す通りである。

（１）アミノ酸配列 Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−１１ｅ−Ｇｌｙ−３
ｅｒ−Ｔｙｒ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−ＬｅｕＧｌｙ−Ｃｙｓ
−へｓｎ−３ｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｏｆ−１（但し、
７位と２３位のシスティン残基はジスルフィド結合して
いる） アミノ酸配列の決定は、高度に単離精製したウナギへＮ
Ｐを、自動アミノ酸分解装置を用いたエドマン分解によ
って、アミン末端より段階的に切断し、高速液体クロマ
トグラフィーによって行なった。

（２）物理化学的性質 分子量：約３０００　（ゲル濾過法による）アミノ酸組
成（ア当）酸分析による） 実測値（モ）１比）理論値（モ）１比）へ５ｐ−１−Δ
ｓｎ　　　　　　２．０　　　　　　　　２Ｓｅｔ　　
　　　　７．０　　　　７ Ｇｌｙ　　　　　　５．４　　　　５ Ｃｙｓ　　　　　　　　　　＋２ Ａｒｇ　　　　　　２．０　　　　２ Ｐｒｏ　　　　　　１．０　　　　１ Ｔｙｒ　　　　　　１．．０　　　　１１１、ｅ　　　
　　　１．０　　　　１Ｌｅｕ　　　　　　２．０　　
　　２ Ｐｈｅ　　　　　　１．１　　　　１ Ｌｙｓ　　　　　　２．５　　　　３ （注）士は存在を示す。

本発明のペプチドの生理活性は以下の通りである。

（利尿作用） 試験方法 ｓｎ系ラうト（体重３００〜４００　ｇ）麻酔下にて、
ｄｅｌｌｏｌｄ等（Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ、２８：８９−９
４．１９８１）に準して行った。

膀胱、大腿動脈、大腿静脈にカニヱーレを挿入し、大腿
静脈より２００　μＥ　／ｍｉｎでリンゲル液を持続注
入した。膀胱カニコ、−レから尿を１０分毎に採取し、
この尿試料の尿量、Ｎａ濃度を測定した。

結果 被検物質ウナギＡＩＩＰを１０Ａｍｏｌｅおよび１００
ｎ１００ｎで投すル、被検物質投与前１０分間と、投与
後１０分間の尿量とＮａ排泄量を測定し、本発明ペプチ
ドの利尿作用およびＮａ利尿作用を評価した。尿量ば１
０Ａｍｏ＋ｅ群で１．２±０．１倍、１００　ｎｍｏｌ
ｅ群で２．０±０．３倍に増加し、Ｎａ排泄量は１０Ａ
ｍｏｌｅで５．８±２゜２倍に、１００　ｎｍｏｌｅ群
で２８．４±１２．１倍に増加し、本発明ペプチドが利
尿作用およびナトリウム利尿作用を有することは明らか
である。

また、ウナギＡＮＰとヒトＡＪＩＰをそれぞれラットに
投与した場合のＮａ排泄量の経時的変化は次の通りであ
る。

１ 投与後経過時間　ウナギＡＮＰ　　ヒトＡＮＰ（１０Ａ
ｍｏｌｅ　）　　（ｌｎｍｏｌｅ　）０〜１０分　　　
５．８倍　　　　６．０倍１０〜２０分　　　３．０倍
　　　　２．０倍２Ｑ−３０分　　　２．０倍　　　　
　１．１倍上記表より、最大のＮａ排泄量はウナギＡＮ
Ｐもヒ１−　ＡＮＰも投与前の６倍程度であり、その際
の投与量はウナギＡＮＰはヒｌ−ＡＮＰの１０倍である
ことが分かる。従って、ラッＩ・におするすトリウム利
尿作用に関して、ウナギＡＮＰの作用力はヒトＡＮＰの
約１７１０であるが、利尿剤としての作用は十分に有す
る。

そして、ウナギＡＮＰ１０ｎｍｏｌｅ群で投与後２０〜
３０分間のＮａ排泄量はなお２．０−１−０．１倍であ
るのに対し、同一作用力を有するヒ）　ＡＮＰ　ｌ　ｎ
ｍｏｌｅ群では、投与後１０〜２０分間のＮａ排泄量は
２．０　＋Ｏ，Ｅ１倍であり、２０〜３０分間では１．
１　±０．１倍と投与前とあまり差がない。従ってウナ
ギＡＮＰはヒｌ−１１ＮＰに比べてＮａ利尿作用が２倍
程度長く持続し、本発明ペプチドが利尿作用に関し、持
続性に優れていることが明らかである。

