JPH04120095A

JPH04120095A - カエル由来新規生理活性ペプチド（カエルｃｎｐ）

Info

Publication number: JPH04120095A
Application number: JP2238294A
Authority: JP
Inventors: Toshiyuki Matsuo; 壽之松尾; Kenji Sagawa; 賢治寒川; Naoto Minamino; 直人南野
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1990-09-07
Filing date: 1990-09-07
Publication date: 1992-04-21
Anticipated expiration: 2014-11-10
Also published as: JP2977159B2; DE69130695D1; DE69130695T2; DK0475290T3; US5336759A; ES2127189T3; EP0475290B1; GR3029632T3; EP0475290A1; ATE175211T1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、カエル由来のナトリウム利尿作用及び血圧降
下作用を有する新規な生理活性ペプチドに関する。さら
に詳しくはＣ型ナトリウム利尿ペプチドに帰属される新
規生理活性ペプチドの単離・同定及びその利用方法に関
する。

（従来の技術）近年、哺乳動物において心房及び脳から、ナトリウム利
尿ペプチド（ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ　ｐｅｐｔｉｄｅ
；ＮＰ）と呼ばれる種々のペプチドが発見されてきた。

現在これらＮＰは、アミノ酸−次配列の類似性及びそれ
らの前駆体構造から、３つのタイプ、すなわちＡ型Ｎ　
Ｐ　（Ａ−ｔｙｐｅ　ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ　ｐｅｐ
ｔｉｄｅ；ＡＮＰ）、Ｂ型Ｎ　Ｐ　（Ｂ−ｔｙｐｅ　ｎ
ａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ　ｐｅｐｔｉｄｅ；ＢＮＰ）及び
Ｃ型Ｎ　Ｐ　（Ｃ−ｔｙｐｅ　ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ
　ｐｅｐｔｉｄｅ；ＣＮＰ）のいずれかに分類すること
ができる。

このうち、ＡＮＰ−ＢＮＰは最初それぞれ心房、脳から
単離・同定されたことから、ＡＮＰは心房性ナトリウム
利尿ペプチド（ａｔｒｉａｌ　ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ
　ｐｅｐｔｉｄｅ）　、Ｂ　Ｎ　Ｐは脳ナトリウム利尿
ペプチド（ｂｒａｉｎ　ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ　ｐｅ
ｐｔｉｄｅ）とも呼ばれている（Ｍａｔｓｕｏ、Ｈ，ａ
ｎｄ　Ｎａｋａｚａｔｏ、Ｈ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、
Ｍｅｔａｂ、　Ｃ１１ｎ、Ｎｏｒｔｈ　Ａｍ、、１６．
４３．１９８７；　５ｕｄｏｈ　Ｔ、ｅｔ　ａｌ、　　
Ｎａｔｕｒｅ、　３３２，７８，１９８８）　、しかし
現在、ＡＮＰは心房のみならず、脳にも存在しているこ
と、同様にＢＮＰは脳のみならず心房にも存在してぃる
ことが判り、また、ＡＮＰ−ＢＮＰはナトリウム利尿作
用及び血圧降下作用を示すことから、ＡＮＰ　−ＢＮＰ
はいずれも吐乳類の体液及び血圧の恒常性を調節するホ
ルモンとして、また脳においては神経伝達物質として作
用していることが明らかになってきた。

