JPH04120095A - カエル由来新規生理活性ペプチド(カエルcnp) - Google Patents
カエル由来新規生理活性ペプチド(カエルcnp)Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
本発明は、カエル由来のナトリウム利尿作用及び血圧降
下作用を有する新規な生理活性ペプチドに関する。さら
に詳しくはC型ナトリウム利尿ペプチドに帰属される新
規生理活性ペプチドの単離・同定及びその利用方法に関
する。
下作用を有する新規な生理活性ペプチドに関する。さら
に詳しくはC型ナトリウム利尿ペプチドに帰属される新
規生理活性ペプチドの単離・同定及びその利用方法に関
する。
(従来の技術)
近年、哺乳動物において心房及び脳から、ナトリウム利
尿ペプチド(natriuretic peptide
;NP)と呼ばれる種々のペプチドが発見されてきた。
尿ペプチド(natriuretic peptide
;NP)と呼ばれる種々のペプチドが発見されてきた。
現在これらNPは、アミノ酸−次配列の類似性及びそれ
らの前駆体構造から、3つのタイプ、すなわちA型N
P (A−type natriuretic pep
tide;ANP)、B型N P (B−type n
atriuretic peptide;BNP)及び
C型N P (C−type natriuretic
peptide;CNP)のいずれかに分類すること
ができる。
らの前駆体構造から、3つのタイプ、すなわちA型N
P (A−type natriuretic pep
tide;ANP)、B型N P (B−type n
atriuretic peptide;BNP)及び
C型N P (C−type natriuretic
peptide;CNP)のいずれかに分類すること
ができる。
このうち、ANP−BNPは最初それぞれ心房、脳から
単離・同定されたことから、ANPは心房性ナトリウム
利尿ペプチド(atrial natriuretic
peptide) 、B N Pは脳ナトリウム利尿
ペプチド(brain natriuretic pe
ptide)とも呼ばれている(Matsuo、H,a
nd Nakazato、H,Endocrinol、
Metab、 C11n、North Am、、16.
43.1987; 5udoh T、et al、
Nature、 332,78,1988) 、しかし
現在、ANPは心房のみならず、脳にも存在しているこ
と、同様にBNPは脳のみならず心房にも存在してぃる
ことが判り、また、ANP−BNPはナトリウム利尿作
用及び血圧降下作用を示すことから、ANP −BNP
はいずれも吐乳類の体液及び血圧の恒常性を調節するホ
ルモンとして、また脳においては神経伝達物質として作
用していることが明らかになってきた。
単離・同定されたことから、ANPは心房性ナトリウム
利尿ペプチド(atrial natriuretic
peptide) 、B N Pは脳ナトリウム利尿
ペプチド(brain natriuretic pe
ptide)とも呼ばれている(Matsuo、H,a
nd Nakazato、H,Endocrinol、
Metab、 C11n、North Am、、16.
43.1987; 5udoh T、et al、
Nature、 332,78,1988) 、しかし
現在、ANPは心房のみならず、脳にも存在しているこ
と、同様にBNPは脳のみならず心房にも存在してぃる
ことが判り、また、ANP−BNPはナトリウム利尿作
用及び血圧降下作用を示すことから、ANP −BNP
はいずれも吐乳類の体液及び血圧の恒常性を調節するホ
ルモンとして、また脳においては神経伝達物質として作
用していることが明らかになってきた。
GNPはごく最近5udohらにより、ANP−’BN
Pのいずれにも帰属されない新しいタイプのNPとして
ブタ脳から単離・同定された(Sudoh、Tet a
l、 Biochem、 Biophys、Res、C
ommun、、里、863゜1990)。すなわち、G
NPは22アミノ酸残基より成り、ANP −BNPと
同様2個のシスティン残基を含んでおり、これが分子内
でジスルフィド結合を形成し、17アミノ酸残基より構
成された環状構造を持っている。しかもこの環状構造を
形成しているアミノ酸−次配列にはANP−BNPのそ
れらと高い相同性が見いだされた。GNPの構造上の特
徴はANP−BNPがいずれも上記環状構造のC−末端
部分にさらに数個のアミノ酸が付加したいわゆるテイル
構造(tail構造)を持っているのに対し、GNPに
はこの構造がない。すなわち、CNPのC−末端はシス
ティン残基で終わっている。このことから、GNPの構
造はANP・BNPと似ているが、これらとは全く異な
っていることか判り、また、CNPかナトリウム利尿作
用及び血圧降下作用を示し、かつヒヨコ直腸標本を用い
た弛緩活性でANP −BNPに比べ高い比活性を示す
ことから、GNPは新しいタイプのNPであることが判
った。
Pのいずれにも帰属されない新しいタイプのNPとして
ブタ脳から単離・同定された(Sudoh、Tet a
l、 Biochem、 Biophys、Res、C
ommun、、里、863゜1990)。すなわち、G
NPは22アミノ酸残基より成り、ANP −BNPと
同様2個のシスティン残基を含んでおり、これが分子内
でジスルフィド結合を形成し、17アミノ酸残基より構
成された環状構造を持っている。しかもこの環状構造を
形成しているアミノ酸−次配列にはANP−BNPのそ
れらと高い相同性が見いだされた。GNPの構造上の特
徴はANP−BNPがいずれも上記環状構造のC−末端
部分にさらに数個のアミノ酸が付加したいわゆるテイル
構造(tail構造)を持っているのに対し、GNPに
はこの構造がない。すなわち、CNPのC−末端はシス
ティン残基で終わっている。このことから、GNPの構
造はANP・BNPと似ているが、これらとは全く異な
っていることか判り、また、CNPかナトリウム利尿作
用及び血圧降下作用を示し、かつヒヨコ直腸標本を用い
た弛緩活性でANP −BNPに比べ高い比活性を示す
ことから、GNPは新しいタイプのNPであることが判
った。
以上のことから、現在哺乳動物においては少なくとも3
つの異なったタイプに属する種々のNPペプチドか存在
し、これらが体液量及び血圧の恒常性(ホメオスタシス
)の調節に関与していることが判ってきた。なお、現在
までのところGNPの生体内分布及び生理作用の詳細に
ついてはANP−BNPはど明確には判っていない。
つの異なったタイプに属する種々のNPペプチドか存在
し、これらが体液量及び血圧の恒常性(ホメオスタシス
)の調節に関与していることが判ってきた。なお、現在
までのところGNPの生体内分布及び生理作用の詳細に
ついてはANP−BNPはど明確には判っていない。
一方、非補乳類を椎動物においても、NPの存在が確認
されている。しかし現在までに、カエルANP、ニワト
リNP及びウナギANPが単離・同定されているだけで
