KR102644116B1 - 알칼린 포스파타제의 제조 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 (a) (i) 재조합 폴리펩타이드 아스포타제 알파(서열번호 1)를 발현시킬 수 있는 세포, 및 (ii) 상기 발현을 수행하기에 적합하고, 약 25μM 내지 약 300μM의 아연을 포함하는 배양 배지를 포함하는 100L 내지 25,000L의 유가식 생물반응기를 제공하는 단계; (b) 상기 세포를 상기 재조합 아스포타제 알파를 발현시키기에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계이되; 여기서 상기 배양 배지의 pH는 약 6.7 내지 약 7.1이고, 여기서 아연은 배양 배지 중의 상기 아연 농도가 약 25μM 내지 약 300μM의 아연 농도로 유지되도록 상기 배양 배지 중에 첨가된, 단계를 포함하는, 재조합 폴리펩타이드의 생산 방법을 제공한다.

Description

알칼린 포스파타제의 제조
서열 목록
첨부 서열 목록에 열거된 아미노산 서열은 37 C.F.R. 1.822에 정의된 바와 같은, 아미노산에 대한 표준 3-문자 암호를 사용하여 나타낸다. 서열 목록은 2016년 8월 16일자에 생성되고, 파일명이 0351 WO_SL.txt이고, 6,604바이트 크기인 ASCII 텍스트 파일로서 제출되고, 이는 본 명세서에 참고로 포함된다.
기술분야
본 개시 내용은 (a) (i) 재조합 폴리펩타이드 아스포타제 알파(서열번호 1)를 발현시킬 수 있는 세포, 및 (ii) 상기 발현을 수행하기에 적합하고, 약 25μM 내지 약 300μM의 아연을 포함하는 배양 배지를 포함하는 100L 내지 25,000L의 유가식 생물반응기(fed-batch bioreactor)를 제공하는 단계; (b) 세포를 재조합 아스포타제 알파를 발현시키기에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계이되; 여기서 배양 배지의 pH는 약 6.7 내지 약 7.1이고, 여기서 아연은 배양 배지 중의 아연 농도가 약 25μM 내지 약 300μM의 아연 농도로 유지되도록 상기 배양 배지 중에 첨가된, 단계를 포함하는, 재조합 폴리펩타이드의 생산 방법에 관한 것이다.
저인산증(HPP)은 기능성 조직 비특이적 알칼린 포스파타제(TNSALP)의 생산 실패를 유발하는 생명-위협적이고, 유전적이고, 매우 희귀한 대사 장애이다. 그것은 뼈 및 치아의 저-미네랄화를 특징으로 하는, 탈미네랄화된 골 기질(unmineralized bone matrix)의 축적(예를 들어, 구루병(rickets), 골연화증(osteomalacia))으로 이어진다. 성장하는 뼈가 적절하게 미네랄화되지 않는 경우, 성장이 손상되어 관절 및 뼈가 비정상적이 된다. 이러한 결과는 결국 운동 수행, 호흡 기능에 영향을 미치고, 심지어는 사망으로 이어지게 할 수 있다. 주산기(perinatal), 유아, 청소년, 및 성인 HPP를 포함하는 HPP의 상이한 형태가 발견되었다. 최근, 주로 증상 시작 연령을 기초로 6개의 임상적인 형태가 정의되었고, 주산기, 양성 태아기(benign prenatal), 유아, 청소년, 성인, 및 치학(odonto)-HPP를 포함한다. 아스포타제 알파는 결함이 있는 내생 TNSALP 수준을 해결하도록 설계된 효소 대체 요법을 표적으로 하는 승인된 혁신 신약(first-in-class)이다. TNSALP로의 HPP의 치료에 대해서는, 문헌[Whyte et al., 2012 N Engl J Med. 366:904-13]을 참고하기 바란다.
아스포타제 알파(스트렌식(STRENSIQ)(등록상표), 알렉시온 파마슈티컬스, 인크.(Alexion Pharmaceuticals, Inc.))는 인간 TNSALP의 촉매 도메인, 인간 면역글로불린 G1 Fc 도메인 및 골-표적 도메인으로서 사용되는 데카 아스파테이트 펩타이드(즉, D10)로 구성된 가용성 융합 당단백질이다. 시험관내에서, 아스포타제 알파는 데카-아스파테이트 펩타이드가 결핍된 가용성 TNSALP보다 수산화인회석에 더 높은 친화도로 결합하여, 아스포타제 알파의 TNSALP 모이어티가 과량의 국지적인 무기 파이로포스페이트(PPi)를 분해하게 하여, 정상적인 미네랄화를 회복시킨다. 파이로포스페이트 가수분해는 골 미네랄화를 촉진시키고, 그의 효과는 비임상 연구에서 평가된 종들 사이에서 유사하다. 초기 효능 연구는 HPP의 마우스 모델(Akp2 -/- 마우스)에서 수행되었다. TNSALP 유전자의 불활성화에 의해서 생성된, Akp2 -/- 마우스 모델(문헌[Narisawa et al. 1997 Dev Dyn. 208:432-46])은, 미네랄화된 골 기질의 축적을 비롯하여 인간 병태의 많은 일반적인 특징을 공유한다.
본 명세서에는 구체적인 특징(예를 들어, 특정 글리칸 구조, 특정 총 시알산 함량(TSAC) 값 등)을 갖는 알칼린 포스파타제(예를 들어, 아스포타제 알파)의 조성물 및 이러한 구체적인 특징을 갖는 알칼린 포스파타제(예를 들어, 아스포타제 알파)를 생산하기 위해서 사용되는 제조 공정이 개시된다. 이러한 알칼린 포스파타제(예를 들어, 아스포타제 알파)는 예를 들어, 대상체, 예를 들어 인간 대상체에서 감소된 알칼린 포스파타제 단백질 수준 및/기능(예를 들어, 무기 파이로포스페이트(PPi)의 불충분한 절단)과 연관된 병태를 치료하기 위한, 요법에서 사용하기에 적합하다.
일 양상에서, 본 개시 내용은 알칼린 포스파타제 기능을 갖는 재조합 폴리펩타이드의 생산 방법을 제공한다. 다양한 실시형태에서, 알칼린 포스파타제 기능은 관련 기술 분야에 공지된 알칼린 포스파타제의 임의의 기능, 예컨대 포스포에탄올아민(PEA), 무기 파이로포스페이트(PPi) 및 피리독살 5'-포스페이트(PLP)를 비롯한 천연 물질에 대한 효소 활성을 포함할 수 있다. 이러한 재조합 폴리펩타이드는 아스포타제 알파(서열번호 1)를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 재조합 폴리펩타이드를 생산하기 위해서 상기 배지 중에 아연을 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 아연은 재조합 폴리펩타이드의 활성 및/또는 안정성 개선에 도움을 줄 수 있다. 일부 실시형태에서, 아연은 상기 배지 중에 약 1 내지 약 300μM의 아연 농도를 제공하도록 첨가될 수 있다. 일 실시형태에서, 아연은 배양 배지 중에 약 10 내지 약 150μM(예를 들어, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 또는 150μM)의 아연 농도를 제공하도록 첨가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 아연은 약 25μM 내지 약 150μM, 또는 약 60μM 내지 약 150μM의 배양 배지 중의 아연 농도를 제공하도록 첨가된다. 특정 일 실시형태에서, 아연은 약 30, 60, 또는 90μM의 배양 배지 중의 아연 농도를 제공하도록 첨가된다. 특정 일 실시형태에서, 아연은 약 28μM의 배양 배지 중의 아연 농도를 제공하도록 첨가된다. 일부 실시형태에서, 아연은 볼러스(bolus)로, 연속적으로 또는 반-연속적으로 상기 배지 중에 첨가된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 재조합 폴리펩타이드를 생산하기 위해서 상기 배지의 pH를 제어하는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, pH는 약 6.8 내지 약 7.0으로 설정될 수 있다. 특정 일 실시형태에서, pH는 약 6.9로 설정된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 배양 및/또는 폴리펩타이드 생산 동안 본래 세포-함유 배양 배지에 적어도 하나의 새로운 배양 배지 볼러스 공급물을 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 새로운 배양 배지의 이러한 첨가는 생산된 재조합 폴리펩타이드의 활성(예를 들어, 비활성도(specific activity))을 개선시킬 수 있다. 일 실시형태에서, 적어도 하나, 2개, 3개, 또는 4개의 공급 볼러스(들)가 배양 동안 배양 배지에 첨가된다. 특정 일 실시형태에서, 적어도 4개의 공급 볼러스가 첨가된다. 일부 실시형태에서, 공급 볼러스 첨가(들)는 재조합 폴리펩타이드의 비활성도를 개선시킨다. 재조합 폴리펩타이드를 생산하기 위해서 본 명세서에 개시된 세포는 관련 기술 분야에 공지된 임의의 세포(예를 들어, 포유동물 세포)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 CHO, NSO/1, PER.C6, COS-7, 인간 배아 신장 세포주(human embryonic kidney line)(현탁 배양물 중에서의 성장을 위해서 서브클로닝된 293 또는 293개의 세포), BHK, TM4, CVl, VERO-76, HeLa, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, MMT 060562, TRI, MRC 5, FS4 세포, 및 Hep G2 세포를 포함하는 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 세포는 CHO 세포이다.
일부 실시형태에서, 세포는 세포 성장을 위해서 특정 시간 동안 제1 온도에서 성장되고, 이어서 폴리펩타이드 발현을 위해서 제2 온도로 이동된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 적어도 약 2.5 x 106 생존 가능한 세포의 세포 밀도에 도달할 때까지 세포를 제1 온도에서 배양하는 단계, 및 이어서 재조합 폴리펩타이드 발현을 위해서 제1 온도보다 더 낮은 제2 온도로 이동시키는 단계를 추가로 포함하는 방법이 개시되어 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 제1 온도는 약 35℃ 내지 약 37.5℃이다. 일부 실시형태에서, 제2 온도는 약 29℃ 내지 약 35℃이다. 일부 실시형태에서, 제1 온도는 약 37℃이고, 제2 온도는 약 30℃이다. 일부 실시형태에서, 제1 온도는 약 36.5℃이고, 제2 온도는 약 33℃이다.
또 다른 양상에서, 본 개시 내용은 본 명세서에 개시된 방법 중 임의의 것에 의해서 생산된 재조합 폴리펩타이드를 제공한다. 이러한 생산된 재조합 폴리펩타이드는 본 명세서에 개시된 생산 방법으로부터 기원한 특이적 특징 중 적어도 하나를 가질 수 있다. 이러한 특징은 하기를 포함하는 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함할 수 있다: (a) 총 시알산 함량(TSAC) 약 0.9 내지 약 3.5㏖ 시알산/단백질 단량체 ㏖; (b) 등전점 맞춤(isoelectric focusing: IEF) 약 5.2 내지 약 6.7; (c) 도 41 또는 도 42에 제시된 바와 같은 주 글리칸 구조; (d) 도 38 또는 39에 제시된 바와 같은 2-AB 표지된 올리고사카라이드 크로마토그램 프로파일; (e) 도 40, 또는 44 내지 49에 제시된 바와 같은 MALDI-ToF(MALDI-ToF) 글리코펩타이드 핑거 프린팅 프로파일; (f) 약 88 내지 108kDa의 분자량 및 생산된 재조합 폴리펩타이드의 총량의 약 85% 이상을 갖는 환원 SDS-PAGE 상의 주 밴드; (g) 약 194 내지 약 273kDa의 분자량 및 생산된 재조합 펩타이드의 총량의 약 85% 이상을 갖는 비-환원 SDS-PAGE 상의 주 밴드; (h) 크기 배제 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해서 재조합 폴리펩타이드의 이량체 약 95.0% 이상 및 응집물 약 5.0% 이하; (i) 역상 고압 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)를 통해서 순도 약 95.0% 이상; (j) 음이온 교환 크로마토그래피(AEX)를 통해서 주 피크 약 90.0% 이상, 산성 피크 약 6.0% 이하, 및 염기성 피크 약 4.0% 이하; (k) 수산화인회석(HA) 결합 백분율 약 75 내지 약 125%; (l) 생성물 비활성도(pNPP) 약 620 내지 약 1250유닛(unit)/㎎; (m) 무기 파이로포스페이트(PPi) 가수분해 검정법에서 Km 약 13 내지 약 69μM; (n) 무기 파이로포스페이트(PPi) 가수분해 검정법에서 K촉매 약 65 내지 약 165s-1; (o) 모세관 전기이동 상에서 모든 피크에 대해서 pI 범위 약 6.45 내지 약 6.95; (p) 탈글리코실화 후 도 34A에 제시된 바와 같은 MALDI-ToF 질량 스펙트럼 상에서의 피크; (q) 환원 및 탈글리코실화 후 도 34B에 제시된 바와 같은 MALDI-ToF 질량 스펙트럼 상의 피크; (r) 도 35에 제시된 바와 같은 MALDI-ToF 질량 스펙트럼 상의 피크; (s) 도 36에 제시된 바와 같은 포스포릴화 프로파일; (t) 도 37A에 제시된 바와 같은 음성 MALDI-ToF 질량 스펙트럼 상의 시알릴화(sialyated) 글리칸 프로파일; (u) 도 37B에 제시된 바와 같은 양성 MALDI-ToF 질량 스펙트럼 상의 중성 글리칸 프로파일; (v) 재조합 폴리펩타이드 몰당 마그네슘 몰비 약 0.03 내지 약 0.15; (w) 재조합 폴리펩타이드 몰당 칼슘 몰비 약 0.5 내지 약 1.5; 및 (x) 재조합 폴리펩타이드 몰당 아연 몰비 약 0.5 내지 약 3.0.
일 실시형태에서, 생산된 재조합 단백질은 절반 분자(half molecule)당 약 0.7 내지 약 1.19개의 유리 시스테인을 갖는다.
일 실시형태에서, 생산된 재조합 단백질은 약 13.5% 내지 약 35.7%의 백분율의 Ser 93에서의 포스포릴화를 갖는다.
일 실시형태에서, 생산된 재조합 단백질은 AEX 크로마토그램 상에서 주 피크가 90.0% 이상이고, 산성 피크의 경우 6.0% 이하이고, 염기성 피크의 경우 4.0% 이하이다. 일 특정 실시형태에서, 생산된 재조합 단백질은 AEX 크로마토그램 상에서 주 피크가 93.7% 이상이고, 산성 피크의 경우 4.9% 이하이고, 염기성 피크의 경우 3.4% 이하이다.
일부 실시형태에서, 생산된 재조합 단백질은 약 0.9 내지 약 3.5㏖ 시알산/단백질 단량체 ㏖의 총 시알산 함량(TSAC)을 갖는다. 일 실시형태에서, 생산된 재조합 단백질은 약 1.2 내지 약 3.0㏖ 시알산/단량체 ㏖의 평균 총 시알산 함량(TSAC) 값을 갖는다. 일 실시형태에서, 생산된 재조합 단백질은 약 1.9 내지 약 2.7㏖ 시알산/단량체 ㏖의 평균 총 시알산 함량 값을 갖는다. 특정 일 실시형태에서, 생산된 재조합 단백질은 약 1.85 내지 약 2.28㏖ 시알산/단량체 ㏖의 평균 총 시알산 함량 값을 갖는다.
일 실시형태에서, 생산된 재조합 단백질은 약 0.15 미만의 마그네슘 이온의 결합 몰비를 갖는다. 일부 실시형태에서, 생산된 재조합 단백질은 약 0.05 내지 약 0.10의 마그네슘의 몰비를 갖는다. 특정 일 실시형태에서, 생산된 재조합 단백질은 약 0.12의 마그네슘 이온의 결합 몰비를 갖는다.
일부 실시형태에서, 생산된 재조합 단백질은 즉, 크기 배제 HPLC에 의해서 측정되는 경우 적어도 약 95.0%의 재조합 폴리펩타이드의 이량체 및 약 5.0% 이하의 폴리펩타이드 응집물을 포함한다. 일 실시형태에서, 생산된 재조합 단백질은 즉, 크기 배제 HPLC에 의해서 측정되는 경우, 적어도 약 96.8%의 재조합 폴리펩타이드의 이량체 및 약 3.2% 이하의 폴리펩타이드 응집물을 포함한다. 특정 일 실시형태에서, 생산된 재조합 단백질은 즉, 크기 배제 HPLC에 의해서 측정되는 경우 적어도 약 97.6%의 재조합 폴리펩타이드의 이량체 및 약 2.4% 이하의 응집물을 포함한다.
일 실시형태에서, 생산된 재조합 단백질은 RP-HPLC에 의해서 측정되는 경우 95.0% 이상의 순도를 갖는다. 특정 일 실시형태에서, 생산된 재조합 단백질은 RP-HPLC에 의해서 측정되는 경우 97.6% 이상의 순도를 갖는다.
일부 실시형태에서, 생산된 재조합 단백질은 약 75 내지 약 125%의 수산화인회석(HA) 결합 백분율을 갖는다. 일 실시형태에서, 생산된 재조합 단백질은 약 85% 내지 약 97%의 평균 % 수산화인회석 결합률을 갖는다. 특정 일 실시형태에서, 생산된 재조합 단백질은 약 90% 내지 약 91%의 평균 % 수산화인회석 결합률을 갖는다.
일 실시형태에서, 생산된 재조합 단백질은 약 620 내지 약 1250유닛/㎎의 비활성도(pNPP)을 갖는다. 특정 일 실시형태에서, 생산된 재조합 단백질은 약 904.0 내지 약 907.7U/㎎의 평균 비활성도(pNPP)를 갖는다.
일부 실시형태에서, 재조합 폴리펩타이드는 서열번호 1에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 서열번호 1에 완전히 상보적인 서열에 의해서 암호화된다.
