CN108350440A - 碱性磷酸酯的制造 - Google Patents

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Abstract

用于生产重组多肽的方法，所述方法包括：(a)提供100L至25,000L的补料分批生物反应器，所述生物反应器包含(i)能够表达重组多肽阿司弗泰斯阿尔法(SEQ ID NO：1)的细胞，和(ii)适合于进行此类表达的培养基，所述培养基包含约25μM至约300μM的锌；(b)在适于表达重组阿司弗泰斯阿尔法的条件下培养所述细胞，其中所述培养基的pH为约6.7至约7.1，并且其中向所述培养基中添加锌，使得将所述培养基中的锌浓度保持在约25μM至约300μM的锌浓度。

Description

碱性磷酸酯的制造
序列表
所附序列表中列出的氨基酸序列是使用如37C.F.R.1.822中定义的氨基酸的标准三字母编码表示的。序列表是作为2016年8月16日创建的ASCII文本文件提交的，命名为0351 WO_SL.txt，大小为6,604字节，其通过引用并入本文。
发明领域
本公开涉及用于生产重组多肽的方法，所述方法包括：(a)提供100L至25,000L的补料分批生物反应器，所述生物反应器包含(i)能够表达重组多肽阿司弗泰斯阿尔法(asfotase alfa)(SEQ ID NO：1)的细胞，和(ii)适于进行此类表达的培养基，所述培养基包含约25μM至约300μM的锌；(b)在适于表达重组阿司弗泰斯阿尔法的条件下培养所述细胞；其中所述培养基的pH为约6.7至约7.1，并且其中向所述培养基中添加锌，使得所述培养基中的锌浓度保持在约25μM至约300μM的锌浓度。
背景
低磷酸酯酶症(HPP)是危及生命的遗传性和超罕见的代谢障碍，其导致不能产生功能性组织非特异性碱性磷酸酶(TNSALP)。其导致特征在于骨骼和牙齿的低矿化的未矿化骨基质的累积(例如佝偻病、骨软化症)。当生长的骨骼不能正常矿化时，生长受损是使关节和骨骼变形的结果。该结果反过来影响运动表现、呼吸功能，甚至可导致死亡。发现不同形式的HPP包括围产期、婴儿期、幼年期和成年HPP。最近，已经定义了六种临床形式，大部分基于症状发作时的年龄，包括围产期、良性产前、婴儿、青少年、成人和牙齿-HPP。阿司弗泰斯阿尔法是被批准的首创批靶向酶替代疗法，其被设计来解决有缺陷的内源性TNSALP水平。关于利用TNSALP治疗HPP，参见Whyte等，2012N Engl J Med.366：904-13。
阿司弗泰斯阿尔法(Alexion Pharmaceuticals，Inc.)是可溶性融合糖蛋白，其由人TNSALP的催化结构域、人免疫球蛋白G1Fc结构域和用作骨靶向结构域的十天冬氨酸肽(即D10)组成。在体外，与缺乏十天冬氨酸肽的可溶性TNSALP相比，阿司弗泰斯阿尔法以更大的亲和力结合羟基磷灰石，从而使允许阿司弗泰斯阿尔法的TNSALP部分高效地降解过量的局部无机焦磷酸盐(PPi)并恢复正常矿化。焦磷酸盐水解促进骨矿化，其效果在非临床研究中评估的物种间是相似的。在HPP小鼠模型(Akp2-/-小鼠)中进行初始功效研究。通过使TNSALP基因失活而建立的Akp2-/-小鼠模型(Narisawa等1997Dev Dvn.208：432-46)共享人病况的许多共同特征.包括未矿化骨基质的积累。
概述
本文公开了具有特定特征(例如，特定聚糖结构，特定总唾液酸含量(TSAC)值等)的碱性磷酸酶(例如，阿司弗泰斯阿尔法)的组合物和用于生产具有此类特定特征的碱性磷酸酶(例如，阿司弗泰斯阿尔法)的制造工艺。此类碱性磷酸酶(例如，阿司弗泰斯阿尔法)适用于疗法，例如用于治疗受试者(例如，人受试者)的与碱性磷酸酶蛋白水平和/或功能(例如，无机焦磷酸盐(PPi)的裂解不足)降低相关的病况。
在一个方面，本公开提供了用于生产具有碱性磷酸酶功能的重组多肽的方法。在各种实施方案中，碱性磷酸酶功能可包括本领域已知的碱性磷酸酶的任何功能，诸如针对天然底物(包括磷酸乙醇胺(PEA)、无机焦磷酸盐(PPi)和吡哆醛5′-磷酸(PLP))的酶促活性。此类重组多肽可包含阿司弗泰斯阿尔法(SEQ ID NO：1)。
在一些实施方案中，本文公开的方法还包括向所述培养基中添加锌以生产重组多肽。锌可帮助改善重组多肽的活性和/或稳定性。在一些实施方案中，可以添加锌以在所述培养基中提供约1至约300μM的锌浓度。在一个实施方案中，可以添加锌以在培养基中提供约10至约150μM(例如，10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM、100μM、110μM、120μM、130μM、140μM或150μM)的锌浓度。在一些实施方案中，添加锌以在培养基中提供约25μM至约150μM、或约60μM至约150μM的锌浓度。在一个具体实施方案中，添加锌以在培养基中提供约30μM、60μM或90μM的锌浓度。在一个具体实施方案中，添加锌以在培养基中提供约28μM的锌浓度。在一些实施方案中，以浓注、连续或半连续的方式向所述培养基中添加锌。
在一些实施方案中，本文公开的方法还包括控制所述培养基的pH以生产重组多肽。例如，可将pH设定在约6.8至约7.0。在一个具体的实施方案中，将pH设定在约6.9。
在一些实施方案中，本文公开的方法还包括在培养和/或多肽生产期间将至少一种额外新鲜培养基的浓注补料添加到初始含细胞培养基中。新鲜培养基的此类添加可以提高所生产的重组多肽的活性(例如，比活性)。在一个实施方案中，在培养期间向培养基中添加至少一次、两次、三次或四次补料浓注。在一个具体实施例中，添加至少四次补料浓注。在一些实施方案中，一次或多次补料浓注添加提高了重组多肽的比活性。本文公开的用于生产重组多肽的细胞可以是本领域已知的任何细胞(例如，哺乳动物细胞)。在一些实施方案中，所述细胞选自由以下组成的组：CHO、NSO/1、PER.C6、COS-7、人胚胎肾细胞系(经亚克隆用于在悬浮培养物中生长的293或293细胞)、BHK、TM4、CV1、VERO-76、HeLa、MDCK、BRL 3A、W138、Hep G2、MMT 060562、TRI、MRC 5、FS4细胞和Hep G2细胞。在一些实施方案中，细胞是CHO细胞。
在一些实施方案中，使细胞在第一温度下生长一定的时间用于细胞生长，然后转换至第二温度用于多肽表达。例如，在一些实施方案中，公开的方法还包括在第一温度下培养细胞直至达到至少约2.5×106个活细胞的细胞密度，然后转换到低于第一温度的第二温度以进行重组多肽表达。例如，在一些实施方案中，第一温度为约35℃至约37.5℃。在一些实施方案中，第二温度为约29℃至约35℃。在一些实施例中，第一温度为约37℃，并且第二温度为约30℃。在一些实施方案中，第一温度为约36.5℃，并且第二温度为约33℃。
另一方面，本公开提供了通过本文公开的任一种方法生产的重组多肽。此类产生的重组多肽可具有源自本文公开的生产方法的特定特征中的至少一种特征。此类特征可以包括选自由以下组成的组的至少一种：(a)约0.9至约3.5mol唾液酸/mol蛋白质单体的总唾液酸含量(TSAC)；(b)约5.2至约6.7的等电聚焦(IEF)；(c)如图41或图42所示的主要聚糖结构；(d)如图38或39所示的2-AB标记的寡糖色谱图特征谱；(e)如图40或44-49所示的MALDI-ToF糖肽指纹特征谱；(f)还原SDS-PAGE上的主要条带，其具有约88-108kDa的分子量且不少于约85％的所生产的重组多肽的总量；(g)非还原SDS-PAGE上的主要条带，其具有约194至约273kDa的分子量且不少于约85％的所生产的重组多肽的总量；(h)通过尺寸排阻高压液相色谱(HPLC)，重组多肽的二聚体不少于约95.0％，并且聚集体不超过约5.0％；(i)通过反相高压液相色谱(RP-HPLC)，纯度不低于约95.0％；(j)通过阴离子交换色谱(AEX)，主峰不少于约90.0％，并且酸性峰不超过约6.0％，碱性峰不超过约4.0％；(k)约75至约125％的羟基磷灰石(HA)结合百分比；(1)约620至约1250单位/mg的产物比活性(pNPP)；(m)在无机焦磷酸盐(PPi)水解测定中约13至约69μM的Km；(n)在无机焦磷酸盐(PPi)水解测定中约65至约165s-1的Kcat；；(o)对于毛细管电泳上的所有峰，约6.45至约6.95的pI范围；(p)去糖基化后如图34A所示的MALDI-ToF质谱上的峰；(q)还原及去糖基化后如图34B所示的MALDI-ToF质谱上的峰；(r)如图35所示的MALDI-ToF质谱上的峰；(s)如图36所示的磷酸化特征谱；(t)如图37A所示的阴性MALDI-ToF质谱上的唾液酸聚糖特征谱；(u)如图37B所示的阳性MALDI-ToF质谱上的中性聚糖特征谱；(v)约0.03至约0.15的每摩尔重组多肽的镁摩尔比；(w)约0.5至约1.5的每摩尔重组多肽的钙摩尔比；和(x)约0.5至约3.0的每摩尔重组多肽的锌摩尔比。
在一个实施方案中，所生产的重组蛋白具有每半分子约0.7至约1.19个游离半胱氨酸。
在一个实施方案中，所生产的重组蛋白在Ser 93处具有约13.5％至约35.7％的百分比的磷酸化。
在一个实施方案中，所生产的重组蛋白在AEX色谱图上具有不少于90.0％的主峰、不超过6.0％的酸性峰和不超过4.0％的碱性峰。在一个具体实施方案中，所生产的重组蛋白在AEX色谱图上具有不少于93.7％的主峰、不超过4.9％的酸性峰和不超过3.4％的碱性峰。
在一些实施方案中，所生产的重组蛋白质具有约0.9至约3.5mol唾液酸/mol蛋白质单体的总唾液酸含量(TSAC)。在一个实施方案中，所生产的重组蛋白具有约1.2至约3.0mol唾液酸/mol单体的平均总唾液酸含量(TSAC)值。在一个实施方案中，所生产的重组蛋白具有约1.9至约2.7mol唾液酸/mol单体的平均总唾液酸含量值。在一个具体实施方案中，所生产的重组蛋白具有约1.85至约2.28mol唾液酸/mol单体的平均总唾液酸含量值。
在一个实施方案中，所生产的重组蛋白质具有小于约0.15的镁离子的结合摩尔比。在一些实施方案中，所生产的重组蛋白质具有约0.05至约0.10的镁摩尔比。在一个具体的实施方案中，所生产的重组蛋白具有约0.12的镁离子结合摩尔比。
在一些实施方案中，所生产的重组蛋白包含至少约95.0％的重组多肽的二聚体，约5.0％或更少的多肽聚集体，即，如通过尺寸排阻HPLC测量的。在一个实施方案中，所生产的重组蛋白质包含至少约96.8％的重组多肽的二聚体和约3.2％或更少的多肽聚集体，即，如通过尺寸排阻HPLC测量的。在一个具体的实施方案中，所生产的重组蛋白包含至少约97.6％的重组多肽的二聚体和约2.4％或更少的聚集体，即，如通过尺寸排阻HPLC测量的。
在一个实施方案中，如通过RP-HPLC测量的，所生产的重组蛋白具有不低于95.0％的纯度。在一个具体的实施方案中，如通过RP-HPLC测量的，所生产的重组蛋白具有不低于97.6％的纯度。
在一些实施方案中，所生产的重组蛋白具有约75至约125％的羟基磷灰石(HA)结合百分比。在一个实施方案中，所生产的重组蛋白具有约85％至约97％的平均羟基磷灰石结合百分比。在一个具体的实施方案中，所生产的重组蛋白具有约90％至约91％的平均羟基磷灰石结合百分比。
在一个实施方案中，所生产的重组蛋白具有约620至约1250单位/mg的比活性(pNPP)。在一个具体实施方案中，所生产的重组蛋白具有约904.0至约907.7U/mg的平均比活性(pNPP)。
在一些实施方案中，重组多肽由多核苷酸所编码编码，所述多核苷酸编码包含SEQID NO：1中所示的序列或与SEQ ID NO：1完全互补的序列的多肽。
本文公开的重组多肽可以以工业或商业规模生产。例如，在一些实施方案中，补料分批反应器为200L至20,000L。在一些实施方案中，补料分批反应器为2,000L至20,000L。
在另一方面，本公开提供了包含组合物的药物制剂，其包含本文公开的重组多肽以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在另一方面，本公开提供了使用本文所述的重组多肽或药物制剂来增加受试者中无机焦磷酸盐(PPi)的裂解的方法。
在另一方面，本公开提供了治疗受试者的方法，其包括对患有与碱性磷酸酶缺乏相关的病况的受试者施用治疗有效量的本文论述的重组多肽或药物制剂。与碱性磷酸酶缺乏相关的此类病况包括例如低磷酸酯酶症(HPP)和I型神经纤维瘤病(NF1)。此类低磷酸酯酶症(HPP)可以是围产期、婴儿、幼年或成年HPP中的任一种。此类病况可用骨骼和牙齿的未矿化骨基质和/或低矿化来表征。例如，此类未矿化骨基质可导致佝偻病和/或骨软化症。
在一些实施方案中，此类受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，此类受试者是人。
附图简述
在附图中：
图1是显示在利用或不利用温度转换进行蛋白质生产的示例性生产工艺(#1)之间的细胞生长(图A，左)和活力(图A，右)以及总体葡萄糖(图B，左)和乳酸盐(图B，右)浓度的比较的图。对照表示两个利用温度转换的运行的平均结果。
图2是显示使用利用或不利用温度转换的示例性生产工艺(#1)生产的阿司弗泰斯阿尔法的蛋白A可结合滴定(图A)、容积活性(volumetric activity)(图B)和比活性(图C)的比较的图。对照表示两个利用温度转换的运行的平均结果。
图3是显示使用利用或不利用温度转换的示例性生产工艺(#1)生产的阿司弗泰斯阿尔法的AEX(阴离子交换色谱)酸性峰(％)(图A)和SEC(尺寸排阻色谱)聚集体(％)(图B)的比较的图。
图4是显示使用利用或不利用温度转换的示例性生产工艺(#1)所生产的阿司弗泰斯阿尔法的非还原LoC(芯片上实验室；图A)、还原LoC(图B)和TSAC(总唾液酸含量；图C)的比较的图。
图5是显示通过利用或不利用温度转换的示例性生产工艺(#1)生产的阿司弗泰斯阿尔法的神经聚糖特征谱(通过基质辅助激光解吸/电离-飞行时间或MALDI-TOF)的图。参考代表由先前的20K工艺生产的标准阿司弗泰斯阿尔法。
图6是显示转换生产温度对所生产的阿司弗泰斯阿尔法的聚集水平(图A)和TSAC(图B)的影响的图。误差棒表示每个条件下的标准偏差。
图7是显示在培养10或12天后，培养物的pH对通过示例性工艺#2生产的阿司弗泰斯阿尔法的TSAC值的影响的图。
图8是显示在示例性工艺#2中培养基补料添加(由不同浓度的葡萄糖(glc)代表；图A)和补料添加模式(图B)对阿司弗泰斯阿尔法TSAC的影响的图。
图9是显示在示例性工艺#2中补充锌对阿司弗泰斯阿尔法活性(图A；在第9天补充的锌)的影响以及锌浓度对细胞生长(图B)和活力(图C)的影响的图。
图10是显示在示例性工艺#3中pH和生产温度阿司弗泰斯阿尔法TSAC(图A)、蛋白A滴度(图B)和容积活性(图C)的影响的图。
图11是显示在示例性工艺#3中生长温度对容积活性(图A)和阿司弗泰斯阿尔法片段化(图B，通过SEC测量的)的影响的图。
图12是显示在示例性工艺#3中生产温度和pH对阿司弗泰斯阿尔法聚集(图A，通过SEC测量的)、酸性峰％(图B，通过AEX测量的)、阿司弗泰斯阿尔法片段化(图C，通过SEC测量的)和碱性峰％(图D，通过AEX测量的)的影响的图。
图13是显示接种密度和温度转换时间安排对容积活性(图A)和阿司弗泰斯阿尔法片段化(图B，通过SEC测量的)的影响的图。接种代表示例性工艺#3中的接种密度。
图14是显示在示例性工艺#3中培养基补料(量和时间安排)对阿司弗泰斯阿尔法容积活性(图A)、聚集(图B，通过SEC测量的)、酸性峰％(图C，通过AEX测量的)、碱性峰％(图D，通过AEX测量的)和TSAC(图E)的影响的图。
图15是显示在示例性工艺#4中培养基pH对细胞生长(图A)和活力(图B)的长达10天的影响的图。
图16是显示在示例性工艺#4中生产温度对细胞生长(图A)和活力(图B)的长达10天的影响的图。
图17是显示在示例性工艺#4中培养基pH对培养基中的葡萄糖(图A)和乳酸盐(图B)浓度的长达10天的影响的图。
图18是显示在示例性工艺#4中生产温度对培养基中的葡萄糖(图A)和乳酸盐(图B)浓度的长达10天的影响的图。
图19是显示在示例性工艺#4中培养基pH对蛋白A滴度(图A)、容积活性(图B)、特异性蛋白A生产率(图C)和比活性(小图D)的长达10天的影响的图。
图20是显示在示例性工艺#4中生产温度对蛋白A滴度(图A)、容积活性(图B)、特定蛋白A生产率(图C)和比活性(图D)的不同影响的图。
图21是显示在示例性工艺#4中培养基pH(图A)和生产温度(图B)对阿司弗泰斯阿尔法TSAC的影响的图。
图22是显示在示例性工艺#4中培养基pH(图A)和生产温度(图B)对所生产的阿司弗泰斯阿尔法的AEX酸性峰的影响的图。
图23是显示在示例性工艺#4中培养基pH(图A)和生产温度(图B)对阿司弗泰斯阿尔法聚集(通过SEC测量的)的影响的图。
图24是显示在示例性工艺#4中培养基pH(图A)和生产温度(图B)对所生产的阿司弗泰斯阿尔法的LoC主峰(％，非还原条件)测量的不同影响的图。
图25是显示在示例性工艺#4中培养基pH对所生产的阿司弗泰斯阿尔法(通过MALDI-ToF测量的)的中性聚糖特征谱的影响的图。上图显示了在33℃下持续10天但在不同培养基pH下产生的所有MALDI-ToF峰。在下图中计算和比较每个峰的值。
图26是显示在示例性工艺#4中生产温度对所生产的阿司弗泰斯阿尔法的中性聚糖特征谱(通过MALDI-ToF测量的)的影响的图。上图显示了在不同的生产温度下在pH 6.9下持续10天产生的阿司弗泰斯阿尔法的所有MALDI-ToF峰。在下图中计算和比较每个峰的值。
图27是显示在示例性工艺#4中培养基pH(图A)和生产温度(图B)对阿司弗泰斯阿尔法质量的iCE280分析的毛细管等电聚焦峰百分比的影响的图。
图28是针对不同工艺比较细胞生长(图A)和活力(图B)的图(蓝线：利用单次浓注培养基补料的对照工艺(针对两个生物反应器罐进行的))；红线：利用四次培养基补料的改进的工艺(针对六个生物反应器罐进行的)；灰线：作为标准的先前的20K工艺(针对20个生物反应器罐进行的)。灰色实线代表20K工艺的平均值，而虚线代表平均值±1x标准偏差。
图29是针对不同工艺比较葡萄糖利用(图A)和乳酸盐生产(图B)的图(蓝线：利用单次浓注培养基补料的对照工艺(针对两个生物反应器罐进行的))；红线：利用四次培养基补料的改进的工艺(针对六个生物反应器罐进行的)；灰线：作为标准的先前的20K工艺(针对20个生物反应器罐进行的)。灰色实线代表20K工艺的平均值，而虚线代表平均值±1x标准偏差。
图30是比较通过不同工艺生产的阿司弗泰斯阿尔法的蛋白A滴度(图A)和比活性(图B)的图(蓝线：利用单次浓注培养基补料的对照工艺(针对两个生物反应器罐进行的))；红线：利用四次培养基补料的改进的工艺(针对六个生物反应器罐进行的)；灰线：作为标准的先前的20K工艺(针对20个生物反应器罐进行的)。灰色实线代表20K工艺的平均值，而虚线代表平均值±1x标准偏差。
图31是针对不同工艺比较活性滴度(图A)和总容积活性(图B)的图(蓝线：利用单次浓注培养基补料的对照工艺(针对两个生物反应器罐进行的))；红线：利用四次培养基补料的改进的工艺(针对六个生物反应器罐进行的)；灰线：作为标准的先前的20K工艺(针对20个生物反应器罐进行的)。灰色实线代表20K工艺的平均值，而虚线代表平均值±1x标准偏差。