（降圧作用） 試験方法 ウズラ（１０７±７　ｇ）をウレタン麻酔下にて、Ｔａ
ｋｅｉ等の方法（Ｚｏｏｌ　Ｓｃｉ、１９９０１ｎｐｒ
ｅｓｓ）に準し、右頚動、静脈にカニユーレを挿入し血
圧を直接測定した。また、ウナギ（２０５±５　ｇ）を
麻酔後、背大動脈、腹大動脈にカニユーレを挿入し、覚
醒後血圧を連続測定した（Ｔａｋｅｉ等、Ｃｏｍｐ、　
Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐｈｙｓｉｏｌ。

９１Ａ、２９３−２９７，１９８８）。

ヒトＡＮＰ、ウナギＡＮＰを０．０３〜１　ｎｍｏｌｅ
の量でウズラおよびウナギに投与し、上記方法により血
圧を測定して血圧の変動をのた。

結果 ウズラにおける降圧作用については、ウナギＡＮＰで８
〜２２％の血圧ｇ孟作用が認められ、ヒトＡＮＰに比べ
てやや劣るが、ウナキにおけるウナギＡＮＰの効力はヒ
ｌ−ＡＮＰの１００倍程度であり、ウナギＡＮＰが降圧
作用を有することは明らかである。

また、同程度の作用を誘起する用量で作用時間を比べる
と、ウナギＡＮＰはヒトＡＮＰより２倍程度長い時間効
果が持続し、本発明ペプチド゛の降圧作用の持続性が優
れていることが判明した。

以上の結果から明らかなように、本発明のペプチドは、
利尿作用および降圧作用が、従来のものに比べ長い時間
持続するので、高血圧治療、ナトリウム利尿、虚血性心
不全治療に有用であり、実用性に優れていると考えられ
る。

本発明のペプチドを降圧剤または利尿剤として用いる場
合、その投与量は、投与方法、投与形態によって変化す
るが１０ｐｍｏｌｅ／ｋｇ　〜１００ｎ１００ｎ／ｋｇ
で投与できる。

本発明のペプチドは、これを蒸留水、生理食塩水等に溶
解し、注射剤として静脈、筋肉内または皮下に投与する
か、あるいは製剤化して経口により投与したり、座薬、
経粘膜吸収剤の形で投与することができる。製剤化の際
には、医薬の製剤化において通常用いられる希釈剤、担
体、賦形剤、粘結剤、ビヒクル等を使用し、錠剤、顆粒
剤、散剤点鼻剤等の形にすればよい。

（実施例） 以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。

実施例］ ウナギ心房からのウナギＡＮＰの単離 １６９０匹のウナギから心房３１．８Ｆ、を摘出し、７
倍量の藁留水中で５分間煮沸した。直ち乙こ冷却後、酢
酸を添加しＩＭとし、ポリトロンミキサーでホモジナイ
ズすることにより抽出した。得られた抽出液を２５００
０　Ｘｇで３０分間遠心分離し、上清に冷却したアセト
ンを滴加して６７％とした後、１６０００　Ｘｇで３０
分間遠心分離して上′？？Ｉを得た。上清を減圧縮乾固
し、得られた残漬を１Ｍ酢酸３０准に溶解後、２１の冷
却アセトンを加え、４　’Ｃで一昼夜放置した。その後
１６０００　Ｘｇで３０分間遠心分離し、沈渣３０５ｍ
ｇを得た。この沈渣をＩＭ酢酸３９ｍ１に再溶解し、５
ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ２５（ファルマンヤ製、５　Ｘ８２
ｃｍ；溶離液目間酢酸；流速：７０ｍ１／時間；フラク
ションヅイズ・６　、５　ｍＲ）でゲル濾過および脱塩
を行った。