본 명세서에 개시된 재조합 폴리펩타이드는 산업적 규모 또는 상업적 규모 하에서 생산될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 유가식 반응기는 200L 내지 20,000L이다. 일부 실시형태에서, 유가식 반응기는 2,000L 내지 20,000L이다.
또 다른 양상에서, 본 개시 내용은 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여, 본 명세서에 개시된 재조합 폴리펩타이드를 포함하는 조성물 약제학적 제형을 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 개시 내용은 대상체에서 무기 파이로포스페이트(PPi)의 절단을 증가시키기 위해서 본 명세서에 논의된 재조합 폴리펩타이드, 또는 약제학적 제형을 사용하는 방법을 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 개시 내용은 알칼린 포스파타제 결핍과 연관된 병태를 앓고 있는 대상체에게 치료적 유효량의 본 명세서에 논의된 재조합 폴리펩타이드, 또는 약제학적 제형을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 치료 방법을 제공한다. 알칼린 포스파타제 결핍과 연관된 이러한 병태는 예를 들어, 저인산증(HPP) 및 신경섬유종증 I형(NF1)을 포함한다. 이러한 저인산증(HPP)은 주산기, 유아, 청소년, 또는 성인 HPP 중 임의의 것일 수 있다. 이러한 병태는 탈미네랄화된 골 기질 및/또는 뼈 및 치아의 저-미네랄화를 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 이러한 탈미네랄화된 골 기질은 구루병 및/또는 골연화증으로 이어질 수 있다.
일부 실시형태에서, 이러한 대상체는 포유동물이다. 일부 실시형태에서, 이러한 대상체는 인간이다.
첨부된 도면은 다음과 같다:
도 1은 단백질 생산을 위해서 온도를 이동시키거나 온도를 이동시키지 않은 예시적인 생산 방법(#1) 간의 세포 성장(패널 A, 좌측) 및 생존력(패널 A, 우측) 및 총 글루코스(패널 B, 좌측) 및 락테이트(패널 B, 우측) 농도를 나타낸 그래프. 대조군은 온도를 이동시킨 2회의 작동의 평균 결과를 나타낸다.
도 2는 온도를 이동시키거나 이동시키지 않은 예시적인 생산 방법(#1)을 사용하여 생산된 아스포타제 알파의 단백질 A 결합 가능한 역가(패널 A), 부피 활성(패널 B) 및 비활성도(패널 C)의 비교를 나타낸 그래프. 대조군은 온도를 이동시킨 2회의 작동의 평균 결과를 나타낸다.
도 3은 온도를 이동시키거나 이동시키지 않은 예시적인 생산 방법(#1)을 사용하여 생산된 아스포타제 알파의 AEX(음이온 교환 크로마토그래피) 산성 피크(%)(패널 A) 및 SEC (크기 배제 크로마토그래피) 응집물(%)(패널 B) 측정치의 비교를 나타낸 그래프.
도 4는 온도를 이동시키거나 이동시키지 않은 예시적인 생산 방법(#1)을 사용하여 생산된 아스포타제 알파의 비-환원 LoC(랩-온-칩(Lab-on-Chip); 패널 A), 환원 LoC(패널 B), 및 TSAC(총 시알산 함량; 패널 C)의 비교를 나타낸 그래프.
도 5는 온도를 이동시키거나 이동시키지 않은 예시적인 생산 방법(#1)에 의해서 생산된 아스포타제 알파의 중성 글리칸 프로파일(기질 보조 레이저 탈착/이온화 - 비행 시간, 또는 MALDI-TOF)을 나타낸 그래프. 참조군은 이전 20K 방법에 의해서 생산된 표준 아스포타제 알파를 나타낸다.
도 6은 생산된 아스포타제 알파의 응집물 수준(패널 A) 및 TSAC(패널 B)에 대한 생산 온도 이동의 영향을 나타낸 그래프. 오차 막대는 각각의 조건 하에서의 표준 편차를 나타낸다.
도 7은 10 또는 12일 배양 후 예시적인 방법 #2에 의해서 생산된 아스포타제 알파의 TSAC 값에 대한 배양 pH의 영향을 나타낸 그래프.
도 8은 예시적인 방법 #2에서 아스포타제 파 TSAC에 대한 배지 공급물 첨가(글리코스(glc)의 상이한 농도로 표현됨: 패널 A) 및 공급물 첨가 모드(패널 B)의 영향을 나타낸 그래프.
도 9는 예시적인 방법 #2에서 아스포타제 알파 활성에 대한 아연 보충물의 영향(패널 A; 9일에 아연 보충됨) 및 세포 성장(패널 B) 및 생존력(패널 C)에 대한 아연의 영향을 나타낸 그래프.
도 10은 예시적인 방법 #3에서 아스포타제 알파 TSAC(패널 A), 단백질 A 역가(패널 B), 및 부피 활성(패널 C)에 대한 pH 및 생산 온도의 영향을 나타낸 그래프.
도 11은 예시적인 방법 #3에서 부피 활성(패널 A) 및 아스포타제 알파 단편화(패널 B, SEC에 의해서 측정됨)에 대한 성장 온도의 영향을 나타낸 그래프.
도 12는 예시적인 방법 #3에서 아스포타제 알파 응집(패널 A, SEC에 의해서 측정됨), % 산성 피크(패널 B, AEX에 의해서 측정됨), 아스포타제 알파 단편화(패널 C, SEC에 의해서 측정됨), 및 % 염기성 피크(패널 D, AEX에 의해서 측정됨)에 대한 생산 온도 및 pH의 영향을 나타낸 그래프.
도 13은 부피 활성(패널 A) 및 아스포타제 알파 단편화(패널 B, SEC에 의해서 측정됨)에 대한 시딩 밀도 및 온도 이동 시기의 영향을 나타낸 그래프. 시딩은 예시적인 방법 #3에서의 시딩 밀도를 나타낸다.
도 14는 예시적인 방법 #3에서 아스포타제 알파 부피 활성(패널 A), 응집(패널 B, SEC에 의해서 측정됨), % 산성 피크(패널 C, AEX에 의해서 측정됨), % 염기성 피크(패널 D, AEX에 의해서 측정됨), 및 TSAC(패널 E)에 대한 배지 공급물(양 및 시기)의 영향을 나타낸 그래프.
도 15는 예시적인 방법 #4에서 10일까지 세포 성장(패널 A) 및 생존력(패널 B)에 대한 배양 배지 pH의 영향을 나타낸 그래프.
도 16은 예시적인 방법 #4에서 10일까지 세포 성장(패널 A) 및 생존력(패널 B)에 대한 생산 온도의 영향을 나타낸 그래프.
도 17은 예시적인 방법 #4에서 10일까지 배양 배지 중의 글루코스(패널 A) 및 락테이트(패널 B) 농도에 대한 배양 배지 pH의 영향을 나타낸 그래프.
도 18은 예시적인 방법 #4에서 10일까지 배양 배지 중의 글루코스(패널 A) 및 락테이트(패널 B) 농도에 대한 생산 온도의 영향을 나타낸 그래프.
도 19는 예시적인 방법 #4에서 10일까지 단백질 A 역가(패널 A), 부피 활성(패널 B), 특이적 단백질 A 생산성(패널 C), 및 비활성도(패널 D)에 대한 배양 배지 pH의 영향을 나타낸 그래프.
도 20은 예시적인 방법 #4에서 단백질 A 역가(패널 A), 부피 활성(패널 B), 특이적 단백질 A 생산성(패널 C), 및 비활성도(패널 D)에 대한 생산 온도의 상이한 영향을 나타낸 그래프.
도 21은 예시적인 방법 #4에서 아스포타제 알파 TSAC에 대한 배양 배지 pH(패널 A) 및 생산 온도(패널 B)의 영향을 나타낸 그래프.
도 22는 예시적인 방법 #4에서 생산된 아스포타제 알파의 AEX 산성 피크에 대한 배양 배지 pH(패널 A) 및 생산 온도(패널 B)의 영향을 나타낸 그래프.
도 23은 예시적인 방법 #4에서 아스포타제 알파 응집(SEC에 의해서 측정됨)에 대한 배양 배지 pH(패널 A) 및 생산 온도(패널 B)의 영향을 나타낸 그래프.
도 24는 예시적인 방법 #4에서 생산된 아스포타제 알파의 LoC 주 피크(%, 비-환원 조건) 측정치에 대한 배양 배지 pH(패널 A) 및 생산 온도(패널 B)의 상이한 영향을 나타낸 그래프.
도 25는 예시적인 방법 #4에서 생산된 아스포타제 알파(MALDI-ToF에 의해서 측정됨)의 중성 글리칸에 대한 배양 배지 pH의 영향을 나타낸 그래프. 상단 패널은 33℃에서 10일 동안 상이한 배양 배지 pH 하에서 생산된 아스포타제 알파에 대한 모든 MALDI-ToF 피크를 나타낸다. 각각의 피크의 값을 계산하고, 하단 패널에서 비교하였다.
도 26은 예시적인 방법 #4에서 생산된 아스포타제 알파(MALDI-ToF에 의해서 측정됨)의 중성 글리칸에 대한 생산 온도의 영향을 나타낸 그래프. 상단 패널은 상이한 생산 온도 하에서 pH 6.9에서 10일 동안 생산된 아스포타제 알파에 대한 모든 MALDI-ToF 피크를 나타낸다. 각각의 피크의 값을 계산하고, 하단 패널에서 비교하였다.
도 27는 예시적인 방법 #4에서 아스포타제 알파 품질의 iCE280 분석을 위한 모세관 등전점 맞춤 피크 백분율에 대한 배양 배지 pH(패널 A) 및 생산 온도(패널 B)의 영향을 나타낸 그래프.
도 28은 상이한 방법(청색선: 단일 볼러스 배지 공급물을 사용한 대조군 방법(2개의 생물반응기 탱크에 대해서 수행됨); 적색선: 배지 공급물을 4회 사용한 개선된 방법(6개의 생물반응기 탱크에 대해서 수행됨); 회색선: 표준으로서의 이전 20K 방법(20개의 생물반응기 탱크에 대해서 수행됨))에 대한 세포 성장(패널 A) 및 생존력(패널 B)을 비교한 그래프. 회색 실선은 20K 방법의 평균치를 나타내는 반면, 점선은 평균 ± 1 x 표준 편차를 나타낸다.
도 29는 상이한 방법(청색선: 단일 볼러스 배지 공급물을 사용한 대조군 방법(2개의 생물반응기 탱크에 대해서 수행됨); 적색선: 배지 공급물을 4회 사용한 개선된 방법(6개의 생물반응기 탱크에 대해서 수행됨); 회색선: 표준으로서의 이전 20K 방법(20개의 생물반응기 탱크에 대해서 수행됨))에 대한 글루코스 이용(패널 A) 및 락테이트 생산(패널 B)을 비교한 그래프. 회색 실선은 20K 방법의 평균치를 나타내는 반면, 점선은 평균 ± 1 x 표준 편차를 나타낸다.
도 30은 상이한 방법(청색선: 단일 볼러스 배지 공급물을 사용하여 2개의 생물반응기 탱크에 대해서 수행된 대조군 방법; 적색선: 배지 공급물을 4회 사용한 개선된 방법(6개의 생물반응기 탱크에 대해서 수행됨); 회색선: 표준으로서의 이전 20K 방법(20개의 생물반응기 탱크에 대해서 수행됨))에 의해서 생산된 아스포타제 알파의 단백질 A 역가(패널 A) 및 비활성도(패널 B)을 비교한 그래프. 회색 실선은 20K 방법의 평균치를 나타내는 반면, 점선은 평균 ± 1 x 표준 편차를 나타낸다.
도 31은 상이한 방법(청색선: 단일 볼러스 배지 공급물을 사용한 대조군 방법(2개의 생물반응기 탱크에 대해서 수행됨); 적색선: 배지 공급물을 4회 사용한 개선된 방법(6개의 생물반응기 탱크에 대해서 수행됨); 회색선: 표준으로서의 이전 20K 방법(20개의 생물반응기 탱크에 대해서 수행됨))에 대한 활성 역가(패널 A) 및 총 부피 활성(패널 B)을 비교한 그래프. 회색 실선은 20K 방법의 평균치를 나타내는 반면, 점선은 평균 ± 1 x 표준 편차를 나타낸다.
도 32는 대조군 방법(회색; 단일 볼러스 배지 공급물) 및 개선된 방법(암회색; 4회의 배지 공급물)으로부터 아스포타제 알파 비활성도를 비교한 그래프.
도 33은 이전 방법 Y(하단 선; 추가로 아연 보충하지 않음) 및 추가로 개선된 방법(상단 선; 평균 30 내지 90μM의 아연 보충 조건 및 14일로 연장된 배양 시간을 나타냄)으로부터 아스포타제 알파 비활성도를 비교한 그래프.
도 34는 탈글리코실화 후에 생산된 아스포타제 알파(패널 A) 및 환원 및 탈글리코실화된 생산된 아스포타제 알파(패널 B)에 대한 MALDI-ToF 질량 스펙트럼 데이터를 나타낸 그래프.
도 35는 생산된 아스포타제 알파의 MALDI-ToF 질량 스펙트럼을 나타낸 그래프. 도 35는 각각, 보이는 순서로, 서열번호 1의 잔기 83-105로서의 "TYNTNAQVPDSAGTATAYLCGVK", 서열번호 1의 잔기 93 내지 97로서의 "SAGTA" 및 서열번호 1의 잔기 99-104로서의 "AYLCGV"를 개시한 도면.
도 36은 아스포타제 알파 상의 포스포릴화 부위의 MS/MS 측정을 나타낸 그래프.
도 37은 시알릴화 글리칸의 음성 MALDI-ToF 질량 스펙트럼(패널 A) 및 생산된 아스포타제 알파 상의 중성 글리칸의 양성 MALDI-ToF 질량 스펙트럼(패널 B)을 나타낸 그래프.
도 38은 아스포타제 알파의 올리고사카라이드의 형광 크로마토그램을 나타낸 그래프.
도 39는 아스포타제 알파 참조 표준품의 형광 크로마토그램을 나타낸 그래프.
도 40은 아스포타제 알파로부터 생성된 글리코펩타이드의 질량 스펙트럼을 나타낸 그래프.
도 41은 아스포타제 알파의 주요 글리칸의 제안된 구조(C7108H11008O2206S56(단백질 부분 이량체); 또는 C3554H5506O1103S28(단량체))의 표현. 글리칸당 NeuAc(FA2G2, FA2G1 및 A2G2)의 수는 예측된 수이다.
도 42는 아스포타제 알파의 글리코실화 부위 상의 예측된 글리칸 구조의 표현.
도 43은 아스포타제 알파의 대표적인 전기영동도를 나타낸 그래프.
도 44는 20K 배취 및 2K 배취로부터 생산된 아스포타제 알파에 대한 글리코펩타이드 질량 핑거프린트를 나타낸 그래프(T15-16에서 N123). 2K 배취 번호: #35, #36 및 #38; 20K 배취 번호: #40, #42 및 #34.
도 45는 20K 배취 및 2K 배취로부터 생산된 아스포타제 알파에 대한 글리코펩타이드 질량 핑거프린트를 나타낸 그래프(T26-27에서 N213). 2K 배취 번호: #35, #36 및 #38; 20K 배취 번호: #40, #42 및 #34.
도 46은 20K 배취 및 2K 배취로부터 생산된 아스포타제 알파에 대한 글리코펩타이드 질량 핑거프린트를 나타낸 그래프(T33에서 N254). 2K 배취 번호: #35, #36 및 #38; 20K 배취 번호: #40, #42 및 #34.
도 47은 20K 배취 및 2K 배취로부터 생산된 아스포타제 알파에 대한 글리코펩타이드 질량 핑거프린트를 나타낸 그래프(T35에서 N286). 2K 배취 번호: #35, #36 및 #38; 20K 배취 번호: #40, #42 및 #34.
도 48은 20K 배취 및 2K 배취로부터 생산된 아스포타제 알파에 대한 글리코펩타이드 질량 핑거프린트를 나타낸 그래프(T45-46에서 N413). 2K 배취 번호: #35, #36 및 #38; 20K 배취 번호: #40, #42 및 #34.
도 49는 20K 배취 및 2K 배취로부터 생산된 아스포타제 알파에 대한 글리코펩타이드 질량 핑거프린트를 나타낸 그래프(T55에서 N564). 2K 배취 번호: #35, #36 및 #38; 20K 배취 번호: #40, #42 및 #34.
도 50은 2K 및 20K 배취로부터 생산된 아스포타제 알파의 아연(패널 A), 마그네슘(패널 B), 및 칼슘(패널 C)에 대한 ICP 금속 이온 몰비를 비교한 그래프.
도 51a는 상이한 pH 조건 하에서 배양 시간에 따른 생존 가능한 세포 밀도(VCD)를 비교한 그래프. 도 51b는 상이한 pH 조건 하에서 배양 시간에 따른 세포 생존력을 비교한 그래프.
도 52a는 경과된 배양 시간에 따른 생물반응기에서 글루코스 농도를 나타낸 그래프. 도 52b는 경과된 배양 시간에 따른 생물반응기에서 락테이트 농도를 나타낸 그래프.
도 53은 상이한 pH 조건 하에서 비활성도 프로파일을 비교한 그래프.
정의
"약", "대략": 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약" 및 "대략"은, 하나 이상의 특정 세포 배양 조건에 적용되는 바와 같이, 그 배양 조건 또는 배양 조건들에 대해서 언급된 기준값에 유사한 값의 범위를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 용어 "약"은 그 배양 조건 또는 조건들에 대해서 언급된 기준값의 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% 또는 그 미만 내에 포함되는 값의 범위를 지칭한다.
"아미노산": 용어 "아미노산"은, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 폴리펩타이드의 형성에 일반적으로 사용되는 20개의 자연 발생 아미노산 또는 이들 아미노산의 유사체 또는 유도체 중 임의의 것을 지칭한다. 본 개시 내용의 아미노산은 세포 배양물에 배지 중에서 제공될 수 있다. 배지 중에 제공된 아미노산은 염으로서 또는 수화 형태로 제공될 수 있다.