图32是比较来自对照工艺(灰色；单次浓注培养基补料)和改进的工艺(深灰色；四次培养基补料)的阿司弗泰斯阿尔法比活性的图。
图33是比较来自先前的工艺Y(下线；没有进一步补充锌)和进一步改进的工艺(上线；显示平均30-90μM的补充锌条件和延长至14天的培养时间)的图。
图34是显示去糖基化后所生产的阿司弗泰斯阿尔法(图A)以及经还原和去糖基化的所生产的阿司弗泰斯阿尔法(图B)的MALDI-ToF质谱数据的图。
图35是显示所生产的阿司弗泰斯阿尔法的MALDI-ToF质谱的图。图35公开了分别按出现的顺序的作为SEQ ID NO：1的残基83-105的“TYNTNAQVPDSAGTATAYLCGVK”、作为SEQID NO：1的残基93-97的“SAGTA”和作为SEQ ID NO：1的残基99-104的“AYLCGV”。
图36是显示阿司弗泰斯阿尔法上的磷酸化位点的MS/MS测定的图。
图37是显示所生产的阿司弗泰斯阿尔法上的唾液酸化聚糖的阴性MALDI-ToF质谱(图A)和中性聚糖的阳性MALDI-ToF质谱(图B)的图。
图38是显示阿司弗泰斯阿尔法的寡糖的荧光色谱图的图。
图39是显示阿司弗泰斯阿尔法参考标准物的荧光色谱的图。
图40是显示从阿司弗泰斯阿尔法生成的糖肽的质谱的图。
图41表示阿司弗泰斯阿尔法(C7108H11008O2206S56(蛋白质部分二聚体)；或C3554H550601103S28(单体))的主要聚糖的推定结构。每个聚糖(FA2G2、FA2G1和A2G2)的NeuAc数是估计的数目。
图42表示阿司弗泰斯阿尔法的糖基化位点上估计的聚糖结构。
图43是显示阿司弗泰斯阿尔法的代表性电泳图谱的图。
图44是显示从20K和2K批次(T15-16中的N123)生产的阿司弗泰斯阿尔法的糖肽质量指纹的图。2K批号：#35、#36和#38；20K批号：#40、#42和#34。
图45是显示从20K和2K批次(T26-27中的N213)生产的阿司弗泰斯阿尔法的糖肽质量指纹的图。2K批号：#35、#36和#38；20K批号：#40、#42和#34。
图46是显示20K和2K批次(T33中的N254)生产的阿司弗泰斯阿尔法的糖肽质量指纹的图。2K批号：#35、#36和#38；20K批号：#40、#42和#34。
图47是显示由20K和2K批次(T35中的N286)生产的阿司弗泰斯阿尔法的糖肽质量指纹的图。2K批号：#35，#36和#38；20K批号：#40、#42和#34。
图48是显示从20K和2K批次(T45-46中的N413)生产的阿司弗泰斯阿尔法的糖肽质量指纹的图。2K批号：#35、#36和#38；20K批号：#40、#42和#34。
图49是显示从20K和2K批次(T55中的N564)生产的阿司弗泰斯阿尔法的糖肽质量指纹的图。2K批号：#35、#36和#38；20K批号：#40、#42和#34。
图50是比较从2K和20K批次生产的阿司弗泰斯阿尔法的锌(图A)、镁(图B)和钙(图C)的ICP金属离子摩尔比的图。
图51A是比较不同pH条件下在整个培养时间中的活细胞密度(VCD)的图。图51B是比较在不同pH条件下在整个培养时间中的细胞活力的图。
图52A是显示在整个耗用培养时间中的生物反应器中的葡萄糖浓度的图。图52B是显示在整个耗用培养时间中的生物反应器中的乳酸盐浓度的图。
图53是比较不同pH条件下的比活性特征谱的图。
详述
定义
“约”、“大约”：如本文中所用，术语“约”和“大约”，当应用于一种或多种特定细胞培养条件时，是指与针对该一个或多个培养条件的所述参考值相似的值的范围。在某些实施方案中，术语“约”是指落在针对该一个或多个培养条件的所述参考值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少内的值的范围。
“氨基酸”：如本文中所用，术语“氨基酸”是指通常用于形成多肽的二十种天然存在的氨基酸中的任一种或这些氨基酸的类似物或衍生物。可将本公开的氨基酸在培养基中提供给细胞培养物。培养基中提供的氨基酸可以以盐或水合物形式提供。
“分批培养”：如本文中所用，术语“分批培养”是指培养细胞的方法，其中将最终用于培养细胞的所有组分，包括培养基(参见下文中“培养基”的定义)以及细胞本身，在培养工艺开始时提供。通常在某个时间点停止分批培养，收获培养基中的细胞和/或组分，并任选地进行纯化。
“生物反应器”：如本文中所用，术语“生物反应器”是指用于细胞培养物(例如，哺乳动物细胞培养物)生长的任何容器。生物反应器可具有任何尺寸，只要其可用于培养细胞。通常地，生物反应器将为至少1升，并且可以是10升、100升、250升、500升、1000升、2500升、5000升、8000升、10,000升、12,0000升、20,000升或更多，或之间的任何体积。通常在培养期间控制生物反应器的内部条件，包括但不限于pH和温度。生物反应器可由适合于在本公开的培养条件下保持悬浮在培养基中的哺乳动物或其它细胞培养物的任何材料(包括玻璃、塑料或金属)构成。如本文中所用，术语“生产型生物反应器”是指用于生产目标多肽或蛋白质的最终生物反应器。大规模细胞培养生产型生物反应器的体积通常为至少500升，并且可以是1000升、2500升、5000升、8000升、10,000升、12,0000升、20,000升或更多，或之间的任何体积。本领域普通技术人员将意识到并将能够选择合适的生物反应器用于实践本公开。
“细胞密度”：如本文中所用，术语“细胞密度”是指给定体积的培养基中存在的细胞的数量。
“细胞存活力”：如本文中所用，术语“细胞存活力”是指培养中的细胞在给定的一组培养条件或实验变化下存活的能力。如本文中所用，该术语也指在特定时间相对于当时培养物中存活和死亡的细胞总数存活的那部分细胞。
“培养物”和“细胞培养物”：如本文中所用，这些术语是指在适于细胞群体的存活和/或生长的条件下悬浮于培养基中的细胞群体(参见下文中的“培养基”的定义)。如对于本领域普通技术人员将很清楚的，如本文中使用的这些术语可以指包含细胞群体和群体悬浮于其中的培养基的组合。
“补料分批培养”：如本文中所用，术语“补料分批培养”是指培养细胞的方法，其中在培养工艺开始之后的某个时间向培养物中提供额外的组分。所提供的组分通常包含在培养工艺中已被耗尽的细胞的营养补充剂。补料分批培养通常在某一点停止，收获培养基中的细胞和/或组分，并任选地进行纯化。补料分批培养可在相应的补料分批生物反应器中进行。
“片段”：如本文中所用，术语“片段”是指多肽，并且被定义为对于该多肽是独特的或为该多肽的特征的给定多肽的任何分立部分。本文使用的术语还指给定多肽的任何分立部分，其保留全长多肽的至少一部分活性。在一些实施方案中，保留的活性部分是全长多肽的活性的至少10％。在各种实施方案中，保留的活性部分是全长多肽活性的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在其它实施方案中，保留的活性部分是全长多肽的活性的至少95％、96％、97％、98％或99％。在一个实施方案中，保留的活性部分是100％的全长多肽活性。本文使用的术语还指给定多肽的任何部分，其包括在全长多肽中发现的至少一个建立的序列元件。在一些实施方案中，所述序列元件跨越全长多肽的至少4-5个氨基酸。在一些实施方案中，序列元件跨越全长多肽的至少约10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或更多个氨基酸。
“积分活细胞密度”：如本文中所用，术语“积分活细胞密度”是指在培养过程中活细胞的平均密度乘以培养物已运行的时间量。假设所生产的多肽和/或蛋白质的量与在培养过程中存在的活细胞的数量成比例，积分活细胞密度是用于估计在培养过程中生产的多肽和/或蛋白质的量的有用工具。
“培养基”、“细胞培养基”和“培养基(culture medium)”：如本文中所用，这些术语是指滋养正在生长的哺乳动物细胞的含有营养物的溶液。通常，这些溶液提供细胞进行最小生长和/或存活所需的必需和非必需氨基酸、维生素、能量来源、脂质和微量元素。该溶液还可包含增强高于最低速率的生长和/或存活的组分，包括激素和生长因子。该溶液例如被配制成最适于细胞存活和增殖的pH和盐浓度。培养基也可以是“成分确定的培养基”-不含蛋白质、水解物或未知组合物的组分的无血清培养基。成分确定的培养基不含动物来源的组分，并且所有组分都具有已知的化学结构。
“代谢废物产物”：如本文中所用，术语“代谢废物产物”是指由细胞培养物作为正常或非正常代谢过程的结果而产生的化合物，其以一定的方式对细胞培养物造成损害，特别是在所需重组多肽或蛋白质的表达或活性方面。例如，代谢废物产物可对细胞培养物的生长或活力有害，可减少生产的重组多肽或蛋白质的量，可改变所表达的多肽或蛋白质的折叠、稳定性、糖基化或其它翻译后修饰，或者可以以许多其它方式对细胞和/或重组多肽或蛋白质的表达或活性造成损害。示例性代谢废物产物包括作为葡萄糖代谢的结果产生的乳酸盐和作为谷氨酰胺代谢的结果产生的铵。在一个实施方案中，采取方法来减缓细胞培养物中代谢废物产物的产生、减少甚至消除。
“摩尔渗透压浓度(Osmolality)”和“摩尔渗透压浓度(osmolarity)”：摩尔渗透压浓度是溶解的溶质颗粒在水溶液中的渗透压力的量度。溶质颗粒包括离子和非电离的分子。摩尔渗透压浓度表示为溶解在1kg溶液中的渗透活性颗粒(即，渗透压摩尔(osmoles))的浓度(1mOsm/kgH2O在38℃下相当于19mm Hg的渗透压)。相比之下，“摩尔渗透压浓度”是指溶解在1升溶液中的溶质颗粒的数量。当在本文中使用时，缩写“mOsm”意指“毫渗摩尔/千克溶液”。
“灌注培养”：如本文中所用，术语“灌注培养”是指培养细胞的方法，其中在培养工艺开始之后连续或半连续地向培养物提供额外的组分。所提供的组分通常包含在培养工艺过程中已被耗尽的细胞的营养补充剂。通常在连续或半连续的基础上收获培养基中的一部分细胞和/或组分，并任选进行纯化。
“多肽”：如本文中所用，术语“多肽”是指经由肽键连接在一起的氨基酸的连续链。该术语用于指具有任何长度的氨基酸链，但是本领域的普通技术人员将理解，该术语不限于长链，并且可指包含经由肽连接在一起的两个氨基酸的最小链。
“蛋白质”：如本文中所用，术语“蛋白质”是指作为分立单位起作用的一种或多种多肽。如果单个多肽是分立的功能单位并且不需要与其它多肽的永久性物理缔合来形成分立的功能单位，则本文使用的术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用。
“重组表达的多肽”和“重组多肽”：如本文中所用，这些术语是指从宿主细胞表达的多肽，所述宿主细胞已被遗传工程化以表达该多肽。重组表达的多肽可以与在哺乳动物宿主细胞中正常表达的多肽相同或相似。重组表达的多肽对于宿主细胞也可以是外来的，即对在宿主细胞中正常表达的肽是异源的。或者，重组表达的多肽可以是嵌合的，因为多肽的部分含有与在哺乳动物宿主细胞中正常表达的多肽相同或相似的氨基酸序列，而其它部分对于宿主细胞是外来的。
“接种”：如本文中所用，术语“接种”是指将细胞培养物提供至生物反应器或另一容器的过程。先前可将所述细胞已在另一个生物反应器或容器中繁殖。或者，可将细胞冷冻，并在即将提供给生物反应器或容器之前将其解冻。该术语是指任何数量的细胞，包括单个细胞。
“滴度”：如本文中所用，术语“滴度”是指由细胞培养物生产的重组表达的多肽或蛋白质的总量除以给定量的培养基体积。滴度通常以每毫升培养基中多肽或蛋白质的毫克的单位表示。
本文使用的首字母缩写包括例如VCD：活细胞密度；IVCC：活细胞浓度的积分；TSAC：总唾液酸含量；HPAE-PAD：高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法；SEC：尺寸排阻色谱；AEX：阴离子交换色谱；LoC：芯片上实验室；和MALDI-TOF：基质辅助激光解吸/电离-飞行时间。
本公开提供了培养表达重组蛋白的细胞(例如，哺乳动物细胞，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)的方法。本公开提供了用于通过细胞培养生产碱性磷酸酶(例如，阿司弗泰斯阿尔法)的制造系统。在某些实施方案中，提供了使对细胞生长、活力和/或蛋白质生产或质量有害的一种或多种代谢产物的产生最小化的系统。在具体实施方案中，细胞培养是分批培养、补料分批培养、培养或连续培养。下面详细论述本公开的其它实施例。然而，本领域普通技术人员将理解，对这些实施方案的各种修改包括在本公开的范围内。
蛋白质
本公开涉及细胞培养物中碱性磷酸酶阿司弗泰斯阿尔法蛋白的表达。在某些实施方案中，此类阿司弗泰斯阿尔法，在通过本文公开的方法制造之后，可用于治疗或预防碱性磷酸酶相关疾病或病症。例如，可向具有减少的和/或功能失常的内源性碱性磷酸酶或具有过表达的(例如，高于正常水平)碱性磷酸酶底物的受试者施用此类阿司弗泰斯阿尔法。在一些实施方案中，本公开中的阿司弗泰斯阿尔法是重组蛋白。在一些实施方案中，阿司弗泰斯阿尔法是融合蛋白。在一些实施方案中，本公开中的阿司弗泰斯阿尔法特异性靶向细胞类型、组织(例如，结缔组织、肌肉组织、神经组织或上皮组织)或器官(例如，肝、心、肾、肌肉、骨、软骨、韧带、肌腱等)。阿司弗泰斯阿尔法是由两个sTNALP-Fc-D10多肽组成的可溶性Fc融合蛋白，每个sTNALP-Fc-D10多肽具有726个氨基酸，如SEQ ID NO：1所示的。下划线标示的天冬酰胺(N)残基对应于潜在的糖基化位点(即N 123、213、254、286、413和564)。粗体下划线标示的氨基酸残基(L486-K487和D715-I716)分别对应于sALP与Fc结构域之间以及Fc与D10结构域之间的接头。
每种多肽或单体由五部分组成。含有氨基酸L1-S485的第一部分(sALP)是人组织非特异性碱性磷酸酶的可溶性部分，其含有催化功能。第二部分含有氨基酸L486-K487作为接头。含有氨基酸D488-K714的第三部分(Fc)是含有铰链、CH2和CH3结构域的人免疫球蛋白γ1(IgG1)的Fc部分。第四部分含有D715-I716作为接头。第五部分含有氨基酸D717-D726(D10)，其为允许阿司弗泰斯阿尔法与骨矿物质相结合的骨靶向部分。另外，每个多肽链含有六个潜在的糖基化位点和十一个半胱氨酸(Cys)残基。Cys102以游离半胱氨酸形式存在。每条多肽链在Cys122和Cys184、Cys472和Cys480、Cys528和Cys588以及Cys634和Cys692之间含有四个链内二硫键。两条多肽链通过两条链上的Cys493之间和两条链上的Cys496之间的两个链间二硫键连接。除了这些共价结构特征以外，哺乳动物碱性磷酸酶被认为在每条多肽链上具有四个金属结合位点，包括两个锌位点，一个镁位点和一个钙位点。
阿司弗泰斯阿尔法
在一个实施方案中，碱性磷酸酶蛋白质(例如，骨靶向sALP融合蛋白质)是阿司弗泰斯阿尔法(即，sTNALP-Fc-D10；SEQ ID NO：1)。具体地，阿司弗泰斯阿尔法是具有726个氨基酸的多肽长度的复合型可溶性糖蛋白。阿司弗泰斯阿尔法是由3个结构域组成的Fc融合蛋白。阿司弗泰斯阿尔法从N末端至C末端包含：(1)人组织非特异性碱性磷酸酶(TNSALP)的可溶性催化结构域(UniProtKB/Swiss-Prot登录号P05186)，(2)人免疫球蛋白G1Fc结构域(UniProtKB/Swiss-Prot登录号P01857)和(3)用作骨靶向结构域的十天冬氨酸肽(D10)(Nishioka等，2006Mol Genet Metab 88：244-255)。蛋白质从两个一级蛋白质序列缔合成同二聚体。该融合蛋白含有6个确认的复合N-糖基化位点。这些N-糖基化位点中的5个位点位于sALP结构域上，另一个位于Fc结构域上。存在于阿司弗泰斯阿尔法上的另一个重要的翻译后修饰是稳定酶和Fc结构域的二硫桥的存在。每个单体总共存在4个分子内二硫桥，并且二聚体中存在2个分子间二硫桥。碱性磷酸酶结构域的一个半胱氨酸是游离的。
阿司弗泰斯阿尔法可用作用于治疗低磷酸酯酶(HPP)的酶替代疗法。在HPP患者中，编码TNSALP的基因中的功能丧失突变造成TNSALP酶促活性的缺乏，这导致升高的底物(诸如无机焦磷酸盐(PPi)和吡哆醛-5’-磷酸盐(PLP))循环水平。给HPP患者施用阿司弗泰斯阿尔法可裂解PPi，释放出与钙结合的无机磷酸盐，从而促进羟基磷灰石晶体形成和骨矿化，并恢复正常的骨骼表型。关于阿司弗泰斯阿尔法的更多细节及其在治疗中的用途，参见PCT公开号WO2005103263和WO2008138131，所述PCT公开号的教导通过引用整体并入本文。在另一个实施方案中，阿司弗泰斯阿尔法可用作治疗神经纤维瘤病I型(NF1)的酶替代疗法。关于阿司弗泰斯阿尔法及其在NF1治疗中的用途(连同其它碱性磷酸酶的用途)的更多细节，参见PCT公开号WO2013/058833，其通过引用整体并入本文。
制造工艺
碱性磷酸酶蛋白(例如，阿司弗泰斯阿尔法)可使用本领域已知的标准方法由哺乳动物或其它细胞生产。可在培养皿、玻璃摇瓶或生物反应器中生长此类细胞。用于细胞培养和生产重组蛋白的具体工艺是本领域已知的，诸如，Nelson和Geyer，1991 BioprocessTechnol.13：112-143和Rea等，Supplement toBioPharm International2008年3月，20-25中所描述的。示例性生物反应器包括分批反应器、补料分批反应器和连续反应器。在一些实施方案中，在补料分批生物反应器中生产碱性磷酸酶蛋白质。
细胞培养工艺的物理化学环境中的潜在可变性包括例如pH、温度、细胞培养基组成、原料批次间的变化、培养基过滤材料、生物反应器规模差异、放气策略(空气、氧气和二氧化碳)等。如本文所公开的，制造的碱性磷酸酶蛋白的糖基化特征谱可受到一个或多个参数的改变的影响。
细胞培养工艺的开发
对于细胞培养中的重组蛋白生产，首先将具有必需转录调控元件的重组基因转移到宿主细胞中。通常，转移赋予受体细胞选择性有利方面的第二基因。在选择剂(其通常在基因转移后数天施用)的存在下，只有表达选择基因的那些细胞存活。两种流行的选择基因是二氢叶酸还原酶(DHFR)(一种参与核苷酸代谢的酶)和谷氨酰胺合成酶(GS)。在这两种情况下，在合适的代谢物(在DHFR的情况下为次黄嘌呤和胸苷，在GS的情况下为谷氨酰胺)不存在的情况下选择发生，从而防止非转化细胞的生长。一般地，为了高效表达重组蛋白质，生物药物编码基因和选择基因是否在相同的质粒上并不重要。
选择后，可将存活的细胞作为单细胞转移至第二培养容器中，并将培养物扩增以产生克隆群体。最后，评估个体克隆的重组蛋白表达，保留最高的生产者用于进一步的培养和分析。从这些候选物中，选择具有适当生长和生产率特征的一个细胞系来生产重组蛋白质。然后建立由生产需求决定的培养工艺。
细胞