、非唾乳類動物のNPに関する情報は哺乳類のそれに比
べ、はるかに少ない(Sakata、J、、Kanga
wa、に、and Matsuo、H,Biochem
。
されている。しかし現在までに、カエルANP、ニワト
リNP及びウナギANPが単離・同定されているだけで
、非唾乳類動物のNPに関する情報は哺乳類のそれに比
べ、はるかに少ない(Sakata、J、、Kanga
wa、に、and Matsuo、H,Biochem
。
Biophys、Res、Commun、、155.1
338−1345.1988; Miyata、A、、
Minamino、N、、Kangawa、に、and
Matsuo、HBiochem、Biophys
、 Res 、Commun 、 、 155 、13
30−1337 、1988Takei Y、 Tak
ahashi、A、、Watanabe、T、X、、N
akajima、に、and 5akakibara、
S、 Biochem、Biophys、Res、Co
mmun、 164,537−543.1989)。
338−1345.1988; Miyata、A、、
Minamino、N、、Kangawa、に、and
Matsuo、HBiochem、Biophys
、 Res 、Commun 、 、 155 、13
30−1337 、1988Takei Y、 Tak
ahashi、A、、Watanabe、T、X、、N
akajima、に、and 5akakibara、
S、 Biochem、Biophys、Res、Co
mmun、 164,537−543.1989)。
ところで、哺乳類で見つけ出された生理活性ペプチドと
よく似たペプチドが両棲類から見いだされることがしば
しばある(Erspamer、V、and Melch
iori、P、Trends Pharmacol、S
ci、、1.391−395,198ONakajim
a、T、Trends Pharmacol、Sci、
、ス、202−2051981)。実際、本発明者らは
、ブタを髄中の未知ペプチドを探索した結果、両棲類で
見いだされたペプチドとよく似たペプチドを見いだすこ
とに成功している(Minamino、N、Kanga
wa、に、and Matsu。
よく似たペプチドが両棲類から見いだされることがしば
しばある(Erspamer、V、and Melch
iori、P、Trends Pharmacol、S
ci、、1.391−395,198ONakajim
a、T、Trends Pharmacol、Sci、
、ス、202−2051981)。実際、本発明者らは
、ブタを髄中の未知ペプチドを探索した結果、両棲類で
見いだされたペプチドとよく似たペプチドを見いだすこ
とに成功している(Minamino、N、Kanga
wa、に、and Matsu。
、H,Biochem、Biophys、Res、Co
mmun、、114,541−5481983; Mi
namino、N、、Kangawa、に、and M
atsuo、H,Biochem、Biophys、R
es、Commun、、119.14−20.1984
; MLnamino、N、、5udoh、T、Kan
gawa、に、and Matsuo、H,Pepti
des、6(Suppl、3) 、245−248.1
985)。
mmun、、114,541−5481983; Mi
namino、N、、Kangawa、に、and M
atsuo、H,Biochem、Biophys、R
es、Commun、、119.14−20.1984
; MLnamino、N、、5udoh、T、Kan
gawa、に、and Matsuo、H,Pepti
des、6(Suppl、3) 、245−248.1
985)。
このことから、両棲類でも吐乳類と同様、今までに知ら
れているカエルANP (カエルANPは吐乳類のAN
Pに帰属される)以外に、タイプの異なるNPが存在し
ている可能性が高い。しかしながら、現在までに両棲類
からカエルANP以外の新規NPを単離・同定した報告
はない。
れているカエルANP (カエルANPは吐乳類のAN
Pに帰属される)以外に、タイプの異なるNPが存在し
ている可能性が高い。しかしながら、現在までに両棲類
からカエルANP以外の新規NPを単離・同定した報告
はない。
(発明が解決しようとする課題)
従って本発明では、両棲類から既に知られているカエル
ANP以外の新規NPを単離・同定し、このペプチドを
提供する方法を確立することを目的とする。
ANP以外の新規NPを単離・同定し、このペプチドを
提供する方法を確立することを目的とする。
(課題を解決するための手段)
本発明者は、吐乳類のNPを単離・精製する際、ヒヨコ
直腸標本を用いた弛緩活性が、比較的簡単でしかも確実
なNPの生物活性測定法であったことに着目し、このア
ッセイを指標にカエル脳から新規NPを見いだすことを
計画した。
直腸標本を用いた弛緩活性が、比較的簡単でしかも確実
なNPの生物活性測定法であったことに着目し、このア
ッセイを指標にカエル脳から新規NPを見いだすことを
計画した。
本発明では、まず、カエルの脳を適当な酸性溶媒例えば
氷酢酸などの中でホモジネートし、これを出発原料に、
ペプチドの精製に常用される各種精製法を組み合せ、前
記したバイオアッセイを指標に分子量的3000を示す
ペプチド画分を精製したところ、最終的には第3図に示
すように、ヒヨコ直腸標本を用いたバイオアッセイ系で
弛緩活性を有するペプチドを単一で純粋な状態までに精
製することに成功した。次に、このペプチドの一部を還
元し、このペプチドに含まれるシスティン残基をカルボ
キシメチル化し、このペプチドのアミノ酸組成を求めた
ところこのペプチドは22個のアミノ酸残基から成るペ
プチドであることが判った。
氷酢酸などの中でホモジネートし、これを出発原料に、
ペプチドの精製に常用される各種精製法を組み合せ、前
記したバイオアッセイを指標に分子量的3000を示す
ペプチド画分を精製したところ、最終的には第3図に示
すように、ヒヨコ直腸標本を用いたバイオアッセイ系で
弛緩活性を有するペプチドを単一で純粋な状態までに精
製することに成功した。次に、このペプチドの一部を還
元し、このペプチドに含まれるシスティン残基をカルボ
キシメチル化し、このペプチドのアミノ酸組成を求めた
ところこのペプチドは22個のアミノ酸残基から成るペ
プチドであることが判った。
さらに、このペプチドのアミノ酸−次配列を決定したと
ころ、最終的にこのペプチドは以下に示す構造を有する
新規ペプチドであることを見いだした。
ころ、最終的にこのペプチドは以下に示す構造を有する
新規ペプチドであることを見いだした。
(4)Gly−Ala−Phe−Ser−Gly−Le
u−Gly−Cys−OH(式中、(1)と(2)、(
3)と(4)は直接結合しており、6位と22位のシス
ティン残基(Cys)は分子内でS−8結合を形成して
いる。) 以下本明細書において、この新規ペプチドをfCN P
(frog C−type natriuretic
peptide)と称する。
u−Gly−Cys−OH(式中、(1)と(2)、(