"회분식 배양": 용어 "회분식 배양"은, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 배지(하기 "배지"의 정의 참고)를 비롯한, 세포를 배양하는 데 궁극적으로 사용될 성분 전부뿐만 아니라 세포 자체가 배양 방법의 시작 시에 제공되는 세포 배양 방법을 지칭한다. 회분식 배양은 전형적으로 일부 지점에서 중단되고, 배지 중의 세포 및/또는 성분은 수확되고, 임의로 정제된다.
"생물반응기": 용어 "생물반응기"는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 세포 배양(예를 들어, 포유동물 세포 배양)의 성장을 위해서 사용되는 임의의 용기를 지칭한다. 생물반응기는 그것이 세포의 배양에 유용한 한 임의의 크기일 수 있다. 전형적으로, 생물반응기는 적어도 1리터일 것이고, 10, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10,000, 12,0000, 20,000리터 또는 그 초과, 또는 그 사이의 임의의 부피일수 있다. pH 및 온도를 포함하지만, 이들에 제한되지 않는, 생물반응기의 내부 조건은 전형적으로 배양 기간 동안 제어된다. 생물반응기는 유리, 플라스틱 또는 금속을 비롯한, 본 개시 내용의 배양 조건 하에서 배지 중에 현탁된 포유동물 또는 다른 세포 배양물을 보유하기에 적합한 임의의 재료로 구성될 수 있다. 용어 "생산 생물반응기"는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 관심 폴리펩타이드 또는 단백질의 생산에서 사용되는 최종 생물반응기를 지칭한다. 큰-규모의 세포 배양 생산 생물반응기의 부피는 전형적으로 적어도 500리터이고, 1000, 2500, 5000, 8000, 10,000, 12,0000, 20,000리터 또는 그 초과, 또는 그 사이의 임의의 부피일수 있다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 본 개시 내용을 실시하는 데 사용하기에 적합한 생물반응기를 인식할 것이고 선택할 수 있을 것이다.
"세포 밀도": 용어 "세포 밀도"는, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 주어진 배지 부피 중에 존재하는 세포의 수를 지칭한다.
"세포 생존력": 용어 "세포 생존력"은, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 배양 조건 또는 실험 변화의 주어진 세트 하에서 생존하는 배양물 중의 세포의 능력을 지칭ㅎ안다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어는 또한 그 시기에 배양물 중의 세포의 총 수, 살아있는 것, 죽은 것과 관련하여 특정 시간에 살아있는 세포의 부분을 지칭한다.
"배양물" 및 "세포 배양물": 이들 용어는, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 세포 집단의 생존 및/또는 성장에 적합한 조건 하에서 배지(하기 "배지"의 정의 참고) 중에 현탁된 세포 집단을 지칭한다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 명백할 바와 같이, 이들 용어는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 세포 집단 및 세포 집단이 현탁된 배지를 포함하는 조합물을 지칭할 수 있다.
"유가식 배양(fed-batch culture)": 용어 "유가식 배양"은, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 배양 방법을 시작한 후 일부 시간에 추가 성분이 배양물에 제공되는 세포 배양 방법을 지칭한다. 제공된 성분은 전형적으로 배양 방법 동안 고갈된 세포를 위한 영양 보충물을 포함한다. 유가식 배양은 전형적으로 일부 지점에서 중단되고, 배지 중의 세포 및/또는 성분은 수확되고, 임의로 정제된다. 유가식 배양은 상응하는 유가식 생물반응기에서 수행될 수 있다.
"단편": 용어 "단편"은, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 폴리펩타이드를 지칭하고, 그 폴리펩타이드에 대해서 독특하거나 특징적인 주어진 폴리펩타이드의 임의의 별개의 부분으로서 정의된다. 이 용어는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 또한 전장 폴리펩타이드의 적어도 부분을 보유하는 주어진 폴리펩타이드의 임의의 별개의 일부를 지칭한다. 일부 실시형태에서 보유된 활성의 분획은 전장 폴리펩타이드의 활성의 적어도 10%이다. 다양한 실시형태에서 보유된 활성의 분획은 전장 폴리펩타이드의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%이다. 다른 실시형태에서 보유된 활성의 분획은 전장 폴리펩타이드의 활성의 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%이다. 일 실시형태에서, 보유된 활성의 분획은 전장 폴리펩타이드의 활성의 100%이다. 이 용어는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 또는 전장 폴리펩타이드에서 발견되는 적어도 설정된 서열 요소를 포함하는 주어진 폴리펩타이드의 임의의 부분을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 서열 요소는 전장 폴리펩타이드의 적어도 4 내지 5개의 아미노산에 걸쳐있다. 일부 실시형태에서, 서열 요소는 전장 폴리펩타이드의 적어도 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 또는 그 초과의 아미노산에 걸쳐있다.
"적분된 생존 가능한 세포 밀도": 용어 "적분된 생존 가능한 세포 밀도"는, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 배양 과정에 걸쳐서 생존 가능한 세포의 평균 밀도와 배양이 작동되는 시간의 양을 곱셈한 것을 지칭한다. 생산된 폴리펩타이드 및/또는 단백질이 배양 과정에 걸쳐서 존재하는 생존 가능한 세포의 수에 비례한다고 가정하면, 적분된 생존 가능한 세포 밀도는 배양 기간에 걸쳐서 생산된 폴리펩타이드 및/또는 단백질의 양을 추정하는 데 유용한 수단이다.
"배지", "세포 배양 배지", 및 "배양 배지": 이들 용어는, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 성장하는 포유동물 세포에 영양을 공급하는 영양분을 함유하는 용액을 지칭한다. 저현적으로, 이들 용액은 최소 성장 및/또는 생존을 위해서 세포에게 요구되는 필수 및 비필수 아미노산, 비타민, 에너지 공급원, 지질 및 미량 원소를 제공한다. 이 용액은 또한 호르몬 및 성장 인자를 비롯한, 성장 및/또는 생존을 최소 비율을 초과하게 향상시키는 성분을 함유할 수 있다. 이 용액은 예를 들어, 세포 생존 및 증식에 최적화된 pH 및 염 농도로 제형화된다. 배지는 또한 단백질, 가수분해물 또는 미지 조성의 성분을 함유하지 않는 "정의된 배지" - 무-혈청 배지일 수 있다. 정의된 배지는 동물-유래 성분이 존재하지 않고, 모든 성분은 알고 있는 화학 구조를 갖는다.
"대사 폐기 산물": 용어 "대사 폐기 산물"은, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 특히 목적하는 재조합 폴리펩타이드 또는 단백질의 발현 또는 활성과 관련하여, 일부 방식에서 세포 배양에 결정적인 정상 또는 비정상 대사 공정의 결과로서 세포 배양에 의해서 생산된 화합물을 지칭한다. 예를 들어, 대사 폐기 산물은 세포 배양물의 성장 또는 생존력에 결정적일 수 있거나, 생산된 재조합 재조합 폴리펩타이드 또는 단백질의 양을 감소시킬 수 있거나, 발현된 폴리펩타이드 또는 단백질의 폴딩(folding), 안정성, 글리코실화 또는 다른 번역전 변형을 변경시킬 수 있거나, 또는 임의의 수의 다른 방식으로 세포 및/또는 재조합 폴리펩타이드 또는 단백질의 발현 또는 활성에 결정적일 수 있다. 예시적인 대사 폐기 산물은, 글루코스 대사의 결과로서 생산된 락테이트, 및 글루타민 대사의 결과로서 생산된 암모늄을 포함한다. 일 실시형태에서, 방법은 세포 배양에서 대사 폐기 산물의 생산을 둔화시키거나, 대사 폐기 산물을 감소 또는 심지어는 제거하도록 수행된다.
"삼투압몰농도(osmolality)" 및 "삼투압농도(osmolarity)": 삼투압몰농도는 수성 용액 중에 용해된 용질 입자의 삼투압의 척도이다. 용질 입자는 이온 및 비이온화 분자 둘 모두를 포함한다. 삼투압몰농도는 용액 1㎏ 중에 용해된 삼투 활성 입자의 농도(즉, 오스몰)로서 표현된다(38℃에서 1mOsm/㎏ H2O는 19㎜ Hg의 삼투압에 상응함). 이에 반해서, "삼투압농도"는 용액 1리터 중에 용해된 용질 입자의 수를 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 경우 약어 "mOsm"은 "밀리오스몰/㎏ 용액"을 의미한다.
"관류 배양": 용어 "관류 배양"은, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 배양 방법을 시작한 후 추가 성분이 배양물에 연속적으로 또는 반-연속적으로 제공되는 세포 배양 방법을 지칭한다. 제공된 성분은 전형적으로 배양 방법 동안 고갈된 세포를 위한 영양 보충물을 포함한다. 배지 중의 세포 및/또는 성분의 일부는 전형적으로 연속식 또는 반-연속식 기반으로 수확되고, 임의로 정제된다.
"폴리펩타이드": 용어 "폴리펩타이드"는, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 펩타이드 결합을 통해서 연결된 아미노산의 순차적인 쇄를 지칭한다. 이 용어는 임의의 길이의 아미노산 쇄를 지칭하는 데 사용되지만, 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 이 용어가 긴 쇄로 제한되지 않고, 펩타이드 결합을 통해서 함께 연결된 2개의 아미노산을 포함하는 최소 쇄를 지칭할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
"단백질": 용어 "단백질"은, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 별개의 단위로서 기능하는 하나 이상의 폴리펩타이드를 지칭한다. 단일 폴리펩타이드가 별개의 기능 단위를 제공하고, 별개의 기능 단위를 형성하기 위해서 다른 폴리펩타이드와 영구적인 물리적 회합을 요구하지 않는 경우, 용어 "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 상호 교환 가능하게 사용된다.
"재조합방식으로-발현된 폴리펩타이드" 및 "재조합 폴리펩타이드": 이들 용어는, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 폴리펩타이드를 발현하도록 유전자 조작된 숙주 세포로부터 발현된 폴리펩타이드를 지칭한다. 재조합방식으로-발현된 폴리펩타이드는 포유동물 숙주 세포에서 일반적으로 발현되는 폴리펩타이드와 동일하거나 유사할 수 있다. 재조합방식으로-발현된 폴리펩타이드는 또한 숙주 세포에 대해서 이질적, 즉 숙주 세포에서 일반적으로 발현된 펩타이드에 이종성일 수 있다. 대안적으로, 재조합방식으로-발현된 폴리펩타이드는, 그 폴리펩타이드의 일부가 포유동물 숙주 세포에서 일반적으로 발현되는 폴리펩타이드와 동일하거나 유사한 아미노산 서열을 함유하고, 다른 부분이 숙주 세포에 이질적이라는 점에서 키메릭일 수 있다.
"시딩": 용어 "시딩"은, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 생물반응기 또는 또 다른 용기에 세포 배양물을 제공하는 방법을 지칭한다. 세포는 또 다른 생물반응기 또는 용기에서 이미 번식된 것일 수 있다. 대안적으로, 세포는 그것을 생물반응기 또는 용기에 제공하기 전에 이미 동결 및 해동된 것일 수 있다. 이 용어는 단일 세포를 비롯한, 임의의 수의 세포를 지칭한다.
"역가": 용어 "역가"는, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 세포 배양에 의해서 생산된 재조합방식으로-발현된 폴리펩타이드 또는 단백질의 총량을 배지 부피의 주어진 양으로 나눈 값을 지칭한다. 역가는 전형적으로 배지 밀리리터당 폴리펩타이드 또는 단백질의 밀리그램의 단위로서 표현된다.
본 명세서에서 사용되는 두문자어는 예를 들어, VCD: 생존 가능한 세포 밀도; IVCC: 생존 가능한 세포 농도의 적분; TSAC: 총 시알산 함량; HPAE-PAD: 펄스식-전류측정 검출법(Pulsed Amperometric Detection)을 사용한 고-성능 음이온 교환 크로마토그래피; SEC: 크기 배제 크로마토그래피; AEX: 음이온 교환 크로마토그래피; LoC: 랩-온-칩; 및 MALDI-TOF: 기질 보조 레이저 탈착/이온화 - 비행 시간을 포함한다.
본 개시 내용은 세포(예를 들어, 재조합 단백질을 발현하는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 포유동물 세포)를 배양하는 방법을 제공한다. 본 개시 내용은 세포 배양에 의해서 알칼린 포스파타제(예를 들어, 아스포타제 알파)의 생산을 위한 제조 시스템을 제공한다. 특정 실시형태에서, 세포 성장, 생존력, 및/또는 단백질 생산 또는 품질에 유해한 1종 이상의 대사 산물의 생산을 최소화하는 시스템이 제공된다. 특정 실시형태에서, 세포 배양은 회분식 배양, 유가식 배양, 또는 배양 또는 연속식 배양이다. 본 개시 내용의 다른 실시형태가 하기에 상세히 논의된다. 그러나, 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 이들 실시형태에 대한 다양한 변형이 본 개시 내용의 범주에 포함된다는 것을 이해할 것이다.
단백질
본 개시 내용은 세포 배양물에서 알칼린 포스파타제, 아스포타제 알파, 단백질의 발현에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법에 의해서 제조된 후, 이러한 아스포타제 알파는 알칼린 포스파타제-관련 질환 또는 장애를 치료 또는 예방에 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 아스포타제 알파는 기능 불량 내생 알칼린 포스파타제를 갖거나 이것이 감소되거나, 또는 과발현된(예를 들어, 정상 수준 초과의) 알칼린 포스파타제 기질을 갖는 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시 내용에서 아스포타제 알파는 재조합 단백질이다. 일부 실시형태에서, 아스포타제 알파는 융합 단백질이다. 일부 실시형태에서, 본 개시 내용에서 아스포타제 알파는 구체적으로 세포 유형, 조직(예를 들어, 결합, 근육, 신경, 또는 상피 조직), 또는 기관(예를 들어, 간, 심장, 신장, 근육, 뼈, 연골, 인대, 힘줄 등)을 표적으로 한다. 아스포타제 알파는 각각 서열번호 1에 제시된 바와 같은 726개의 아미노산을 갖는 2개의 sTNALP-Fc-D10 폴리펩타이드로 이루어진 가용성 Fc 융합 단백질이다. 밑줄 친 아스파라긴(N) 잔기는 잠재적인 글리코실화 부위(즉, N 123, 213, 254, 286, 413 및 564)에 상응한다. 볼드체의 밑줄 친 아미노산 잔기(L486-K487 및 D715-I716)는 각각 sALP와 Fc, 및 Fc와 D10 도메인 사이의 링커에 상응한다.
각각의 폴리펩타이드 또는 단량체는 5개의 부분으로 구성된다. 아미노산 L1 내지 S485를 함유한 제1 부분(sALP)은, 촉매 기능을 함유한, 인간 조직 비-특이적 알칼린 포스파타제 효소의 가용성 부분이다. 제2 부분은 링커로서 아미노산 L486 내지 K487을 함유한다. 아미노산 D488 내지 K714를 함유한 제3 부분(Fc)은 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 함유하는 인간 면역글로불린 감마 1(IgG1)의 Fc 부분이다. 제4 부분은 링커로서 D715 내지 I716을 함유한다. 제5 부분은 아스포타제 알파가 뼈의 미네랄 상에 결합하게 하는 골 표적화 모이어티인 아미노산 D717 내지 D726(D10)을 함유한다. 또한, 각각의 폴리펩타이드 쇄는 6개의 잠재적인 글리코실화 부위 및 11개의 시스테인(Cys) 잔기를 함유한다. Cys102가 유리 시스테인으로서 존재한다. 각각의 폴리펩타이드 쇄는 Cys122와 Cys184, Cys472와 Cys480, Cys528과 Cys588, 및 Cys634와 Cys692 사이에 4개의 쇄내 다이설파이드 결합을 함유한다. 2개의 폴리펩타이드 쇄는 두 쇄 상의 Cys493 사이 및 두 쇄 상의 Cys496 사이의 2개의 쇄내 다이설파이드 결합에 의해서 연결된다. 이들 공유 구조 특징부에 더하여, 포유동물 알칼린 포스파타제는 아연을 위한 2개의 부위, 마그네슘을 위한 하나의 부위 및 칼슘을 위한 하나의 부위를 비롯한, 각각의 폴리펩타이드 쇄 상에 4개의 금속-결합 부위를 갖는다고 생각된다.
아스포타제 알파
일 실시형태에서, 알칼린 포스파타제 단백질(예를 들어, 골-표적화 sALP 융합 단백질)은 아스포타제 알파(즉, sTNALP-Fc-D10; 서열번호 1)이다. 구체적으로, 아스포타제 알파는 726개의 아미노산의 폴리펩타이드 길이를 갖는 복합체 가용성 당단백질이다. 아스포타제 알파는 3개의 도메인으로 구성된 Fc-융합 단백질이다. N-말단으로부터 C 말단까지, 아스포타제 알파는 하기를 포함한다: (1) 인간 조직 비-특이적 알칼린 포스파타제(TNSALP)(유니프로트케이비/스위스-프로트 어세션 번호(UniProtKB/Swiss-Prot Accession No.) P05186)의 가용성 촉매 도메인, (2) 인간 면역글로불린 G1 Fc 도메인(유니프로트케이비/스위스-프로트 어세션 번호 P01857) 및 (3) 골-표적 도메인으로서 사용되는 데카 아스파테이트 펩타이드(D10)(문헌[Nishioka et al. 2006 Mol Genet Metab 88:244-255]). 단백질은 2개의 1차 단백질 서열로부터 단독-이량체로 회합된다. 이러한 융합 단백질은 6개의 확인된 복합체 N-글리코실화 부위를 함유한다. 이들 N-글리코실화 부위 중 5개는 sALP 도메인 상에 그리고 Fc 도메인 상의 하나에 위치된다. 아스포타제 알파 상에 존재하는 또 다른 중요한 번역-후 변형은 효소를 안정화시키는 다이설파이드 다리 및 Fc-도메인 구조의 존재이다. 단량체당 총 4개의 분자내 다이설파이드 다리가 존재하고, 2개의 분자간 다이설파이드 다리가 이량체 중에 존재한다. 알칼린 포스파타제 도메인의 하나의 시스테인은 유리되어 있다.