可根据本公开使用可被培养以生产多肽的任何哺乳动物细胞或非哺乳动物细胞类型。可使用的哺乳动物细胞的非限制性实例包括例如中国仓鼠卵巢细胞+/-DHFR(CHO，Urlaub和Chasin，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4216)；BALB/c小鼠骨髓瘤细胞系(NSO/1，ECACC登录号：85110503)；人成视网膜细胞(PER.C6(CruCell，Leiden，TheNetherlands))；由SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾细胞系(经亚克隆用于在悬浮培养物中生长的293或293细胞，Graham等，1977J.Gen Virol.，36：59)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；小鼠塞尔托利细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.，23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-I587)；人宫颈癌细胞(HeLa，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳房肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等，1982，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383：44-68)；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝细胞瘤细胞系(Hep G2)。在具体实施方案中，从中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系培养和表达多肽和蛋白质。
另外，可根据本公开使用任何数量的表达多肽或蛋白质的商业和非商业可获得的重组细胞系。本领域技术人员将会理解，重组细胞系可能具有不同的营养需求和/或可能需要不同的培养条件以获得最佳生长和多肽或蛋白质表达，并且将能够根据需要改变条件。
如上所述，在许多情况下，细胞将被选择或工程化以生产高水平的蛋白质或多肽。通常，细胞被遗传工程化以生产高水平的蛋白质，例如通过引入编码目标蛋白质或多肽的基因和/或通过引入调控编码目标多肽的基因(无论是内源的还是引入的)表达的控制元件。
温度转换
细胞培养工艺(特别是非连续工艺(例如，生物反应器中的补料分批工艺))的运行时间通常受到细胞的剩余活力的限制，所述剩余活力通常在整个运行过程中降低。因此，延长细胞活力的时间长度对于改善重组蛋白生产是期望的。产物质量问题还提供了使活细胞密度的减小最小化和维持高细胞活力的动机，因为细胞死亡可将唾液酸酶释放到培养物上清液中，这可降低所表达的蛋白质的唾液酸含量。蛋白质纯化问题提供了使活细胞密度的降低最小化和维持高细胞活力的另一个动机。培养物中死细胞的细胞碎片和内容物可负面影响人们在培养运行结束时分离和/或纯化蛋白质产物的能力。因此，通过使细胞在培养中更长时间地保持活力，细胞蛋白质和酶(例如，细胞蛋白酶和唾液酸酶)对培养基的污染降低，所述细胞蛋白质和酶可引起由细胞产生的所需糖蛋白的降解和最终质量的降低。
可应用许多方法来在细胞培养中获得高细胞活力。一个工艺涉及在常温下初始培养之后降低培养温度。例如，参见Ressler等，1996，Enzyme and Microbial Technology18：423-427。通常，将能够表达目标蛋白质的哺乳动物或其它类型的细胞首先在常温下生长以增加细胞数量。每个细胞类型的此类“正常”温度通常在37℃左右(例如，从约35℃至约39℃，包括例如35.0℃、35.5℃、36.0℃、36.5℃、37.0℃、37.5℃、38.0℃、38.5℃和/或39.0℃)。在一个具体实施方案中，将用于生产阿司弗泰斯阿尔法的温度首先设定在约37℃。当达到相当高的细胞密度时，然后转换(例如降低)用于整个细胞培养物的培养温度以促进蛋白质生产。在大多数情况下，与先前的较高温度环境相比，降低温度使细胞向细胞周期的非生长G1部分转换，这可以增加细胞密度和活力。另外，较低的温度也可通过提高细胞蛋白质生产速率，促进蛋白质翻译后修饰(例如，糖基化)，减少新产生的蛋白质的片段化或聚集，促进蛋白质折叠和形成3D结构(从而保持活性)和/或减少新产生的蛋白质的降解来促进重组蛋白质生产。在一些实施方案中，较低的温度为约30℃至约35℃(例如，30.0℃、30.5℃、31.0℃、31.5℃、32.0℃、32.5℃、33.0℃、33.5℃、34.0℃、34.5℃和/或35.0℃)。在其它实施方案中，首先将用于生产阿司弗泰斯阿尔法的温度首先设定为约35.0至约39.0℃，然后转换至约30.0至约35.0℃。在一个实施方案中，首先将用于生产阿司弗泰斯阿尔法的温度首先设定在约37.0℃，然后转换至约30℃。在另一个实施方案中，首先将用于生产阿司弗泰斯阿尔法的温度首先设定在约36.5℃，然后转换至约33℃。在又一个实施方案中，首先将用于生产阿司弗泰斯阿尔法的温度首先设定在约37.0℃，然后转换至约33℃。在又一个实施方案中，首先将用于生产阿司弗泰斯阿尔法的温度首先设定在约36.5℃，然后转换至约30℃。在其它实施方案中，可应用多个(例如，不止一个)温度转换的步骤。例如，首先可将温度从37℃降至33℃，然后再降至30℃。
可以确定在转换到不同温度之前将培养物维持在特定温度的时间以获得足够的(或期望的)细胞密度，同时维持细胞活力和生产目标蛋白质的能力。在一些实施方案中，将细胞培养物在第一温度下生长直至活细胞密度达到约105个细胞/mL至约107个细胞/mL(例如，1x105、1.5x105、2.0x105、2.5x105、3.0x105、3.5x105、4.0x105、4.5x105、5.0x105、5.5x105、6.0x105、6.5x105、7.0x105、7.5x105、8.0x105、8.5x105、9.0x105、9.5x105、1.0x106、1.5x106、2.0x106、2.5x106、3.0x106、3.5x106、4.0x106、4.5x106、5.0x106、5.5x106、6.0x106、6.5x106、7.0x106、7.5x106、8.0x106、8.5x106、9.0x106、9.5x106、1x107个细胞/mL或更多)，然后将其转换至不同的温度。在一个实施方案中，将细胞培养物在第一温度下生长直至活细胞密度达到约2.5至约3.4x10６个细胞/mL，然后转换至不同的温度。在另一个实施方案中，将细胞培养物在第一温度下生长，直至活细胞密度达到约2.5至约3.2x10６个细胞/mL，然后转换至不同的温度。在另一个实施方案中，将细胞培养物在第一温度下生长直至活细胞密度达到约2.5至约2.8x10６个细胞/mL，然后转换至不同的温度。
在一些实施方案中，使细胞培养物在37℃下生长直至活细胞密度达到约2.5-2.8x106个细胞/mL，然后转换至30℃进行蛋白质生产。在其它实施方案中，将细胞培养物在37℃下生长直至活细胞密度达到约2.5-3.4x10６个细胞/mL，然后转换至30℃进行蛋白质生产。
pH
细胞培养物中生长培养基pH的改变可影响细胞蛋白水解活性、分泌和蛋白质生产水平。大部分细胞系在pH约7-8时生长良好。虽然细胞生长的最适pH在不同的细胞株间变化相对较小，但一些正常的成纤维细胞细胞系在pH 7.0-7.7下表现最好，并且转化的细胞通常在7.0-7.4的pH下表现最好(Eagle，1 973The effect of environmental pH on thegrowth of normal and malignant cells.J Cell Physiol82：1-8)。在一些实施方案中，用于生产阿司弗泰斯阿尔法的培养基的pH为约pH6.5-7.7(例如，6.50、6.55、6.60、6.65、6.70、6.75、6.80、6.85、6.90、6.95、7.00、7.05、7.10、7.15、7.20、7.25、7.30、7.35、7.39、7.40、7.45、7.50、7.55、7.60、7.65和7.70)。在一些实施方案中，用于生产阿司弗泰斯阿尔法的培养基的pH为约pH 7.20-7.60。在其它实施方案中，用于生产阿司弗泰斯阿尔法的培养基的pH为约pH 6.9-7.1。在一个具体的实施方案中，用于生产阿司弗泰斯阿尔法的培养基的pH为约pH 6.9。在另一个实施方案中，用于生产阿司弗泰斯阿尔法的培养基的pH为约pH 7.30。在另一个实施方案中，用于生产阿司弗泰斯阿尔法的培养基的pH约为pH 7.39。
本文引用的所有参考文献全文通过引用整体并入。
尽管为了清楚理解的目的，已经通过举例说明和实施例的方式详细描述了本公开，但对于本领域技术人员显而易见的是将实践某些小的改变和修改。因此，描述和实施例不应被解释为限制本公开的范围。
实施例
实施例1.阿司弗泰斯阿尔法的一般制造工艺
如本文所述，已经开发了生产碱性磷酸酶(例如，阿司弗泰斯阿尔法(sTNALP-Fc-D10))的制造工艺。
表1.示例性制造工艺(上游)之间的差异
使用GS基因表达系统开发了表达阿司弗泰斯阿尔法的稳定的CHO细胞系。次级克隆来源于单轮有限稀释克隆中的高产初级克隆，并选择最终的细胞系。
本文描述了示例性制造工艺，工艺X。将一小瓶主细胞库解冻，并将小瓶的整个体积重新悬浮。将整个体积转移至250mL摇瓶中以进行生长。每天取样进行计数和活力测试(也用于所有随后的扩增步骤)。通过几个步骤扩增细胞并将其接种至1,000L种子生物反应器(N-3低水平)、1,000L种子生物反应器(N-2高水平)和4,000L种子生物反应器(N-1)中，然后接种至20,000L生产型生物反应器。在产生阿司弗泰斯阿尔法后，采用收获物澄清工艺通过无菌过滤除去完整细胞和细胞碎片。然后将收获物超滤(收获后UF)以进行浓缩和缓冲液稀释。其它工艺包括例如病毒灭活(以化学灭活病毒颗粒)、MabSelect SuRe色谱、疏水相互作用色谱(HIC)、HIC后UF/DF(UF/DF2)、capto adhere混合模式色谱、病毒过滤(通过尺寸排阻)、制剂(UF/DF3)和大量填充(bulk fill)。进行多种制造工艺，包括例如2,000L-规模工艺，随后按比例放大到20,000L生产规模。2,000L(2K)与20,000L(20K)工艺之间的示例性差异概括于表2和3中。2,000L(2K)规模的工艺具有更明显的滞后期和更多不同的晚期活力(数据未显示)。
表2.示例性2,000L工艺和20,000L工艺之间的接种物扩增参数比较
表3.示例性2,000L工艺与20,000L工艺之间的生产型生物反应器参数比较
比较2K工艺和20K工艺的总产率以及相应生产的阿司弗泰斯阿尔法的质量。用于比较产物表征的分析方法包括例如SEC-HPLC、RP-HPLC和以测量生产的阿司弗泰斯阿尔法的比活性、蛋白质浓度、pH和总唾液酸含量(TSAC)的其它方法。另外，还进行杂质和安全性测试，以测量例如从不同工艺生产的阿司弗泰斯阿尔法中的残余DNA、残余蛋白A、宿主细胞蛋白质、生物负荷和内毒素。还进行了三个额外的测试(即，等电聚焦(IEF)、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和寡糖作图)，以比较2K和20K规模批次的药物。这三个测试的结果显示了这些批次的可比的分布。总之，在所有批次中，2,000L和20,000L规模之间的阿司弗泰斯阿尔法质量是可比的。
实施例2.温度转换对阿司弗泰斯阿尔法生产率和质量的影响
在生产sTNALP-Fc-D10所采用和实施的不同制造工艺中，通常发现温度转换会影响生产率和最终的阿司弗泰斯阿尔法质量。在所有的工艺中实施从生长温度(相对高的温度)至生产温度(相对低的温度)的温度转换。
为了比较温度转换对比不转换的作用，进行重复的sTNALP-Fc-D10生产型生物反应器运行，其中存在或不存在温度转换。Sartorius 2L和10L生物反应器用于不同的生产工艺。在该示例性工艺中，用于生产型生物反应器的原料包括例如生产培养基，10％碳酸钠、CHO补料和谷氨酰胺原液，如表4中概括的。SFM4CHO是指用于CHO的无血清培养基。
表4.示例性工艺中的工艺参数
方法
细胞培养实验设计
实施两个区块的实验以评估温度转换对示例性工艺的阿司弗泰斯阿尔法生产率和质量属性的影响。如表5中所示，在温度转换(37℃至30℃)下进行两个生物反应器运行(即，#1和#2)，而另外两个运行(即#3和#4)在不从37℃转换温度的情况下进行。
表5工艺#1的反应器条件
生物反应器ID 条件
#1 温度转换1
#2 温度转换2
#3 无温度转换1
#4 无温度转换2
使用细胞计数器(即，ViCell VR，Beckman Coulter)计数细胞密度和活力。使用pHOx测量pH和离线气体，并使用传感器(Nova Profile 100，Nova Biomedical，Waltham，MA)测量包括葡萄糖和乳酸盐的主要代谢物。使用具有修改(每个样品在酶活性测量之前仅稀释一次而不是三次)的标准方法测量酶活性。
收获和纯化方法
使用注射器从所有生物反应器收获50微升第10天(240±4小时)样品。通过离心(3000×g，5分钟)除去细胞后，使用0.22μm瓶顶过滤器澄清上清液，并在纯化前储存在-80℃。高通量蛋白A纯化的单个步骤应用于此研究中。在分析和蛋白质表征分析之前，将样品缓冲液交换为低盐缓冲液(5mM Na3PO4，pH7.4)。
分析和蛋白质表征方法
该研究中分析的质量属性包括阿司弗泰斯阿尔法聚集、片段化、电荷分布、总唾液酸含量(TSAC)和中性聚糖种类水平。通过SEC中定量的聚集峰相对于总蛋白质的百分比来估计聚集水平。通过LoC中定量的片段相对于总蛋白质的百分比来估计片段水平。通过在AEX中定量的碱性峰、主峰和酸性峰分别相对于总蛋白质的百分比来估计电荷分布。通过HPAE-PAD定量总唾液酸含量(TSAC)。中性聚糖种类的检测通过MALDI-TOF质谱来进行。
结果
细胞培养物性能
在工艺#1中，在活细胞密度(VCD)达到25-32×105个细胞/mL之后5小时内，将温度设定点从37℃转换至30℃。在无温度转换的情况下，细胞培养物达到了更高的峰VCD，但经历了更快的活力下降(图1A)。在无温度转换条件下也观察到更高的总体葡萄糖消耗(图1B)。根据工艺描述在无温度转换条件下在第5天和第8天施加葡萄糖浓注添加。有趣的是，乳酸盐仍在被消耗，但在无温度转换条件下的速率比在温度转换条件下的速率低得多(图1B)。
在无温度转换条件下的更高峰VCD导致蛋白A可结合滴度的早期产生(图2A)。随着在无温度转换条件下更快速的活力下降，在两种条件下于第10天获得相似的蛋白A可结合滴度。对于温度转换条件，总体特异性蛋白A可结合生产率为6.4pg/细胞/天，对于无温度转换条件为6.7pg/细胞/天。有趣的是，尽管在两种条件下观察到相似的蛋白A可结合滴度，但在无温度转换条件下的容积活性显著低于温度转换条件下的容积活性(图2B)。另外，在整个培养期间，无温度转换条件下的比活性显著低于温度转换条件下的比活性(图2C)。该数据表明，从37℃至33℃的温度转换对于保持工艺#1的比活性是最佳的。
表6中概述了在工艺#1中定量的所有质量属性。
表6.工艺#1的定量的质量属性
AEX结果表明，与温度转换条件相比，从无温度转换条件生成更少的酸性种类(图3A)。然而，在无温度转换条件下，通过SEC结果定量显著更高的聚集体(图3B)。在无温度转换条件下，非还原LoC平均峰百分比较高(图4A，同样在表6中的“LoC(主峰％，NR)”栏中)，而减小的LoC平均峰百分比较低(图4B，也在表6中的“LoC(主峰％，R)”栏中)。
在无温度转换条件下，唾液酸化显著增加约1倍(图4C)。
通过MALDI-TOF分析中性聚糖显示在无温度转换条件下没有检测到的高级甘露糖种类或非典型聚糖种类(图5)。然而，无温度转换条件导致较少量的A2(在具有温度转换的控制条件下为占优势的无岩藻糖基化的聚糖种类)、较高的岩藻糖基化(较高的FA2对A2比率)和高级聚糖(包括FA3G3、FA4G3、FA4G1L1和FA4G4L1)的增加(图5)。
在表7中概述了工艺#1中不转换温度对阿司弗泰斯阿尔法生产率和质量的影响。在无温度转换的情况下，所生产的阿司弗泰斯阿尔法具有低得多的比活性。同时，在无温度转换条件下的较高生产温度导致较高的唾液酸化和较高的岩藻糖基化。
表7.不转换温度对阿司弗泰斯阿尔法生产率和质量的影响
参数 工艺#1-无温度转换
蛋白A滴度 没有影响
容积活性 显著较低的容积活性
比活性 显著较低的比活性
AEX酸性峰 较少的酸性峰
SEC聚集体 需要进一步评价
LoC片段 需要进一步评价
TSAC 显著较高的TSAC
中性聚糖 更高的岩藻糖基化和更高级聚糖
实施例3.示例性工艺#2的初始上游工艺参数评估
本实施例概述了示例性阿司弗泰斯阿尔法制造工艺#2的上游制造工艺参数的初始评估以及它们影响所生产的阿司弗泰斯阿尔法的关键质量属性的潜力。一些上游工艺参数包括聚集％、片段化％、唾液酸化、糖基化、电荷分布和比活性。
细胞培养
该研究中提及的所有生产工艺均在摇瓶或生物反应器中进行。解冻后，将细胞通过一系列摇瓶和旋转瓶进行扩增，然后接种生产型生物反应器。除非另有说明，否则生产型生物反应器(2L、5L、10L或200L)使用一致的功率/体积和喷射气体体积/液体体积/分钟(VVM)进行按比例缩放。除非另有说明，否则将生产型生物反应器的温度从0至约120小时控制在36.5℃，并且在约120小时时转换至33.0℃。将溶解氧设定点维持在30％。在第10天(240小时±6小时)收获培养物时，在第96小时(h)、第144小时和第192小时添加约2.7％(v/v)的CPN补料/浓注，在晚于第10天收获培养物时，在第240小时给予另外的浓注补料。
收获和纯化
在以3000×g离心5分钟后通过0.22μm过滤澄清从生产型生物反应器收获的样品。进行澄清过滤的收获物的纯化，纯化的程度取决于研究和样品测试的要求。对大多数测试的样品实施一个色谱步骤(蛋白A)或两个连续色谱步骤(蛋白A，然后疏水相互作用色谱(HIC))纯化。另外，在分析测试之前，将样品缓冲液交换至低盐缓冲液(5mM Na3PO4，pH7.4)中。
分析表征
在该研究中引用的质量属性被定义为更广泛的质量量度(诸如纯度、效力和结构)的子集。描述的质量子集包括聚集％、片段化％、电荷分布、总唾液酸含量(TSAC)、中性聚糖特征谱和比活性。通过使用凝胶渗透HPLC(GP-HPLC)定量的相对峰面积来测定聚集体和片段水平。另外，使用SDS-PAGE或芯片上实验室(LoC)毛细管电泳来测定片段水平。使用阴离子交换(AEX)色谱法估计电荷分布。通过高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测(HPAE-PAD)对TSAC进行定量。中性聚糖种类的检测通过基质辅助激光解吸/电离(MALDI)质谱来进行。在基于对硝基苯基磷酸(pNPP)的碱性磷酸酶酶促测定之后测量比活性。
结果
1.生长和生产温度
已论述了温度对产物片段化的影响。对于由在36.5℃下生长的所选细胞克隆生产的阿司弗泰斯阿尔法，阿司弗泰斯阿尔法主条带被计算为95.9％，其中约4％为片段，如通过SDS-PAGE测量的。当第5天将温度从36.5℃转换至33.0℃时，相同克隆几乎不产生阿司弗泰斯阿尔法片段(主条带被计算为＞99％)。其它次级克隆在通过将温度从36.5℃转换至33.0℃而导致片段减少方面显示非常相似的趋势，尽管不是所有的次级克隆都能将片段水平降至1％以下。因此，生长温度和生产温度可影响片段化。另外，与进行温度转换相关的时间安排也可影响阿司弗泰斯阿尔法质量。