3)と(4)は直接結合しており、6位と22位のシス
ティン残基(Cys)は分子内でS−8結合を形成して
いる。) 以下本明細書において、この新規ペプチドをfCN P
(frog C−type natriuretic
peptide)と称する。
fCNPのアミノ酸−次配列及び構造を、今までに知ら
れている3つのタイプに分類されたNPのそれらと比較
したところ(第5図参照)、fCNPはCNPに帰属さ
れる新規ペプチドであることが判った。すなわち、fC
NPはCNPと同様22アミノ酸残基より構成されてお
り、しかもGNPの構造的特徴に一致してC−末端テイ
ル構造を持っていない。また、fCNPのアミノ酸−次
配列の相同性をANP、BNP及びCNPと比べると、
fCNPはGNPと最も高い相同性を持っていることが
判った。実際、fCNPとGNPのアミノ酸−次配列を
比較すると22アミノ酸残基のうち、17アミノ酸残基
が全く同一であった。しかも、残りの異なる5アミノ酸
残基についても、それらアミノ酸残基の性質(アミノ酸
残基の塩基性及び疎水性などの性質)は同じであること
が判った。さらに、fCNPをラットに投与するとナト
リウム利尿作用及び血圧降下作用を示すことを見いたし
た。
れている3つのタイプに分類されたNPのそれらと比較
したところ(第5図参照)、fCNPはCNPに帰属さ
れる新規ペプチドであることが判った。すなわち、fC
NPはCNPと同様22アミノ酸残基より構成されてお
り、しかもGNPの構造的特徴に一致してC−末端テイ
ル構造を持っていない。また、fCNPのアミノ酸−次
配列の相同性をANP、BNP及びCNPと比べると、
fCNPはGNPと最も高い相同性を持っていることが
判った。実際、fCNPとGNPのアミノ酸−次配列を
比較すると22アミノ酸残基のうち、17アミノ酸残基
が全く同一であった。しかも、残りの異なる5アミノ酸
残基についても、それらアミノ酸残基の性質(アミノ酸
残基の塩基性及び疎水性などの性質)は同じであること
が判った。さらに、fCNPをラットに投与するとナト
リウム利尿作用及び血圧降下作用を示すことを見いたし
た。
以上のことから、fCNPはGNPに帰属される新規ペ
プチドであることが判明し、本発明を完成するに至った
。
プチドであることが判明し、本発明を完成するに至った
。
なお、本発明でfCNPの構造が開示されたことから、
fCNPを得るには本明細書に示したカエルの脳から精
製する方法さらに化学合成を用いる方法以外に、遺伝子
工学的手法を用いてこれを製造することもできる。また
、fCNPは顕著なナトリウム利尿作用及び血圧降下作
用を示すことから、これを医薬品へと応用することもで
きる。
fCNPを得るには本明細書に示したカエルの脳から精
製する方法さらに化学合成を用いる方法以外に、遺伝子
工学的手法を用いてこれを製造することもできる。また
、fCNPは顕著なナトリウム利尿作用及び血圧降下作
用を示すことから、これを医薬品へと応用することもで
きる。
以下実施例により本発明の詳細な説明する。
実施例1.カエル からのfCNPの
■製
カエル157匹から47gの脳を摘出し、細断した後、
プロテアーゼを不活化するために10容量の沸騰水で8
分間処理した。冷却後氷酢酸を最終濃度がIMになるよ
うに加え、この組織をポリトロンミキサーを用いて5分
間ホモジナイズした。次に、このホモシネイトを遠心分
離することによす(14500x g 、 35分)、
沈澱画分と上清画分に分離し、この上清画分を2容量の
水で希釈し、逆相C−18カラムにかけた(90d、C
hemco LC−3ORB 5PW−C−ODS)。
プロテアーゼを不活化するために10容量の沸騰水で8
分間処理した。冷却後氷酢酸を最終濃度がIMになるよ
うに加え、この組織をポリトロンミキサーを用いて5分
間ホモジナイズした。次に、このホモシネイトを遠心分
離することによす(14500x g 、 35分)、
沈澱画分と上清画分に分離し、この上清画分を2容量の
水で希釈し、逆相C−18カラムにかけた(90d、C
hemco LC−3ORB 5PW−C−ODS)。
カラムを0.5M酢酸で洗浄後、カラムに吸着したペプ
チドを01%トリフルオロ酢酸(TFA)を含む60%
アセトニトリル(CH3CN)で溶出し、この溶出液を
濃縮した。次に、1M酢酸で平衡化したSP−セファデ
ックスC−25カラム(H”form、10d)を用い
たイオン交換クロマトグラフィーにかけた。次に、カラ
ムに吸着したペプチドを1M酢酸、2Mピリジン、及び
2Mピリジン−酢酸(pH5,0)を用いて溶出し、各
溶出液による溶出画分を5P−I、5p−n及びsp−
mとし、これらをそれぞれ凍結乾燥した。このようにし
て得たsp−m画分40■(乾燥重量)をセファツデク
スG−50カラム(fine、 1.8x134cm
;ファルマシア)を用いたゲル濾過にかけた。第1図に
ゲル濾過の様子を示す。溶媒は1M酢酸、フラクション
サイズは5.0+d/チユーブ、流速はLO,Od/h
rである。第1図中、斜線付きボックスはヒヨコ直腸弛
緩活性を有するフラクション49−57を示す。
チドを01%トリフルオロ酢酸(TFA)を含む60%
アセトニトリル(CH3CN)で溶出し、この溶出液を
濃縮した。次に、1M酢酸で平衡化したSP−セファデ
ックスC−25カラム(H”form、10d)を用い
たイオン交換クロマトグラフィーにかけた。次に、カラ
ムに吸着したペプチドを1M酢酸、2Mピリジン、及び
2Mピリジン−酢酸(pH5,0)を用いて溶出し、各
溶出液による溶出画分を5P−I、5p−n及びsp−
mとし、これらをそれぞれ凍結乾燥した。このようにし
て得たsp−m画分40■(乾燥重量)をセファツデク
スG−50カラム(fine、 1.8x134cm
;ファルマシア)を用いたゲル濾過にかけた。第1図に
ゲル濾過の様子を示す。溶媒は1M酢酸、フラクション
サイズは5.0+d/チユーブ、流速はLO,Od/h
rである。第1図中、斜線付きボックスはヒヨコ直腸弛
緩活性を有するフラクション49−57を示す。
この活性フラクションをまとめて凍結乾燥し、さらにC
M陽イオン交換体によるHP’LCカラム(TSKゲル
CM−2SW: 4.6x250mm、Tosoh)で
精製した。下記(A)と(B)の溶媒系を使用し、(A
) : (B) =50:50からO:100の直線濃
度勾配で20分かけて流速1.0 HI3分で溶出した
。
M陽イオン交換体によるHP’LCカラム(TSKゲル
CM−2SW: 4.6x250mm、Tosoh)で
精製した。下記(A)と(B)の溶媒系を使用し、(A
) : (B) =50:50からO:100の直線濃
度勾配で20分かけて流速1.0 HI3分で溶出した
。
(A) 10mM HCOONH4(pH6,6)、C
HsCN=90:10(V/V)(B) 1.OM H
COONH,(pH6,6):CHsCN=90:10
(V/V)溶出の様子を第2図に示す。このクロマトグ
ラフィーにおいて、ヒヨコ直腸弛緩活性の大部分は溶出
時間36−39分に溶出され、15−18分及び22.