아스포타제 알파는 저인산증(HPP)의 치료를 위해서 효소-대체 요법으로서 사용될 수 있다. HPP를 갖는 환자에서, TNSALP를 암호화하는 유전자에서의 기능-손실 돌연변이는 TNSALP 효소 활성의 결핍을 유발하고, 이것은 기질, 예컨대 무기 파이로포스페이트(PPi) 및 피리독살-5'-포스페이트(PLP)의 증가된 순환 수준으로 이어진다. HPP를 갖는 환자에게 아스포타제 알파를 투여하는 것은 PPi를 절단하여, 칼슘과의 조합을 위해서 무기 포스페이트를 방출하고, 이에 의해서 수산화인회석 결정 형성 및 골 미네랄화를 촉진시키고, 정상 골격 표현형을 회복시킨다. 아스포타제 알파 및 치료에서의 이의 용도에 대한 보다 상세한 사항에 대해서는, PCT 공개 제WO2005103263호 및 제WO2008138131호를 참고하기 바라며, 이의 교시 내용은 이의 전문이 참고로 본 명세서에 포함된다. 또 다른 실시형태에서, 아스포타제 알파는 신경섬유종증 I형(NF1)의 치료를 위한 효소-대체 요법으로서 사용될 수 있다. 아스포타제 알파 및 NF1의 치료에서의 이의 용도(다른 알칼린 포스파타제의 용도와 함께)에 대한 보다 상세한 사항에 대해서는, PCT 공개 제WO　2013/058833호를 참고하기 바라며, 이는 이의 전문이 참고로 본 명세서에 포함된다.
제조 방법
알칼린 포스파타제 단백질(예를 들어, 아스포타제 알파)은 관련 기술 분야에 공지된 표준 방법을 사용하여 포유동물 또는 다른 세포에 의해서 생산될 수 있다. 이러한 세포는 배양 접시, 플라스크 유리, 또는 생물반응기에서 성장될 수 있다. 세포 배양 및 재조합 단백질을 생산하기 위한 구체적인 방법은 관련 기술 분야에 공지되어 있고, 예컨대 문헌[Nelson and Geyer, 1991 Bioprocess Technol . 13:112-143] 및 [Rea et al., Supplement to BioPharm International March 2008, 20-25]에 기술되어 있다. 예시적인 생물반응기는 회분식, 유가식, 및 연속식 반응기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 알칼린 포스파타제 단백질은 유가식 생물반응기에서 생산된다.
세포 배양 방법 물리화학적 환경에서의 잠재적인 변동성은 예를 들어, pH, 온도, 세포 배양 배지 조성, 원료 로트-대-로트 변동, 배지 여과 재료, 생물반응기 규모 차이, 기체처리(gassing) 전략(공기, 산소, 및 이산화탄소) 등을 포함한다. 본 명세서에 개시된 바와 같이, 제조된 알칼린 포스파타제 단백질의 글리코실화 프로파일은 하나 이상의 파라미터의 변경에 영향을 받을 수 있다.
세포 배양 방법의 개발
세포 배양에서 재조합 단백질 생산을 위해서, 필수적인 전사 조절 요소를 갖는 재조합 유전자를 먼저 숙주 세포에 전달한다. 통상적으로, 수용 세포에 선택적인 이점을 부여하는 제2 유전자를 전달한다. 전형적으로 유전자 전달 몇 일 후에 적용되는 선택제의 존재 하에서, 선택인자 유전자를 발현하는 이러한 세포 만이 생존한다. 선택을 위한 2가지 대중적인 유전자는 다이하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR), 뉴클레오타이드 대사에 관여되는 효소, 및 글루타민 신쎄타제(GS)이다. 두 경우 모두에서, 선택은 적절한 대사산물(DHFR의 경우에는 하이포잔틴 및 티미딘, GS의 경우에는 글루타민)의 부재 하에서 일어나서, 형질전환되지 않은 세포의 성장을 예방한다. 일반적으로, 재조합 단백질의 효율적인 발현을 위해서는, 생물약제학적-암호화 유전자 및 선택인자 유전자가 동일한 플라스미드 상에 존재하는지 그렇지 않은지의 여부는 중요하지 않다.
선택 이후에, 생존한 세포를 제2 재배 용기에 단일 세포로서 전달할 수 있고, 배양물을 확장시켜 클론 집단을 생산한다. 결과적으로, 개별 클론을 재조합 단백질 발현에 대해서 평가하고, 가장 높은 생산자를 추가 재배 및 분석을 위해서 보유한다. 이들 후보군으로부터, 적절한 성장 및 생산성 특징으로 갖는 하나의 세포주를 재조합 단백질의 생산을 위해서 선택한다. 이어서, 생산 요구에 의해서 결정되는 재배 방법이 확립된다.
세포
폴리펩타이드를 생산하도록 배양될 수 있는 임의의 포유동물 세포 또는 비-포유동물 세포 유형을 본 개시 내용에 따라서 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 포유동물 세포의 비제한적인 예는 예를 들어, 중국 햄스터 난소 세포 +/-DHFR(문헌[CHO, Urlaub and Chasin, 1980 Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 77:4216]); BALB/c 마우스 골수종 세포주(NSO/1, ECACC 어세션 번호: 85110503); 인간 망막모세포(PER.C6 (크루셀(CruCell), 네덜란드 라이덴 소재)); SV40에 의해서 형질전환된 원숭이 신장 CVl 세포주(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주(현탁 배양물 중에서 성장을 위해서 서브클로닝된 293 또는 293개의 세포, 문헌[Graham et al., 1977 J. Gen Virol., 36:59]); 아기 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 마우스 서톨리(Sertoli) 세포(TM4, 문헌[Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)]); 원숭이 신장 세포(CVl ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-I 587); 인간 자궁경부 암종 세포(HeLa, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(문헌[Mather et al., 1982, Annals N.Y . Acad. Sci . 383:44-68]); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암 세포주(Hep G2)를 포함한다. 특별한 실시형태에서, 폴리펩타이드 및 단백질의 배양 및 발현은 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주로부터 일어난다.
추가로, 폴리펩타이드 또는 단백질을 발현시키는 임의의 수의 상업적으로 입수 가능한 재조합 세포주 및 비상업적으로 입수가능한 재조합 세포주가 본 개시 내용에 따라서 사용될 수 있다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 재조합 세포주가 최적의 성장 및/또는 폴리펩타이드 또는 단백질 발현을 위해서 상이한 영양 요건을 가질 수 있고/있거나 상이한 배양 조건을 요구할 수 있고, 이것은 필요로 따라서 변형될 수 있을 것이라는 것을 인지할 것이다.
상기에 언급된 바와 같이, 많은 예에서, 세포는 높은 수준의 단백질 또는 폴리펩타이드를 생산하도록 선택 또는 조작될 것이다. 흔히, 세포는 예를 들어, 관심 단백질 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자의 도입에 의해서 그리고/또는 관심 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자(내생성인지 도입된 것인지에 무관함)의 발현을 조절하는 제어 요소의 도입에 의해서 높은 수준의 단백질을 생산하도록 유전자 조작된다.
온도 이동
세포 배양 방법, 특히 비-연속식 방법(예를 들어, 생물반응기에서의 유가식 방법)의 작동 시간은 통상적으로, 실시 과정에 걸쳐서 전형적으로 감소하는, 세포의 남아있는 생존력에 의해서 제한된다. 따라서, 세포 생존력을 위한 시간 길이의 연장은 재조합 단백질 생산을 개선시키는 데 바람직하다. 생성물 품질은 또한 생존 가능한 세포 밀도의 감소를 최소화하고, 높은 세포 생존력을 유지시키기 위한 동기를 제공하는데, 그 이유는 세포사가 배양 상청액에 시알리다제를 방출할 수 있고, 이것이 발현된 단백질의 시알산 함량을 감소시킬 수 있기 때문이다. 생존 가능한 세포 밀도의 감소를 최소화하고 높은 세포 생존력을 유지시키기 위해서 단백질 정제 문제가 추가의 또 다른 동기를 제공한다. 배양물 중의 세포 파편 및 죽은 세포의 함량은 배양 작동 마지막에 단백질 산물을 단리 및/또는 정제하는 이의 능력에 부정적으로 영향을 줄 수 있다. 따라서, 세포를 배양물 중에서 더 긴 시간 기간 동안 생존 가능하게 유지시킴으로써, 세포에 의해서 생산된 목적하는 당단백질의 품질의 궁극적인 감소 및 저하를 유발할 수 있는 세포 단백질 및 효소(예를 들어, 세포 프로테아제 및 시알리다제)에 의한 배양 배지의 오염이 감소된다.
세포 배양물 중에서 높은 세포 생존력을 달성하기 위해서 다수의 방법이 적용될 수 있다. 하나는 일반적인 온도에서의 초기 배양 후에 배양 온도를 낮추는 것을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Ressler et al., 1996, Enzyme and Microbial Technology 18:423-427] 참고. 일반적으로, 관심 단백질을 발현시킬 수 있는 포유동물 또는 다른 유형의 세포를 먼저 일반적인 온도 하에서 성장시켜서 세포수를 증가시킨다. 각각의 세포 유형을 위한 이러한 "일반적인" 온도는 일반적으로 대략 37℃(예를 들어, 35.0℃, 35.5℃, 36.0℃, 36.5℃, 37.0℃, 37.5℃, 38.0℃, 38.5℃, 및/또는 39.0℃를 비롯한, 예를 들어 약 35℃ 내지 약 39℃)이다. 특정 일 실시형태에서, 아스포타제 알파의 생산 온도를 먼저 약 37℃로 설정한다. 타당하게 높은 세포 밀도가 도달된 경우, 이어서 전체 세포 배양을 위한 배양 온도를 이동시켜(예를 들어, 감소시켜) 단백질 생산을 촉진시킨다. 대부분의 경우, 온도를 낮추는 것은 세포를 세포 사이클의 비-성장 G1로 이동시키는데, 이것은 이전의 더 높은-온도 환경과 비교할 때, 세포 밀도 및 생존력을 증가시킬 수 있다. 또한, 더 낮은 온도는 또한 세포 단백질 생산율을 증가시킴으로써 재조합 단백질 생산을 촉진시켜서, 단백질 번역-후 변형(예를 들어, 글리코실화)을 용이하게 하고, 새로-생산된 단백질의 단편화 또는 응집을 감소시키고, 단백질 폴딩 및 3D 구조의 형성을 용이하게 하고(따라서 활성을 유지시키고), 그리고/또는 새로 생산된 단백질의 분해를 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 더 낮은 온도는 약 30℃ 내지 약 35℃(예를 들어, 30.0℃, 30.5℃, 31.0℃, 31.5℃, 32.0℃, 32.5℃, 33.0℃, 33.5℃, 34.0℃, 34.5℃, 및/또는 35.0℃)이다. 다른 실시형태에서, 아스포타제 알파 생산 온도를 먼저 약 35.0℃ 내지 약 39.0℃로 설정하고, 이어서 약 30.0℃ 내지 약 35.0℃로 이동시킨다. 일 실시형태에서, 아스포타제 알파의 생산 온도를 먼저 약 37.0℃로 설정하고, 이어서 약 30℃로 이동시킨다. 또 다른 실시형태에서, 아스포타제 알파의 생산 온도를 먼저 약 36.5℃로 설정하고, 약 33℃로 이동시킨다. 추가의 또 다른 실시형태에서, 아스포타제 알파의 생산 온도를 먼저 약 37.0℃로 설정하고, 이어서 약 33℃로 이동시킨다. 추가로 또 다른 실시형태에서, 아스포타제 알파의 생산 온도의 생산 온도를 먼저 약 36.5℃로 설정하고, 이어서 약 30℃로 이동시킨다. 다른 실시형태에서, 다수(예를 들어, 1회 초과) 단계의 온도 이동이 적용될 수 있다. 예를 들어, 온도를 먼저 37℃에서 33℃로 낮추고, 이어서 추가로 30℃로 낮출 수 있다.
상이한 온도로의 이동 전에 특정 온도에서 배양을 유지시키는 시간은, 세포 생존력 및 관심 단백질을 생산하는 능력을 유지시키면서, 충분한 (또는 목적하는) 세포 밀도를 달성하도록 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물을, 생존 가능한 세포 밀도가 약 105세포/㎖ 내지 약 107세포/㎖(예를 들어, 1 x 105, 1.5 x 105, 2.0 x 105, 2.5 x 105, 3.0 x 105, 3.5 x 105, 4.0 x 105, 4.5 x 105, 5.0 x 105, 5.5 x 105, 6.0 x 105, 6.5 x 105, 7.0 x 105, 7.5 x 105, 8.0 x 105, 8.5 x 105, 9.0 x 105, 9.5 x 105, 1.0 x 106, 1.5 x 106, 2.0 x 106, 2.5 x 106, 3.0 x 106, 3.5 x 106, 4.0 x 106, 4.5 x 106, 5.0 x 106, 5.5 x 106, 6.0 x 106, 6.5 x 106, 7.0 x 106, 7.5 x 106, 8.0 x 106, 8.5 x 106, 9.0 x 106, 9.5 x 106, 1 x 107세포/㎖, 또는 그 초과)에 도달할 때까지 제1 온도 하에서 성장시키고, 그 후 상이한 온도로 이동시킨다. 일 실시형태에서, 세포 배양물을 생존 가능한 세포 밀도가 약 2.5 내지 약 3.4 x 106세포/㎖에 도달할 때까지 제1 온도 하에서 성장시키고, 그 후 상이한 온도로 이동시킨다. 또 다른 실시형태에서, 세포 배양물을 생존 가능한 세포 밀도가 약 2.5 내지 약 3.2 x 106세포/㎖에 도달할 때까지 제1 온도 하에서 성장시키고, 그 후 상이한 온도로 이동시킨다. 추가의 또 다른 실시형태에서, 세포 배양물을 생존 가능한 세포 밀도가 약 2.5 내지 약 2.8 x 106세포/㎖에 도달할 때까지 제1 온도 하에서 성장시키고, 그 후 상이한 온도로 이동시킨다.
일부 실시형태에서, 세포 배양물을 생존 가능한 세포 밀도가 약 2.5 내지 2.8 x 106세포/㎖에 도달할 때까지 37℃ 하에서 성장시키고, 그 후 단백질 생산을 위해서 30℃로 이동시킨다. 다른 실시형태에서, 세포 배양물을 생존 가능한 세포 밀도가 약 2.5 내지 3.4 x 106세포/㎖에 도달할 때까지 37℃ 하에서 성장시키고, 그 후 단백질 생산을 위해서 30℃로 이동시킨다.
pH
세포 배양에서 성장 배지의 pH 변경은 세포 단백질분해 활성, 분비, 및 단백질 생산 수준에 영향을 줄 수 있다. 대부분의 세포주는 약 pH 7 내지 8에서 잘 성장한다. 세포 성장을 위한 최적의 pH는 상이한 세포 균주 사이에서 상대적으로 덜 달라지지만, 일부 정상 섬유모세포 세포주는 pH 7.0 내지 7.7에서 가장 잘 수행되고, 형질전환된 세포는 전형적으로 pH 7.0 내지 7.4에서 수행된다(문헌[Eagle, 1973 The effect of environmental pH on the growth of normal and malignant cells. J Cell Physiol 82:1-8]). 일부 실시형태에서, 아스포타제 알파의 생산을 위한 배양 배지의 pH는 약 pH 6.5 내지 7.7(예를 들어, 6.50, 6.55, 6.60, 6.65, 6.70, 6.75, 6.80, 6.85, 6.90, 6.95, 7.00, 7.05, 7.10, 7.15, 7.20, 7.25, 7.30, 7.35, 7.39, 7.40, 7.45, 7.50, 7.55, 7.60, 7.65, 및 7.70)이다. 일부 실시형태에서, 아스포타제 알파의 생산을 위한 배양 배지의 pH는 약 pH 7.20 내지 7.60이다. 다른 실시형태에서, 아스포타제 알파의 생산을 위한 배양 배지의 pH는 약 pH 6.9 내지 7.1이다. 특정 일 실시형태에서, 아스포타제 알파의 생산을 위한 배양 배지의 pH는 약 pH 6.9이다. 또 다른 실시형태에서, 아스포타제 알파의 생산을 위한 배양 배지의 pH는 약 pH 7.30이다. 추가의 또 다른 실시형태에서, 아스포타제 알파의 생산을 위한 배양 배지의 pH는 약 pH 7.39이다.
본 명세서에 언급된 모든 참고문헌은 이들의 전문이 참고로 포함된다.
본 개시 내용은 이해의 명확성의 목적을 위해서 예시 및 예의 방식에 의해서 약간 상세하게 설명되어 있지만, 약간의 특정 변화 및 변형이 실시될 것이라는 것은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 자명할 것이다. 따라서, 설명 및 실시예는 본 개시 내용의 범주를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.
실시예
실시예 1. 아스포타제 알파의 일반적인 제조 방법
본 명세서에 기술된 바와 같이, 알칼린 포스파타제(예를 들어, 아스포타제 알파 (sTNALP-Fc-D10))를 생산하기 위한 제조 방법을 개발하였다.
GS 유전자 발현 시스템을 사용하여 아스포타제 알파를 발현시키는 안정한 CHO 세포주를 개발하였다. 단회 라운드의 제한된 희석 클로닝으로 고 생산 1차 클론으로부터 2차 클론을 유래시키고, 최종 세포주를 선택하였다.