在于2L生物反应器中进行次级克隆筛选期间，在较低的生产温度下观察到通过GP-HPLC检测到的较高的聚集水平。图6A显示了当温度转换至33℃时，相较于温度未转换(即，保持在36.5℃)时由10个次级克隆生产的材料，由6个次级克隆生产的阿司弗泰斯阿尔法的聚集水平。这些数据表明温度从36.5℃转换至33.0℃可引起聚集水平的升高。
另外，在初级克隆选择和初始工艺开发期间研究了温度转换对TSAC的影响(图6B)。在2L生物反应器中使用初级克隆来研究生产温度(第5天以后)对唾液酸化或TSAC的影响。在该研究中，在条件1的第5天将生产温度从36.5℃转换至30.0℃，在条件2下的第5天将生产温度从36.5℃转换至33.0℃，并且对照在没有温度转换的情况下进行。当活力在60％与80％之间时收获样品，并且取决于活力，将这些培养物在收获之前运行11至18天。如图6B中所示，相较于在类似活力下，在恒定的温度下的对照，实施温度转换导致较低的TSAC，并且转换至较低的温度对应于较低的TSAC。本文中期望的最小TSAC值是1.8。由于唾液酸化(或TSAC)将改变产物的电荷分布，并将中性聚糖转化为带负电的聚糖，因此这三种质量属性(生产温度、聚集和TSAC)被认为是密切相关的。
2.pH
初步结果表明，将pH设定点从6.90改变成7.00导致TSAC增加(图7)。使用所选的次级克隆，分别使用pH设定点分别为6.90和7.00的两个2L生物反应器来研究pH对于阿司弗泰斯阿尔法唾液酸化的影响。分别在第10天和第12天从生物反应器中收获样品。据观察，在pH6.90的条件下，TSAC从第10天的1.9下降至第12天的1.4。尽管在pH 7.00的条件下观察到TSAC值下降的趋势相同，但在这两天的pH 7.00下的TSAC值(第10天的2.6，和第12天的2.1)高于较低pH条件下的那些TSAC值。这些数据表明，TSAC随着培养持续时间而下降，并且较低的pH设定点导致较低的TSAC值。
3.培养基补料添加
初步数据表明，与对照条件相比，延迟第一浓注添加或增加培养基中的葡萄糖浓度可导致显著更高的TSAC(图8A)。
另外，如何递送(连续地或通过浓注添加)培养基补料也对TSAC产生影响。来自2L和10L规模的数据均显示，与连续添加模式相比，当以浓注模式添加补料时观察到显著更高的TSAC(图8B)。因此，CPN补料被确定为以浓注方式补充。另外，当通过顶部端口滴加添加或通过表面下(浸渍)添加递送补料时，未观察到对TSAC的影响。
4.硫酸锌添加
已知对碱性磷酸酶(例如，阿司弗泰斯阿尔法)稳定性是必不可少的，因为锌离子有助于保持碱性磷酸酶结构和活性。例如，两个锌原子与一个胎盘碱性磷酸酶分子结合(Helene Le Du等2001 J.Biol.Chem.276：9158-9165)。基于该比率，对于通过在小规模模型中开发的示例性制造工艺产生的1g/L阿司弗泰斯阿尔法的滴度，对于阿司弗泰斯阿尔法活性需要约20μM的锌。
观察到随着细胞培养的进行，可连续生产蛋白A可结合的阿司弗泰斯阿尔法，但相应的容积活性不与蛋白A滴度同步，这表明所生产的蛋白质是无活性的(图9A)。此外，虽然容积活性从第5天至第9天下降时，但是在第9天补充硫酸锌时，蛋白质活性立即恢复。该数据表明需要将锌补充到生产培养基中。在该研究中，通过在第9天浓注添加，硫酸锌浓度增加了25μM。鉴于在第9天蛋白A滴度约为1000mg/L，该锌浓注添加使锌离子对阿司弗泰斯阿尔法的比率增加至至少2∶1。
在下面的研究中，使用微型生物反应器系统以分批模式研究了硫酸锌对细胞生长和活力的细胞毒性水平，其中在第0天将向培养基中添加不同浓度的硫酸锌。当锌硫酸盐浓度低于300μM时，几乎未观察到对生长或活力的影响(图9B和17C)。然而，在其中锌浓度大于或等于500μM的条件下，生长和生存力均受到显著影响。因此，总的锌补充的最佳浓度低于500μM。因此，据估计，在第0天补充的最佳锌浓度可以在约25μM与约300μM之间(考虑细胞生长/活力和蛋白质功能问题)。事实上，150μM的锌浓度甚至可能优于300μM，因为前者在第5天后导致更少的细胞生长抑制(图9A)。同样令人惊讶的是，尽管20μM的锌对于产生功能性阿司弗泰斯阿尔法在理论上是足够的(即，每个活性酶2个锌离子)，但实际的锌补充在碱性磷酸盐(例如，阿司弗泰斯阿尔法、TNALP、PALP、GCALP、IAP或其融合/变体蛋白)制造工艺中可能需要显著更高的锌浓度(例如150μM)。
5.接种密度
通常，较高的接种密度导致较高的峰活细胞密度，这主要归因于生产培养基中的某些营养组分限制。由于补料和温度转换是基于培养持续时间的，因此接种密度结合其它上游工艺参数，尤其是温度转换时间安排，可能会影响阿司弗泰斯阿尔法质量。
6.收获时间安排
该示例性工艺中的收获时间安排是240±6小时。收获时间安排对TSAC的影响已被证实(参见例如图7)。另外，收获时间安排也被认为与活力相关(参见例如图14)，并且接近培养结束时的活力下降表明收获时间安排可能会影响阿司弗泰斯阿尔法质量。
评估各种上游工艺参数，包括接种密度、温度、pH、DO、放气策略、搅拌、CPN补料、葡萄糖添加、半乳糖添加、锌添加和收获时间安排的控制。例如，如下所述评估更多的上游工艺参数，包括聚集％、片段化％、唾液酸化、糖基化、电荷分布和比活性。
温度对聚集、片段化和唾液酸化具有强烈影响。pH也影响阿司弗泰斯阿尔法唾液酸化。放气策略或/和搅拌似乎影响活力。CPN补料添加似乎对唾液酸化有影响。已显示锌添加对于维持酶促活性是必需的，并且基于提供的研究确定锌添加量(150μM)。已显示收获时间按排与接近培养结束时的活力和TSAC下降相关。
实施例4.示例性工艺#3的其它上游工艺参数的评估
本实施例概述了为了筛选生产型生物反应器工艺参数而进行的上游工艺的进一步表征。对于初始评估，在该示例性工艺中测试了一列上游工艺参数，包括生产培养物的pH、温度、接种密度、放气策略、搅拌、CPN补料、葡萄糖添加、半乳糖添加和收获时间安排。
首字母缩写
CPP：关键工艺参数，一种对关键质量属性有影响并因此将被监测和控制以确保工艺产生所需质量的工艺参数(工艺输入)。
CQA：关键质量属性
HPLC：高效液相色谱
LoQ：定量限
P/V：每体积的功率
材料和方法
进一步研究在初始实验中显示具有潜在影响的工艺参数。在以下工艺表征研究中进行了六个区块的生物反应器(表8)。考虑到制造和工艺参数范围测试时的控制能力，测试每个工艺参数的三个水平，以中间水平作为当前设定点(对照)。在区块1至5中，实施具有两个重复对照的三水平全因子设计。在区块6中，进行了极端P/V和喷射VVM加两种对照的四种组合。
表8.调查的工艺参数和水平
细胞培养
该研究中提及的所有生产工艺均在2L或10L生物反应器中进行。在接种生产型生物反应器之前，将解冻后的细胞通过一系列摇瓶和旋转瓶进行扩增。除非另有说明，否则生产型生物反应器(2L或10L)使用P/V和喷射VVM进行按比例缩放。在对照条件下，细胞培养工艺参数如下。培养物的pH设定点为6.90，具有0.05的死谱带。将温度从0到120小时控制在36.5℃，在120小时时转换至33℃。将溶解氧设定点维持在30％。初始P/V为17W/m3(0-96小时)，并且在于96小时时进行第一次浓注补料添加之前转移至81W/m3。在96小时、168小时和192小时时添加2.67％(v/v)的CPN补料/浓注。使葡萄糖维持在≤2g/L。如果葡萄糖低于2g/L，施加每日浓注将葡萄糖浓度增加至1.8-2.0g/L范围。整个培养过程中补充半乳糖：在第0天至第4天为2.0g/L，第5天至第9天每天1.0g/L。在第10天(240±4小时)和第11天(264±4小时)收获一部分培养物。
收获和纯化
将从生产型生物反应器收获的样品在3000×g下离心5分钟后通过0.22μm滤器进行澄清。对澄清过滤的收获物进行纯化。纯化的程度取决于研究和样品测试的要求。实施一步(蛋白A)或两个连续步骤(蛋白A和HIC)的纯化。另外，在分析测试之前，将样品缓冲液交换至含有低盐的缓冲液(5mM Na3PO4，pH7.4)中。
分析表征
该研究中提及的质量属性包括聚集％、片段化％、电荷分布、总唾液酸含量(TSAC)和中性聚糖特征谱。聚集体和片段水平均通过使用尺寸排阻色谱(SEC)定量的相对峰面积来测定。另外，还使用芯片上实验室(LoC)毛细管电泳来测定阿司弗泰斯阿尔法纯度(主峰)。使用阴离子交换色谱(AEX)估计电荷分布。通过高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测(HPAE-PAD)对TSAC进行定量。通过基质辅助激光解吸/电离-飞行时间(MALDI-TOF)质谱对中性聚糖种类进行检测。在基于对硝基苯基磷酸酯(pNPP)的碱性磷酸酶酶促测定之后测量容积活性。
统计分析和数据可视化
使用统计软件包JMP(Cary，NC)评估测试的工艺参数影响生产率和每个质量属性的潜力。分析了三个连续参数(分别为两个测试的工艺参数的三个水平，以及收获的两个水平)。报道了通过双侧t检验计算的单个p值，选择0.05作为显著性阈值。使用由JMP生成的等值线图来使测试的参数对每个质量属性的潜在影响可视化。
结果
由于该示例性工艺中的每个CQA的可接受范围仍在研究中，因此生成了示例性实验范围并将其用于比较目的(表9)。数据源来源于该研究获得的第10天的全部结果。对于杂质测量值(包括通过SEC测得的片段和聚集体以及通过AEX测得的碱性和酸性峰)，以平均值加2倍标准偏差作为阈值上限。由于通过SEC测量的片段的计算阈值上限和通过AEX测量的碱性峰低于SEC和AEX测定的LoQ(1％)，因此对于两个属性，将阈值上限设定为1％。至于TSAC，将平均值减去和加上2倍的标准偏差用作实验范围。
表9.CQA的小规模实验范围
每个工艺参数对每个CQA的直接影响的显著性概括于表10中。由于缺乏统计功效，没有计算P/V和喷射VVM影响的p值。小于或等于0.05的p值被认为是统计学显著的。
表10.每个工艺参数对通过JMP分析的CQA的直接影响的显著性
表11概述了在最小和最大测试的工艺参数水平上获得的平均质量属性值。例如，在葡萄糖和半乳糖添加研究中，三个生物反应器使用1.5g/L作为葡萄糖添加阈值，并且它们中的每一个具有不同的半乳糖添加水平。然后使用来自这三个生物反应器的平均值计算在葡萄糖阈值条件为1.5g/L时的CQA值。在下面的部分中，除非另有说明，否则将第10天的数据用于质量讨论。
表11.测试条件下的平均质量属性值
注释：当在总的半乳糖添加为15g/L的条件下计算通过AEX测量的碱性峰和酸性峰的平均百分比时，一个离群样品由于在测定中其峰响应低而被排除。将来自另一个生物反应器的生物重复样品保留用于计算目的。
1.pH
先前的结果表明pH影响所生产的阿司弗泰斯阿尔法的TSAC。在2L生物反应器中，进一步研究了培养物的pH和生产温度对阿司弗泰斯阿尔法的生产率和质量的潜在影响。实施包括三个培养物的pH水平(6.75、6.90和7.10)和三个生产温度水平(30.0℃、33.0℃和35.0℃)的全因子设计，并且分别在240±4小时、264±4小时时收获来自所有条件的样品。在分析性分析之前应用两步纯化(ProA+HIC)。
在测试范围6.75至7.10中的培养物的pH设定点被认为不是关键工艺参数(CPP)，因为所有测试的CQA均在表9中指定的小规模实验范围内。然而，已显示pH显著影响几个测试的质量属性。将pH设定点从6.75提高到7.10导致在33℃的对照生产温度转换后使TSAC从1.9增加至2.7(图10A)。pH也对通过SEC测量的片段化和通过AEX测量的碱性峰(表10)具有显著的影响，但所述影响小于或等于0.2％(表11)，其低于0.5％的基于HPLC的测定变化。此外，在控制条件(pH 6.90和生产温度33.0℃)下，在蛋白A滴度和容积活性方面均达到最高生产率(图10B和10C)。
数据表明，6.75至7.10的范围内的pH设定点对CQA的影响全部在实验范围内，表明生产培养物的pH不可能是CPP。在各种实施方案中，在6.65、6.70、6.75、6.80、6.85、6.90、6.95、7.00、7.05、7.10、7.15、7.2或更高的pH设定点生产碱性磷酸酶(例如，阿司弗泰斯阿尔法)。
2.温度
先前的结果表明温度对若干参数(包括聚集、片段化和TSAC)具有强烈的影响。由于先前的工艺在120小时时使用从36.5℃至33.0℃的温度转换，因此将温度影响的研究分成三个参数：生长温度(0-120小时)、生产温度(120小时时收获)和温度转换时间安排。分别对这三个温度相关参数进行进一步研究和概述于下文中。
2.1生长温度
在2L生物反应器中将生长温度的影响与DO设定点一起研究。在不同的测试条件下，从0至120小时保持三个水平的生长温度(35.0℃、36.5℃和37.5℃)，随后在120小时时将温度转换至33.0℃。在240±4小时和264±4小时时收获来自所有条件的样品。在分析性分析之前应用一步纯化(ProA)。生长温度影响生长速率和活力。在早期阶段较高的生长温度与较快的生长速率相关，随后在温度转换后快速生长速率下降，这导致较低的峰VCD。另外，较高生长温度下的培养物在收获当天也具有2-4％的较低终活力。有趣的是，生长温度显著影响生产率，并且容积活性在36.5℃的生长温度下达到峰值(图11A)。
关于对阿司弗泰斯阿尔法质量的影响，已显示生长温度仅对片段化(如通过SEC测量的)具有显著影响(图11B)。将生长温度从35.0℃升高至37.5℃导致片段水平从0.3％升高至0.8％。注意，这些测量值均低于SEC测定的LoQ(1％)。
由于生长温度对CQA的影响均在实验范围内(表9和表11)，因此在35.0℃至37.5℃范围内的生长温度不可能是CPP。在各种实施方案中，在33.0℃、33.5℃、34.0℃、34.5℃、35.0℃、35.5℃、36.0℃、36.5℃、37.0℃、37.5℃、38.0℃或38.5℃的生长温度下生产碱性磷酸酶(例如阿司弗泰斯阿尔法)。在一个具体实施方案中，在35.0℃、36.5℃、37.0℃或37.5℃的生长温度下生产碱性磷酸酶(例如，阿司弗泰斯阿尔法)。
2.2生产温度
2L生物反应器中将生产温度(30.0℃、33.0℃和35.0℃)对CQA的影响与培养物的pH设定点一起研究。在分析性分析之前应用一步纯化(ProA)。
生产温度显著影响CQA(特别是TSAC)、聚集和片段化(如通过SEC测量的)，以及通过AEX测量的酸性峰(表10和表11)。将生产温度从30.0℃升高至35.0℃导致平均TSAC从1.6增加至2.7(图10A)，同时将生产温度从35.0℃降低至30.0℃，从而导致从3.8％至8.2％的聚集体大量增加(如通过SEC测量的)(图12A)。另外，通过降低生产温度，通过AEX测量的酸性峰从3.7增加至8.5％(图12B)。该数据表明，高于30.0℃的生产温度可能有益于降低低TSAC的风险，并防止聚集/酸性峰增加。同时，生产温度与片段化(通过SEC测量的)(图12C)以及与碱性峰(如通过AEX测量的)(图12D)之间似乎存在非常微妙的正相关。该数据表明低于35℃的生产温度对于降低阿司弗泰斯阿尔法片段化的风险可以是优选的。
就对生产率的影响而言，生产温度似乎对蛋白A滴度和容积活性具有最大的影响(图10B和10C)。在30.0℃至35.0℃的范围内，升高生产温度与提高生产率相关。然而，在pH7.10下，生产温度与pH相互作用以影响生产率，在33.0℃的生产温度下出现最高生产率。在大于或等于33.0℃的生产温度下在pH 6.90下观察到关于容积活性和蛋白A滴度的峰生产率。尽管已显示生产温度对若干CQA具有显著的影响(表10)，但所述影响仍在实验范围内(表9和表11)。因此，在30.0℃至35.0℃的范围内的生产温度不可能是CPP。
在各种实施方式中，在29.0℃、29.5℃、30.0℃、30.5℃、31.0℃、31.5℃、32.0℃、32.5℃、33.0℃、33.5℃、34.0℃、34.5℃、35.0℃、35.5℃、36℃或更高温度的生产温度下生产碱性磷酸酶(例如，阿司弗泰斯阿尔法)。在一个具体实施方案中，在30.0℃、30.5℃、35.0℃的生产温度下生产碱性磷酸酶(例如，阿司弗泰斯阿尔法)。
3.温度转换时间安排
在2L生物反应器中将温度转换时间安排对CQA的影响与接种密度一起研究。测试了三个温度转换时间安排(108小时、120小时和132小时)，并在240±4小时和264±4小时收获来自所有条件的样品。在分析性分析之前应用一步纯化(蛋白A)。
温度转换时间安排对容积活性具有微妙的影响(图13A)。在高接种密度下，将温度转换时间安排从108小时延迟至132小时似乎降低了容积活性。然而，在较低的接种密度下，在较晚的温度转换条件下观察到最大的容积活性。
就阿司弗泰斯阿尔法质量而言，已显示温度转换时间安排仅显著影响片段化(如通过SEC测量的)(图13B)。在最晚的温度转换条件(132小时)下，平均片段水平为0.8％，接近片段化的小规模实验范围(＜1.0％)。因此，较窄的温度转换时间窗可能有益于降低片段化风险。
由于温度转换时间安排对CQA的影响全部在实验范围内(表9和表11)，因此从108小时至132小时的温度转换时间安排不可能是CPP。
在各种实施方案中，通过工艺生产碱性磷酸酶(例如，阿司弗泰斯阿尔法)，在所述工艺中在生长起始点(例如，接种)后100小时、105小时、108小时、110小时、115小时、120小时、125小时、130小时、132小时、135小时、140小时、145小时或150小时进行温度转换。在一个具体实施方案中，通过工艺生产碱性磷酸酶(例如，阿司弗泰斯阿尔法)，在所述工艺中在约108小时、120小时或132小时时进行温度转换。在各种实施方案中，在约200小时、210小时、220小时、230小时、240小时、250小时、260小时、264小时、270小时、280小时、288小时(即，12天)或超过12天的时间点收获碱性磷酸酶(例如，阿司弗泰斯阿尔法)。在一个具体实施方案中，在约240小时、264小时或288小时的时间点收获碱性磷酸酶(例如，阿司弗泰斯阿尔法)。
4.培养基补料
先前的结果表明，培养基补料添加影响唾液酸化。作为该示例性工艺的对照，在第4天、第6天和第8天向生产型生物反应器中添加三次培养基的浓注，总量相当于初始培养体积的8％(v/v)。在浓注次数不变的情况下，测试了三个补料量：67％、100％(对照)和133％。在浓注添加时间安排方面，研究了三种策略：(1)第3天、第5天和第7天；(2)第4天、第6天和第8天(对照)；(3)第5天、第7天和第9天。所有生物反应器在2L生物反应器中进行，并且在240±4小时和264±4小时收获来自所有条件的样品。在分析性分析之前应用一步纯化(蛋白A)。
尽管培养基补料量和起始时间安排不直接影响生产率，但它们的相互作用似乎对容积活性具有微妙的影响(图14A)。在控制条件下，达到最大容积活力。当提供减少33％的补料时，推迟补料起始导致较低的容积活性。