ＧＮＰはごく最近５ｕｄｏｈらにより、ＡＮＰ−’ＢＮ
Ｐのいずれにも帰属されない新しいタイプのＮＰとして
ブタ脳から単離・同定された（Ｓｕｄｏｈ、Ｔｅｔ　ａ
ｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃ
ｏｍｍｕｎ、、里、８６３゜１９９０）。すなわち、Ｇ
ＮＰは２２アミノ酸残基より成り、ＡＮＰ　−ＢＮＰと
同様２個のシスティン残基を含んでおり、これが分子内
でジスルフィド結合を形成し、１７アミノ酸残基より構
成された環状構造を持っている。しかもこの環状構造を
形成しているアミノ酸−次配列にはＡＮＰ−ＢＮＰのそ
れらと高い相同性が見いだされた。ＧＮＰの構造上の特
徴はＡＮＰ−ＢＮＰがいずれも上記環状構造のＣ−末端
部分にさらに数個のアミノ酸が付加したいわゆるテイル
構造（ｔａｉｌ構造）を持っているのに対し、ＧＮＰに
はこの構造がない。すなわち、ＣＮＰのＣ−末端はシス
ティン残基で終わっている。このことから、ＧＮＰの構
造はＡＮＰ・ＢＮＰと似ているが、これらとは全く異な
っていることか判り、また、ＣＮＰかナトリウム利尿作
用及び血圧降下作用を示し、かつヒヨコ直腸標本を用い
た弛緩活性でＡＮＰ　−ＢＮＰに比べ高い比活性を示す
ことから、ＧＮＰは新しいタイプのＮＰであることが判
った。

以上のことから、現在哺乳動物においては少なくとも３
つの異なったタイプに属する種々のＮＰペプチドか存在
し、これらが体液量及び血圧の恒常性（ホメオスタシス
）の調節に関与していることが判ってきた。なお、現在
までのところＧＮＰの生体内分布及び生理作用の詳細に
ついてはＡＮＰ−ＢＮＰはど明確には判っていない。

一方、非補乳類を椎動物においても、ＮＰの存在が確認
されている。しかし現在までに、カエルＡＮＰ、ニワト
リＮＰ及びウナギＡＮＰが単離・同定されているだけで
、非唾乳類動物のＮＰに関する情報は哺乳類のそれに比
べ、はるかに少ない（Ｓａｋａｔａ、Ｊ、、Ｋａｎｇａ
ｗａ、に、ａｎｄ　Ｍａｔｓｕｏ、Ｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍ
。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、、１５５．１
３３８−１３４５．１９８８；　Ｍｉｙａｔａ、Ａ、、
Ｍｉｎａｍｉｎｏ、Ｎ、、Ｋａｎｇａｗａ、に、ａｎｄ
　Ｍａｔｓｕｏ、ＨＢｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ　
、　Ｒｅｓ　、Ｃｏｍｍｕｎ　、　、　１５５　、１３
３０−１３３７　、１９８８Ｔａｋｅｉ　Ｙ、　Ｔａｋ
ａｈａｓｈｉ、Ａ、、Ｗａｔａｎａｂｅ、Ｔ、Ｘ、、Ｎ
ａｋａｊｉｍａ、に、ａｎｄ　５ａｋａｋｉｂａｒａ、
Ｓ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏ
ｍｍｕｎ、　１６４，５３７−５４３．１９８９）。

ところで、哺乳類で見つけ出された生理活性ペプチドと
よく似たペプチドが両棲類から見いだされることがしば
しばある（Ｅｒｓｐａｍｅｒ、Ｖ、ａｎｄ　Ｍｅｌｃｈ
ｉｏｒｉ、Ｐ、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、Ｓ
ｃｉ、、１．３９１−３９５，１９８ＯＮａｋａｊｉｍ
ａ、Ｔ、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、Ｓｃｉ、
、ス、２０２−２０５１９８１）。実際、本発明者らは
、ブタを髄中の未知ペプチドを探索した結果、両棲類で
見いだされたペプチドとよく似たペプチドを見いだすこ
とに成功している（Ｍｉｎａｍｉｎｏ、Ｎ、Ｋａｎｇａ
ｗａ、に、ａｎｄ　Ｍａｔｓｕ。

、Ｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏ
ｍｍｕｎ、、１１４，５４１−５４８１９８３；　Ｍｉ
ｎａｍｉｎｏ、Ｎ、、Ｋａｎｇａｗａ、に、ａｎｄ　Ｍ
ａｔｓｕｏ、Ｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒ
ｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、、１１９．１４−２０．１９８４
；　ＭＬｎａｍｉｎｏ、Ｎ、、５ｕｄｏｈ、Ｔ、Ｋａｎ
ｇａｗａ、に、ａｎｄ　Ｍａｔｓｕｏ、Ｈ，Ｐｅｐｔｉ
ｄｅｓ、６（Ｓｕｐｐｌ、３）　、２４５−２４８．１
９８５）。

このことから、両棲類でも吐乳類と同様、今までに知ら
れているカエルＡＮＰ　（カエルＡＮＰは吐乳類のＡＮ
Ｐに帰属される）以外に、タイプの異なるＮＰが存在し
ている可能性が高い。しかしながら、現在までに両棲類
からカエルＡＮＰ以外の新規ＮＰを単離・同定した報告
はない。

（発明が解決しようとする課題）従って本発明では、両棲類から既に知られているカエル
ＡＮＰ以外の新規ＮＰを単離・同定し、このペプチドを
提供する方法を確立することを目的とする。

（課題を解決するための手段）本発明者は、吐乳類のＮＰを単離・精製する際、ヒヨコ
直腸標本を用いた弛緩活性が、比較的簡単でしかも確実
なＮＰの生物活性測定法であったことに着目し、このア
ッセイを指標にカエル脳から新規ＮＰを見いだすことを
計画した。

本発明では、まず、カエルの脳を適当な酸性溶媒例えば
氷酢酸などの中でホモジネートし、これを出発原料に、
ペプチドの精製に常用される各種精製法を組み合せ、前
記したバイオアッセイを指標に分子量的３０００を示す
ペプチド画分を精製したところ、最終的には第３図に示
すように、ヒヨコ直腸標本を用いたバイオアッセイ系で
弛緩活性を有するペプチドを単一で純粋な状態までに精
製することに成功した。次に、このペプチドの一部を還
元し、このペプチドに含まれるシスティン残基をカルボ
キシメチル化し、このペプチドのアミノ酸組成を求めた
ところこのペプチドは２２個のアミノ酸残基から成るペ
プチドであることが判った。

さらに、このペプチドのアミノ酸−次配列を決定したと
ころ、最終的にこのペプチドは以下に示す構造を有する
新規ペプチドであることを見いだした。

（４）Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅ
ｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＯＨ（式中、（１）と（２）、（
３）と（４）は直接結合しており、６位と２２位のシス
ティン残基（Ｃｙｓ）は分子内でＳ−８結合を形成して
いる。）以下本明細書において、この新規ペプチドをｆＣＮ　Ｐ
　（ｆｒｏｇ　Ｃ−ｔｙｐｅ　ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ
　ｐｅｐｔｉｄｅ）と称する。

ｆＣＮＰのアミノ酸−次配列及び構造を、今までに知ら
れている３つのタイプに分類されたＮＰのそれらと比較
したところ（第５図参照）、ｆＣＮＰはＣＮＰに帰属さ
れる新規ペプチドであることが判った。すなわち、ｆＣ
ＮＰはＣＮＰと同様２２アミノ酸残基より構成されてお
り、しかもＧＮＰの構造的特徴に一致してＣ−末端テイ
ル構造を持っていない。また、ｆＣＮＰのアミノ酸−次
配列の相同性をＡＮＰ、ＢＮＰ及びＣＮＰと比べると、
ｆＣＮＰはＧＮＰと最も高い相同性を持っていることが
判った。実際、ｆＣＮＰとＧＮＰのアミノ酸−次配列を
比較すると２２アミノ酸残基のうち、１７アミノ酸残基
が全く同一であった。しかも、残りの異なる５アミノ酸
残基についても、それらアミノ酸残基の性質（アミノ酸
残基の塩基性及び疎水性などの性質）は同じであること
が判った。さらに、ｆＣＮＰをラットに投与するとナト
リウム利尿作用及び血圧降下作用を示すことを見いたし
た。