예시적인 제조 방법, 방법 X가 본 명세서에 기술된다. 마스터 셀 뱅크(Master Cell Bank)의 바이알을 해동시키고, 바이알의 전체 부피를 재-현탁시켰다. 전체 부피를 성장을 위해서 250㎖ 진탕 플라스크에 전달하였다. 계수 및 생존력 시험을 위해서(또한 모든 다음 확장 단계를 위해서) 샘플을 매일 취하였다. 세포를 몇 단계에 걸쳐서 확장시키고, 1,000L의 시드 생물반응기(N-3 낮은 수준), 1,000L의 시드 생물반응기(N-2 높은 수준), 및 4,000L의 시드 생물반응기(N-1)에 접종시키고, 이어서 20,000L의 생산 생물반응기에 접종시켰다. 아스포타제 알파의 생산 후에, 수확 정화 방법을 사용하여 무균 여과에 의해서 미손상 세포 및 세포 파편을 제거하였다. 이어서 수확물을 농축 및 완충물 희석을 위해서 한외여과하였다(포스트 하비스트(Post Harvest) UF). 추가 방법은 예를 들어, 바이러스 불활성화(바이러스 입자를 화학적으로 불활성화시키기 위함), 맙셀렉트 수레 크로마토그래피(MabSelect SuRe chromatography), 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 포스트 HIC UF/DF(UF/DF2), 캡토 부착 혼합-모드-크로마토그래피(capto adhere mixed-mode chromatography), 바이러스 여과(크기 배제에 의함), 제형(UF/DF3) 및 벌크 충전을 포함하였다. 예를 들어, 2,000L-규모 방법 및 그 후의 20,000L 생산 규모로의 규모 확대를 비롯한, 다양한 제조 방법을 수행할 수 있다. 2,000L(2K) 방법과 20,000L(20K) 방법 간의 예시적인 차이는 표 2 및 표 3에 요약되어 있다. 2,000L(2K) 규모 방법은 보다 확연한 유도기를 가졌고, 후기 생존력을 보다 변화시켰다(데이터에 나타내지 않음).
2K 방법 및 20K 방법의 전체 수율, 뿐만 아니라 상응하는 생산된 아스포타제 알파의 품질을 비교하였다. 생성물 특징을 비교하기 위해서 사용된 분석 방법은 예를 들어, SEC-HPLC, RP-HPLC, 및 생산된 아스포타제 알파의 비활성도, 단백질 농도, pH, 및 총 시알산 함량(TSAC)을 측정하기 위한 다른 방법을 포함한다. 또한, 불순물 및 안정성 시험을 또한 수행하여 예를 들어, 상이한 방법으로부터 생산된 아스포타제 알파 중의 잔류 DNA, 잔류 단백질 A, 숙주 세포 단백질, 생균수(bioburden) 및 엔도톡신을 측정하였다. 3종의 추가 시험, 즉 등전점 맞춤(IEF), 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE), 및 올리고사카라이드 맵핑을 또한 수행하여 2K 규모 배취 및 20K 규모 배취로부터의 약물 물질을 비교하였다. 이들 3종의 시험 결과는 이들 배취에 대해서 대등한 프로파일을 나타내었다. 결론적으로, 2,000L와 20,000L 규모 간의 아스포타제 알파 품질은 모든 배취에 걸쳐서 대등하였다.
실시예 2. 아스포타제 알파 생산성 및 품질에 대한 온도 이동의 영향
sTNALP-Fc-D10을 생산하기 위해서 채택되고, 실시된 상이한 제조 방법 중에서, 온도 이동이 일반적으로 생산성 및 최종 아스포타제 알파 품질에 영향을 준다는 것이 발견된다. 성장 온도(비교적 높은 온도)로부터 생산 온도(비교적 낮은 온도)로의 온도 이동을 모든 방법에서 실시하였다.
온도 이동시킨 것 대 온도 이동시키지 않는 것을 비교하기 위해서, 2개의 sTNALP-Fc-D10 생산 생물반응기 작동을 수행하였는데, 여기서 온도 이동이 존재하거나 존재하지 않았다. 사토리우스(Sartorius) 2L 생물반응기 및 10L 생물반응기를 상이한 생산 방법에 대해서 사용하였다. 이러한 예시적인 방법에서, 생산 생물반응기에서 사용된 원료는 표 4에 요약된 바와 같이, 예를 들어, 생산 배지, 10% 탄산나트륨, CHO 공급물, 및 글루타민 스톡 용액을 포함하였다. SFM4CHO는 CHO를 위한 무혈청 배지를 지칭한다.
방법
세포 배양 실험 설계
2개 블록의 실험을 실시하여 예시적인 방법에 대한 아스포타제 알파 생산성 및 품질 속성에 대한 온도 이동의 영향을 평가하였다. 표 5에 도시된 바와 같이, 온도 이동(37℃ 내지 30℃)을 사용하여 2개의 생물반응기 작동(즉, #1 및 #2)을 수행하였고, 온도 이동 없이 37℃로부터 2개의 나머지 작동(즉, #3 및 #4)을 수행하였다.
세포 계수기(즉, 비셀 브이알(ViCell VR), 베크만 쿨터(Beckman Coulter))를 사용하여 세포 밀도 및 생존력을 계수하였다. pHOx를 사용하여 pH 및 오프-라인 기체(off-line gas)를 측정하였고, 글루코스 및 락테이트를 비롯한, 주요 대사산물을 센서(노바 프로파일(Nova Profile) 100, 노바 바이오메디컬(Nova Biomedical), 미국 매사추세스주 월섬 소재)를 사용하여 측정하였다. 효소 활성 측정 전에, 3회 희석하는 대신에, 각각의 샘플을 한번만 희석함으로써 변형된 표준 방법을 사용하여 효소 활성을 측정하였다.
수확 및 정제 방법
50마이크로리터의 10일(240 ± 4시간) 샘플을 주사기를 사용하여 모든 생물반응기로부터 수확하였다. 원심분리(3000 x g, 5분)에 의해서 세포를 제거한 후, 0.22μM 바틀-탑 필터(bottle-top filter)를 사용하여 상청액을 정화하고, 정제 전에 -80℃에서 저장하였다. 단일 단계의 고 처리량 단백질 A 정제를 본 연구에서 적용하였다. 분석 및 단백질 특징 분석법 이전에 샘플을 저염 완충제(5mM Na3PO4, pH 7.4)로 완충제 교환시켰다.
분석 및 단백질 특징 규명 방법
본 연구에서 분석된 품질 속성은 아스포타제 알파 응집, 단편화, 전하 분포, 총 시알산 함량(TSAC), 및 중성 글리칸 종 수준을 포함하였다. 응집물 수준을 SEC에서 정량분석된 총 단백질에 대한 응집물 피크의 백분율에 의해서 추정하였다. 단편 수준을 LoC에서 정량분석된 총 단백질에 대한 단편 피크의 백분율에 의해서 추정하였다. 전하 분포를 AEX에서 각각 정량 분석된 총 단백질 피크에 대한 염기성 피크, 주 피크 및 산 피크의 백분율에 의해서 추정하였다. 총 시알산 함량(TSAC)을 HPAE-PAD에 의해서 정량분석하였다. 중성 글리칸 종의 검출은 MALDI-TOF 질량 분광분석법에 의해서 수행하였다.
결과
세포 배양 성능
방법 #1에서, 생존 가능한 세포 밀도(VCD)가 25 내지 32 x 105세포/㎖에 도달한 후 5시간 내에 온도 설정값을 37℃에서 30℃로 이동시켰다. 온도를 이동시키지 않은 경우, 세포 배양물은 더 높은 피크 VCD에 도달하였지만, 더 신속한 생존력 감소를 경험하였다(도 1A). 더 높은 총 글루코스 소모가 마찬가지로 온도 이동이 없는 조건 하에서 관찰되었다(도 1B). 방법 설명에 따라서 온도 이동이 없는 조건 하에서 글루코스 볼러스 첨가를 5일 및 8일에 적용하였다. 흥미롭게도, 락테이트는 여전히 소모되었지만, 온도 이동 조건보다 온도 이동이 없는 조건 하에서 상당히 더 낮았다(도 1B).
온도 이동이 없는 조건 하에서의 더 높은 피크 VCD는 단백질 A 결합 가능한 역가의 조기 생성으로 이어졌다(도 2A). 온도 이동이 없는 조건 하에서 보다 신속한 생존력 감소와 함께, 유사한 단백질 A 결합 가능한 역가가 두 조건 모두 하에서 10일에 달성되었다. 총 특이적 단백질 A 결합 가능한 생산성은 온도 이동 조건의 경우 6.4pg/세포/일이었고 온도 이동이 없는 조건의 경우 6.7pg/세포/일이었다. 흥미롭게도, 유사한 단백질 A 결합 가능한 역가가 두 조건 모두 하에서 관찰되었지만, 온도 이동이 없는 조건 하에서의 부피 활성은 온도 이동 조건보다 상당히 더 낮았다(도 2B). 또한, 온도 이동이 없는 조건 하에서의 비활성도는 배양 기간 전체에서 온도 이동 조건보다 상당히 더 낮았다(도 2C). 이러한 데이터는 37℃로부터 33℃로의 온도 이동이 방법 #1에 대한 비활성도를 유지시키는 데 최적임을 나타낸다.
방법 #1에서 정량분석된 모든 품질 속성을 표 6에 요약한다.
AEX 결과는 온도 이동 조건과 비교하여 더 적은 산성 종이 온도 이동이 없는 조건으로부터 생성되었다는 것을 나타내었다(도 3a). 그러나, 상당히 더 많은 응집물이 온도 이동이 없는 조건 하에서 SEC 결과에 의해서 정량분석되었다(도 3B). 온도 이동이 없는 조건 하에서, 비-환원 LoC 평균 피크 백분율은 더 높은 반면(도 4A, 또한 표 6의 "LoC(% 주, NR)" 열에서), 환원 LoC 평균 피크 백분율은 더 낮았다(도 4B, 또한 표 6의 "LoC(% 주, R)" 열에서).
시알릴화는 온도 이동이 없는 조건 하에서 대략 1배가 상당히 증가되었다(도 4C).
MALDI-TOF에 의한 중성 글리칸의 분석은 온도 이동이 없는 조건 하에서 고차원 만노스 종 또는 전형적이지 않은 글리칸 종이 검출되지 않았음을 나타내었다(도 5). 그러나, 온도 이동이 없는 조건은 더 적은 양의 A2(온도 이동이 있는 대조군 조건 하에서 우세한 아푸코실화된(afucosylated) 글리칸 종), 보다 높은 푸코실화(더 높은 FA2 대 A2의 비율), 및 FA3G3, FA4G3, FA4G1L1, 및 FA4G4L1을 비롯한 고차 글리칸의 증가를 초래하였다(도 5).
아스포타제 알파 생산성 및 방법 #1의 품질에 대한 온도 이동이 없는 것의 영향을 표 7에 요약한다. 온도 이동이 없으면, 생산된 아스포타제 알파는 훨씬 더 낮은 비활성도를 가졌다. 한편, 온도 이동이 없는 조건 하에서의 더 높은 생산 온도는 더 높은 시알릴화 및 더 높은 푸코실화로 이어졌다.
실시예 3. 예시적인 방법 #2에 대한 초기 상류 공정 파라미터 평가
본 실험은 예시적인 아스포타제 알파 제조 방법 #2에 대한 상류 제조 공정 파라미터의 초기 평가 및 생산된 아스포타제 알파의 중요 품질 속성에 영향을 주는 이의 가능성을 요약한다. 일부 상류 공정 파라미터는 % 응집, % 단편화, 시알릴화, 글리코실화, 전하 분포, 및 비활성도를 포함한다.
세포 배양
본 연구에서 언급된 모든 생산 방법은 진탕 플라스크 또는 생물반응기에서 수행하였다. 해동 후, 생산 생물반응기의 접종 전에 세포를 일련의 진탕 플라스크 및 스피너 플라스크(spinner flask)를 통해서 확장시켰다. 생산 생물반응기(2L, 5L, 10L, 또는 200L)는 달리 명시되지 않는 한, 부피당 일정한 동력 및 분당 액체 부피당 분사 기체 부피(VVM)를 사용하는 규모였다. 생산 생물반응기의 온도를 달리 명시되지 않는 한 0 내지 대략 120시간까지 36.5℃에서 제어하였고, 대략 120시간에 33.0℃로 이동시켰다. 용존 산소 설정값을 30%로 유지시켰다. 배양물을 10일(240시간 ± 6시간)에 수확하는 경우 대략 볼러스당 2.7%(v/v)의 CPN 공급물을 96시간(hr), 144시간 및 192시간에 첨가한 반면, 배양물을 10일보다 늦게 수확한 경우 추가 볼러스 공급물을 240시간에 제공하였다.
수확 및 정제
생산 생물반응기로부터 수확된 샘플을 3000 x g로 5분 동안 원심분리시킨 후 0.22μm 여과기에 의해서 정화시켰다. 정화 여과된 수확물의 정제를 수행하였고, 정제 정도는 시험 및 샘플 시험 요건에 의해서 지시되었다. 1회의 크로마토그래피 단계(단백질 A) 또는 2회의 순차적인 크로마토그래피 단계(단백질 A 이후의 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)) 정제를 시험된 대부분의 샘플에 대해서 실시하였다. 추가로, 분석 시험 이전에, 샘플을 저염 완충제(5mM Na3PO4, pH7.4)로 완충제 교환시켰다.
분석 특징
본 연구에서 언급된 품질 속성은 광범위한 품질 매트릭스, 예컨대 순도, 효력 및 구조의 하위세트로서 식별되었다. 기술된 품질 하위세트는 % 응집, % 단편화, 전하 분포, 총 시알산 함량(TSAC), 중성 글리칸 프로파일, 및 비활성도를 포함한다. 응집물 및 단편 수준 둘 모두는 겔 투과 HPLC(GP-HPLC)을 사용하여 정량분석된 상대적인 피크 면적에 의해서 측정되었다. 또한, 단편 수준은 SDS-PAGE 또는 랩-온-칩(LoC) 모세관 전기이동을 사용하여 측정되었다. 전하 분포는 음이온-교환(AEX) 크로마토그래피에 의해서 추정되었다. TSAC는 펄스트-암페로메트릭 검출법(HPAE-PAD)을 사용한 고-성능 음이온 교환 크로마토그래피에 의해서 정량분석되었다. 중성 글리칸 종의 검출은 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화(MALDI) 질량 분광분석법에 의해서 수행되었다. 비활성도는 파라나이트페닐포스페이트(pNPP)-기반 알칼린 포스파타제 효소 검정법에 따라서 측정되었다.
결과
1. 성장 및 생산 온도
생성물 단편에 대한 온도의 영향을 논의하였다. 36.5℃에서 성장된 선택된 세포 클론에 의해서 생산된 아스포타제 알파의 경우, 주 아스포타제 알파 밴드는 SDS-PAGE에 의해서 측정되는 경우 95.9%이고, 단편은 대략 4%인 것으로 계산되었다. 온도를 5일에 36.5℃에서 33.0℃로 이동시킨 경우, 아스포타제 알파 단편이 거의 없는 동일한 클론이 생산되었다(주 밴드가 99% 초과인 것으로 계산됨). 다른 2차 클론은 36.5℃에서 33.0℃로의 온도 이동을 통해서 단편의 감소에서 매우 유사한 경향성을 나타내었지만, 모든 2차 클론에서 단편 수준이 1% 미만인 수준으로 감소될 수 있는 것은 아니었다. 따라서, 성장 온도 및 생산 온도는 단편화에 영향을 줄 수 있다. 또한, 온도 이동을 수행하는 것과 연관된 시기가 또한 아스포타제 알파 품질에 영향을 줄 수 있었다.
2L 생물반응기에서의 2차 클론 스크리닝 동안 더 낮은 생산 온도 하에서 GP-HPLC에 의해서 검출된 더 높은 응집물 수준이 관찰되었다. 도 6A는 온도를 이동시키지 않은 경우(즉, 36.5℃로 유지됨) 10개의 2차 클론에 의해서 생산된 물질과 비교한, 온도를 33℃로 이동시킨 경우 6개의 2차 클론에 의해서 생산된 아스포타제 알파의 응집물 수준을 나타내었다. 이들 데이터는 36.5℃에서 33.0℃로의 온도 이동이 응집물 수준 증가를 유발할 수 있음을 제안한다.
또한, TSAC에 대한 온도 이동의 영향을 1차 클론 선택 및 초기 방법 개발 동안 조사하였다(도 6B). 1차 클론을 사용하여 2L 생물반응기에서 시알릴화, 또는 TSAC에 대한 생산 온도의 영향(5일 이후)을 조사하였다. 본 연구에서, 생산 온도를 5일에 조건 1 하에서 36.5℃에서 30.0℃로 이동시켰고, 5일에 조건 2하에서 36.5℃에서 33.0℃로 이동시켰으며, 대조군은 온도 이동 없이 작동되었다. 생존력이 60% 내지 80%인 경우 샘플을 수확하였고, 생존력에 따른 수확 전에 11일 내지 18일 동안 배양을 작동시켰다. 도 6B에 도시된 바와 같이, 온도 이동의 실시는 유사한 생존력 하에서 일정한 온도 하의 대조군과 비교할 때 더 낮은 TSAC를 생성하였고, 더 낮은 온도로의 이동은 더 낮은 TSAC에 상응하였다. 본 명세서에서 목적하는 최소 TSAC 값은 1.8이다. 시알릴화(또는 TSAC)는 생성물의 전하 프로파일을 변화시키고, 중성 글리칸을 음으로 하전된 글리칸으로 전환시킬 것이기 때문에, 이들 3개의 품질 속성(생산 온도, 응집, 및 TSAC)은 밀접하게 관련된다고 간주된다.