在更多(133％)和更早(在第3天进行第一次浓注)补料条件下观察到的升高的酸性峰(10.1％)和聚集(9.5％)接近小规模实验范围(对于酸性峰为10.2％，对于聚集为9.6％，表9)，表明需要在规模上更紧密地控制至少一个参数，例如，每次浓注15％的培养补料量变化和/或相对较短的添加时间窗口(96±3小时、144±3小时和192±3小时)。由于培养基补料添加对CQA的影响均在实验范围内(表9和表11)，因此在67％至133％的范围内变化的培养基补料量和补料时间安排(96±24小时、144±24小时和192±24小时)不可能是CPP。
在各种实施方案中，通过工艺生产碱性磷酸酶(例如，阿司弗泰斯阿尔法)，在所述工艺中，将培养基的额外浓注添加至生产型生物反应器中。例如，可以添加一次、两次、三次、四次、五次、六次或更多次的培养基浓注。在一个具体实施方案中，添加三次培养基浓注。在各种实施方案中，培养基的此类额外浓注可以以各种量添加。例如，可在生产型生物反应器中以约20％、25％、30％、33％、40％、45％、50％、60％、67％、70％、75％、80％、90％、100％、110％、120％、125％、130％、133％、140％、150％、160％、167％、170％、175％、180％、190％、200％或更多的培养基原始体积添加培养基的此类浓注。在一个具体实施方案中，可以以约33％、67％、100％或133％的原始体积的量添加培养基的此类浓注。在各种实施方案中，可在细胞生长或蛋白质生产期间的不同时间进行此类额外浓注的添加。例如，可在该工艺的第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天或更晚时间添加浓注。在一个具体实施方案中，可以每隔一天(例如在(1)第3天、第5天和第7天；(2)第4天、第6天和第8天；或(3)第5天、第7天和第9天)添加培养基的此类浓注。在实践中，可以根据上述限制自由地组合培养基的浓注补充的频率、量、时间点和其它参数，并且通过实验实践进行测定。
5.接种密度
在该研究中，在2L生物反应器中将接种密度对CQA的影响与温度转换时间安排一起研究。测试三种接种密度(4.0×105个细胞/mL，5.5×105个细胞/mL和8.0×105个细胞/mL)，并在240±4小时和264±4小时收集来自所有条件的样品。在分析性分析之前应用一步纯化(蛋白A)。
温度转换时间安排对生产率具有非常强的影响。如图13A中所示，将接种密度从4.0×105个细胞/mL增加至8.0×105个细胞/mL导致容积活性从平均806U/mL增加至平均1012U/mL。
就阿司弗泰斯阿尔法质量而言，仅接种密度经显示显著影响片段化，如通过SEC测量的(图13B)。在最高接种密度条件(8.0×105个细胞/mL)下，平均片段水平为0.8％，接近片段化的小实验范围(＜1.0％)。因此，更紧密的接种密度范围可有益于在尺度上减小片段生成的风险。
由于接种密度对CQA的影响均在实验范围内(表9和表11)，因此在4.0×105个细胞/mL至8.0×105个细胞/mL的范围内变化的接种密度不可能是CPP。在各种实施方式中，通过工艺生产碱性磷酸酶(例如，阿司弗泰斯阿尔法)在所述工艺中以约1.0×105个细胞/mL、1.5×105个细胞/mL、2.0×105个细胞/mL、2.5×105个细胞/mL、3.0×105个细胞/mL、3.5×105个细胞/mL、4.0×105个细胞/mL、4.5×105个细胞/mL、5.0×105个细胞/mL、5.5×105个细胞/mL、6.0×105个细胞/mL、6.5×105个细胞/mL、7.0×105个细胞/mL、7.5×105个细胞/mL、8.0×105个细胞/mL、8.5×105个细胞/mL、9.0×105个细胞/mL、9.5×105个细胞/mL、1.0×106个细胞/mL、1.5×106个细胞/mL、2.0×106个细胞/mL或更高的密度接种细胞。在一个具体实施方案中，在此类工艺中，以约4.0×105个细胞/mL、5.5×105个细胞/mL或8.0×105个细胞/mL的密度接种细胞。
6.收获时间安排
先前的数据表明，延迟收获时间安排与活力和TSAC下降相关，因此收获时间安排可对其它CQA具有潜在影响。在所有工艺表征研究中，从第10天(240±4小时)和第11天(264±4小时)从所有生物反应器收获样品。10个2L生物反应器用作工艺表征研究的多个区块中的控制条件。由于所有研究都是在相同的条件下利用现有工艺参数设置进行的，因此，他们允许就阿司弗泰斯阿尔法的生产率和质量对收获时间安排进行调查。这10个2L生物反应器的分析结果列于表12中。要指出的是，来自两个生物反应器(#18和#19)的样品通过两步纯化(ProA+HIC)来进行纯化，而来自另外8个生物反应器(#10至#17)的样品仅通过ProA纯化。应该指出的是，HIC能够提高样品纯度而不会影响TSAC。
表12.示例性2L生物反应器批次的分析结果
在每个单独的研究中，将收获时间安排被作为用于统计分析的第三参数来处理。如每个单独的研究中所示，将收获从第10天延迟至第11天导致蛋白A滴度和容积活性增加约10-15％。
在全部五个单独的研究中观察到收获时间安排对TSAC的显著影响。尽管TSAC在两种条件下仍在如表9中指定的小规模实验范围(1.5-2.9)内，但将收获延迟1天导致平均每摩尔蛋白质约0.3-0.4摩尔唾液酸的TSAC下降。由于收获时间安排对TSAC的显著影响，所以可以进行早期收获来增加TSAC。
关于聚集(如通过SEC测量的)和酸性峰(如通过AEX测量的)，已显示收获时间安排在5个研究中的3个中具有统计学显著的影响(表13)。
然而，与每个单独的研究中的对照条件相比，对任一CQA的影响的程度是微小的，小于1％。另外，所有值都落在表9中指定的小规模实验范围内(对于聚集体，≤9.6％，对于酸性峰，≤10.2％)。
在5项研究中的一项中(见表13)，片段水平受收获时间安排影响。然而，将收获延迟一天导致在两个对照条件下片段水平升高仅0.1-0.2％，并且第11天的片段水平仍低于SEC测定的LoQ(1％)。类似地，碱性峰水平从第10天的0.2-0.3％上升到第11天的0.4％，p值为0.03(表13)。然而，这两个值均仍然远低于AEX测定的LoQ(1％)。因此，在第10天(240±4小时)至第11天(264±4小时)的范围内变化的收获时间安排不可能是CPP。
表13.收获时间安排对来自单独研究的CQA的影响
结论
该研究中的被测试的工艺参数包括培养物的pH设定点、温度、接种密度、培养基补料量和时间安排、葡萄糖添加、半乳糖添加和收获时间安排。表14概述了每个使用的工艺参数。
表14工艺参数的概述
实施例5.针对示例性工艺#4中pH和生产温度对阿司弗泰斯阿尔法的质量属性的影响的更高分辨率的研究
除了先前的评估之外，该研究还提供了针对示例性制造工艺中培养物的pH和生产温度(≥120小时)对阿司弗泰斯阿尔法的生产率和质量属性的影响的更高分辨率的检查。测试的情况包括：1)不同的pH水平(即6.70、6.80、6.90、7.00和7.10)和为33.0℃的相同生产温度；以及2)不同的生产温度水平(即31.0℃、32.0℃、33.0℃、34.0℃和35.0℃)和为6.90的相同pH设定点。在240±4小时时收集来自所有条件的样品，并且测试蛋白A纯化的材料的若干质量属性(例如，片段化百分比、聚集百分比、电荷分布、总唾液酸含量(TSAC)和中性聚糖覆盖度。该研究确认了在于6.70至7.10的范围内变化的pH设定点和在于31.0℃至35.0℃的范围内变化的生产温度下运行的工艺保持所有的CQA。
细胞培养
在该研究中进行的所有实验使用Mobius 3L一次性生物反应器(CR0003L200；EMDMillipore)。该研究中使用的一列工艺参数示于表15中。另外，在对照生产温度(33.0℃)下检查了四个另外的培养物的pH条件，并在对照培养物的pH(6.90)下检查了另外四个温度(表16)。
表15用于示例性工艺#4的细胞培养工艺参数
表16测试的条件
编号 培养pH 生产温度
1 6.70 33.0℃
2 6.80 33.0℃
3 6.90 33.0℃
4 7.00 33.0℃
5 7.10 33.0℃
6 6.90 31.0℃
7 6.90 32.0℃
8 6.90 35.0℃
9 6.90 34.0℃
10 6.90 33.0℃
使用ViCell VR计数细胞密度和存活力。使用pHOx测量pH和离线气体，使用NovaProfile 100(Nova Biomedical，Waltham，MA)测量包括葡萄糖和乳酸盐的主要代谢物。使用具有修改的标准方法测量酶促活性，所述修改是每个样品在酶促活性测量之前仅稀释一次而非三次。
收获和纯化
使用注射器从所有生物反应器中收获50微升的第10天(240±4小时)样品。通过离心(3000xg，5分钟)除去细胞后，使用0.22μM瓶顶过滤器澄清上清液，并在纯化前储存于-80℃。在该研究中应用单步的基于高通量板的纯化(蛋白A)。在分析和蛋白质表征分析之前，将样品缓冲液交换至低盐缓冲液(5mM Na3PO4，pH7.4)。
分析和蛋白质表征
在该研究中分析的关键质量属性包括聚集百分比、片段百分比、电荷分布、TSAC和中性聚糖分布。通过聚集体峰相对总蛋白质的百分比(在SEC中定量的)来估计聚集体水平。通过片段相对总蛋白质的百分比(在SEC中以及LoC中定量的)来估计片段水平。分别通过碱性峰、主峰和酸性峰相对总蛋白质的百分比(通过AEX定量的)来估计电荷分布。通过HPAE-PAD定量唾液酸化水平(或TSAC)。中性聚糖种类的检测通过MALDI-TOF质谱来进行。等电聚焦使用iCE280系统来进行。
结果
细胞培养物性能
如上所述，培养物的pH和生产温度都对细胞培养物性能具有影响。低pH条件(pH＝6.70)导致最低的生长速率和最低的最大VCD，在收获当天(第10天)达到11.1x106个细胞/mL的最大密度(图15A)。较高的pH条件(pH＝7.00和7.10)导致比第10天的另一条件低1-2％的活力(图15B)。
较高的生产温度也与增加的生长(图16A)以及接近培养结束时的活力的更快下降相关(图16B)。较低的生产温度产生了较低的峰VCD，但产生了与33.0℃的对照设定点可比的活力。
增加培养物的pH也导致了葡萄糖的快得多的消耗(图17A)，并且在培养的早期阶段(在温度转换之前)导致更大的乳酸盐产量以及在整个培养持续时间中导致更大的乳酸盐的总体积累(图17B)。
在将生长温度转换至生产温度之前使培养细胞生长五天(120小时)。在第0天与第5天之间葡萄糖和乳酸盐的特征谱非常一致(图18A和图18B)。在温度转换之后，较高的生产温度与较高的葡萄糖消耗相关。与另一条件相比，对于33.0℃的生产温度条件观察到乳酸盐的最大浓度略有下降。另外，与所有其它条件相比，35.0℃的生产温度显示在培养的第9天和第10天期间乳酸盐消耗显著降低。
先前观察到，对于30.0℃与35.0℃之间的生产温度范围和6.75与7.10之间的培养物的pH，生产温度相较于培养物的pH对蛋白A滴度和比活性具有更加剧烈的作用。然而，该研究中的低pH条件(6.70)似乎对蛋白A滴度产生剧烈的影响，与对照条件(pH＝6.90)相比产生35％的下降(图19A)，以及与所有其它检查的pH条件相比产生低得多的容积活性(图19B)。培养物的pH似乎对特定蛋白A的生产率没有影响(图19C)。然而，低pH条件产生了最高比活性(图19D)，并且观察到培养物的pH不断降低与比活性不断增加之间的一般趋势。
与对照条件相比，低生产温度条件(31.0℃和32.0℃)引起蛋白A滴度的大幅下降(分别为26％和21％)(图20A)。另外，升高的生产温度与更高的容积活性(图20B)和略微增加的特定蛋白A生产率相关(图20C)。从生产温度的变化，没有观察到对比活性的影响(图20D)。
表17中概述了来自该研究的所有质量属性以及检查培养物的pH和生产温度的影响的先前工作。
表17.不同pH和生产温度的定量的质量属性
如在先前的研究中一样，TSAC受培养物的pH和生产温度的影响(图21)。TSAC的小规模实验范围为1.5-2.9，在此范围内更高的TSAC为更加期望的。已显示提高培养物的pH或生产温度增加产物的TSAC。一方面，将培养物的pH设定点从6.70提高到7.10，导致TSAC从约1.5增加到2.6-2.8，这在小规模实验范围内。另一方面，将生产温度从30.0℃提高到35.0℃导致TSAC从1.4增加到2.6-2.8。由于在30.0℃的生产温度下的TSAC值(1.4)低于小规模实验范围的下限(1.5)，因此在生产型生物反应器中应当可能地避免30.0℃的生产温度。该数据表明TSAC可以通过提高培养物的pH或生产温度或两者来增加。
目前通过使用AEX的酸性峰百分比测量的杂质水平示于图22中。提高生产温度降低了产物中的酸性峰百分比。培养物的pH与通过AEX酸性峰测量的杂质似乎没有任何相关性。尽管生产温度显示了对AEX酸性峰百分比的影响，但所有的值均在纯化的可接受限度内(≤10.2％)。对于所有检查的条件，AEX碱性峰始终低于1％，即测定的LoQ。
先前的研究显示AEX酸性峰与聚集体百分比之间的强相关性，如通过SEC所测量的。如图23所示，对于该研究，这一趋势得到保持。较高的生产温度导致较低的聚集体百分比。所有聚集体百分比均在小规模实验范围内(≤9.6％)。培养物的pH对聚集体百分比没有很强的作用。对于所有条件，通过SEC测量的阿司弗泰斯阿尔法片段低于1％，即测定的LoQ。
先前将通过LoC测量的主峰百分比鉴定为受到生产温度的显著影响。发现不断升高的生产温度与未降低的主峰百分比之间存在正相关(图24B)。发现培养物的pH对LoC主峰百分比(非还原)没有明显的影响(图24A)。还原LoC分析鉴定了所有条件下的100％主峰。
与实施例2中的示例性工艺中描述的BDS材料相比，对于任何条件没有观察到新的中性种类。然而，在低pH条件与较高的pH之间观察到分布变化，其中从在较高的培养物的pH下产生的物质观察到更高级的糖型(图25)。对于生产温度观察到类似趋，更高级的糖型存在于在较高的生产温度(34.0℃和35.0℃)下产生的材料中(图26)。
通过将最碱性的峰鉴定为峰6并以逆向数字顺序将接下来的4个峰鉴定为峰5至2来从iCE280色谱图进行峰确定。然后，峰1则由在峰2之后的下一个峰的pI以下鉴定的所有峰百分比组成。所鉴定的峰的所得pI值列于表18中。培养基pH和生产温度似乎均对毛细管等电聚焦结果具有影响(图27)。提高培养pH或生产温度都会使低pI峰的百分比增加，确定为峰1。另外，随着培养物的pH或生产温度的升高，高pI峰(峰5和峰6)的相关百分比降低。这些因素表明朝向更酸性种类的普遍转变与升高的pH或生产温度相关。这种转变可与和升高的pH和生产温度相关的增加的唾液酸化相关，这将产生更大百分比的酸性种类。
表18.鉴定的iCE280峰的pI范围
峰ID pI范围
峰1 ≤6.63
峰2 6.62-6.67
峰3 6.67-6.72
峰4 6.71-6.77
峰5 6.77-6.82
峰6 ≥6.83
结论
该研究证实了先前的结果，表明培养物的pH(6.70-7.10)和生产温度(31.0-35.0℃)不可能是CPP，因为所测量的CQA全部在如前所指定的小规模范围内。培养物的pH和生产温度均影响许多细胞培养物性能参数和质量属性。值得注意的是，提高培养物的pH或生产温度导致增加的最大VCD，而且还引起培养后期的活力迅速下降。
培养物的pH和生产温度均可在蛋白A滴度和容积活性方面影响生产率。6.70的培养物的pH导致较低的蛋白A滴度和容积活性。提高培养物的pH设定点导致比活性降低。因此，尽管培养物的pH对蛋白A滴度有积极影响，但在6.80至7.10的pH范围下容积活性几乎没有差异。另外，提高生产温度导致蛋白A滴度和容积活性增加，但不影响比活性。
提高培养物的pH或生产温度也导致较高的TSAC值。增加后一个参数也减少了聚集体和酸性峰的形成。最后，培养物的pH和生产温度均似乎改变了产物的等电聚焦特征谱。这些结果表明6.70至7.10的pH范围和31.0℃至35.0℃的生产温度范围是可接受的，并且建议严格控制两个工艺参数以在按比例放大(例如，达到10,000L的按比例放大工艺)中保持工艺稳健性和一致性。
实施例6.通过额外补料补充改善活性阿司弗泰斯阿尔法滴度
如先前实施例中所述，用于生产阿司弗泰斯阿尔法(sTNALP-Fc-D10)的先前示例性工艺是低产量工艺，在收获时具有约0.1g/L的活性阿司弗泰斯阿尔法滴度。本文中举例说明了用于工艺改进的替代制造工艺。上游和下游工艺都进行了评估。
在先前研究中评估了上游细胞培养工艺参数对阿司弗泰斯阿尔法质量和生产率的潜在影响。评估了细胞培养参数，包括金属补充(Zn2+/Mg2+/Ca2+)、温度转换时间安排、CHO补料量和收获时间安排，以在不影响任何其它关键质量属性(CQA)的情况下提高滴度和/或容积活性。先前研究的数据表明，金属补充导致TSAC显著低于对照条件，因此被排除在进一步评估之外。将温度转换时间安排从54小时延迟至78小时导致较低的比活性和较高的蛋白A滴度。作为结果，后期温度转换条件下的总容积活性保持不变。将CHO补料浓注量从1X(第2天5ml/L)增加至4X(第2、4、6和8天5ml/L)导致容积活性的显著增加，而对其它测试的质量属性(例如，TSAC、电荷分布和中性聚糖分布)没有不利影响。将收获日从第10天延迟至第12天与较高的生产率(例如，容积活性、蛋白A滴度和比活性)和略低的TSAC相关。基于该数据，在该研究中选择了CHO补料量的增加，以便在10L规模下进行进一步评估。
材料和方法
利用下列种子训练和细胞培养工艺进行用于阿司弗泰斯阿尔法(sTNALP-Fc-D10)生产的上游工艺：细胞接种物解冻，目标接种密度为5x105个细胞/mL；接种量扩大(细颈瓶/滚瓶阶段)，目标接种密度为3.5x105个细胞/mL；接种量扩大(细胞袋阶段)，目标接种密度为3.5x105个细胞/mL；接种量扩大(100L-低水平)，目标接种密度为3.5x105个/mL；接种量扩大(100L-高水平)，目标接种密度为3.5x105个/mL；1000L种子生物反应器(N3-低水平)，目标接种密度为3.5x105个细胞/mL；1000L种子生物反应器(N2-高水平)，目标接种密度为3.5x105个细胞/mL；4000L种子生物反应器(N1)，目标接种密度为3.5x105个细胞/mL；20000L生产型生物反应器，目标接种密度为5.5x105个细胞/mL。对于该研究，用作用于对照和改进的生物反应器工艺的生物反应器的接种物的小规模种子训练工艺包括：接种物解冻；第1代(1x100mL摇瓶，目标种子密度为5x105个细胞/mL)；第2代(2x100mL摇瓶，目标种子密度为3.5x105个细胞/mL)；第3代(2x1L旋转器，目标种子密度为3.5x105个细胞/mL)；第4代(2x15L旋转器，目标种子密度为3.5x105个细胞/mL)；8x10L生物反应器，目标种子密度为5.5xl05个细胞/mL。在该研究中使用的10L生物反应器是Sartorius B-DCU II生物反应器系统(Sartorius Stedim Biotech)和MFCS/win 3.0 Module Shell 3.0(32级)数据采集软件(Sartorius Stedim Biotech)。在生产型生物反应器中所用的一列原料包括：CM69生长培养基、100μM MTX(甲氨喋呤)、200mM的L-谷氨酰胺、CM70生长培养基、Sigma CHO补料、10％碳酸钠和FoamAway AOF(Gibco)。