5−255分に溶出される画分にも小さいピークが観察
された。
HsCN=90:10(V/V)(B) 1.OM H
COONH,(pH6,6):CHsCN=90:10
(V/V)溶出の様子を第2図に示す。このクロマトグ
ラフィーにおいて、ヒヨコ直腸弛緩活性の大部分は溶出
時間36−39分に溶出され、15−18分及び22.
5−255分に溶出される画分にも小さいピークが観察
された。
36−39分に溶出されたヒヨコ直腸弛緩活性フラクシ
ョンをケムコソルブ(chemcosorb) 30D
S−Hカラム(8,Ox75mm、 chemco)に
よる逆相HPLCでさらに精製した。下記(A)と(B
)の溶媒系を使用し、(A)から(B)への直線濃度勾
配で120分かけて流速2.0 d/分で溶出した。
ョンをケムコソルブ(chemcosorb) 30D
S−Hカラム(8,Ox75mm、 chemco)に
よる逆相HPLCでさらに精製した。下記(A)と(B
)の溶媒系を使用し、(A)から(B)への直線濃度勾
配で120分かけて流速2.0 d/分で溶出した。
(A) H2O:CH,CN:10%TFA=90 :
10 : 1 (V/V)(B) H2O:CH3C
N:10%TFA=40:6叶1 (V/V)溶出の様
子を第3図に示す。ヒヨコ直腸弛緩活性は図中の黒いボ
ックス部分のみに観察された。
10 : 1 (V/V)(B) H2O:CH3C
N:10%TFA=40:6叶1 (V/V)溶出の様
子を第3図に示す。ヒヨコ直腸弛緩活性は図中の黒いボ
ックス部分のみに観察された。
本発明におけるfCNPの最終精製は、この活性フラク
ションをさらにμmボンダスフェア(B。
ションをさらにμmボンダスフェア(B。
ndasphere) C−18(3,9x150mm
、 300 A、faters)を用いた逆相HPLC
に供することにより、実質的に純粋なペプチドとして得
ることができた。
、 300 A、faters)を用いた逆相HPLC
に供することにより、実質的に純粋なペプチドとして得
ることができた。
なお、後記アミノ酸分析の結果に基づいて計算したfC
NPの収量は920pmolであった。
NPの収量は920pmolであった。
実施例2.fCNPの 浩°定
A、fCNPのS−カルボキシメチル
実施例1で得たfCNPを0.5M Tris−HCI
バッファー (pH8,5)中20mMのジチオスレイ
トール(DTT )を用い、37℃、4時間反応させ、
次いで60mMのヨード酢酸ナトリウム(sodium
monoiodoacetie acid)を加え2
0分間処理することにより、fCNPのS−力ルボキシ
メチル体すなわち(R’ CM)fCNPを得た。
バッファー (pH8,5)中20mMのジチオスレイ
トール(DTT )を用い、37℃、4時間反応させ、
次いで60mMのヨード酢酸ナトリウム(sodium
monoiodoacetie acid)を加え2
0分間処理することにより、fCNPのS−力ルボキシ
メチル体すなわち(R’ CM)fCNPを得た。
この(RCM)fCNPを、μmポンダスフェア(Bo
ndasphere) C−18(3,9x150mm
、 300A、Waters)を用いた逆相HPLCに
供し、0.1%TFA中のアセトニトリル10−60%
の直線勾配により、流速1.0d/分で60分間溶出す
ることにより精製した。
ndasphere) C−18(3,9x150mm
、 300A、Waters)を用いた逆相HPLCに
供し、0.1%TFA中のアセトニトリル10−60%
の直線勾配により、流速1.0d/分で60分間溶出す
ることにより精製した。
B、 RCM fCNPのアミノ の 定実施
例2のAで得た(ROM)fCNP約200p!110
1を、まず0.1%フェノールと002%の2−メルカ
プトエタノールを含んだ6N塩酸で110℃、20時間
処理することにより(ROM)fCNPを完全水解した
。次にこのサンプルを日立L−83.57ミノ酸分析機
を用いて(RCM)fCNPのアミノ酸組成を求めたと
ころ、第1表に示す値が得られ、この結果fCNPは2
個のシスティン残基を含む22個のアミノ酸残基より成
るペプチドであることが判った。
例2のAで得た(ROM)fCNP約200p!110
1を、まず0.1%フェノールと002%の2−メルカ
プトエタノールを含んだ6N塩酸で110℃、20時間
処理することにより(ROM)fCNPを完全水解した
。次にこのサンプルを日立L−83.57ミノ酸分析機
を用いて(RCM)fCNPのアミノ酸組成を求めたと
ころ、第1表に示す値が得られ、この結果fCNPは2
個のシスティン残基を含む22個のアミノ酸残基より成
るペプチドであることが判った。
第1表は(ROM)fCNPのアミノ酸組成を示す。な
お、0内の数値は測定値に最も近い整数を示し、CmC
ysはS−カルボキシメチルシスティンを示す。
お、0内の数値は測定値に最も近い整数を示し、CmC
ysはS−カルボキシメチルシスティンを示す。
第1表
(ROM)
CNP
1.18
1.02
1.87
合計
C,RCM fCNPのアミノ − 配 の固定
実施例2のAで作製した(RCM)fCNP約200p
molを用い、アミノ酸配列自動分析機(Applie
d Biosystems 470A/120A)に供
し、エドマン分解法によりアミノ酸−次配列を分析した
結果、第4図に示す結果か得られた。同図中、各アミノ
酸は一文字表記で表され、CmはS−カルボキシメチル
システィン残基を示す。この結果に基づいて(ROM)
fCNPのアミノ酸−次配列が決定された(第5図参照
)。
molを用い、アミノ酸配列自動分析機(Applie
d Biosystems 470A/120A)に供
し、エドマン分解法によりアミノ酸−次配列を分析した
結果、第4図に示す結果か得られた。同図中、各アミノ
酸は一文字表記で表され、CmはS−カルボキシメチル
システィン残基を示す。この結果に基づいて(ROM)
fCNPのアミノ酸−次配列が決定された(第5図参照
)。
D、fCNPの 合 びS−8合 の同定
実施例2のCで決定したアミノ酸−次配列を基にfCN
Pをペプチド合成機(Applied Biosyst
ems 430A)を用いた固相合成法で合成した。な
お、合成の際システィン残基のSH保護基として4−メ
チルベンジル(4−methylbenzyl)基を用
い、HFを用いて完全脱保護した後、fCNPの6.2
2位のシスティン残基のSH基をフェリシアン化カリウ
ム[KsFe(CN)s]で処理することにより分子内
S−8結合を形成させた。このようにして合成したfC
NPは、アミノ酸分析、アミノ酸−次配列の解析を行い
その構造を確認した。さらに、この化学合成したfCN
Pと実施例1で得た天然由来のfCNPは、HPLCの
溶出時間が完全に一致し、合成fCNPもヒヨコ直腸弛
緩活性を示したことから、最終的にfCNPの構造は、
(4)Gly−Ala−Phe−3er−Gly−Le
u−Gly−Cys−OH(式中、(1)と(2)、(
3)と(4)は直接結合しており、6位と22位のシス