ヒヨコ直腸標本弛緩活性のあるフラクションを集め、】
ｈ酢酸溶液で平衡にした５Ｐ−３ｅｐｈａｄｅｘ　Ｃ−
２５（ファルマシャ製、１．６　Ｘ　１７ｃｍ）に供与
し、１月酢５ 酸、２Ｍピリジン溶液および２月ピリジン−１Ｍ酢酸溶
液（ｐＨ５，０）で各々溶出し、５Ｐ−１，５Ｐ−１１
、ｓｐ■のフラクションを得た。ＳＰ−■を凍結乾燥し
、その乾燥物（６０ｎｇ）を１Ｍ酢酸に溶解し５ｅｐｈ
ａｃｌｅｘ　Ｇ７５によりゲル濾過（２，６Ｘ７１ｃｍ
；溶離液：１ｈ酢酸；流速＋３６　ｍＡ／時間；フラク
ションサイズ：５ｍｆＬ）シた。ヒヨコ直腸標本弛緩活
性のあるフラクション（３８−６４画分）を陽イオン交
換高速クロマトグラフィー（［」本分光製Ｂｉｏｔｉｎ
ｅ　ＩＢＣ−ＣＭ　７．５　Ｘ７５ｍｍ、流速：１ｍ旦
／分、フラクションサイズ：２ｍＲ）にイ；］シた。１
０％アセト二１−リルを含むぎ酸アンモニウムｐｌ＋６
．Ｅｌの１０ｍＭからＩＭの３０分間直線勾配法により
分画した。活性のあるフラクション（２３両分）を逆相
高速液体クロマトグラフィー（旭化威製、Ａｓａｈｉｐ
ａｋ　Ｇｅｌ　０ＤＰ−５０，４，６ｘ２５０ｍｍ；流
速１　ｍ１７分）に付した。０．１％トリフルオロ酢酸
を含むアセトニトリルの１０％から６０％の４０分間直
線勾配法により分画し、活性のあるフラクションを再度
逆相高速液体クロマ１−グラフィー（０，１％トリフル
オロ酢酸を含むアセトニトリル ６ ４０分間直線勾配法）によって、純粋なウナギＡＮＰ（
１．７ｎｍｏｌ　　αｈＡＮＰ等量）を得た（第１図）
。

実施例２ ウナギＡＮＰの合成 Ｙａｎａｇｉｓａｗａ等の方法（Ｐｒｏ．　Ｎａｔｌ．
　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＩＪＳ八８へ：６９６４−６
９６７、　１．９８８）の方法に準して行った。

すなわち、Ａｐｐｌｉｅｄ　ＢｉｏｓｙｓＬｅｍｓ製全
自動ペプチド合威機を用いた。フ合成ルアセドアごトメ
チルレジンを固相とし、Ｆｍｏｃ法によるアミノ酸のカ
ップリングを行い、最終的に９５％トリフルオロ酢酸に
よって固相からペプチドを切り出した。９９．４％以上
の純度で合成品が得られた。得られた直鎮ウナギＡＮＰ
のシスティンの保護基をヨウ素による酸化によって除去
すると同時にスルフィト結合が形成された。合成品は、
逆相高速液体クロマトグラフィー（Ｗａｔｅｒｓ　Ｐｒ
ｅｐＬＣ　Ｓｙｓｔｅｍ　５００）によらて精製した。

また前述の逆相高速液体クロマ）・グラフィー（Ａｓａ
ｈｉｐａｋ　Ｇｅｌ　ＯＤＰ−５０）によって再精製を
行い、同時にウナギから抽出精製した天然のウナキＡＮ
Ｐと同一の溶出位置にあることを確認した。

実施例３ 製剤化例 合成ウナギＡＮＰを生理食塩液に溶解し、１０−’　ｍ
ｏ１ｅ／　ｊ！の？８液を注射用製剤とした。

ラットに頚動脈より急速注入した（Ｎ＝１０／群）。

尿量は１０ｎｍｏ１群で、１２０±１０％、１００ｎｍ
ｏ１群で２００±３０％に増加し、利尿作用が証明され
た。またウナギに投与した際（ｎ＝８）、０．０３ｎｍ
ｏ１群で１２％、０、３ｎｍｏ１群で１７％の血圧降下
作用が認められた。

（発明の効果） 本発明によれば、新規なペプチドを提供することができ
、このペプチドは従来単離されている利尿ペプチドに比
べて、生理活性の持続性に優れており、利尿剤または降
圧剤として用いる場合、効果が持続しうる、実用性の高
い治療薬とすることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は逆相高速液体クロマトグラフィーによるウナギ
ＡＮＰの？岩田を示す図である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）次のアミノ酸配列、 ▲数式、化学式、表等があります▼ （但し、７位のシステイン残基と２３位のシステイン残
   基はジスルフィド結合している）を有するペプチドまた
   はその塩。
2. （２）請求項（１）記載のペプチドまたはその塩を有効
   成分とする利尿剤。
3. （３）請求項（１）記載のペプチドまたはその塩を有効
   成分とする降圧剤。