将来自阿司弗泰斯阿尔法(sTNALP-Fc-D10)克隆(细胞系X)的开发工作细胞库的细胞小瓶解冻，并通过种子训练传代通过N-1期(相当于先前使用的20,000L工艺中的4000L种子生物反应器)。在2个具有15L工作体积的15L旋转器中进行N-1培养。将两种N-1培养物用于接种。将搅拌设定在200rpm，总气流量为20L/小时。根据测量的溶解氧和pH调整氧气和二氧化碳的放气。接种8个10L生物反应器和并在第10天进行收获。使用对照补料策略(一次补料)对两个生物反应器进行补料，而使用改进的补料策略对另外6个生物反应器进行补料(第2、4、6和8天的多次补料)。表19概述了用于这些生物反应器的细胞培养工艺参数。
表19.细胞培养工艺参数
*：与仅含约9μM氯化锌的基础培养基相比，各浓注补料含有1.2mM氯化锌。因此，各浓注补料增加约6μM的锌浓度(0.5v/v)。
20,000L规模的制造工艺使用基于VCD补料策略(以约25.0-32.0x105个细胞/mL的VCD进行的单次浓注，通常在培养的第2天左右)。在该研究中，将温度转换时间安排规划在接种后58小时进行，以满足VCD标准(25.0-32.0x105个细胞/mL)，所述VCD标准基于从在20K生物反应器产生的制造数据计算的平均倍增时间24.5小时。实施这一改变以简化工艺，并允许对补料时间安排进行更紧密控制。
结果
图28至图31中概述了所有生物反应器的细胞培养物性能。
将目前改进的工艺的生长动力学和活力与对照和先前的20，000L工艺进行比较。整个培养过程中的VCD与对照和20,000L工艺相似(图28A，误差棒表示±1X标准偏差)。在对照工艺和改进的工艺#4下的细胞活力以相似的速率下降，这比在先前的20,000L-规模工艺下的速率更快(图28B)。对于对照和改进的工艺，最终的活力分别为73％和70％，而20,000L工艺通常保持约80％。这似乎是可能归因于搅拌速率的10L系统的按比例缩放问题。这是在第二材料生成区块中测试的，并且来自该运行的数据表明活力下降可能归因于搅拌速率与被设定成通用CHO细胞类型的ViCell细胞计数器设置的组合，所述通用CHO细胞类型具有比先前工艺中的细胞类型(11-30μM)更宽的可接受细胞直径范围(5-50μM)。
图29中显示了葡萄糖利用和乳酸盐消耗曲线。改进的工艺显示与对照相似的葡萄糖利用和乳酸盐特征谱。
图30中显示了整个培养过程中的阿司弗泰斯阿尔法的蛋白A滴度和比活性。对照和改进的工艺的蛋白A滴度是可比的。然而，它们均低于通常在20,000L工艺中所见的滴度。这可部分归因于对于活性所见的规模差异，因为发现该研究中使用的功率对体积的比率比制造中使用的功率对体积的比率高30％(通过在制造规模下使用的P/V比率的随后接收确认的)。改进的工艺的比活性(单位/mg蛋白质)比对照平均高17％(532U/mg对比456U/mg)。这些数据与蛋白A滴度数据一起表明，虽然对于每个工艺产生相同量的蛋白质，但当对培养物进行更多补料时，所产生的蛋白质更具活性。
活性滴度和总容积活性(图31中显示的)表明改进的工艺产生比10L规模的对照工艺多约22-24％的活性。改进的工艺产生了与在20,000L规模下看到的大致相同的活性滴度，而对照工艺低约19％。
结论
该研究记录了改进的制造工艺(10L规模)的细胞培养物性能，其利用增加的补料量，导致活性滴度增加约22-24％，同时保持产物的蛋白A滴度。图32中显示了对照与改进的工艺之间的阿司弗泰斯阿尔法比活性的比较。显然，所有6个重复的改进的工艺条件(每个具有3次额外的补料添加)显示比对照高的比活性。
与仅含有约9μM氯化锌的基础培养基相比，各浓注补料含有1.2mM氯化锌。因此，各浓注补料在整个培养过程中导致约6μm锌浓度(0.5v/v)的增加。不局限于任何特定的理论，据推测，通过额外的补料补充产生的比活性的增加至少部分地归因于补充锌。
实施例7.通过补充锌来进一步提高阿司弗泰斯阿尔法活性
基于先前实施例中公开的制造工艺，进行了新的研究以进一步优化上游工艺参数。在表20中概述和比较示例性工艺Z与Z′。
表20.示例性制造工艺(上游)之间的差异
已经基于先前的工艺Y进行了进一步的优化。例如，新工艺Z′包括向培养基中补充约30-90μM硫酸锌，并将总培养时间从约240小时(即，10天)增加至约288小时(即，12天)。进行小规模摇瓶研究以测试工艺Z＇的三个变型(分别补充30μM、60μM或90μM的锌)。30μM的补充通过前装载至培养基中来进行。60μM和90μM的补充包括以两个相同的浓注在第2和6天(对于60μM的条件)补充锌，或者以三个相同的浓注在第2、6和10天(对于90μM的条件)补充锌。如图33中所示，与对照工艺Y(蓝线)相比，补充锌(红线；显示利用不同锌浓度的3次实验的平均值)有效地提高了阿司弗泰斯阿尔法的比活性。该增加在大约288小时(即12天)时隙达到峰值，随后下降。
实施例8.制造的阿司弗泰斯阿尔法的表征
本文说明了利用多个正交分析方法对制造的阿司弗泰斯阿尔法的示例性表征。这些方法被用来评估所生产的阿司弗泰斯阿尔法的身份、纯度、尺寸、结构、糖基化和电荷分布。一些方法也用于确保批次间一致性。另外，还表征了产物相关物质和产物相关杂质。
阿司弗泰斯阿尔法的结构阐明
除去寡糖后分子量的基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)分析
将除去寡糖之后的阿司弗泰斯阿尔法的MALDI-TOF质谱分析用于确定阿司弗泰斯阿尔法的身份。另外，还可通过该方法检测到任何显著水平的翻译后修饰，其分子量与阿司弗泰斯阿尔法的理论分子量显著不同。通过使用PNGaseF在还原或不还原二硫键的情况下消化阿司弗泰斯阿尔法来实现寡糖的去除。将样品脱盐并与2，5-二羟基苯甲酸和2-羟基-5-甲氧基苯甲酸在乙腈和三氟乙酸中的90∶10混合物混合。将样品风干，然后使用MALDI-TOF质谱仪分析。质谱以正模式获得。所述仪器使用牛血清白蛋白(BSA)进行外部校准。去糖基化后阿司弗泰斯阿尔法的质谱示于图34A中。m/z为161,140、80,571和53,748的峰分别对应于带单电荷、双电荷、三电荷的分子。161,140Da的测量分子量与在仪器的1％准确度极限内的计算分子量(161,135.2Da)一致。图34B显示了还原和除去寡糖后的阿司弗泰斯阿尔法的质谱。m/z为80,545、40,267和26,808的峰分别对应于带单电荷、双电荷或三电荷的分子。80,545Da的测量分子量与在仪器的1％准确度极限内的80,577.7Da的计算分子量一致。结果确认了阿司弗泰斯阿尔法的身份，并且证明不存在显著水平的除糖基化外的翻译后修饰。
分析超速离心(AUC)
将AUC用于测定聚集体、二聚体和片段(如果存在的话)的百分比，从而测定阿司弗泰斯阿尔法的纯度。另外，AUC测定阿司弗泰斯阿尔法二聚体的分子量，所述二聚体由于独特的氨基酸序列和翻译后修饰而为该分子的特征。其被认为是尺寸排阻色谱(SEC)的正交方法。使用25mM磷酸盐、150mM NaCl，pH 7.4将阿司弗泰斯阿尔法样品稀释至约1mg/mL。使用分析超速离心机进行沉降速度分析。使用配备有石英窗的双扇区池。使转子在20℃真空下平衡，约1小时后将转子加速至36,000RPM。以4.5分钟的间隔获取280nm处的吸收扫描，进行约6小时。首先使用DCDT分析数据以测定表观分子量，然后使用c(s)方法(SEDFIT软件)测定二聚体、高分子量和低分子量种类的百分比。阿司弗泰斯阿尔法的分子量为211kDa，代表性批次的纯度为96.8％。
完整分子量的MALDI-TOF
阿司弗泰斯阿尔法分子量的MALDI-TOF测量确定分子(包括所有翻译后修饰，主要是糖基化)的尺寸。将阿司弗泰斯阿尔法样品脱盐并与由2，5-二羟基苯甲酸和2-羟基-5-甲氧基苯甲酸的90∶l0混合物制成的基质混合。将样品风干，然后使用MALDI-TOF质谱仪分析。质谱以正模式获得。所述仪器使用牛血清白蛋白(BSA)进行外部校准。图35显示了阿司弗泰斯阿尔法的质谱图。m/z为180,157、90,223和60,540的峰分别对应于带单电荷、双电荷或三电荷的分子。其它低丰度的峰因苛刻的仪器设置造成的片段化而形成。180,157Da的测量分子量显著高于基于已知氨基酸序列的161,135.2Da的计算分子量。该结果表明阿司弗泰斯阿尔法的广泛翻译后修饰，主要是糖基化，因为去糖基化的阿司弗泰斯阿尔法的MALDI-TOF和ESI-TOF分析没有检测到显著水平的修饰。
尺寸排阻色谱多角光散射(SEC-MALS)
SEC-MALS用于根据尺寸分离蛋白质，然后测定每个峰的分子量。通过SEC-MALS分析阿司弗泰斯阿尔法(数据未显示)。在7.0-8.2分钟的保留时间窗口中的峰的计算分子量为194.1Da，这与基于已知氨基酸序列和广泛糖基化的阿司弗泰斯阿尔法的计算分子量非常一致，并且也与通过MALDI-TOF观测的分子量一致。
金属分析
使用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)来测定锌和镁的含量，并使用电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-AES)来测定钙的水平。使用加热的微波消化法，首先添加浓硝酸，然后添加过氧化氢来消化阿司弗泰斯阿尔法样品。然后使用ICP-MS仪(针对锌和镁)和ICP-AES仪(针对钙)分析样品。测定的摩尔比(离子摩尔数/阿司弗泰斯阿尔法单体的摩尔数)对于锌是2.27，对于钙是0.97，以及对于镁是0.12。锌和钙的比率与文献(Stec等2000J MolBiol 299：1303-1311和Mornet等，2001 J Biol Chem276：31171-31178)中的报道的比率完全一致。Mornet等(2001)教导，钙可以占据TNALP上的镁结合位点，从而表明阿司弗泰斯阿尔法分子中镁的比率可以小于一(1)。然而，为0.12的测试的镁比率仍然惊人地低。
磷酸化位点的确定
使用UPLC-MSe来确定磷酸化的位点和百分比。使终浓度为0.5mg/mL的阿司弗泰斯阿尔法在0.2M Tris，pH，8.6中的6M盐酸胍存在的情况下在37℃下用40mM DTT变性和还原1小时。通过添加碘乙酸至50mM的终浓度，并在室温下孵育30分钟来使还原的样品烷基化。然后使用截留分子量为10kDa的透析管将样品缓冲液交换成50mM碳酸氢铵。在37℃下以1∶50的胰蛋白酶：蛋白质的终比率(w∶w)使用胰蛋白酶消化样品，持续24小时。使用配备有反相C18柱和Q-TOF质谱仪的UPLC系统分析消化的样品。含有Ser93的胰蛋白酶消化肽(Trypticpeptide)被鉴定为磷酸化的和非磷酸化的。如图36所示，MS/MS谱显示S93偏移+80Da(通过磷酸化添加的磷酸的质量)，如通过y12和y13离子观察到的。使用提取离子色谱图(EIC’s)峰面积将磷酸化的相对百分比确定为33.9％。
游离聚糖的MALDI分析
游离聚糖的MALDI-TOF分析用于测定寡糖种类及其相对百分比。通过PNGaseF消化从阿司弗泰斯阿尔法参考标准物中释放寡糖。释放的聚糖使用Top tip carbon反相柱纯化。将释放的聚糖与sDHB基质1∶1混合，然后通过MALDI-TOF分析。对具有唾液酸的聚糖以负模式进行分析，然后对中性聚糖以正模式进行分析。图37A中显示了使用负模式获得的质谱。图37B中显示了使用正模式获取的质谱。通过将观测分子量与通常已知的寡糖的理论分子量相匹配来确定寡糖种类。相对百分比通过将单个峰强度除以所有聚糖的总峰强度来测定。主要的寡糖概述于表21和表22中。基于分子量，可将唾液酸的结构确定为N-乙酰基神经氨酸(Neu5Ac或NANA)。
表21.唾液酸化聚糖的理论和观测分子量(M-H)-
表22.中性聚糖的理论和观测分子量(M+Na)+
2-氨基苯甲酰胺(2-AB)标记的寡糖特征谱分析
通过2-氨基苯甲酰胺(2-AB)标记从阿司弗泰斯阿尔法释放的寡糖，然后通过具有荧光检测的正相HPLC进行分析，以测定各种寡糖的类型和相对百分比。使用二硫苏糖醇(DTT)在37℃下还原阿司弗泰斯阿尔法样品1小时，然后使用PNGaseF在37℃下消化过夜以释放N-连接的寡糖。将来自消化的样品的蛋白质沉淀，并通过冷乙醇和离心将其与释放的聚糖分离。含有释放的聚糖的上清液使用真空离心机来进行干燥，使用1％甲酸重构并在室温下孵育40分钟，然后再次干燥。然后按照制造商的说明(Ludger，Oxfordshire，UK)使用2-AB标记试剂来标记样品。使用聚糖S盒(Prozyme，Hayward，CA)清洁标记的聚糖，然后使用具有荧光检测(330nm的激发波长和420nm的发射波长)的HPLC进行分析。图38中显示了来自阿司弗泰斯阿尔法的分析的荧光色谱图。通过分级收集、分子量的质谱分析以及将分子量与通常已知的寡糖结构的分子量相匹配来确认峰的身份。通过2-AB标记鉴定的寡糖概述于表23中。从阿司弗泰斯阿尔法参考标准的分析获得的色谱图显示于图39中。
表23.糖型及其通过2-AB标记获得的相对百分比
糖肽特征谱分析
使用糖肽特征谱来确定位点特异性寡糖分布。使终浓度为0.5mg/mL的阿司弗泰斯阿尔法样品在0.2M Tris，pH 8.6中的6M盐酸胍存在的情况下在37℃下用40mM DTT变性和还原1小时。通过添加碘乙酸至50mM的终浓度，并在室温下孵育30分钟来使还原的样品烷基化。然后使用截留分子量为10kDa的透析管将样品缓冲液交换成50mM碳酸氢铵。在37℃下以1∶50的胰蛋白酶∶蛋白质的终比率(w∶w)使用胰蛋白酶消化样品，持续24小时。使用配备有反相C18柱和Q-TOF质谱仪的UPLC系统分析消化的样品。数据以正模式获得。对于每种糖肽，将横跨洗脱时间窗的质谱平均化。从阿司弗泰斯阿尔法的胰蛋白酶消化生成6种糖肽，其对应于每阿司弗泰斯阿尔法的单体6个糖基化位点。由于肽部分是决定保留时间的主要因素，因此基于其独特的氨基酸序列分离糖肽；因此，可获得位点特异性寡糖分布。糖肽的质谱示于图40中。与每个糖基化位点相关的寡糖种类概述于表24中。
表24.与每种糖肽相关的寡糖种类
基于观测分子量和其它分析结果(例如，质谱数据和2-氨基苯甲酰胺(2-AB)标记的寡糖特征谱分析数据)，在图41和图42中确定了阿司弗泰斯阿尔法的主要聚糖(≥4％的相对丰度)的结构。
毛细管等电聚焦(cIEF)
cIEF基于其等电点分离蛋白质，并用于监测阿司弗泰斯阿尔法的电荷变体。使用毛细管电泳系统分析性分析含有尿素、甲基纤维素、蔗糖、pharmalytes和pI标志物的缓冲液中的终浓度为0.5mg/mL的阿司弗泰斯阿尔法样品。将样品在1500V下聚焦0.1分钟，然后在3000V下聚焦14分钟。使用280nm处的紫外光吸收检测分离的蛋白质变体。来自阿司弗泰斯阿尔法的代表性批次的电泳图示于图43中。通过cIEF观察到6个峰。通常地，峰1具有宽的pI范围。对峰4和5观察到另外的肩。该结果表明，由于存在多个糖基化位点并且在每个位点处具有不同数量和水平的唾液酸，所以预期阿司弗泰斯阿尔法在电荷方面是高度不均匀的。表25中概述了代表性批次的阿司弗泰斯阿尔法的每个峰的pI和其相对百分比。
表25.通过cIEF观察到的峰的pI和相对百分比
产物相关物质
可预期因翻译后修饰而引起的阿司弗泰斯阿尔法的结构异质性，因为其在CHO细胞系中表达。如前所述，阿司弗泰斯阿尔法的异质性被反映为电荷变体，其中当通过cIEF分析时观察到6个峰。在临床和PV批次中已经证实了阿司弗泰斯阿尔法的电荷分布的一致模式。如使用代表性材料通过AUC、SDS-PAGE、SEC和AEX所测定的，阿司弗泰斯阿尔法的纯度最低为96％，表明通过cIEF观察到的多个峰充分代表了所生产的阿司弗泰斯阿尔法，并且所有峰均为产物相关物质。
产物相关杂质
产物相关杂质是分子变体，其在活性、功效和安全性方面不具有可与期望的阿司弗泰斯阿尔法可比的性质(工业指南，Q6B规范：生物技术/生物产物的测试程序和验收标准，1999年8月，ICH)。已经通过三次测定观察到产物相关杂质，并且每种杂质的特征概述于表26中。
表26.与阿司弗泰斯阿尔法产物相关的杂质的概述
方法 杂质
SDS-PAGE 具有除主条带外的分子量的条带
SEC 聚集体
AEX 截短的分子
SDS-PAGE条带的表征
通过非还原和还原SDS-PAGE分析阿司弗泰斯阿尔法。SDS-PAGE分析的结果表明，条带1对应于完整的阿司弗泰斯阿尔法，条带2对应于仅有一个酶臂的完整阿司弗泰斯阿尔法，条带3对应于阿司弗泰斯阿尔法的还原形式(单体)(数据未显示)。
如所预期的，在还原SDS-PAGE上从条带上观察到来自酶部分和IgG1-Fc部分的肽。除了在还原SDS-PAGE上的条带的表观分子量以外，该结果还表明主条带对应于以其还原形式存在的阿司弗泰斯阿尔法。条带表征概述于表27中。
表27：SDS-PAGE条带表征的概述
SEC峰的表征
通过分离高分子量种类(聚集体)、阿司弗泰斯阿尔法二聚体和低分子量种类，将SEC-HPLC用作纯度测定。在典型的SEC色谱图上，最丰富的峰对应于阿司弗泰斯阿尔法同二聚体。在主峰之前洗脱的峰对应于高分子量种类。在主峰之后洗脱的峰对应于低分子量种类。收集对应于高分子量种类和主峰的级分，并通过SDS-PAGE，然后通过凝胶内消化和质谱分析来进行分析。将观察到的肽分子量与从已知氨基酸序列推导出的理论分子量相匹配，显示对于主峰86.6％的序列覆盖度和对于高分子量种类70.7％的序列覆盖度。因此，可以得出结论：高分子量种类代表产物相关杂质。
表征AEX峰
将AEX用于监测阿司弗泰斯阿尔法的电荷变体。通过GP-HPLC以及通过非还原和还原SDS-PAGE(数据未显示)分析五种AEX级分以及原料。数据表明，AEX碱性峰主要含有阿司弗泰斯阿尔法，以及可能地小百分比的高分子量种类。AEX酸性峰含有阿司弗泰斯阿尔法高分子量种类。如通过肽指纹印迹(通过MALDI-TOF分析)确认碱性和酸性种类是与产物相关的。
已使用多种分析技术很好地表征了阿司弗泰斯阿尔法。通过N端测序、氨基酸分析以及通过MALDI-TOF和ESI-MS进行的分子量分析来确认其身份。通过AUC、SDS-PAGE、GP-HPLC和AEX监测所生产的阿司弗泰斯阿尔法的纯度。通过具有寡糖的分子的MALDI-TOF和SEC-MALS分析来评估阿司弗泰斯阿尔法的尺寸。另外，还通过AUC和SDS-PAGE进行阿司弗泰斯阿尔法的分子量分析。通过这些正交方法观察到一致的较高分子量的阿司弗泰斯阿尔法，表明分子在多个位点上的广泛糖基化，这已通过糖基化分析确认。通过远紫外光和近紫外光CD确定了阿司弗泰斯阿尔法的高级结构。分子的流体动力学尺寸也可通过AUC和SEC-MALS的分析来确定，这进一步确认了阿司弗泰斯阿尔法作为共价二聚体存在。通过SEC、AUC和SEC-MALS检测到少量聚集体。通过非还原肽图谱的LC-MS分析确认了天然二硫键结构和游离半胱氨酸在102处的定位。通过游离巯基总量的评估进一步确认了仅存在一个主要游离半胱氨酸。LC-MS分析表明活性位点丝氨酸残基被部分磷酸化。在阿司弗泰斯阿尔法药物中检测到文献中所报道的三种金属(包括锌、钙和镁)。通过使用MALDI-TOF的游离聚糖分析、2-AB标记的寡糖的正相HPLC分析、糖肽的LC-MS分析和总唾液酸测量，广泛分析了阿司弗泰斯阿尔法的糖基化。发现每个阿司弗泰斯阿尔法单体的全部6个糖基化位点与寡糖的异质群体相关。通过cIEF分析电荷分布、主要由唾液酸的存在引起的异质性，其中观察到6个峰。产物相关物质通过经由cIEF观察6个峰来反映。通过SEC、AEX和SDS-PAGE检测到低水平的产物相关杂质。