以上のことから、ｆＣＮＰはＧＮＰに帰属される新規ペ
プチドであることが判明し、本発明を完成するに至った
。

なお、本発明でｆＣＮＰの構造が開示されたことから、
ｆＣＮＰを得るには本明細書に示したカエルの脳から精
製する方法さらに化学合成を用いる方法以外に、遺伝子
工学的手法を用いてこれを製造することもできる。また
、ｆＣＮＰは顕著なナトリウム利尿作用及び血圧降下作
用を示すことから、これを医薬品へと応用することもで
きる。

以下実施例により本発明の詳細な説明する。

実施例１．カエル　からのｆＣＮＰの ■製カエル１５７匹から４７ｇの脳を摘出し、細断した後、
プロテアーゼを不活化するために１０容量の沸騰水で８
分間処理した。冷却後氷酢酸を最終濃度がＩＭになるよ
うに加え、この組織をポリトロンミキサーを用いて５分
間ホモジナイズした。次に、このホモシネイトを遠心分
離することによす（１４５００ｘ　ｇ　、　３５分）、
沈澱画分と上清画分に分離し、この上清画分を２容量の
水で希釈し、逆相Ｃ−１８カラムにかけた（９０ｄ、Ｃ
ｈｅｍｃｏ　ＬＣ−３ＯＲＢ　５ＰＷ−Ｃ−ＯＤＳ）。

カラムを０．５Ｍ酢酸で洗浄後、カラムに吸着したペプ
チドを０１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む６０％
アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）で溶出し、この溶出液を
濃縮した。次に、１Ｍ酢酸で平衡化したＳＰ−セファデ
ックスＣ−２５カラム（Ｈ”ｆｏｒｍ、１０ｄ）を用い
たイオン交換クロマトグラフィーにかけた。次に、カラ
ムに吸着したペプチドを１Ｍ酢酸、２Ｍピリジン、及び
２Ｍピリジン−酢酸（ｐＨ５，０）を用いて溶出し、各
溶出液による溶出画分を５Ｐ−Ｉ、５ｐ−ｎ及びｓｐ−
ｍとし、これらをそれぞれ凍結乾燥した。このようにし
て得たｓｐ−ｍ画分４０■（乾燥重量）をセファツデク
スＧ−５０カラム（ｆｉｎｅ、　１．８ｘ１３４ｃｍ　
；ファルマシア）を用いたゲル濾過にかけた。第１図に
ゲル濾過の様子を示す。溶媒は１Ｍ酢酸、フラクション
サイズは５．０＋ｄ／チユーブ、流速はＬＯ，Ｏｄ／ｈ
ｒである。第１図中、斜線付きボックスはヒヨコ直腸弛
緩活性を有するフラクション４９−５７を示す。

この活性フラクションをまとめて凍結乾燥し、さらにＣ
Ｍ陽イオン交換体によるＨＰ’ＬＣカラム（ＴＳＫゲル
ＣＭ−２ＳＷ：　４．６ｘ２５０ｍｍ、Ｔｏｓｏｈ）で
精製した。下記（Ａ）と（Ｂ）の溶媒系を使用し、（Ａ
）　：　（Ｂ）　＝５０：５０からＯ：１００の直線濃
度勾配で２０分かけて流速１．０　ＨＩ３分で溶出した
。

（Ａ）　１０ｍＭ　ＨＣＯＯＮＨ４（ｐＨ６，６）、Ｃ
ＨｓＣＮ＝９０：１０（Ｖ／Ｖ）（Ｂ）　１．ＯＭ　Ｈ
ＣＯＯＮＨ，（ｐＨ６，６）：ＣＨｓＣＮ＝９０：１０
（Ｖ／Ｖ）溶出の様子を第２図に示す。このクロマトグ
ラフィーにおいて、ヒヨコ直腸弛緩活性の大部分は溶出
時間３６−３９分に溶出され、１５−１８分及び２２．
５−２５５分に溶出される画分にも小さいピークが観察
された。