ティン残基(Cys)は分子内でS−8結合を形成して
いる。)であると決定した。
Pをペプチド合成機(Applied Biosyst
ems 430A)を用いた固相合成法で合成した。な
お、合成の際システィン残基のSH保護基として4−メ
チルベンジル(4−methylbenzyl)基を用
い、HFを用いて完全脱保護した後、fCNPの6.2
2位のシスティン残基のSH基をフェリシアン化カリウ
ム[KsFe(CN)s]で処理することにより分子内
S−8結合を形成させた。このようにして合成したfC
NPは、アミノ酸分析、アミノ酸−次配列の解析を行い
その構造を確認した。さらに、この化学合成したfCN
Pと実施例1で得た天然由来のfCNPは、HPLCの
溶出時間が完全に一致し、合成fCNPもヒヨコ直腸弛
緩活性を示したことから、最終的にfCNPの構造は、
(4)Gly−Ala−Phe−3er−Gly−Le
u−Gly−Cys−OH(式中、(1)と(2)、(
3)と(4)は直接結合しており、6位と22位のシス
ティン残基(Cys)は分子内でS−8結合を形成して
いる。)であると決定した。
ヒヨコ直腸弛緩活性はKangawa等及びCurri
e等の方法(Kangawa、に、and Matsu
o、H,、Biochem、Biophys、Res、
Commun、、118.131−139,1984;
Currie、M、G、 、Ge1ler 、D 、
M、 、Co1e 、 B、R、、Boylar 、J
、G 、 、 Yusheng 。
e等の方法(Kangawa、に、and Matsu
o、H,、Biochem、Biophys、Res、
Commun、、118.131−139,1984;
Currie、M、G、 、Ge1ler 、D 、
M、 、Co1e 、 B、R、、Boylar 、J
、G 、 、 Yusheng 。
W、 、Hormberg、S、W、and Need
leman、P、 、5cience、22171−7
3.1983)に従い測定した。測定値は6回の繰り返
しの平均である。その結果を第2表に示す。この測定法
でfCNPはα−hANP及びfANP−21に比べ各
々約3倍〜約7倍高い活性を示した。なお、fCNPは
、類似ペプチドにとって利尿作用等の生物活性を発揮す
るために重要と考えられていたC−末端のテール配列(
WatanabeT、X、 、Noda、Y、 、Ch
ino、N、 、N15hiuchi 、 Y、 、K
umura 、T、5akakibara、S、and
Imai、M、、Eur、J、Pharmacol。
leman、P、 、5cience、22171−7
3.1983)に従い測定した。測定値は6回の繰り返
しの平均である。その結果を第2表に示す。この測定法
でfCNPはα−hANP及びfANP−21に比べ各
々約3倍〜約7倍高い活性を示した。なお、fCNPは
、類似ペプチドにとって利尿作用等の生物活性を発揮す
るために重要と考えられていたC−末端のテール配列(
WatanabeT、X、 、Noda、Y、 、Ch
ino、N、 、N15hiuchi 、 Y、 、K
umura 、T、5akakibara、S、and
Imai、M、、Eur、J、Pharmacol。
147.49−57.1988) カ欠失しテいルが、
pCNP (ブタ由来GNP)と匹敵する強い直腸弛緩
活性を保持していた。
pCNP (ブタ由来GNP)と匹敵する強い直腸弛緩
活性を保持していた。
第2表
利尿ペプチド
相対活性
αhANP 100fCNP
321fANP−2147 fANP−243,7 pCNP 472 pBNP−26270 相対活性はαhANPの活性を100として等モル量の
ペプチドの活性である。
321fANP−2147 fANP−243,7 pCNP 472 pBNP−26270 相対活性はαhANPの活性を100として等モル量の
ペプチドの活性である。
B、fCNPのナトリウム 用 び血庄屋
fCNPの利尿作用については、Kangawa等及び
5udoh等の方法に従い測定した(Kangawa
et al 、 Biochem、Biophys、R
es、Commun 、 、 118 、131−13
9 、1984;5udoh、T、、Kangawa、
に、、Minamino、N、 and Matsuo
、H,、Nature、332.78−81.1988
) 、すなわち、雄性SDラット(体重300−400
g )にベンドパルビタール50■/kgを腹腔的投
与し、麻酔し、気道確保のため気管カニユーレ(PE−
240クレイ・アダムス社製)を施す。股動脈に血圧測
定用のカニユーレ(PE−50)を挿入し、また、股静
脈に挿入したカニユーレ(PE−10)を通じてリンゲ
ル液を1.8N1/hrの速度で定常注入する。シラス
ティックチューブ(内径0,02インチ、外径0.03
フインチ、ダウコーニング社製)の膀胱カニユーレより
試験管内に採尿し、この採尿は被験物質を投与する15
分間と投与後5分間ずつ15分後まで及びその後経時的
に行った。この試料の量そして試料中の電解質濃度を比
較することにより、及び血圧の変化により被験物質の作
用を測定した。
5udoh等の方法に従い測定した(Kangawa
et al 、 Biochem、Biophys、R
es、Commun 、 、 118 、131−13
9 、1984;5udoh、T、、Kangawa、
に、、Minamino、N、 and Matsuo
、H,、Nature、332.78−81.1988
) 、すなわち、雄性SDラット(体重300−400
g )にベンドパルビタール50■/kgを腹腔的投
与し、麻酔し、気道確保のため気管カニユーレ(PE−
240クレイ・アダムス社製)を施す。股動脈に血圧測
定用のカニユーレ(PE−50)を挿入し、また、股静
脈に挿入したカニユーレ(PE−10)を通じてリンゲ
ル液を1.8N1/hrの速度で定常注入する。シラス
ティックチューブ(内径0,02インチ、外径0.03
フインチ、ダウコーニング社製)の膀胱カニユーレより
試験管内に採尿し、この採尿は被験物質を投与する15
分間と投与後5分間ずつ15分後まで及びその後経時的
に行った。この試料の量そして試料中の電解質濃度を比
較することにより、及び血圧の変化により被験物質の作
用を測定した。
なお、被験物質fCNPは、その所定量を0.IN酢酸
に溶解した後、1/10容量の13Mトリス溶液で中和
する。これを50μlの滅菌生理水で希釈し、頚静脈か
ら投与した。この結果、第3表に示すように、fCNP
はナトリウム利尿作用及び血圧降下作用を示すことが判
り、さらに、これらの作用は用量依存的に増大すること
が判った。
に溶解した後、1/10容量の13Mトリス溶液で中和
する。これを50μlの滅菌生理水で希釈し、頚静脈か
ら投与した。この結果、第3表に示すように、fCNP
はナトリウム利尿作用及び血圧降下作用を示すことが判
り、さらに、これらの作用は用量依存的に増大すること
が判った。
第3表に、fCNPのナトリウム利尿作用及び血圧降下
作用をα−hANPと比較して示す。