实施例9.以2,000L(2K)和20,000L(20K)规模制造的阿司弗泰斯阿尔法的可比性
在该实施例中，使用2,000L(2K)和20,000L(20K)工艺制造阿司弗泰斯阿尔法药物。为了证明以不同规模生产的阿司弗泰斯阿尔法之间的可比性，在可能的情况下，使用表28中描述的方法并行地分析使用2K(#35、#36和#38)工艺生产的3批阿司弗泰斯阿尔法和使用20K工艺(#40、#42和#34)生产的3批阿司弗泰斯阿尔法的物理化学性质。基于临床使用选择2K和20K的特定批次，并且对于所有2K和20K批次，先前测试的批次已经证实了批次间一致性。
所测试的物理化学性质确认了阿司弗泰斯阿尔法纯度、电荷变体、尺寸、身份、结构、糖基化和活性。测试结果概述于表29中。使用并行强制降解研究进一步评估制造可比性，其中比较了上述2K和20K批次的降解途径和动力学。将样品在40℃孵育0小时、14小时、24小时和48小时，并通过表30中所列的方法进行分析。温度强制降解研究的测试结果概述于表31中。
总体结果证明，使用2K和20K工艺制造的阿司弗泰斯阿尔法是可比的。
表28.阿司弗泰斯阿尔法的物理化学测试
表30.阿司弗泰斯阿尔法的温度强制降解测试
表31.阿司弗泰斯阿尔法的温度强制降解结果的概述
纯度
分析超速离心(AUC)
在2K与20K批次之间，通过分析超速离心测定的百分比单体水平是可比的。所有值在94.5％与97.6％之间范围内，20K的平均值为96.8％，2K的平均值为95.6％。如先前针对IgG1抗体的分析所证明的(参见Pekar和Sukumar2007 Quantitation of aggregates intherapeutic proteins using sedimentation velocity analyticalultracentrifugation：Practical considerations that affect precision andaccuracy.AnalyticalBiochemistrv，367：225-237)，差异在AUC的测定变异性内，所述IgG1抗体也是具有相似分子量的糖蛋白。GP-HPLC数据(如下所示)显示单体的百分比可比性，这进一步表明通过AUC检测的批次间的轻微差异是由分析内变异(诸如仪器池之间的差异)造成的。对于从示例性工艺#35生产的阿司弗泰斯阿尔法，检测到2.5(s)处的小的另外的峰，这是c(s)分析的假像。对应于阿司弗泰斯阿尔法的二聚体(约11(s))的#35峰的偏移被认为在该方法的误差限内。阿司弗泰斯阿尔法AUC数据由University of Connecticut，Analytical Ultracentrifugation Facility，Biotechnology Bioservices Center获得。该方法基于连续沉降系数分布来区分阿司弗泰斯阿尔法单体与由二聚种类或更大种类组成的聚集体以及其相对百分比。
SDS-PAGE/LoC(芯片上实验室)
通过SDS-PAGE：(PerkinElmer)GXII蛋白质测定法测定的非还原和还原的蛋白质的主条带％在2K批次与20K批次之间是可比的。如表29中所概述的，对于3个2K批次，平均主条带％为100.0％(非还原的)和99.8％(还原的)，对于20K批次，平均主条带％为100.0％(非还原的)和99.8％(还原的)。另外，如通过非还原和还原分析的电泳图所证实的，对于2K和20K批次观察到可比的条带模式。该测试基于其分子量分离蛋白质，并提供以百分比主条带表示的完整蛋白质的纯度分析。该测定按照LabChip GXII Protein AssayQuick Guide，HT Protein Express LabChip Kit，第2版(2010年3月修订)进行。
SDS-PAGE
使用SDS-PAGE并行分析3个2K批次和3个20K批次。对于用于非还原和还原SDS-PAGE的所有批次，通过光密度测定法进行的分析产生占100％的主条带。除了主条带以外，对于所有批次还观察到低于定量限的微弱条带，所述微弱条带具有高于阿司弗泰斯阿尔法二聚体的表观分子量的表观分子量。对于所有批次，通过还原SDS-PAGE只观察到一个条带。该测试基于分子量分离蛋白质，并提供以百分比主条带表示的完整蛋白质的纯度分析。将蛋白质样品在凝胶上分离，用考马斯蓝染色剂染色以进行可视化，脱色并通过光密度测定法进行分析。通过与已知分子量标准比较来估计阿司弗泰斯阿尔法、降解产物和工艺相关杂质的分子量。通过扫描以及利用密度计分析法分析来进行分离的蛋白质的定量测量。
GP-HPLC
通过GP-HPLC并行分析阿司弗泰斯阿尔法的纯度。表29中显示了2K平均值(96.5％)和20K平均值(98.6％)。20K批次的阿司弗泰斯阿尔法％略高于2K批次。然而，批次数据显示相似的二聚体％，表明2K批次的略低的二聚体％主要归因于样品历史(诸如材龄)的差异。GP-HPLC色谱图也显示了来自2K和20K批次的可比的产物。相同保留时间处的相同峰表明观察到相同的种类。该方法可区分阿司弗泰斯阿尔法与较大种类和较小片段。
阴离子交换色谱(AEX)
对于所有2K批次和20K批次通过AEX所得的主峰％在93.62％至96.84％的狭窄范围内，如表29中所示。2K平均值为94.17％的主峰面积，20K平均值为96.38％的主峰面积。对于20K批次，由于晚期洗脱峰的减少而观察到略高的主峰％。20K批次中的主峰的略高水平表明产物纯度较高。AEX色谱图在相同的保留时间下显示2K和20K批次的重叠峰，表明来自所有批次的产物具有相同的种类。该方法按照净表面阴离子电荷递增的顺序分离蛋白质。利用280nm处的紫外吸光度检测分离的蛋白质，然后将其定量为峰面积百分比。
电荷分布
毛细管等电聚焦(cIEF)
当通过cIEF分析阿司弗泰斯阿尔法时，2K和20K批次的每个峰的峰谱和相对％是可比的。所有样品均显示～6.57至～6.85的等电点(pI)范围的6个主峰，并且这些峰从左至右被称为峰1、峰2、峰3、峰4、峰5和峰6。在2K和20K批次中针对每种带电荷的变体种类检测到的峰面积是可比的，如表29中所示。使用所有批次的T检验分析确认2K和20K批次的cIEF峰％之间的可比性，如表32中所示(所有p值均大于0.05，表明批次之间任何观察到的差异不显著)。2K和20K批次的cIEF电泳图谱在相同的pI范围内显示相似的峰谱。cIEF提供基于蛋白质同种型pI的带电荷的变体种类的半定量分离。在280nm吸光度处检测分离的蛋白质。
表32. 2K和20K批次的cIEF峰％的T-检验
分子尺寸
尺寸排阻色谱-多角光散射(SEC-MALS)
通过2K和20K批次的SEC-MALS测定的阿司弗泰斯阿尔法的分子量是可比的。2K批次的平均分子量为189.2kDa，并且20K批次的平均分子量为189.2kDa，如表29中所示。在紫外光色谱图上观察到所有批次的相似峰谱(批次#36的样品在较后的日期运行，由于样品的可用性，导致其峰谱与另外的样品非完美匹配)。SEC-MALS方法将根据尺寸分离蛋白质种类的SEC柱与测定峰的分子量的MALS仪组合。高分子量种类(表29中所列的)的分子量的高度变化(如通过光散射信号和折射率(RI)测定的)归因于低丰度种类的测定的较高方法变化。基于UV色谱图，高分子量种类相对于阿司弗泰斯阿尔法的相对保留时间对于所有6个批次是相似的，这表明高分子量种类的分子量也应该是相似的。
完整分子量分析(MALDI-ToF-MS)
2K批次的平均分子量为180,902Da，20K批次的平均分子量为180,019Da，如表29中所示。20K批次和2K批次的分子量在外部校准的MALDI-ToF的1％质量准确度内，因此具有可比性。2K分子量的略高的趋势可能归因于存在略高量的较大寡糖诸如具有唾液酸的寡糖。阿司弗泰斯阿尔法2K和20K批次的MALDI-ToF完整分子量(IMW)谱也检测到相同的峰谱。使用不同的仪器校准对批次#36进行单独地分析，但为了可比性的完整性，将批次#36包括在内。谱中存在的另外的质量归因于测定诱导的片段化和/或多电荷离子。针对鉴定的种类观察到的强度差异是基质结晶和激光效应的结果。该方法基于分子量来鉴定分子。将测试样品固相萃取并与sDHB基质溶液混合，并在MALDI靶上共沉淀。该干燥的样品用激光电离至ToF质谱仪中。从每个样品收集m/z谱，并将完整的m/z转换成分子量。
身份
去糖基化/还原以及去糖基化分子量分析(MALDI-ToF-MS)
使用NIST分子量和同位素百分比(具有形成10个二硫键的20个半胱氨酸)，从两个具有726个氨基酸的相同多肽氨基酸序列的一级氨基酸序列计算去糖基化的阿司弗泰斯阿尔法的分子量。去糖基化的阿司弗泰斯阿尔法分子量计算为161,135.20Da。
来自20K批次和来自2K批次的去糖基化的阿司弗泰斯阿尔法的分子量全部在计算的去糖基化分子量(外部校准的MALDI-TOF的质量准确度)的1％内，如表29中所示。20K批次的平均分子量为160,881Da，2K批次的平均分子量为161,050Da，如表29中所示。2K和20K批次的MALDI-ToF谱检测到类似的峰谱。谱中存在的另外的质量归因于测定诱导的片段化、不完全去糖基化和/或多电荷离子。针对鉴定的种类观察到的强度差异是基质结晶和激光效应的结果。
使用NIST分子量和同位素百分比，从具有726个氨基酸的多肽氨基酸序列的一级氨基酸序列计算还原和去糖基化的阿司弗泰斯阿尔法的分子量。还原和去糖基化的阿司弗泰斯阿尔法的分子量计算为80,577.68Da。
将还原和去糖基化的阿司弗泰斯阿尔法20K批次的分子量值与2K批次比较，并且所有值均在计算的还原和去糖基化分子量(外部校准的MALDI-ToF的质量准确度)的1％内，如表29中所示。2K批次的平均值为80,530Da，且20K批次的平均值为80,539Da。2K和20K批次的MALDI-ToF谱检测到可比的峰谱。谱中存在的另外的质量归因于测定诱导的片段化和或多电荷离子。针对鉴定的种类观察到的强度差异是基质结晶和激光效应的结果。该方法基于分子量鉴定分子。将测试样品固相萃取并与sDHB基质溶液混合，并在MALDI靶上共沉淀。将该干燥的样品用激光电离至ToF质谱仪中。从每个样品收集m/z谱，并将完整的m/z转换成分子量。
2K和20K批次的去糖基化阿司弗泰斯阿尔法的分子量是可比的，并且所有值均在计算的去糖基化分子量(外部校准的ESI-ToF-MS的质量准确度)的100ppm内，如表29中所示。2K批次的平均分子量为161,137.39Da，并且20K批次的平均分子量为161,137.28Da，并且所述值与为161,135.20Da的计算的去糖基化分子量一致。2K批次的主峰的还原和去糖基化分子量值与20K批次的主峰的还原和去糖基化分子量值是可比的，并且所有值都在计算的还原和去糖基化的分子量(外部校准的ESI-ToF-MS的质量准确度)的100ppm内，如表29所示。2K批次的平均分子量为80,575.52Da，且20K批次的平均分子量为80,574.76Da。所述值与80,577.68Da的阿司弗泰斯阿尔法的计算的还原和去糖基化分子量值一致。该方法基于完整分子量鉴定分子。将测试样品注射到C4RP-HPLC柱上并用水性：有机溶剂梯度洗脱。然后将洗脱物电喷雾至ToF质谱仪中，并将来自色谱峰的上半部分的谱解卷积以提供完整分子量。
如表29所示，通过电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测定的3个20K批次和3个2K批次的锌与镁离子的摩尔比是可比的。如表29所示，通过电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)测定的20K和2K批次的钙离子摩尔比是可比的。锌和钙的离子摩尔比也与文献一致，其中两个锌和一个钙与每个碱性磷酸酶单体相缔合(参见E.Mornet等2001“Structuralevidence for a functional role of human tissue non-specific alkalinephosphatase in bone mineralization.”JBC，276：31171-31178；以及B.Stec，KM.Holtz和ER.Kantrowitz.2000“A revised mechanism for the alkaline phosphatase reactioninvolving three metal ions.”JMB，299：1303-1311)。所有批次的镁离子摩尔比令人惊讶地低于文献报道的预期值。选择ICP-AES用于钙分析，因为ICP-AES不会受到在ICP-MS中针对钙同位素观察到的氩多原子干扰的影响。阿司弗泰斯阿尔法的ICP数据可商购获得。这些方法测定了镁、锌和钙的量(μg/mL)，从其计算出阿司弗泰斯阿尔法的摩尔离子比。
通过UPLC-MSe进行的磷酸化位点鉴定和定量
通过UPLC-MS胰蛋白酶消化肽作图确定磷酸化的位点和相对百分比。已知碱性磷酸酶在活性位点中含有可形成丝氨酸-磷酸酯中间体的丝氨酸残基(参见Millán，JoséLuis.2006“Mammalian Alkaline Phosphatases.”Wiley-VCH的第28-29页)。如表29所示，发现相同的丝氨酸残基93在所有批次中磷酸化的百分比在35.7％至31.2％的范围内。发现磷酸化百分比与阿司弗泰斯阿尔法的比活性(pNPP)、HA结合、Km和Kcat相关(数据未显示)。基于相关性的缺乏，磷酸化中间体不是阿司弗泰斯阿尔法活性的限速步骤。通过UPLC-MSe肽作图确认了阿司弗泰斯阿尔法中S93处的磷酸化位点的确认和鉴定。将阿司弗泰斯阿尔法的理论序列和预测的胰蛋白酶裂解用于分析。收集所得的LC-MSe数据，并使用WatersBiopharmalynx v.1.2处理所述数据。Biopharmalynx软件(Waters)将来自一级序列的第13个胰蛋白酶消化肽(T13)(其含有来自该分子的酶促部分的活性位点丝氨酸S93)鉴定为具有用ac封端的Cys102以及以磷酸化和非磷酸化形式存在的S93。一旦被鉴定为肽图谱的一部分，就拉出这些肽中的每一种的提取离子色谱图(EIC)，对其进行平滑和积分。从所得到的EIC峰面积中，磷酸化肽峰面积与总峰面积的比率给出了S93处磷酸化的相对百分比。如图36中所示，通过检查针对所提出的磷酸化T13肽生成的MSe片段化模式来确认与磷酸化丝氨酸侧链相关的+80Da。该片段化模式确认了S93偏移+80Da(磷酸化的质量)(通过y12和y13离子观察到的)。将每批次阿司弗泰斯阿尔法还原并烷基化，然后用胰蛋白酶消化。使用Waters Acquity UPLC和Synapt Q-ToF质谱仪，以正离子电喷雾模式操作，通过ESI-Q-ToF-MS进行检测。
糖基化
N-连接的寡糖质量特征谱分析(MALDI-ToF-MS)
通过MALDI-ToF分析来自3个2K批次和3个20K批次的释放的寡糖，结果显示在表29中。在20K批次和2K批次中观察到以相似相对百分比存在的相同聚糖种类。该方法通过分子量鉴定了与药物相关的聚糖。使用PNGase-F消化和随后的酸化将聚糖从药物中酶促裂解。然后将聚糖固相萃取并与超级3，4-二羟基苯甲酸基质溶液混合，并在MALDI靶上共沉淀。将该干燥样品用激光电离至ToF质谱仪中。收集m/z(M+Na)+谱。
2-AB标记的N-连接的寡糖特征谱分析(HPLC)
通过2-AB标记和HPLC分析来分析糖型的类型和每种糖型的相对百分比。结果示于表29中。在所有批次(数据未显示)中观察到相同保留时间处的峰具有相似的相对百分比，表明相同类型的寡糖具有相似的水平。在晚些时候运行批次#36样品。举例来说，将主要糖型FA2的百分比针对酶活性绘图。在FA2百分比与比活性(pNPP)、HA结合、Km和Kcat之间没有观察到相关性(数据未显示)。
该测定通过基于荧光标记的游离寡糖的保留时间和峰面积测定与药物分子相关的寡糖来表征糖基化模式。从药物酶促释放游离寡糖，并通过还原胺化用2-氨基苯甲酰胺(2-AB)标记。然后将样品注射至具有Ludger柱的HPLC系统上，分离2AB标记的寡糖并用荧光检测器进行检测；330nm激发，420nm发射。比较每个批次的色谱图，并使用每个解析峰的峰面积来测定每批中寡糖的相对量。
通过UPLC-OToF-MS产生的糖肽特征谱
通过利用UPLC-MS分析糖肽来评估每个糖基化位点处的寡糖特征谱。组织非特异性碱性磷酸酶(TNAP)具有五个N-糖基化位点(参见Millán，2006Wiley-VCH的第54-55页)。阿司弗泰斯阿尔法在Fc区中含有额外的N-糖基化位点，从而每个单体提供了总共6个N-糖基化位点。图44至图49显示了T15-16中的N123、T26-27中的N213、T33中的N254、T35中的N286、T45-46中的N413和T55中的N564的糖肽指纹特征谱。总计的N-连接寡糖的UPLC-Q-ToF-MS糖肽指纹提供了N-糖基化的详细表征。通过每个种类的质量分析和相对定量来鉴定糖肽种类，通过将在原始糖肽质量指纹谱中观察到的多电荷状态转化成每个位点的单电荷和去同位素化谱来进行。这些转化的结果示于表29中。其列出了所有观察到的糖型的质量以及对每个观察到的N连接的寡糖位点上的总糖型含量贡献≥5％的糖型的相对百分比。在该测定中，将阿司弗泰斯阿尔法还原并烷基化，然后用胰蛋白酶消化。使用Waters AcquityUPLC和Synapt Q-ToE质谱仪，以正离子电喷雾模式操作，通过ESI-Q-ToF-MS进行检测。将阿司弗泰斯阿尔法的理论序列和预测的胰蛋白酶裂解用于分析。使用NIST分子量和同位素百分比计算理论糖肽的分子量。糖肽以具有密切相关的洗脱时间的相关糖型的集合被观察到，因此需要对谱求和来确保观察到特定位点的完整糖肽补充物。对于所测试的每个批次，对于含有阿司弗泰斯阿尔法中的每个N-连接的寡糖位点的每个最丰富的肽种类获得位点特异性总谱(糖肽质量指纹)。
总唾液酸含量(TSAC)
总唾液酸含量通过HPAE-PAD测定。如表29中所示，每批次的唾液酸含量在0.9-3.5mol唾液酸/mol单体的规范内。考虑到由于其相对较低量而导致的唾液酸含量的变化，2K批次和20K批次是可比的。在TSAC值与比活性(pNPP)、HA结合、Km和Kcat之间没有观察到相关性。
活性
比活性(pNPP)
测定3个20K批次和3个2K批次的阿司弗泰斯阿尔法的比活性。20K批次的平均比活性为981.7U/mg，3个2K批次的平均比活性为861.7U/mg。所有批次的比活性均在620-1250U/mg的规范内，并且对于20K和2K批次是可比的。该方法用于使用pNPP作为底物来测定阿司弗泰斯阿尔法的酶促活性。阿司弗泰斯阿尔法是具有来自人组织非特异性碱性磷酸酶的一个结构域的重组蛋白。该结构域具有催化活性并水解磷酸酯。在酶饱和的情况下进行测定以达到并保持测量期间的Vmax。将pNPP水解成黄色产物(405nm处的最大吸光度)。反应速率与酶促活性成正比。一个单位(U)对应于在所采用的方法条件下每分钟形成的1μmol的pNPP。从酶促活性和蛋白质浓度(通过A280测量的)计算pNPP的比活性(每毫克蛋白质的酶活性)。结果示于表29中。
羟基磷灰石结合