３６−３９分に溶出されたヒヨコ直腸弛緩活性フラクシ
ョンをケムコソルブ（ｃｈｅｍｃｏｓｏｒｂ）　３０Ｄ
Ｓ−Ｈカラム（８，Ｏｘ７５ｍｍ、　ｃｈｅｍｃｏ）に
よる逆相ＨＰＬＣでさらに精製した。下記（Ａ）と（Ｂ
）の溶媒系を使用し、（Ａ）から（Ｂ）への直線濃度勾
配で１２０分かけて流速２．０　ｄ／分で溶出した。

（Ａ）　Ｈ２Ｏ：ＣＨ，ＣＮ：１０％ＴＦＡ＝９０　：
　１０　：　１　（Ｖ／Ｖ）（Ｂ）　Ｈ２Ｏ：ＣＨ３Ｃ
Ｎ：１０％ＴＦＡ＝４０：６叶１　（Ｖ／Ｖ）溶出の様
子を第３図に示す。ヒヨコ直腸弛緩活性は図中の黒いボ
ックス部分のみに観察された。

本発明におけるｆＣＮＰの最終精製は、この活性フラク
ションをさらにμｍボンダスフェア（Ｂ。

ｎｄａｓｐｈｅｒｅ）　Ｃ−１８（３，９ｘ１５０ｍｍ
、　３００　Ａ、ｆａｔｅｒｓ）を用いた逆相ＨＰＬＣ
に供することにより、実質的に純粋なペプチドとして得
ることができた。

なお、後記アミノ酸分析の結果に基づいて計算したｆＣ
ＮＰの収量は９２０ｐｍｏｌであった。

実施例２．ｆＣＮＰの　浩°定Ａ、ｆＣＮＰのＳ−カルボキシメチル実施例１で得たｆＣＮＰを０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
バッファー　（ｐＨ８，５）中２０ｍＭのジチオスレイ
トール（ＤＴＴ　）を用い、３７℃、４時間反応させ、
次いで６０ｍＭのヨード酢酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ
　ｍｏｎｏｉｏｄｏａｃｅｔｉｅ　ａｃｉｄ）を加え２
０分間処理することにより、ｆＣＮＰのＳ−力ルボキシ
メチル体すなわち（Ｒ’　ＣＭ）ｆＣＮＰを得た。

この（ＲＣＭ）ｆＣＮＰを、μｍポンダスフェア（Ｂｏ
ｎｄａｓｐｈｅｒｅ）　Ｃ−１８（３，９ｘ１５０ｍｍ
、　３００Ａ、Ｗａｔｅｒｓ）を用いた逆相ＨＰＬＣに
供し、０．１％ＴＦＡ中のアセトニトリル１０−６０％
の直線勾配により、流速１．０ｄ／分で６０分間溶出す
ることにより精製した。

Ｂ、　　ＲＣＭ　　ｆＣＮＰのアミノ　　　の　定実施
例２のＡで得た（ＲＯＭ）ｆＣＮＰ約２００ｐ！１１０
１を、まず０．１％フェノールと００２％の２−メルカ
プトエタノールを含んだ６Ｎ塩酸で１１０℃、２０時間
処理することにより（ＲＯＭ）ｆＣＮＰを完全水解した
。次にこのサンプルを日立Ｌ−８３．５７ミノ酸分析機
を用いて（ＲＣＭ）ｆＣＮＰのアミノ酸組成を求めたと
ころ、第１表に示す値が得られ、この結果ｆＣＮＰは２
個のシスティン残基を含む２２個のアミノ酸残基より成
るペプチドであることが判った。