作用をα−hANPと比較して示す。
第3表
α−hANP 3.0461±51
572±84 291±19445±67なお、第3表
中、利尿及びナトリウム利尿応答は、麻酔ラットへペプ
チドを静脈注射する前及び後に、各15分間の尿サンプ
ルを集め、尿量、Na+、K+及びCI−の排泄量の変
化の%(平均上標準誤差)として示した。各ペプチドに
3匹のラットを用いた。
中、利尿及びナトリウム利尿応答は、麻酔ラットへペプ
チドを静脈注射する前及び後に、各15分間の尿サンプ
ルを集め、尿量、Na+、K+及びCI−の排泄量の変
化の%(平均上標準誤差)として示した。各ペプチドに
3匹のラットを用いた。
fCNPの利尿及びナトリウム利尿作用は、α−hAN
Pに比べて、約100分の1程度に低かった。fCNP
はまた、麻酔ラットに投与したところ弱い血圧降下作用
も示した。典型的実験において、10nmolのfCN
Pは、心収縮期の血圧を約3゜分間にわたって25−3
25−3O低下させた。これらの結果はpCNPの結果
(Sudoh、T、 、Minamino、N、 、K
angawa、に、 and Matsuo、H,、B
iochem、Biophys、ResCommun、
、168,863−870.1990)と非常に類似し
ている。
Pに比べて、約100分の1程度に低かった。fCNP
はまた、麻酔ラットに投与したところ弱い血圧降下作用
も示した。典型的実験において、10nmolのfCN
Pは、心収縮期の血圧を約3゜分間にわたって25−3
25−3O低下させた。これらの結果はpCNPの結果
(Sudoh、T、 、Minamino、N、 、K
angawa、に、 and Matsuo、H,、B
iochem、Biophys、ResCommun、
、168,863−870.1990)と非常に類似し
ている。
(発明の効果)
以上のように、本発明者は、カエルの脳よりヒヨコ直腸
弛緩活性を指標として新規生理活性ペプチド(fCNP
)を単離・同定することに成功すると共に、このペプチ
ドがナトリウム利尿作用及び血圧降下作用を示すことを
見いだし、このペプチドがGNPに帰属される新規ペプ
チドであることを明らかにした。
弛緩活性を指標として新規生理活性ペプチド(fCNP
)を単離・同定することに成功すると共に、このペプチ
ドがナトリウム利尿作用及び血圧降下作用を示すことを
見いだし、このペプチドがGNPに帰属される新規ペプ
チドであることを明らかにした。
本発明でfCNPが単離・同定されたことにより、カエ
ルと哺乳類ではANPを共有するのみならずGNPをも
共有していることが判明した。このことは、ANP及び
GNPが進化の初期の過程から体液量及び血圧の恒常性
を調節するのに重要な役割を果たしているペプチドであ
ることを示唆している。
ルと哺乳類ではANPを共有するのみならずGNPをも
共有していることが判明した。このことは、ANP及び
GNPが進化の初期の過程から体液量及び血圧の恒常性
を調節するのに重要な役割を果たしているペプチドであ
ることを示唆している。
また、本発明で特に注目すべきことは、fCNPの脳内
組織濃度が50pmol/ g組織湿重量と高くこの濃
度が哺乳類ANP及びBNPの脳内濃度よりはるかに高
いことである。このことは、現在のところfCNPの心
房における存在量が判っていないか、GNPがおもに脳
内において神経伝達系に作用し、生体内の体液量及び血
圧の恒常性の調節に関与していることを示唆している(
なお、先にも述へたが、咽乳動物ではANP−BNPは
脳及び心房にも存在しているが、その存在量は心房が圧
倒的に高いことが判っている。また、ブタの脳において
は、GNPの存在量はBNPとほぼ同程度であり、AN
Pと比べると約20倍量存在している)。さらには、本
発明によりfCNPの構造か明らかになったことから、
このアミノ酸−次配列を先に本発明者らにより明らかに
されたブタ脳由来CNP (pCNP)と比較すればG
NPの構造活性相関を研究することができる。
組織濃度が50pmol/ g組織湿重量と高くこの濃
度が哺乳類ANP及びBNPの脳内濃度よりはるかに高
いことである。このことは、現在のところfCNPの心
房における存在量が判っていないか、GNPがおもに脳
内において神経伝達系に作用し、生体内の体液量及び血
圧の恒常性の調節に関与していることを示唆している(
なお、先にも述へたが、咽乳動物ではANP−BNPは
脳及び心房にも存在しているが、その存在量は心房が圧
倒的に高いことが判っている。また、ブタの脳において
は、GNPの存在量はBNPとほぼ同程度であり、AN
Pと比べると約20倍量存在している)。さらには、本
発明によりfCNPの構造か明らかになったことから、
このアミノ酸−次配列を先に本発明者らにより明らかに
されたブタ脳由来CNP (pCNP)と比較すればG
NPの構造活性相関を研究することができる。
以上のことから、本発明はGNPの生理的役割、ひいて
は生体内における体液量及び血圧の恒常性を調節するメ
カニズムを解明する上で、大いに貢献するものである。
は生体内における体液量及び血圧の恒常性を調節するメ
カニズムを解明する上で、大いに貢献するものである。
第1図は、カエル脳からの抽出物(SP−I[[分画を
さらにセファデックスG−50で分画したときの、溶出
経過及び各フラクションのヒヨコ直腸弛緩活性を示す図
である。 第2図は、第1図のセファデックスG−50で溶出した
活性フラクションを、CMイオン交換HPLCでさらに
精製したときの溶出経過及び各フラクションのヒヨコ直
腸弛緩活性を示す図である。 第3図は、第2図のCMイオン交換HPLCで36−3
9分目に溶出されたヒヨコ直腸弛緩活性フラクションを
ケムコソルブ(chemcosorb) 30DS−H
カラムによる逆相HPLCでさらに精製したときの様子
を示す図である。 第4図は、(ROM)fCNPのエドマン分解における
各サイクルのPTH−アミノ酸の収率及びアミノ酸配列
を示す図である。 第5図は、各種ANP、BNP、CNPのアミノ酸−次
配列及びこれらのペプチドのアミノ酸−次配列の相同性
を示す図である。
さらにセファデックスG−50で分画したときの、溶出
経過及び各フラクションのヒヨコ直腸弛緩活性を示す図
である。 第2図は、第1図のセファデックスG−50で溶出した
活性フラクションを、CMイオン交換HPLCでさらに
精製したときの溶出経過及び各フラクションのヒヨコ直
腸弛緩活性を示す図である。 第3図は、第2図のCMイオン交換HPLCで36−3
9分目に溶出されたヒヨコ直腸弛緩活性フラクションを
ケムコソルブ(chemcosorb) 30DS−H
カラムによる逆相HPLCでさらに精製したときの様子
を示す図である。 第4図は、(ROM)fCNPのエドマン分解における
各サイクルのPTH−アミノ酸の収率及びアミノ酸配列
を示す図である。 第5図は、各種ANP、BNP、CNPのアミノ酸−次
配列及びこれらのペプチドのアミノ酸−次配列の相同性