2. pH
예비 결과는 pH 설정값을 6.90에서 7.00으로 변화시키는 것이 증가된 TSAC로 이어진다는 것을 나타내었다(도 7). 선택된 2차 클론을 사용하여, 각각 6.90 및 7.00의 pH 설정값을 갖는 2개의 2L 생물반응기를 사용하여 아스포타제 알파 시알릴화에 대한 pH의 영향을 조사하였다. 샘플을 각각 10일 및 12일에 생물반응기로부터 수확하였다. TSAC는 pH 6.90 조건 하에서 10일에 1.9에서 12일에 1.4로 낮아졌다. TSAC 값 감소의 동일한 경향성이 pH 7.00 조건 하에서 관찰되었지만, pH 7.00 하에서 두 일수 모두에 대한 TSAC 값(10일에 2.6, 및 12일에 2.1)은 더 낮은 pH 조건 하에서의 것보다 더 높았다. 이들 데이터는 TSAC가 배양 기간에 따라서 감소하고, 더 낮은 pH 설정값은 더 낮은 TSAC 값을 유발함을 제안하였다.
3. 배지 공급물 첨가
예비 데이터는 제1 볼러스 첨가를 늦추거나 또는 배지 중의 글루코스 농도를 증가시키는 것이 대조군 조건과 비교하여 상당히 더 높은 TSAC로 이어질 수 있다는 것을 나타내었다(도 8A).
또한, 배지 공급물이 전달되는 방법(연속식으로 또는 볼러스 첨가에 의함)이 또한 TSAC에 대한 영향을 가졌다. 2L 및 10L 규모 둘 모두로부터의 데이터는, 공급물이 볼러스 모드로 첨가되는 경우 연속식 첨가 모드와 비교하여 상당히 더 높은 TSAC가 관찰되었음을 나타냈다(도 8B). 따라서, CPN 공급물은 볼러스로서 보충되는 것으로 결정된다. 또한, 공급물이 상부 포트 드롭 첨가(top port drop addition)를 통해서 전달되거나 표면 하(하부(dip) 첨가에 의해서 전달된 경우 TSAC에 대한 어떤 영향도 관찰되지 않았다.
4. 황산아연 첨가
아연 이온은 알칼린 포스파타제(예를 들어, 아스포타제 알파)에 대해서 필수적이라고 공지되어 있는데, 그 이유는 그것이 그의 구조 및 활성을 유지시키는 것을 돕기 때문이다. 예를 들어, 2개의 아연 원자는 하나의 태반 알칼린 포스파타제 분자와 회합된다(문헌[Helene Le Du et al. 2001 J. Biol . Chem . 276:9158-9165]). 이러한 비율을 기초로, 소규모 모델로 개발된 예시적인 제조 방법에 의해서 생산된 1g/L 아스포타제 알파의 역가의 경우, 대략 20μM의 아연이 아스포타제 알파 활성을 위해서 필요하다.
세포 배양이 진행됨에 따라서, 단백질 A-결합 가능한 아스포타제 알파가 연속적으로 생산되지만, 상응하는 부피 활성은 단백질 A 역가와 동기화되지 않는 것이 관찰되었는데, 이는 생성될 단백질이 불활성화되었음을 나타내었다(도 9A). 추가로, 부피 활성은 5일에서 9일까지 감소하였지만, 단백질 활성은 9일에 황산아연을 첨가할 때 즉시 회복되었다. 이러한 데이터는, 아연이 생산 배지에 보충될 필요가 있다는 것을 제안하였다. 본 연구에서, 황산아연 농도는 9일에 볼러스 첨가를 통해서 25μM이 증가되었다. 단백질 A 역가가 9일에 대략 1000㎎/L인 것을 고려하여, 아연 볼러스 첨가는 아연 이온 대 아스포타제 알파의 비율을 적어도 2:1만큼 증가시켰다.
하기 연구에서, 세포 성장 및 생존력에 대한 황산아연의 세포독성 수준을 회분식 모드에서 소형-생물반응기 시스템을 사용하여 조사하였으며, 여기서 상이한 농도의 황산아연이 0일에 배양 배지에 첨가하였다. 황산아연 농도가 300μM 미만인 경우, 성장 또는 생존력에 대한 영향이 거의 관찰되지 않았다(도 9B 및 도 17C). 그러나, 아연 농도가 500μM 이상인 조건에서, 성장 및 생존력 둘 모두가 극적으로 영향을 받았다. 따라서, 총 아연 보충의 최적의 농도는 500μM 미만이었다. 따라서, 0일에 보충될 최적의 아연 농도는 약 25μM 내지 약 300μM(세포 성장/생존력 및 단백질 기능 문제 둘 모두를 고려함)일 수 있다. 사실, 150μM의 아연 농도가 300μM보다 훨씬 더 양호할 수 있는데, 그 이유는 전자가 5일 후에 세포 성장 저해를 덜 유발할 수 있기 때문이다(도 9A). 또한 20μM 아연이 아스포타제 알파를 생산하기에 이론적으로 충분함에도 불구하고(즉, 활성 효소당 2개의 아연 이온), 실제 아연 보충물이 알칼린 포스페이트(예를 들어, 아스포타제 알파, TNALP, PALP, GCALP, IAP, 또는 이들의 융합/변이 단백질) 제조 방법에서 상당히 더 높은 아연 농도(예를 들어, 150μM)를 필요로 할 수 있다는 것은 놀라운 것이다.
5. 시딩 밀도
일반적으로, 더 높은 시딩 밀도는 더 높은 피크 생존 가능한 세포 밀도로 이어지는데, 이는 주로 생산 배지 중의 특정 영양 성분 제한으로 인한 것이다. 공급 및 온도 이동이 배양 기간을 기초로 하기 때문에, 다른 상류 공정 파라미터, 특히 온도 이동 시기와 함께 시딩 밀도가 아스포타제 알파 품질에 잠재적으로 영향을 줄 수 있다.
6. 수확 시기
이러한 예시적인 방법에서 수확 시기는 240 ± 6시간이었다. TSAC에 대한 수확 시기의 영향을 예증하였다(예를 들어, 도 7 참고). 또한, 수확 시기는 또한 생존력과 연관된다고 고려되며(예를 들어, 도 14 참고), 배양의 마지막의 생존력 감소는 수확 시기가 아스포타제 알파 품질에 잠재적으로 영향을 줄 수 있다는 것을 나타낸다.
시딩 밀도, 온도, pH, DO, 기체처리 전략, 교반, CPN 공급, 글루코스 첨가, 갈락토스 첨가, 아연 첨가, 및 수확 시기를 비롯한, 다양한 상류 공정 파라미터를 평가하였다. % 응집, % 단편화, 시알릴화, 글리코실화, 전하 분포, 및 비활성도를 비롯한, 보다 상류의 공정 파라미터를 예를 들어, 하기에 논의된 바와 같이 평가하였다.
온도는 응집, 단편화, 및 시알릴화에 강한 영향을 가졌다. pH 또한 아스포타제 알파 시알릴화에 영향을 미쳤다. 기체처리 전략 또는/및 교반이 생존력에 영향을 미치는 것 같다. CPN 공급물 첨가가 시알릴화에 영향을 미치는 것 같다. 아연 첨가는 효소 활성 유지에 필수적인 것으로 나타났고, 아연 첨가의 양(150μM)이 제공된 연구를 기반으로 결정되었다. 수확 시기는 생존력 및 배양의 마지막에서 TSAC 감소와 연관되는 것으로 나타났다.
실시예 4. 예시적인 방법 # 3에 대한 추가 상류 공정 파라미터 평가
본 실시예는 생산 생물반응기 공정 파라미터를 스크리닝하려는 목적을 위해서 수행된 상류 방법의 추가 특징 규명을 요약한다. 초기 평가를 위해서, 상류 공정 파라미터의 목록을 본 예시적인 방법에서 시험하였고, 이는 생산 배양 pH, 온도, 시딩 밀도, 기체처리 전략, 교반, CPN 공급, 글루코스 첨가, 갈락토스 첨가, 및 수확 시기를 포함한다.
두문자어
CPP: 중요 공정 파라미터, 중요 품질 속성에 대한 영향을 갖고, 따라서 방법이 목적하는 품질을 생산하는 것을 보장하도록 모니터링 및 제어될 공정 파라미터(방법 입력).
CQA: 중요 품질 속성
HPLC: 고성능 액체 크로마토그래피
LoQ: 정량 한계
P/V: 부피당 전력
물질 및 방법
초기 실험에서 잠재적인 영향을 갖는다고 밝혀진 공정 파라미터를 추가로 조사하였다. 6개 블록의 생물반응기를 하기 공정 특징 규명 연구에서 사용하였다(표 8). 각각의 공정 파라미터에 대한 3가지 수준은 제조 및 공정 파라미터 범위 시험에서 제어 능력을 고려하여 현재 설정값(대조군)으로서 중간 수준으로 시험하였다. 블록 1 내지 블록 5에서, 2개의 복제 대조군을 사용한 3가지-수준 완전 요인 배치법(full factorial design)을 실시하였다. 블록 6에서, 극한 P/V 및 분사 VVM과 2개의 대조군의 4개의 조합을 수행하였다.
세포 배양
본 연구에서 언급된 모든 생산 방법은 2L 또는 10L 생물반응기에서 수행하였다. 해동 후, 생산 생물반응기의 접종 전에 세포를 일련의 진탕 플라스크 및 스피너 플라스크를 통해서 확장시켰다. 생산 생물반응기(2L 또는 10L)는 달리 명시되지 않는 한 P/V 및 분사 VVM을 사용하는 규모였다. 대조군 조건 하에서, 세포 배양 공정 파라미터는 하기와 같았다. 배양 pH 설정값은 0.05 죽은 밴드를 갖는 6.90이었다. 온도를 0에서 120시간까지 36.5℃에서 제어하였고, 120시간에 33℃로 이동시켰다. 용존 산소 설정값을 30%로 유지시켰다. 초기 P/V는 17W/㎥(0 내지 96시간)이었고, 96시간에 제1 볼러스 공급물 첨가 전에 81W/㎥로 이동시켰다. 볼러스당 2.67%(v/v)의 CPN 공급물을 96시간, 168시간, 및 192시간에 첨가하였다. 글루코스를 2g/L 이하에서 유지시켰다. 글루코스가 2g/L인 경우, 매일 볼러스를 첨가하여 글루코스 농도를 1.8 내지 2.0g/L 범위로 증가시켰다. 갈락토스를 배양 전체에서 보충하였다: 0일 및 4일에 2.0g/L, 및 5일에서 9일까지 매일 1.0g/L. 배양물의 일부를 10일(240 ± 4시간) 및 11일(264 ± 4시간)에 수확하였다.
수확 및 정제
생산 생물반응기로부터 수확된 샘플을 3000 x g로 5분동안 원심분리시킨 후 0.22μm 여과기에 의해서 정화시켰다. 정화 여과된 수확물의 정제를 수행하였다. 정제 정도는 시험 및 샘플 시험 요건에 의해서 지시되었다. 1 단계(단백질 A) 또는 2회의 순차적인 단계(단백질 A 및 HIC) 정제를 실시하였다. 추가로, 분석 시험 이전에, 샘플을 저염 함유 완충제(5mM Na3PO4, pH7.4)로 완충제 교환시켰다.
분석 특징
본 연구에서 언급된 품질 속성은 % 응집, % 단편화, 전하 분포, 총 시알산 함량(TSAC), 및 중성 글리칸 프로파일을 포함한다. 응집물 및 단편 수준 둘 모두는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 정량분석된 상대적인 피크 면적에 의해서 측정되었다. 또한, 아스포타제 알파 순도(주 피크)는 또한 랩-온-칩(LoC) 모세관 전기이동을 사용하여 측정되었다. 전하 분포는 음이온-교환 크로마토그래피(AEX)에 의해서 추정되었다. TSAC는 펄스트-암페로메트릭 검출법(HPAE-PAD)을 사용한 고-성능 음이온 교환 크로마토그래피에 의해서 정량분석되었다. 중성 글리칸 종의 검출은 기질 보조 레이저 탈착/이온화 - 비행 시간(MALDI-TOF) 질량 분광분석법에 의해서 수행하였다. 부피 활성은 파라나이트로페닐포스페이트(pNPP)-기반 알칼린 포스파타제 효소 검정법에 따라서 측정되었다.
통계학적 분석 및 데이터 시각화
생산성 및 각각의 품질 속성에 영향을 주는 시험된 공정 파라미터의 가능성을 통계 소프트웨어 패키지 JMP(미국 노쓰 캐롤라이나주 캐리 소재)를 사용하여 평가하였다. 3개의 연속적인 파라미터(2개의 시험된 공정 파라미터 각각에 대한 3가지 수준, 및 수확을 위한 2가지 수준)를 분석하였다. 2측 t-시험(two sided t-test)에 의해서 계산된 개별 p-값을 보고하였고, 0.05를 유의 역치로서 선택하였다. JMP에 의해서 생성된 윤곽 플롯을 사용하여 각각의 품질 속성에 대한 시험된 파라미터의 잠재적인 영향을 시각화하였다.
결과
본 예시적인 방법에서 각각의 CQA에 대한 허용 가능한 범위가 여전히 조사 중이기 때문에, 예시적인 실험 범위가 생성되어 비교 목적을 위해서 사용되었다(표 9). 데이터 소스는 본 연구에서 수득된 10일 결과 모두로부터 생성되었다. SEC에 의한 단편 및 응집물 및 염기성 및 AEX에 의한 산성 피크를 비롯한 불순물 측정의 경우, 평균값 + 표준 편차의 2배를 상한 역치로서 사용하였다. SEC에 의해서 측정된 단편에 대한 상한 역치 계산치 및 AEX에 의해서 측정된 염기성 피크 계산치가 SEC 및 AEX 검정법의 LoQ(1%)보다 낮기 때문에, 상한 역치를 두 속성 모두에 대해서 1%인 것으로 설정하였다. TSAC의 경우, 평균값 -/+ 표준 편차의 2배를 실험 범위로서 사용하였다.
각각의 CQA에 대한 각각의 공정 파라미터의 직접적인 영향의 유의성이 표 10에 요약되어 있다. P/V 및 분사 VVM 영향의 p-값은 통계적 검증력의 부족으로 인해서 계산하지 않았다. 0.05 이하의 p-값은 통계적으로 유의한 것으로서 간주된다.
표 11은 시험된 공정 파라미터 수준 최소값 및 최대값에서 수득된 평균 품질 속성 값을 요약한다. 예를 들어, 글루코스 및 갈락토스 첨가 연구에서, 3개의 생물반응기는 글루코스 첨가 역치로서 1.5g/L를 사용하였고, 이들 각각은 상이한 갈락토스 첨가 수준을 가졌다. 이어서, 이들 3개의 생물반응기로부터의 평균값을 사용하여 1.5g/L의 글루코스 역치 조건에서 CQA 값을 계산하였다. 하기 부분에서, 달리 언급되지 않는 한 10일 데이터를 품질 논의를 위해서 사용하였다.
1. pH
이전 결과는 생산된 아스포타제 알파의 TSAC가 pH에 영향을 받는다는 것을 나타내었다. 아스포타제 알파 생산성 및 품질에 대한 배양 pH 및 생산 온도를 2L 생물반응기에서 추가로 조사하였다. 3종의 배양 pH 수준(6.75, 6.90, 및 7.10) 및 3종의 생산 온도 수준(30.0℃, 33.0℃, 및 35.0℃)을 포함하는 완전 요인 배치법을 실시하였고, 모든 조건으로부터의 샘플을 각각 240 ± 4시간, 및 264 ± 4시간에 수확하였다. 2-단계 정제(단백질 A + HIC)를 분석적 분석법 전에 적용하였다.
시험된 범위 6.75 내지 7.10에서의 배양 pH 설정값은, 시험된 모든 CQA가 표 9에 명시된 소규모 실험 범위 내에 있다는 점에서 중요 공정 파라미터(CPP)로 간주되지 않았다. 그러나, pH는 몇몇 시험된 품질 속성에 상당히 영향을 주는 것으로 나타났다. pH 설정값을 6.75에서 7.10으로 상승시키면 33℃의 제어 생산 온도 이동 후에 TSAC가 1.9에서 2.7로 증가되었다(도 10a). pH는 또한 SEC에 의해서 측정되는 단편화 및 AEX에 의해서 측정되는 염기성 피크에 상당한 영향을 가졌지만(표 10), 그 영향은 0.5%의 HPLC-기반 검정법 편차 미만인 0.2% 이하였다(표 11). 추가로, 대조군 조건(pH 6.90 및 생산 온도 33.0℃) 하에서, 단백질 A 역가 및 부피 활성 둘 모두와 관련하여 최고 생산성이 달성되었다(도 10B 및 10C).
이 데이터는 CQA에 대한 6.75 내지 7.10 범위의 pH 설정값의 영향이 모두 실험 범위 이내였다는 것을 나타내었고, 이는 생산 배양 pH는 CPP일 가능성이 낮다는 것을 제안한다. 다양한 실시형태에서, 알칼린 포스파타제(예를 들어, 아스포타제 알파)는 6.65, 6.70, 6.75, 6.80, 6.85, 6.90, 6.95, 7.00, 7.05, 7.10, 7.15, 7.2, 또는 그 초과의 pH 설정값에서 생산된다.
2. 온도
이전의 결과는, 온도가 응집, 단편화 및 TSAC를 비롯한 몇몇 파라미터에 대한 영향을 가짐을 나타내었다. 이전 방법은 120시간에 36.5℃에서 33.0℃로의 온도를 사용하기 때문에, 온도 영향의 조사는 하기 3개의 파라미터로 분석되었다: 성장 온도(0 내지 120시간), 생산 온도(수확까지 120시간), 및 온도 이동 시기. 이들 3개의 온도-관련된 파라미터를 별개로 추가로 조사하였고, 하기에 요약하였다.