第１表は（ＲＯＭ）ｆＣＮＰのアミノ酸組成を示す。な
お、０内の数値は測定値に最も近い整数を示し、ＣｍＣ
ｙｓはＳ−カルボキシメチルシスティンを示す。

第１表（ＲＯＭ）　ＣＮＰ１．１８１．０２１．８７合計Ｃ，ＲＣＭ　　ｆＣＮＰのアミノ　−　配　の固定実施例２のＡで作製した（ＲＣＭ）ｆＣＮＰ約２００ｐ
ｍｏｌを用い、アミノ酸配列自動分析機（Ａｐｐｌｉｅ
ｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４７０Ａ／１２０Ａ）に供
し、エドマン分解法によりアミノ酸−次配列を分析した
結果、第４図に示す結果か得られた。同図中、各アミノ
酸は一文字表記で表され、ＣｍはＳ−カルボキシメチル
システィン残基を示す。この結果に基づいて（ＲＯＭ）
ｆＣＮＰのアミノ酸−次配列が決定された（第５図参照
）。

Ｄ、ｆＣＮＰの　　合　　びＳ−８合　　の同定実施例２のＣで決定したアミノ酸−次配列を基にｆＣＮ
Ｐをペプチド合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ　４３０Ａ）を用いた固相合成法で合成した。な
お、合成の際システィン残基のＳＨ保護基として４−メ
チルベンジル（４−ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｙｌ）基を用
い、ＨＦを用いて完全脱保護した後、ｆＣＮＰの６．２
２位のシスティン残基のＳＨ基をフェリシアン化カリウ
ム［ＫｓＦｅ（ＣＮ）ｓ］で処理することにより分子内
Ｓ−８結合を形成させた。このようにして合成したｆＣ
ＮＰは、アミノ酸分析、アミノ酸−次配列の解析を行い
その構造を確認した。さらに、この化学合成したｆＣＮ
Ｐと実施例１で得た天然由来のｆＣＮＰは、ＨＰＬＣの
溶出時間が完全に一致し、合成ｆＣＮＰもヒヨコ直腸弛
緩活性を示したことから、最終的にｆＣＮＰの構造は、
（４）Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−３ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅ
ｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＯＨ（式中、（１）と（２）、（
３）と（４）は直接結合しており、６位と２２位のシス
ティン残基（Ｃｙｓ）は分子内でＳ−８結合を形成して
いる。）であると決定した。

ヒヨコ直腸弛緩活性はＫａｎｇａｗａ等及びＣｕｒｒｉ
ｅ等の方法（Ｋａｎｇａｗａ、に、ａｎｄ　Ｍａｔｓｕ
ｏ、Ｈ，、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、
Ｃｏｍｍｕｎ、、１１８．１３１−１３９，１９８４；
　Ｃｕｒｒｉｅ、Ｍ、Ｇ、　、Ｇｅ１ｌｅｒ　、Ｄ　、
Ｍ、　、Ｃｏ１ｅ　、　Ｂ、Ｒ、、Ｂｏｙｌａｒ　、Ｊ
　、Ｇ　、　、　Ｙｕｓｈｅｎｇ　。

Ｗ、　、Ｈｏｒｍｂｅｒｇ、Ｓ、Ｗ、ａｎｄ　Ｎｅｅｄ
ｌｅｍａｎ、Ｐ、　、５ｃｉｅｎｃｅ、２２１７１−７
３．１９８３）に従い測定した。測定値は６回の繰り返
しの平均である。その結果を第２表に示す。この測定法
でｆＣＮＰはα−ｈＡＮＰ及びｆＡＮＰ−２１に比べ各
々約３倍〜約７倍高い活性を示した。なお、ｆＣＮＰは
、類似ペプチドにとって利尿作用等の生物活性を発揮す
るために重要と考えられていたＣ−末端のテール配列（
ＷａｔａｎａｂｅＴ、Ｘ、　、Ｎｏｄａ、Ｙ、　、Ｃｈ
ｉｎｏ、Ｎ、　、Ｎ１５ｈｉｕｃｈｉ　、　Ｙ、　、Ｋ
ｕｍｕｒａ　、Ｔ、５ａｋａｋｉｂａｒａ、Ｓ、ａｎｄ
　Ｉｍａｉ、Ｍ、、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ。