を示す図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 下記の構造式: ▲数式、化学式、表等があります▼ (式中、(1)と(2)、(3)と(4)は直接結合し
ており、6位と22位のシステイン残基(Cys)は分
子内でS−S結合を形成している。)を有する新規生理
活性ペプチド及びその酸付加塩。
Priority Applications (8)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2238294A JP2977159B2 (ja) | 1990-09-07 | 1990-09-07 | カエル由来新規生理活性ペプチド(カエルcnp) |
US07/754,958 US5336759A (en) | 1990-09-07 | 1991-09-04 | Biologically active peptide derived from frog (frog CNP) |
ES91115079T ES2127189T3 (es) | 1990-09-07 | 1991-09-06 | Peptido nuevo biologicamente activo procedente de una rana (rana-cpn). |
DK91115079T DK0475290T3 (da) | 1990-09-07 | 1991-09-06 | Et nyt biologisk aktivt peptid stammende fra frø (frø CNP) |
EP91115079A EP0475290B1 (en) | 1990-09-07 | 1991-09-06 | A novel biologically active peptide derived from frog (frog CNP) |
DE69130695T DE69130695T2 (de) | 1990-09-07 | 1991-09-06 | Neues, biologisch aktives, vom Frosch stammendes Peptid (Frosch-CNP) |
AT91115079T ATE175211T1 (de) | 1990-09-07 | 1991-09-06 | Neues, biologisch aktives, vom frosch stammendes peptid (frosch-cnp) |
GR990400722T GR3029632T3 (en) | 1990-09-07 | 1999-03-09 | A novel biologically active peptide derived from frog (frog CNP) |
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2238294A JP2977159B2 (ja) | 1990-09-07 | 1990-09-07 | カエル由来新規生理活性ペプチド(カエルcnp) |
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Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH04120095A true JPH04120095A (ja) | 1992-04-21 |
JP2977159B2 JP2977159B2 (ja) | 1999-11-10 |
Family
ID=17028056
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2238294A Expired - Fee Related JP2977159B2 (ja) | 1990-09-07 | 1990-09-07 | カエル由来新規生理活性ペプチド(カエルcnp) |
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Country | Link |
---|---|
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EP (1) | EP0475290B1 (ja) |
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AT (1) | ATE175211T1 (ja) |
DE (1) | DE69130695T2 (ja) |
DK (1) | DK0475290T3 (ja) |
ES (1) | ES2127189T3 (ja) |
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Cited By (3)
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WO2005094889A1 (ja) | 2004-03-31 | 2005-10-13 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 関節炎症治療剤又は予防剤 |
EP3446711A1 (en) | 2004-03-31 | 2019-02-27 | Kazuwa Nakao | Composition for increasing body height |
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IL142118A0 (en) * | 2001-03-20 | 2002-03-10 | Prochon Biotech Ltd | Method and composition for treatment of skeletal dysplasias |
DK3404102T3 (da) | 2004-04-21 | 2021-09-06 | Alexion Pharma Inc | Knogletilførselskonjugater og fremgangsmåde til anvendelse heraf til målretning af proteiner mod knogle |
KR20100057641A (ko) * | 2007-09-11 | 2010-05-31 | 몬도바이오테크 래보래토리즈 아게 | 인터메딘 47 및 53 펩티드의 치료적 용도 |
US9266939B2 (en) | 2010-12-27 | 2016-02-23 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Compositions comprising natriuretic peptides and methods of use thereof |
US10052366B2 (en) | 2012-05-21 | 2018-08-21 | Alexion Pharmaceuticsl, Inc. | Compositions comprising alkaline phosphatase and/or natriuretic peptide and methods of use thereof |