2.1 성장 온도
성장 온도의 영향을 2L 생물반응기에서 DO 설정값과 함께 조사하였다. 성장 온도의 3개의 수준(35.0℃, 36.5℃ 및 37.5℃)을 상이한 시험 조건 하에서 0 내지 120시간 유지시키고, 그 다음 120시간에 33.0℃로 온도 이동시켰다. 모든 조건으로부터의 샘플을 240 ± 4시간, 및 264 ± 4시간에 수확하였다. 1-단계 정제(단백질 A)를 분석적 분석법 전에 적용하였다. 성장 온도는 성장률 및 생존력에 영향을 미쳤다. 초기 단계에서 더 높은 성장 온도는 더 빠른 성장률과 상관관계가 있었고, 그 다음 신속한 성장률은 온도 이동 후 감소하는데, 이는 더 낮은 피크 VCD를 생성한다. 또한, 더 높은 성장 온도를 사용한 배양은 또한 수확일에 2 내지 4%의 낮은 최종 생존력을 가졌다. 흥미롭게도, 성장 온도는 생산성에 상당히 영향을 미치며, 부피 활성은 36.5℃의 성장 온도에서 피크 값을 달성하였다(도 11A).
아스포타제 알파 품질에 대한 영향에 대해서, 성장 온도는 SEC에 의해서 측정되는 바와 같이 단편화에만 상당한 영향을 갖는 것으로 나타났다(도 11B). 35.0℃에서 37.5℃로의 성장 온도 증가는 단편 수준을 0.3%에서 0.8%로 상승시켰다. 이들 측정된 값은 모두 SEC 검정법의 LoQ(1%)보다 낮았다.
성장 온도에 의한 CQA에 대한 영향은 모두 실험 범위 이내이기 때문에(표 9 및 표 11), 35.0℃ 내지 37.5℃ 범위의 성장 온도는 CPP일 가능성이 낮다. 다양한 실시형태에서, 알칼린 포스파타제(예를 들어, 아스포타제 알파)는 33.0℃, 33.5℃, 34.0℃, 34.5℃, 35.0℃, 35.5℃, 36.0℃, 36.5℃, 37.0℃, 37.5℃, 38.0℃, 또는 38.5℃의 성장 온도에서 생산된다. 특정 일 실시형태에서, 알칼린 포스파타제(예를 들어, 아스포타제 알파)는 35.0℃, 36.5℃, 37.0℃ 또는 37.5℃의 성장 온도에서 생산된다.
2.2 생산 온도
CQA에 대한 생산 온도(30.0℃, 33.0℃, 및 35.0℃)의 영향을 2L 생물반응기에서 배양 pH 설정값과 함께 조사하였다. 1-단계 정제(단백질 A)를 분석적 분석법 전에 적용하였다.
생산 온도는 CQA, 특히 TSAC, 응집 및 SEC에 측정되는 바와 같은 단편화, 및 AEX에 의해서 측정되는 산성 피크에 상당히 영향을 미쳤다(표 10 및 표 11). 생산 온도를 30.0℃에서 35.0℃로 상승시키면 TSAC가 1.6에서 2.7로 증가되는 반면(도 10A), 생산 온도를 35.0℃에서 30.0℃로 낮추면 SEC에 의해서 측정되는 바와 같이 응집물이 3.8%에서 8.2%로 증가되었다(도 12A). 또한, AEX에 의해서 측정되는 산성 피크는 생산 온도를 낮추면서 3.7%에서 8.5%로 증가되었다(도 12B). 이러한 데이터는 30.0℃보다 더 높은 생산 온도가 아마도 낮은 TSAC의 위험을 감소시키는데 이롭고, 증가된 응집/산성 피크를 예방한다는 것을 제안하였다. 한편, 생산 온도와 SEC에 의해서 측정되는 바와 같은 단편화(도 12C), 및 AEX에 의해서 측정된 염기성 피크(도 12D) 간에는 매우 미미한 양의 상관관계가 있는 것으로 보인다. 이러한 데이터는, 35℃보다 더 낮은 생산 온도가 아스포타제 알파 단편화의 위험을 감소시키는 데 바람직할 수 있음을 제안하였다.
생산성에 대한 영향과 관련하여, 생산 온도가 단백질 A 역가 및 부피 활성에 최대의 영향을 갖는 것으로 보인다(도 10B 및 10C). 30.0℃ 내지 35.0℃의 범위에서, 생산 온도의 증가는 생산성 증가와 상관관계가 있다. 그러나, pH 7.10 미만에서, 생산 온도는 pH와 상호작용하여 생산성에 영향을 주는데, 최고 부피 생산성은 33.0℃의 생산 온도에서 일어난다. 부피 활성 및 단백질 A 역가와 관련하여 피크 생산성은 33.0℃ 이상인 생산 온도 하에서 pH 6.90에서 관찰되었다. 생산 온도는 몇몇 CQA에 상당한 영향을 갖는 것으로 나타났지만(표 10), 그 영향은 여전히 실험 범위 이내였다(표 9 및 표 11). 따라서, 30.0℃ 내지 35.0℃ 범위의 생산 온도는 CPP인 가능성이 낮다.
다양한 실시형태에서, 알칼린 포스파타제(예를 들어, 아스포타제 알파)는 29.0℃, 29.5℃, 30.0℃, 30.5℃, 31.0℃, 31.5℃, 32.0℃, 32.5℃, 33.0℃, 33.5℃, 34.0℃, 34.5℃, 35.0℃, 35.5℃, 36℃, 또는 더 높은 온도의 생산 온도에서 생산된다. 특정 일 실시형태에서, 알칼린 포스파타제(예를 들어, 아스포타제 알파)는 30.0℃, 30.5℃, 또는 35.0℃의 생산 온도에서 생산된다.
3. 온도 이동 시기
CQA에 대한 온도 이동 시기의 영향을 2L 생물반응기에서 시딩 밀도와 함께 조사하였다. 3개의 온도 이동 시간(108시간, 120시간 및 132시간)을 시험하였고, 모든 조건으로부터의 샘플을 240 ± 4시간 및 264 ± 4시간에 수확하였다. 1-단계 정제(단백질 A)를 분석적 분석법 전에 적용하였다.
온도 이동 시기는 부피 활성에 미미한 영향을 갖는다(도 13A). 높은 시딩 밀도에서, 온도 이동 시기를 108시간에서 132시간으로 연기하는 것은 부피 활성을 감소시키는 것으로 보인다. 그러나, 더 낮은 시딩 밀도에서, 최대 부피 활성은 후자 온도 이동 조건 하에서 관찰된다.
아스포타제 알파 품질과 관련하여, 온도 이동 시기는 SEC에 의해서 측정되는 바와 같이 단편화에만 상당한 영향을 미치는 것으로 나타났다(도 13B). 가장 늦은 온도 이동 조건(132시간) 하에서, 평균 단편 수준은 0.8%였고, 이는 단편화에 대한 소규모 실험 범위와 유사하였다(< 1.0%). 따라서, 더 좁은 온도 이동 시간은 아마도 단편화의 위험을 감소시키기에 이롭다.
온도 이동 시기에 의한 CQA에 대한 영향은 모두 실험 범위 이내이기 때문에(표 9 및 표 11), 108시간 내지 132시간 범위의 온도 이동 시기는 CPP일 가능성이 낮다.
다양한 실시형태에서, 알칼린 포스파타제(예를 들어, 아스포타제 알파)는 온도 이동이 성장 시작점(예를 들어, 접종) 약 100시간, 105시간, 108시간, 110시간, 115시간, 120시간, 125시간, 130시간, 132시간, 135시간, 140시간, 145시간, 또는 150시간 후에 일어나는 방법에 의해서 생산된다. 특정 일 실시형태에서, 알칼린 포스파타제(예를 들어, 아스포타제 알파)는 온도 이동이 약 108시간, 120시간 또는 132시간에 일어나는 방법에 의해서 생산된다. 다양한 실시형태에서, 알칼린 포스파타제(예를 들어, 아스포타제 알파)는 약 200시간, 210시간, 220시간, 230시간, 240시간, 250시간, 260시간, 264시간, 270시간, 280시간, 288시간(즉, 12일)의 시간 지점, 또는 12일 초과의 시간 지점에 수확된다. 특정 일 실시형태에서, 알칼린 포스파타제(예를 들어, 아스포타제 알파)는 약 240, 264, 또는 288시간의 시간 지점에 수확된다.
4. 배지 공급물
이전 결과는 배지 공급물 첨가가 시알릴화에 영향을 미친다는 것을 나타내었다. 이러한 예시적인 방법에 대한 대조군으로서, 배지의 3개의 볼러스를 4일, 6일, 및 8일에 생산 생물반응기에 첨가하였고, 총량은 초기 배양 부피의 8%(v/v)에 동등하였다. 볼러스의 수를 변화시키지 않으면서, 3개의 공급량을 시험하였다: 67%, 100%(대조군), 및 133%. 볼러스 첨가 시기와 관련하여, 3개의 전략이 조사되었다: (1) 3일, 5일, 및 7일; (2) 4일, 6일, 및 8일(대조군); (3) 5일, 7일, 및 9일. 모든 생물반응기는 2L 생물반응기에서 수행되었고, 모든 조건으로부터의 샘플을 240 ± 4시간, 및 264 ± 4시간에 수확하였다. 1-단계 정제(단백질 A)를 분석적 분석법 전에 적용하였다.
배지 공급량 및 시작 시기는 생산성에 직접적으로 영향을 미치지 않았지만, 이들의 상호작용은 부피 활성에 미미한 영향을 갖는 것 같았다(도 14A). 대조군 조건 하에서, 최대 부피 활성이 달성되었다. 33% 더 적은 공급물이 제공된 경우, 공급 개시를 늦추면 더 낮은 부피 활성을 유발하였다.
더 많고(133%) 더 조기(3일에 제1 볼러스) 공급 조건 하에서 관찰된 증가된 산성 피크(10.1%) 및 응집(9.5%)은 소규모 실험 범위(산성 피크의 경우 10.2%, 및 응집의 경우 9.6%, 표 9)에 유사하며, 이는 적어도 하나의 파리미터가 규모에서 더 엄격하게 제어될 필요가 있음을 나타낸다(예를 들어, 볼러스당 배지 공급량 15% 변동 및/또는 비교적 짧은 첨가 시간 윈도우(96 ± 3시간, 144 ± 3시간, 및 192 ± 3시간)). 배지 공급물 첨가에 의한 CQA에 대한 영향은 모두 실험 범위 이내이기 때문에(표 9 및 표 11), 67% 내지 133% 범위의 배지 공급량 및 공급 시기(96 ± 24시간, 144 ± 24시간, 및 192 ± 24시간)는 CPP일 가능성이 낮다.
다양한 실시형태에서, 알칼린 포스파타제(예를 들어, 아스포타제 알파)는 배양 배지의 추가 볼러스가 생산 생물 반응기에 첨가되는 공정에 의해서 생산된다. 예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 그 초과의 배양 배지의 볼러스가 첨가될 수 있다. 특정 일 실시형태에서, 배양 배지의 3개의 볼러스가 첨가된다. 다양한 실시형태에서, 배양 배지의 이러한 추가의 볼러스는 다양한 양으로 첨가될 수 있다. 예를 들어, 배양 배지의 이러한 볼러스는 생산 생물반응기 중의 배양 배지의 본래 부피의 약 20%, 25%, 30%, 33%, 40%, 45%, 50%, 60%, 67%, 70%, 75%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 125%, 130%, 133%, 140%, 150%, 160%, 167%, 170%, 175%, 180%, 190%, 200%, 또는 그 초과의 양으로 첨가될 수 있다. 특정 일 실시형태에서, 배양 배지의 이러한 볼러스는 본래 부피의 약 33%, 67%, 100%, 또는 133%의 양으로 첨가될 수 있다. 다양한 실시형태에서, 추가의 볼러스의 이러한 첨가는 세포 성장 또는 단백질 생산 기간 동안 다양한 시기에 일어날 수 있다. 예를 들어, 볼러스는 방법에서 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일에, 또는 더 나중에 첨가될 수 있다. 특정 일 실시형태에서, 배양 배지의 이러한 볼러스는 격일로(예를 들어, (1) 3일, 5일, 및 7일; (2) 4일, 6일, 및 8일; 또는 (3) 5일, 7일, 및 9일) 첨가될 수 있다. 실제로, 배양 배지의 볼러스 보충의 빈도, 양, 시간 지점, 및 다른 파라미터는 상기 제한에 따라서 자유롭게 조합되어, 실험 실시에 의해서 결정될 수 있다.
5. 시딩 밀도
본 연구에서, CQA에 대한 시딩 밀도의 영향을 2L 생물반응기에서 온도 이동 시기와 함께 조사하였다. 3개의 시딩 밀도(4.0 x 105세포/㎖, 5.5 x 105세포/㎖ 및 8.0 x 105세포/㎖)를 시험하였고, 모든 조건으로부터의 샘플을 240 ± 4시간, 및 264 ± 4시간에 수확하였다. 1-단계 정제(단백질 A)를 분석적 분석법 전에 적용하였다.
온도 이동 시기는 생산성에 매우 강한 영향을 갖는다. 도 13A에 도시된 바와 같이, 시딩 밀도를 4.0 x 105세포/㎖에서 8.0 x 105세포/㎖로 증가시키면 부피 활성이 평균 806U/㎖에서 1012U/㎖로 증가된다.
아스포타제 알파 품질과 관련하여, 시딩 밀도는 SEC에 의해서 측정되는 바와 같이 단편화에만 상당한 영향을 미치는 것으로 나타났다(도 13B). 최고 시딩 밀도 조건(8.0 x 105세포/㎖) 하에서, 평균 단편 수준은 0.8%였고, 이는 단편화에 대한 소규모 실험 범위와 유사하였다(< 1.0%). 따라서, 더 엄격한 시딩 밀도는 규모에서 단편 생성의 위험을 감소시키기 위해서 이로울 수 있다.
시딩 밀도에 의한 CQA에 대한 영향은 실험 범위 이내이기 때문에(표 9 및 표 11), 4.0 x 105세포/㎖ 내지 8.0 x 105세포/㎖ 범위의 시딩 밀도는 CPP일 가능성이 낮다. 다양한 실시형태에서, 알칼린 포스파타제(예를 들어, 아스포타제 알파)는 세포가 약 1.0 x 105세포/㎖, 1.5 x 105세포/㎖, 2.0 x 105세포/㎖, 2.5 x 105세포/㎖, 3.0 x 105세포/㎖, 3.5 x 105세포/㎖, 4.0 x 105세포/㎖, 4.5 x 105세포/㎖, 5.0 x 105세포/㎖, 5.5 x 105세포/㎖, 6.0 x 105세포/㎖, 6.5 x 105세포/㎖, 7.0 x 105세포/㎖, 7.5 x 105세포/㎖, 8.0 x 105세포/㎖, 8.5 x 105세포/㎖, 9.0 x 105세포/㎖, 9.5 x 105세포/㎖, 1.0 x 106세포/㎖, 1.5 x 106세포/㎖, 2.0 x 106세포/㎖의 밀도, 또는 더 높은 밀도로 시딩되는 방법에 의해서 생산된다. 특정 일 실시형태에서, 이러한 방법에서 세포는 약 4.0 x 105세포/㎖, 5.5 x 105세포/㎖ 또는 8.0 x 105세포/㎖의 밀도로 시딩된다.
6. 수확 시기
상기 데이터는, 수확 시기를 늦추는 것이 생존력 및 TSAC 감소와 연관이 있고, 따라서 수확 시기는 다른 CQA에 대해서 잠재적인 영향을 가질 수 있다는 것을 나타내었다. 모든 방법 특징 규명 연구에서, 샘플을 모든 생물반응기로부터 10일(240 ± 4시간) 및 11일(264 ± 4시간)로부터 수확하였다. 10개의 2L 생물반응기가 방법 특징 규명 연구의 다수의 블록으로 대조군 조건으로서 작용하였다. 모두 현재 공정 파라미터 설정과 동일한 조건 하에서 수행되었기 때문에, 이것은 아스포타제 알파 생산성 및 품질에 대한 수확 시기의 조사를 허용하였다. 이들 10개의 2L 생물반응기로부터의 분석 결과를 표 12에 열거한다. 2개의 생물반응기(#18 및 #19)로부터의 샘플을 2-단계 정제(단백질 A + HIC)에 의해서 정제한 반면, 나머지 8개의 생물반응기(#10 내지 #17)로부터의 것은 단지 단백질 A에 의해서 정제하였다는 것이 주목된다. HIC는 TSAC에 영향을 주지 않으면서 샘플 순도를 증가시킬 수 있다는 것을 주목해야 한다.
각각의 개별 연구에서, 수확 시기는 통계학적 분석을 위한 제3 파라미터로서 처리되었다. 각각의 개별 연구에서 나타난 바와 같이, 수확을 10일에서 11일로 연기하면 단백질 A 역가 및 부피 활성이 대략 10 내지 15% 증가되었다.
모든 5개의 개별 연구에서 TSAC에 대한 수확 시기의 상당한 영향이 관찰되었다. 수확을 1을 연장하면 TSAC가 단백질 몰당 대략 0.3 내지 0.4몰 시알산만큼 낮아지지만, 두 조건 모두에 대해서 TSAC는 표 9에 명시된 바와 같이 소규모 실험 범위(1.5 내지 2.9) 내에 존재하였다. TSAC에 대한 수확 시기의 상당한 영향으로 인해서, 조기 수확을 수행하여 TSAC를 증가시킬 수 있었다.
SEC에 의해서 측정되는 바와 같은 응집, 및 AEX에 의해서 측정되는 바와 같은 산성 피크에 대해서, 수확 시기는 5개의 연구 중 3개에서 통계학적으로 유의한 영향을 가짐을 나타내었다(표 13).