１４７．４９−５７．１９８８）　カ欠失しテいルが、
ｐＣＮＰ　（ブタ由来ＧＮＰ）と匹敵する強い直腸弛緩
活性を保持していた。

第２表利尿ペプチド相対活性 αｈＡＮＰ　　　　　　　　　　１００ｆＣＮＰ　　　
　　　　　　　　３２１ｆＡＮＰ−２１４７ｆＡＮＰ−２４３，７ｐＣＮＰ　　　　　　　　　４７２ｐＢＮＰ−２６２７０相対活性はαｈＡＮＰの活性を１００として等モル量の
ペプチドの活性である。

Ｂ、ｆＣＮＰのナトリウム　　　用　び血庄屋ｆＣＮＰの利尿作用については、Ｋａｎｇａｗａ等及び
５ｕｄｏｈ等の方法に従い測定した（Ｋａｎｇａｗａ　
ｅｔ　ａｌ　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒ
ｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ　、　、　１１８　、１３１−１３
９　、１９８４；５ｕｄｏｈ、Ｔ、、Ｋａｎｇａｗａ、
に、、Ｍｉｎａｍｉｎｏ、Ｎ、　ａｎｄ　Ｍａｔｓｕｏ
、Ｈ，、Ｎａｔｕｒｅ、３３２．７８−８１．１９８８
）　、すなわち、雄性ＳＤラット（体重３００−４００
　ｇ　）にベンドパルビタール５０■／ｋｇを腹腔的投
与し、麻酔し、気道確保のため気管カニユーレ（ＰＥ−
２４０クレイ・アダムス社製）を施す。股動脈に血圧測
定用のカニユーレ（ＰＥ−５０）を挿入し、また、股静
脈に挿入したカニユーレ（ＰＥ−１０）を通じてリンゲ
ル液を１．８Ｎ１／ｈｒの速度で定常注入する。シラス
ティックチューブ（内径０，０２インチ、外径０．０３
フインチ、ダウコーニング社製）の膀胱カニユーレより
試験管内に採尿し、この採尿は被験物質を投与する１５
分間と投与後５分間ずつ１５分後まで及びその後経時的
に行った。この試料の量そして試料中の電解質濃度を比
較することにより、及び血圧の変化により被験物質の作
用を測定した。

なお、被験物質ｆＣＮＰは、その所定量を０．ＩＮ酢酸
に溶解した後、１／１０容量の１３Ｍトリス溶液で中和
する。これを５０μｌの滅菌生理水で希釈し、頚静脈か
ら投与した。この結果、第３表に示すように、ｆＣＮＰ
はナトリウム利尿作用及び血圧降下作用を示すことが判
り、さらに、これらの作用は用量依存的に増大すること
が判った。

第３表に、ｆＣＮＰのナトリウム利尿作用及び血圧降下
作用をα−ｈＡＮＰと比較して示す。

第３表 α−ｈＡＮＰ　３．０４６１±５１５７２±８４　２９１±１９４４５±６７なお、第３表
中、利尿及びナトリウム利尿応答は、麻酔ラットへペプ
チドを静脈注射する前及び後に、各１５分間の尿サンプ
ルを集め、尿量、Ｎａ＋、Ｋ＋及びＣＩ−の排泄量の変
化の％（平均上標準誤差）として示した。各ペプチドに
３匹のラットを用いた。

ｆＣＮＰの利尿及びナトリウム利尿作用は、α−ｈＡＮ
Ｐに比べて、約１００分の１程度に低かった。ｆＣＮＰ
はまた、麻酔ラットに投与したところ弱い血圧降下作用
も示した。典型的実験において、１０ｎｍｏｌのｆＣＮ
Ｐは、心収縮期の血圧を約３゜分間にわたって２５−３
２５−３Ｏ低下させた。これらの結果はｐＣＮＰの結果
（Ｓｕｄｏｈ、Ｔ、　、Ｍｉｎａｍｉｎｏ、Ｎ、　、Ｋ
ａｎｇａｗａ、に、　ａｎｄ　Ｍａｔｓｕｏ、Ｈ，、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、ＲｅｓＣｏｍｍｕｎ、
、１６８，８６３−８７０．１９９０）と非常に類似し
ている。