US10822596B2 (en) | 2014-07-11 | 2020-11-03 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for treating craniosynostosis |
JP6787894B2 (ja) | 2014-12-05 | 2020-11-18 | アレクシオン ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド | 組換えアルカリホスファターゼを用いた発作の処置 |
CA2973883A1 (en) | 2015-01-28 | 2016-08-04 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating a subject with an alkaline phosphatase deficiency |
CN108350440A (zh) | 2015-08-17 | 2018-07-31 | 阿雷克森制药公司 | 碱性磷酸酯的制造 |
EP3355904A4 (en) | 2015-09-28 | 2019-06-12 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | IDENTIFICATION OF EFFECTIVE DOSE SHEETS FOR TISSUE-SPECIFIC ALKALINE PHOSPHATASE ENZYMERSAT THERAPY OF HYPOPHOSPHATASIA |
WO2017074466A1 (en) | 2015-10-30 | 2017-05-04 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Methods for treating craniosynostosis in a patient |
US11065306B2 (en) | 2016-03-08 | 2021-07-20 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Methods for treating hypophosphatasia in children |
US10898549B2 (en) | 2016-04-01 | 2021-01-26 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Methods for treating hypophosphatasia in adolescents and adults |
MX2018011833A (es) | 2016-04-01 | 2019-02-13 | Alexion Pharma Inc | Tratamiento para la debilidad muscular con fosfatasas alcalinas. |
WO2017214130A1 (en) | 2016-06-06 | 2017-12-14 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Metal impact on manufacturing of alkaline phosphatases |
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CA3057502A1 (en) | 2017-03-31 | 2018-10-04 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Methods for treating hypophosphatasia (hpp) in adults and adolescents |
JP2021519590A (ja) | 2018-03-30 | 2021-08-12 | アレクシオン ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド | 糖タンパク質の製造 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2544929B2 (ja) * | 1987-06-17 | 1996-10-16 | 第一化学薬品 株式会社 | 新規生理活性ペプチド |
US5114923A (en) * | 1988-05-31 | 1992-05-19 | California Biotechnology Inc. | Recombinant techniques for production of novel natriuretic and vasodilator peptides |
-
1990
- 1990-09-07 JP JP2238294A patent/JP2977159B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1991
- 1991-09-04 US US07/754,958 patent/US5336759A/en not_active Expired - Fee Related
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- 1991-09-06 DK DK91115079T patent/DK0475290T3/da active
- 1991-09-06 AT AT91115079T patent/ATE175211T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-09-06 EP EP91115079A patent/EP0475290B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-06 DE DE69130695T patent/DE69130695T2/de not_active Expired - Fee Related
-
1999
- 1999-03-09 GR GR990400722T patent/GR3029632T3/el unknown
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WO2005094889A1 (ja) | 2004-03-31 | 2005-10-13 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 関節炎症治療剤又は予防剤 |
EP3446711A1 (en) | 2004-03-31 | 2019-02-27 | Kazuwa Nakao | Composition for increasing body height |
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