通过阿司弗泰斯阿尔法2K批次的HA结合测定所测定的羟基磷灰石结合百分比与20K批次是可比的，所有值都在85-97％的范围内。20K和2K批次的平均HA结合百分比均为91％(表29)。HA结合测定测量当与羟基磷灰石结合时，阿司弗泰斯阿尔法复合物对pNPP的酶促活性。合成底物(对硝基苯基磷酸酯(pNPP))，当被阿司弗泰斯阿尔法酶水解时，产生可通过405nm处的吸光度来定量的黄色产物。在底物饱和的情况下进行该测定以达到并维持反应期间的Vmax。
使用生理学相关物质的PPi酶动力学测定
动力学参数Km和Kcat通过PPi动力学测定法来测定。在许多场合将样品与参考标准头对头地运行。为进行比较，将Km和Kcat绘制为样品测试时运行的参考标准值的百分比(表29)。所有Km值均在并行运行的参考标准值的30％以内，并被认为是可比的。所有Kcat值均在并行运行的参考标准的20％以内，并且被认为是可比的。2K批次的参考Km％和参考Kcat％可与20K批次是可比的。PPi动力学测定使用PPi(一种天然的碱性磷酸酶底物)测量纯化的阿司弗泰斯阿尔法的效力(酶促活性)，并测定生理条件(37℃，pH7.4)下的PPi水解的动力学常数Km和Kcat。
温度强制降解
为了进一步确保2K和20K批次的可比性，进行并行强制降解研究以比较降解途径和动力学。将表33中详细描述的3个2K批次(#35、#36和#38)和3个20K批次(#40、#42和#34)用于研究。由于有限的BDS样品可用性，一些批次需要使用药品(DP)材料。
使用阿司弗泰斯阿尔法制剂缓冲液(25mM磷酸钠和150mM氯化钠，pH7.4)将批次#35、#36、#40、#42和#34稀释至40mg/mL以匹配批次#38的蛋白质浓度。为了实现显著水平的降解以确立降解动力学，基于初步的强制降解条件筛选来选择强制降解条件。在每个时间点(0小时、14小时、24小时和48小时)为每个测试测定产生等分试样(200μL)。将T0等分试样保持在5℃直至测试。将其余的样品等分试样在40℃孵育14小时、24小时和48小时。通过表30中所列的SDS-PAGE、GP-HPLC、AEX、RP-HPLC、肽作图和效力分析样品以确定可比性。表31列出了3个20K批次和3个2K批次的温度强制降解研究的测试结果。
表33.用于降解研究的批次
名称 浓度mg/mL
#35 90.9
#36 96.4
#38 40.0
#40 107.6
#42 92.9
#34 101.6
SDS-PAGE(非还原和还原)
通过SDS-PAGE(非还原和还原)分析T0和T48小时样品的纯度。对于T＝0时的所有批次，通过非还原SDS-PAGE产生的主条带％为100％，并且如表31中所示，对于20K批次，降至平均97.3％，对于2K批次，降至平均96.8％。对于20K和2K批次，降解的趋势是可比的。在所有六个批次的T48小时样品中检测到高分子量种类。该种类在还原后消失。该结果表明二硫键相关聚集体的形成是所有批次的降解途径。在T＝0和T＝48小时时，对于20K和2K批次通过还原SDS-PAGE均未观察到额外条带，表明肽键没有降解。该测试基于分子量分离蛋白质，并提供以主条带百分比表示的完整蛋白质纯度的分析。将蛋白质样品在凝胶上分离，用考马斯蓝染色剂染色以进行可视化，脱色并通过密度测定法进行分析。通过与已知的分子量标准进行比较来估计阿司弗泰斯阿尔法、降解产物和工艺相关杂质的分子量。分离的蛋白质的定量测量通过扫描和利用密度测试分析的分析来进行。
GP-HPLC
通过GP-HPLC监测由热应激引起的形成聚集体和片段的降解，结果示于表31中。在T＝0时所有批次的峰谱都相似，表明存在相同的种类。热应激导致在约6分钟出现峰，对应于随时间推移而增加的大聚集体。T＝14小时、T＝24小时和T＝48小时时的所有批次的峰谱相似，这表明相似的降解途径。考虑到所使用的材料处于不同材龄的事实，所有批次的主峰随时间推移而下降的斜率是相似的。相似的斜率表示相似的降解动力学。
阴离子交换色谱(AEX)
还通过AEX监测阿司弗泰斯阿尔法的降解，所述AEX基于电荷分离蛋白质。对于所有批次，在T＝0时观察到相同的峰谱，表明所有批次中的相同种类。热应激导致约22-26分钟的保留时间窗内峰的增加。对于所有批次，在T＝14小时、T＝24小时和在T＝48小时时，观察到所有批次的可比的峰谱，这表明通过热降解形成了相同的种类。考虑到T＝0时的微小差异(如先前所公开的)和不同批次的材龄差异，对所有批次观察到通过主峰降低监测的相似降解斜率。
RP-HPLC
当通过RP-HPLC分析时，对于所有批次观察到约21.2-21.3分钟的保留时间窗内的平均峰值，表明所有批次中的相同种类。在T＝0时，主峰是所有批次中观察到的唯一主峰。热应激导致主峰之后立即洗脱峰的增加。在T＝14小时、T＝24小时和T＝48小时时对于所有批次观察到的来自热降解的相同峰表明相同的降解途径。如通过所有批次的相似斜率所证明的，所有批次的降解动力学(如通过主峰降低所监测的)是可比的。
肽作图
通过肽作图分析20K和2K批次的T0小时、T24小时和T48小时样品以评估潜在的化学降解。在所有时间点(T＝0小时和T＝48小时)，在20K与2K之间没有观察到显著性差异。该方法使用盐酸胍、二硫苏糖醇和碘乙酸盐使蛋白质变性、还原和烷基化，然后用蛋白酶胰蛋白酶消化。通过梯度反相HPLC分离产生的肽片段并在210nm处进行检测。
比活性(pNPP)
在每个时间点(T0、T14、T24和T48)40℃孵育后，通过酶促测定法来测定阿司弗泰斯阿尔法20K批次和2K批次的比活性(pNPP)。20K批次的活性在每个时间点与2K批次是可比的。随着时间的推移，所有批次的热应激引起的活性下降遵循相似的斜率。蛋白质磷酸酶，酶控制从蛋白质分子中去除磷酸酯(PO4 3-)基团。将pNPP磷酸酶测定用于检测磷酸酶活性并比较20K与2K批次。该方法用于使用pNPP作为底物来测定阿司弗泰斯阿尔法的酶促活性。阿司弗泰斯阿尔法是具有来自人组织非特异性碱性磷酸酶的一个结构域的重组蛋白。该结构域具有催化活性并水解磷酸酯。在酶饱和的情况下进行测定以达到并维持测量期间的Vmax。将pNPP水解成黄色产物(405nm处的最大吸光度)。反应速率与酶活性成正比。一个单位(U)对应于在所采用的方法条件下每分钟形成的1μmol的pNPP。从酶促活性和通过A280测量的蛋白质浓度计算pNPP的比活性(每mg蛋白质的酶活性)。
确认了以20K规模制造的阿司弗泰斯阿尔法与以2K规模制造的阿司弗泰斯阿尔法的可比性。如果可能的话，使用物理化学方法并行分析来自每个规模的3个批次，以评估阿司弗泰斯阿尔法的纯度、杂质、电荷变体、尺寸、结构、糖基化、二硫键、游离硫醇和活性。另外，进行并行强制降解研究以评估降解途径和动力学。结果表明，以20K和2K规模制造的产物是可比的。
通过分析超速离心、SDS-PAGE/LoC、SDS-PAGE、GP-HPLC和AEX评估批次的纯度。结果显示所有批次的纯度是可比的。通过AUC、SDS-PAGE和GP-HPLC在所有批次中检测到非常低的可比水平的相同类型的聚集体。
通过cIEF评估对于重组蛋白常见的电荷变体。对于所有批次观察到可比水平的相同种类，表明翻译后修饰的水平一致。
通过SEC-MALS和完整的MALDI-ToF分子量评估批次的分子尺寸。通过去糖基化/还原及去糖基化MALDI-ToF分子量和去糖基化/还原及去糖基化的ESI-ToF分子量来确认身份。还通过CD、二硫键键合和游离硫醇(LC/MS)、总游离硫醇测定、金属含量分析(ICP-MS/ICP-AES)和磷酸化位点占据来评估结构。对于所有批次获得了可比的分子量和相似的流体动力学尺寸，表明所有批次的阿司弗泰斯阿尔法的相似修饰和相似构象。
通过游离聚糖的MALDI-ToF、2AB标记的寡糖fHPLC、LC-MS糖肽分析和总唾液酸含量评估阿司弗泰斯阿尔法糖基化。对于所有批次均获得可比水平的相同寡糖种类。
通过比活性(pNPP)、HA结合和PPi活性评估药物的活性。结果显示，阿司弗泰斯阿尔法20K批次与阿司弗泰斯阿尔法2K批次是可比的。
最后，通过使用热应激的并行强制降解研究观察到20K和2K批次的相同降解途径和相似降解动力学。
总之，如通过使用多个正交方法和并行强制降解研究的扩展表征所证明的，阿司弗泰斯阿尔法20K批次与2K批次是可比的。因此，来自20K批次的材料应该具有与来自2K批次的材料可比的安全性和效率。
实施例10.以2,000L(2K)和20,000L(20K)的规模制造的阿司弗泰斯阿尔法的其它可比性
以20,000L规模生产7个批次阿司弗泰斯阿尔法，并且使用2,000L规模生产另外五个批次阿司弗泰斯阿尔法。对两种批次的产物进行分析并发现其是可比的(数据未显示)。

Claims (51)

1.一种用于生产重组多肽的方法，所述方法包括：
a.提供100L至25,000L的补料分批生物反应器，所述生物反应器包含：
i.能够表达所述重组多肽阿司弗泰斯阿尔法(SEQ ID NO：1)的细胞，和
ii.适于进行此类表达的培养基，所述培养基包含约25μM至约300μM的锌；
b.在适于表达所述重组阿司弗泰斯阿尔法的条件下培养所述细胞；其中所述培养基的pH为约6.7至约7.1，并且其中向所述培养基中添加锌，使得所述培养基中的锌浓度保持在约25μM至约300μM的锌浓度。
2.根据前述权利要求所述的方法，其中将所述培养基中的锌浓度保持在约25μM至约150μM的锌浓度。
3.根据权利要求2所述的方法，其中将所述培养基中的锌浓度保持在约60μM至约150μM的锌浓度。
4.根据权利要求3所述的方法，其中将所述培养基中的锌浓度保持在约28μM的锌浓度。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述培养基的pH保持在约6.8至约7.0。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述培养基的pH保持在约6.9。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将锌以至少一次浓注、连续或半连续地添加至所述培养基中。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，所述方法还包括在培养期间向所述培养基中添加至少1次、2次、3次或4次补料浓注。
9.根据权利要求8所述的方法，其中将至少4次补料浓注添加至所述培养基中。
10.根据权利要求8或权利要求9所述的方法，其中所述补料浓注添加提高了所述重组多肽的比活性。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括在第一温度下培养所述细胞直至达到至少约2.5×106个活细胞的细胞密度，以及转换至低于所述第一温度的第二温度以进行重组多肽表达。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述第一温度为约35℃至约37.5℃。
13.根据权利要求11或权利要求12所述的方法，其中所述第二温度为约29℃至约35℃。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述第一温度约为37℃，并且所述第二温度为约30℃。
15.根据权利要求11所述的方法，其中所述第一温度为约36.5℃，并且所述第二温度为约33℃。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述细胞选自由以下组成的组：CHO、NS0/1、PER.C6、COS-7、人胚胎肾细胞系(经亚克隆用于在悬浮培养物中生长的293或293细胞)、BHK、TM4、CV1、VERO-76、HeLa、MDCK、BRL 3A、W138、Hep G2、MMT 060562、TRI、MRC5、FS4细胞和Hep G2细胞。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述细胞是CHO细胞。
18.一种重组多肽，所述重组多肽由如前述权利要求中任一项所述产生。
19.一种在哺乳动物细胞培养物中产生的重组多肽，其中所述重组多肽包含阿司弗泰斯阿尔法(SEQ ID NO:1)并且具有选自由以下组成的组的至少一种特征：
a.约0.9至约3.5mol唾液酸/mol蛋白质单体的总唾液酸含量(TSAC)；
b.约5.2至约6.7的等电聚焦(IEF)；
c.如图41或图42中所示的主要聚糖结构；
d.如图38或图39中所示的2-AB标记的寡糖色谱图特征谱；
e.如图40或图44-49中所示的MALDI-ToF糖肽指纹特征谱；
f.还原SDS-PAGE上的主要条带，其具有约88-108kDa的分子量且不少于约85％的所产生的重组多肽的总量；
g.非还原SDS-PAGE上的主要条带，其具有约194至约273kDa的分子量且不少于约85％的所产生的重组多肽的总量；
h.通过尺寸排阻高压液相色谱(HPLC)，重组多肽的二聚体不少于约95.0％，并且聚集体不超过约5.0％；
i.通过反相高压液相色谱(RP-HPLC)，纯度不低于约95.0％；
j.通过阴离子交换色谱(AEX)，主峰不少于约90.0％，酸性峰不超过约6.0％，并且碱性峰不超过约4.0％；
k.约75％至约125％的羟基磷灰石(HA)结合百分比；
l.约620单位/mg至约1250单位/mg的产物比活性(pNPP)；
m.在无机焦磷酸盐(PPi)水解测定中约13μM至约69μM的Km；
n.在无机焦磷酸盐(PPi)水解测定中约65s-1至约165s-1的Kcat；；
o.对于毛细管电泳上的所有峰，约6.45至约6.95的pI范围；
p.去糖基化后如图34A中所示的MALDI-ToF质谱上的峰；
q.还原及去糖基化后如图34B中所示的MALDI-ToF质谱上的峰；
r.如图35中所示的MALDI-ToF质谱上的峰；
s.如图36中所示的磷酸化特征谱；
t.如图37A中所示的阴性MALDI-ToF质谱上的唾液酸聚糖特征谱；
u.如图37B中所示的阳性MALDI-ToF质谱上的中性聚糖特征谱；
v.约0.03至约0.15的每摩尔重组多肽的镁摩尔比；
w.约0.5至约1.5的每摩尔重组多肽的钙摩尔比；和
x.约0.5至约3.0的每摩尔重组多肽的锌摩尔比。
20.根据权利要求18或权利要求19所述的重组多肽，所述重组多肽具有每半分子约0.7至约1.19个游离半胱氨酸。
21.根据权利要求18、19或20中任一项所述的重组多肽，所述重组多肽在Ser 93处具有约13.5％至约35.7％的百分比的磷酸化。
22.根据权利要求14至21中任一项所述的重组多肽，所述重组多肽在AEX色谱图上具有不少于约90.0％的主峰、不超过约6.0％的酸性峰和不超过约4.0％的碱性峰。
23.根据权利要求22所述的重组多肽，所述重组多肽在AEX色谱图上具有不少于约93.7％的主峰、不超过约4.9％的酸性峰和不超过约3.4％的碱性峰。
24.根据权利要求18至23中任一项所述的重组多肽，所述重组多肽具有约0.9至约3.5mol唾液酸/mol蛋白质单体的总唾液酸含量(TSAC)。
25.根据权利要求24所述的重组多肽，所述重组蛋白具有约1.2至约3.0mol唾液酸/mol单体的平均总唾液酸含量(TSAC)值。
26.根据权利要求25的重组多肽，所述重组多肽重组蛋白具有约1.9至约2.7mol唾液酸/mol单体的平均总唾液酸含量(TSAC)值。
27.根据权利要求26所述的重组多肽，所述重组多肽具有约1.85至约2.28mol唾液酸/mol单体的平均总唾液酸含量(TSAC)值。
28.根据权利要求18至27中任一项所述的重组多肽，所述重组多肽具有小于约0.15的镁摩尔比。
29.根据权利要求28所述的重组多肽，所述重组多肽具有约0.05至0.10的镁摩尔比。
30.根据权利要求28所述的重组多肽，所述重组多肽具有约0.12的镁摩尔比。
31.根据权利要求18至30中任一项所述的重组多肽，所述重组多肽包含至少约95.0％的所述重组多肽的二聚体和约5.0％或更少的多肽聚集体，如通过尺寸排阻HPLC测定的。
32.根据权利要求31所述的重组多肽，所述重组多肽包含至少约96.8％的所述重组多肽的二聚体和约3.2％或更少的多肽聚集体，特别地如通过尺寸排阻HPLC测定的。
33.根据权利要求32所述的重组多肽，所述重组多肽包含至少约97.6％的所述重组多肽的二聚体和约2.4％或更少的聚集体，特别地如通过尺寸排阻HPLC测定的。
34.根据权利要求18至33中任一项所述的重组多肽，所述重组多肽包含至少约95.0％的纯度，特别地如通过RP-HPLC测定的。
35.根据权利要求34所述的重组多肽，所述重组多肽包含至少约97.6％的纯度，如通过RP-HPLC测定的。
36.根据权利要求18至35中任一项所述的重组多肽，所述重组多肽包含约75％至约125％的羟基磷灰石(HA)结合百分比。
37.根据权利要求36所述的重组多肽，所述重组多肽包含约85％至约97％的平均羟基磷灰石结合百分比。
38.根据权利要求37所述的重组多肽，所述重组多肽具有约90％至约91％的平均羟基磷灰石结合百分比。
39.根据权利要求18至38中任一项所述的重组多肽，所述重组多肽具有约620单位/mg至约1250单位/mg的比活性(pNPP)。
40.根据权利要求39所述的重组多肽，所述重组多肽具有约904.0U/mg至约907.7U/mg的平均比活性(pNPP)。
41.根据权利要求18至40中任一项所述的重组多肽，其中所述重组多肽由多核苷酸所编码，所述多核苷酸编码包含SEQ ID NO：1的序列或与SEQ ID NO：1完全互补的序列的多肽。
42.根据权利要求18至41中任一项所述的重组多肽，其中所述补料分批反应器为200L至20,000L。
43.根据权利要求42所述的重组多肽，其中所述补料分批反应器为2,000L至20,000L。
44.一种包含组合物的药物制剂，其包含权利要求18至43中任一项的重组多肽和至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
45.一种方法，所述方法使用权利要求18至43中任一项所述的重组多肽或权利要求44所述的药物制剂来增加受试者中无机焦磷酸盐(PPi)的裂解。
46.一种治疗患有与碱性磷酸酶缺乏相关的病况的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求18至43中任一项所述的重组多肽或权利要求44所述的药物制剂。
47.根据权利要求46所述的方法，其中与碱性磷酸酶缺乏相关的病况是低磷酸酯酶症(HPP)或I型神经纤维瘤病(NF1)。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述低磷酸酯酶症(HPP)是围产期、婴儿期、幼年期或成年HPP。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述与碱性磷酸酶缺乏相关的病况用骨骼和牙齿的未矿化骨基质和/或低矿化来表征。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述未矿化骨基质导致佝偻病和/或骨软化症。
51.根据权利要求45至50中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
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