（発明の効果）以上のように、本発明者は、カエルの脳よりヒヨコ直腸
弛緩活性を指標として新規生理活性ペプチド（ｆＣＮＰ
）を単離・同定することに成功すると共に、このペプチ
ドがナトリウム利尿作用及び血圧降下作用を示すことを
見いだし、このペプチドがＧＮＰに帰属される新規ペプ
チドであることを明らかにした。

本発明でｆＣＮＰが単離・同定されたことにより、カエ
ルと哺乳類ではＡＮＰを共有するのみならずＧＮＰをも
共有していることが判明した。このことは、ＡＮＰ及び
ＧＮＰが進化の初期の過程から体液量及び血圧の恒常性
を調節するのに重要な役割を果たしているペプチドであ
ることを示唆している。

また、本発明で特に注目すべきことは、ｆＣＮＰの脳内
組織濃度が５０ｐｍｏｌ／　ｇ組織湿重量と高くこの濃
度が哺乳類ＡＮＰ及びＢＮＰの脳内濃度よりはるかに高
いことである。このことは、現在のところｆＣＮＰの心
房における存在量が判っていないか、ＧＮＰがおもに脳
内において神経伝達系に作用し、生体内の体液量及び血
圧の恒常性の調節に関与していることを示唆している（
なお、先にも述へたが、咽乳動物ではＡＮＰ−ＢＮＰは
脳及び心房にも存在しているが、その存在量は心房が圧
倒的に高いことが判っている。また、ブタの脳において
は、ＧＮＰの存在量はＢＮＰとほぼ同程度であり、ＡＮ
Ｐと比べると約２０倍量存在している）。さらには、本
発明によりｆＣＮＰの構造か明らかになったことから、
このアミノ酸−次配列を先に本発明者らにより明らかに
されたブタ脳由来ＣＮＰ　（ｐＣＮＰ）と比較すればＧ
ＮＰの構造活性相関を研究することができる。

以上のことから、本発明はＧＮＰの生理的役割、ひいて
は生体内における体液量及び血圧の恒常性を調節するメ
カニズムを解明する上で、大いに貢献するものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、カエル脳からの抽出物（ＳＰ−Ｉ［［分画を
さらにセファデックスＧ−５０で分画したときの、溶出
経過及び各フラクションのヒヨコ直腸弛緩活性を示す図
である。第２図は、第１図のセファデックスＧ−５０で溶出した
活性フラクションを、ＣＭイオン交換ＨＰＬＣでさらに
精製したときの溶出経過及び各フラクションのヒヨコ直
腸弛緩活性を示す図である。第３図は、第２図のＣＭイオン交換ＨＰＬＣで３６−３
９分目に溶出されたヒヨコ直腸弛緩活性フラクションを
ケムコソルブ（ｃｈｅｍｃｏｓｏｒｂ）　３０ＤＳ−Ｈ
カラムによる逆相ＨＰＬＣでさらに精製したときの様子
を示す図である。第４図は、（ＲＯＭ）ｆＣＮＰのエドマン分解における
各サイクルのＰＴＨ−アミノ酸の収率及びアミノ酸配列
を示す図である。第５図は、各種ＡＮＰ、ＢＮＰ、ＣＮＰのアミノ酸−次
配列及びこれらのペプチドのアミノ酸−次配列の相同性
を示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】下記の構造式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、（１）と（２）、（３）と（４）は直接結合し
ており、６位と２２位のシステイン残基（Ｃｙｓ）は分
子内でＳ−Ｓ結合を形成している。）を有する新規生理
活性ペプチド及びその酸付加塩。