그러나, CQA에 대한 영향의 크기는 각각의 개별 연구에서 대조군 조건과 비교할 때 1% 미만으로 미미하였다. 또한, 모든 값은 표 9에 명시된 소규모 실험 범위에 포함되었다(응집물의 경우 9.6% 이하 및 산성 피크의 경우 10.2% 이하).
단편 수준은 5개의 연구 중 하나에서 수확 시기에 영향을 받았다(표 13에 나타낸 바와 같음). 그러나, 수확을 1일 늦추는 것은 2개의 대조군 조건 하에서 단편을 단지 0.1 내지 0.2% 상승시켰고, 11일에 단편 수준은 여전히 SEC 검정법 LoQ(1%)보다 여전히 낮았다. 유사하게, 염기성 피크 수준은 10일에 0.2 내지 0.3%에서 11일에 0.4%로 상승되었고, p-값은 0.03이었다(표 13). 그러나, 두 값 모두는 여전히 AEX 검정법의 LoQ(1%)보다 여전히 훨씬 더 낮았다. 따라서, 10일(240 ± 4시간) 내지 11일(264 ± 4시간) 범위의 수확 시기는 CPP일 가능성이 낮다.
결론
본 연구에서 시험된 공정 파라미터는 배양 pH 설정값, 온도, 시딩 밀도, 배지 공급량 및 시기, 글루코스 첨가, 갈락토스 첨가, 및 수확 시기를 포함한다. 표 14는 각각의 사용된 공정 파라미터를 요약한다.
실시예 5. 예시적인 방법 #4에 대한 아스포타제 알파 품질 속성에 대한 pH 및 생산 온도의 영향의 더 자세한 조사
이전 평가에 추가로, 본 연구는 예시적인 제조 방법에서 아스포타제 알파 생산성 및 품질 속성에 대한 배양 pH 및 생산 온도(120시간 이상)의 더 자세한 조사를 제공한다. 시험된 시나리오는 하기를 포함한다: 1) 상이한 pH 수준(즉, 6.70, 6.80, 6.90, 7.00, 및 7.10) 및 33.0℃의 동일한 생산 온도; 및 2) 상이한 생산 온도 수준(즉, 31.0℃, 32.0℃, 33.0℃, 34.0℃, 및 35.0℃) 및 6.90의 동일한 pH 설정값. 모든 조건으로부터의 샘플을 240 ± 4시간에 수확하였고, 단백질 A-정제된 물질을 몇몇 품질 속성(예를 들어, %단편화, % 응집, 전하 분포, 총 시알산 함량(TSAC), 및 중성 글리칸 포함률에 대해서 시험하였다. 본 연구는, 방법이 6.70 내지 7.10 범위의 pH 설정값, 및 및 31.0℃ 내지 35.0℃ 범위의 생산 온도에서 수행되었음을 확인하였고, 모든 CQA를 유지하였다.
세포 배양
본 연구에서 수행된 모든 실험은 모비우스(Mobius) 3L 일회용 생물반응기(CR0003L200; 이엠디 밀리포어(EMD Millipore))를 사용하였다. 본 연구에서 사용된 공정 파라미터의 목록을 표 15에 제시한다. 추가로, 4개의 추가 배양 pH 조건을 제어 생산 온도(33.0℃)를 사용하여 조사하였고, 4개의 추가 온도를 대조군 배양 pH(6.90)를 사용하여 조사하였다(표 16).
비셀 브이알을 사용하여 세포 밀도 및 생존력을 계수하였다. pHOx를 사용하여 pH 및 오프-라인 기체를 측정하였고, 글루코스 및 락테이트를 비롯한, 주요 대사산물을 노바 프로파일 100(노바 바이오메디컬, 미국 매사추세스주 월섬 소재)을 사용하여 측정하였다. 효소 활성 측정 전에, 3회 희석하는 대신에, 각각의 샘플을 한번만 희석함으로써 변형된 표준 방법을 사용하여 효소 활성을 측정하였다.
수확 및 정제
50마이크로리터의 10일(240 ± 4시간) 샘플을 주사기를 사용하여 모든 생물반응기로부터 수확하였다. 원심분리(3000 x g, 5분)에 의해서 세포를 제거한 후, 0.22μM 바틀-탑 필터(bottle-top filter)를 사용하여 상청액을 정화하고, 정제 전에 -80℃에서 저장하였다. 단일 단계의 고 처리량 플레이트-기반 정제(단백질 A)를 본 연구에서 적용하였다. 분석 및 단백질 특징 분석법 이전에 샘플을 저염 완충제(5mM Na3PO4, pH 7.4)로 완충제 교환시켰다.
분석 및 단백질 특징 규명
본 연구에서 분석된 중요 품질 속성은 %응집물, %단편, 전하 분포, TSAC, 및 중성 글리칸 분포를 포함하였다. 응집물 수준을 SEC에서 정량분석된 총 단백질에 대한 응집물 피크의 백분율에 의해서 추정하였다. 단편 수준을 SEC, 뿐만 아니라 LoC에서 정량분석된 총 단백질에 대한 단편의 백분율에 의해서 추정하였다. 전하 분포를 AEX에 의한 각각 정량 분석된 총 단백질 피크에 대한 염기성 피크, 주 피크 및 산 피크의 백분율에 의해서 추정하였다. 시알릴화 수준(또는 TSAC)을 HPAE-PAD에 의해서 정량분석하였다. 중성 글리칸 종의 검출은 MALDI-TOF 질량 분광분석법에 의해서 수행하였다. 등전점 맞춤을 iCE280 시스템을 사용하여 수행하였다.
결과
세포 배양 성능
주목된 바와 같이, 배양 pH 및 생산 온도 둘 모두는 세포 배양 성능에 대해서 영향을 갖는다. 낮은 pH 조건(pH = 6.70)은 가장 낮은 성장률 및 가장 낮은 최대 VCD를 유발하였는데, 이는 수확일(10일)에 11.1 x 106세포/㎖(도 15A)의 최대 밀도에 도달하였다. 더 높은 pH 조건(pH = 7.00 및 7.10)은 10일에 다른 조건보다 1 내지 2% 더 낮은 생존력을 유발하였다(도 15B).
더 높은 생산 온도는 또한 증가된 성장(도 16A) 및 배양 마지막에서의 생존력의 보다 신속한 감소와 연관되었다(도 16B). 더 낮은 생산 온도는 더 낮은 피크 VCD를 생성하였지만, 33.0℃의 대조군 설정값에 대등한 생존력을 생성하였다.
배양 pH의 증가는 또한 글루코스의 훨씬 더 신속한 소모를 유발하였고(도 17A), 배양의 초기 단계 동안(온도 이동 전) 락테이트의 더 많은 생산 및 배양 기간 전체에서 락테이트의 더 많은 전체 축적 둘 모두를 유발하였다(도 17B).
성장 온도에서 생산 온도로 이동시키기 전에 배양 세포를 5일(120시간) 동안 성장시켰다. 글루코스 및 락테이트 프로파일 둘 모두는 0일 내지 5일에 매우 일정하였다(도 18A 및 도 18B). 온도 이동 후, 더 높은 생산 온도는 글루코스의 더 높은 소모와 연관되었다. 다른 조건과 비교할 때 락테이트의 최대 농도의 약간의 감소가 33.0℃ 생산 온도 조건에 대해서 관찰되었다. 추가로, 35.0℃ 생산 온도는 모든 다른 조건과 비교할 때, 9일 및 10일 동안 상당히 감소된 락테이트 소모를 나타내었다.
생산 온도는 30.0℃ 내지 35.0℃의 생산 온도 범위 및 6.75 내지 7.10의 배양 pH에 대한 단백질 A 역가 및 비활성도에 대해서 배양 pH보다 더 극적인 효과를 가졌음이 이미 관찰되었다. 그러나, 본 연구에서 낮은 pH 조건(6.70)은 단백질 A 역가에 대해서 극적인 영향을 가졌고, 이는 대조군 조건(pH = 6.90)(도 19A)과 비교할 때 35% 감소를 생성하고, 모든 다른 조사된 pH 조건과 비교할 때 훨씬 더 낮은 부피 활성을 생성한 것으로 나타났다(도 19B). 배양 pH는 특이적 단백질 A 생산성에 영향을 갖지 않는 것으로 나타났다(도 19C). 그러나, 낮은 pH 조건은 최고의 비활성도를 생성하였고(도 19D), 배양 pH 감소와 비활성도 증가 간의 일반적인 경향성이 관찰되었다.
낮은 생산 온도 조건(31.0℃ 및 32.0℃)은 대조군 조건과 비교할 때, 단백질 A 역가의 큰 감소를 유발하였다(26% 및 21%)(도 20A). 추가로, 생산 온도 증가는 더 높은 부피 활성(도 20B) 및 약간 증가된 특이적 단백질 A 생산성(도 20C)과 연관되었다. 생산 온도 변화는 비활성도에 대해서 어떤 영향도 없었다(도 20D).
본 연구로부터의 모든 품질 속성 및 배양 pH 및 생산 온도의 영향을 조사하는 이전의 작업을 표 17에 요약한다.
이전의 연구에서와 같이, TSAC는 배양 pH 및 생산 온도 둘 모두에 의해서 영향을 받았다(도 21). TSAC에 대한 소규모 실험 범위는 1.5 내지 2.9였고, 더 높은 TSAC가 이 범위 내에서 보다 바람직하였다. 배양 pH 또는 생산 온도의 증가는 생성물의 TSAC를 증가시키는 것으로 나타났다. 한편, pH 설정값을 6.70에서 7.10으로 증가시키면 TSAC가 대략 1.5에서 2.6 내지 2.8로 증가되었는데, 이는 소규모 실험 범위 내였다. 다른 한편, 생산 온도를 30.0℃에서 35.0℃로 증가시키면 TSAC가 대략 1.4에서 2.6 내지 2.8로 증가되었다. 30.0℃의 생산 온도 하에서의 TSAC 값(1.4)은 소규모 실험 범위의 하한(1.5)보다 더 낮기 때문에, 30.0℃의 생산 온도는 생산 생물반응기에서 아마도 회피되어야 한다. 이러한 데이터는 배양 pH 또는 생산 온도, 또는 둘 모두를 증가시킴으로써 TSAC가 증가될 수 있음을 나타낸다.
AEX를 사용하여 산성 피크 백분율에 의해서 현재 측정되는 바와 같은, 불순물 수준은 도 22에 제시되어 있다. 생산 온도 증가는 생성물 중에서 산성 피크 백분율을 감소시켰다. 배양 pH는 AEX 산성 피크에 의해서 측정되는 불순물과 어떤 상관관계도 없는 것으로 나타났다. 생산 온도가 AEX 산성 피크 백분율에 대한 영향을 나타내었지만, 모든 값은 순도에 대한 허용 가능한 한계치 이내였다(≤10.2%). 조사된 모든 조건에 대해서, AEX 염기성 피크는 일관되게 검정법에 대한 LoQ인 1% 미만이었다.
이전 연구는 SEC에 의해서 측정된 바와 같이 AEX 산성 피크와 응집물 백분율 간에 강한 상관관계를 나타내었다. 이러한 경향성은 도 23에 도시된 바와 같이, 본 연구에 대해서 유지되었다. 더 높은 생산 온도는 더 낮은 응집물 백분율로 이어졌다. 모든 응집물 백분율은 소규모 실험 범위 이내였다(≤ 9.6%). 배양 pH는 응집물 백분율에 대해서 강한 효과를 갖지 않았다. 모든 조건에 대해서, SEC에 측정된 바와 같은 아스포타제 알파 단편은 검정법에 대한 LoQ인 1% 미만이었다.
LoC에 의해서 측정된 주 피크 백분율은 이미 생산 온도에 의해서 상당히 영향을 받는 것으로 식별되었다. 생산 온도 증가와 비-환원 주 피크 백분율 증가 간의 양의 상관관계가 발견되었다(도 24B). LoC 주 피크 백분율(비-환원됨)에 대한 배양 pH의 명확한 영향은 관찰되지 않았다(도 24A). 감소된 LoC 분석은 모든 조건에 대해서 100% 주 피크를 식별하였다.
실시예 2의 예시적인 방법에 기술된 BDS 물질과 비교할 때, 어떤 조건에 대해서도 새로운 중성 종이 관찰되지 않았다. 그러나, 프로파일 이동이 낮은 pH 조건과 더 높은 pH 조건 사이에서 인지되었고, 여기서 더 높은 배양 pH에서 생산된 물질로부터 보다 고차수의 글리코폼이 관찰되었다(도 25). 유사한 경향성이 생산 온도에 대해서 관찰되었는데, 보다 고차수의 글리코폼이 더 높은 생산 온도(34.0℃ 및 35.0℃)에서 생산된 물질 중에 존재하였다(도 26).
iCE280 크로마토그램으로부터의 피크 결정은 가장 기본적인 피크를 피크 6으로서 식별하고, 다음 4개의 피크를 역순으로 피크 5에서 피크 2로 식별함으로써 수행되었다. 이어서 피크 1은 피크 2 이후에 다음 피크의 pI보다 낮게 식별된 모든 피크 백분율로 이루어졌다. 식별된 피크에 대한 결과적인 pI 값을 표 18에 열거한다. 배양 배지 pH 및 생산 온도 둘 모두는 모세관 등전점 맞춤 결과에 영향을 갖는 것으로 보인다(도 27). 배양 pH 또는 생산 온도의 증가는 피크 1로서 식별된, 낮은 pI 피크의 백분율 증가를 생성하였다. 추가로, 높은 pI 피크, 피크 5 및 피크 6의 관련된 백분율은 배양 pH 또는 생산 온도 증가에 따라서 감소되었다. 이들 인자는 pH 또는 생산 온도 증가와 연관된 보다 산성인 종으로의 일반적인 이동을 나타내었다. 이러한 이동은 pH 및 생산 온도 증가 둘 모두와 연관된 시알릴화의 증가에 관련될 수 있고, 이는 더 높은 백분율의 산성 종을 생성할 것이다.
결론
본 연구는, 측정된 CQA가 모두 이전에 명시된 바와 같은 소규모 범위 이내라는 점에서 배양 pH(6.70 내지 7.10) 및 생산 온도(31.0 내지 35.0℃)가 CPP일 가능성이 낮다는 것을 나타내는 이전 결과를 확인한다. 배양 pH 및 생산 온도 둘 모두는 많은 세포 배양 성능 파라미터 및 품질 속성에 대해서 영향을 갖는다. 특히, 배양 pH 또는 생산 온도의 증가는 최대 VCD의 증가로 이어지지만, 또한 이것은 배양의 후기 단계에 생존력의 급격한 감소를 유발한다.
배양 pH 및 생산 온도 둘 모두는 단백질 A 역가 및 부피 활성과 관련하여 생산성에 영향을 줄 수 있다. 6.70의 배양 pH는 더 낮은 단백질 A 역가 및 부피 활성을 유발하였다. 배양 pH 설정값의 증가는 비활성도를 감소시켰다. 따라서, 배양 pH는 단백질 A 역가에 대해서 긍정적인 영향을 갖지만, 6.80 내지 7.10 범위의 pH 하에서 부피 활성과 관련하여 차이점이 거의 없었다. 또한, 생산 온도의 증가는 단백질 A 역가 증가 및 부피 활성 증가로 이어졌지만, 비활성도에 영향을 미치지 않았다.
배양 pH 또는 생산 온도의 증가는 또한 더 높은 TSAC 값으로 이어졌다. 후자 파라미터의 증가는 또한 응집물 및 산성 피크 형성을 감소시켰다. 마지막으로, 배양 pH 및 생산 온도 둘 모두는 생성물의 등전점 맞춤 프로파일을 이동시키는 것으로 보인다. 이들 결과는, 6.70 내지 7.10 범위의 pH 및 31.0℃ 내지 35.0℃ 범위의 생산 온도가 허용 가능하며, 규모 확대(예를 들어, 10,000L 규모 확대 공정)에서 공정 견고성 및 일관성을 유지하기 위해서는 두 공정 파라미터 모두의 엄격한 제어가 제안됨을 나타낸다.
실시예 6. 추가 공급물 보충에 의한 활성 아스포타제 알파 역가의 개선
이전 실시예에 기술된 바와 같이, 아스포타제 알파(sTNALP-Fc-D10)를 생산하기 위한 이전의 예시적인 방법은 수확 시에 대략 0.1g/L의 활성 아스포타제 알파 역가를 갖는 저-생산성 방법이었다. 방법 개선을 위한 대안적인 제조 방법을 본 명세서에서 예시한다. 상류 및 하류 방법 둘 모두를 평가하였다.
아스포타제 알파 품질 및 생산성에 대한 상류 세포 배양 공정 파라미터의 잠재적인 영향을 이전 연구에서 평가하였다. 임의의 다른 중요 품질 속성(CQA)에 영향을 미치지 않으면서 역가 및/또는 부피 활성을 개선시키기 위해서, 금속 보충(Zn2+/Mg2+/Ca2+), 온도 이동 시기, CHO 공급량 및 수확 시기를 비롯한 세포 배양 파라미터를 평가하였다. 이전 연구로부터의 데이터는 금속 보충이 대조군 조건보다 상당히 더 낮은 TSAC를 유발하였고, 따라서 추가 평가에서 제외되었음을 나타내었다. 온도 이동 시기를 54시간에서 78시간으로 늦추면 비활성도가 더 낮아졌고, 단백질 A 역가가 더 높아졌다. 그 결과, 더 나중의 온도 이동 조건 하에서의 총 부피 활성은 동일하게 유지되었다. CHO 공급 볼러스 양을 1X(2일에 5㎖/L)에서 4X(2일, 4일, 6일, 및 8일에 5㎖/L)로 증가시키면 다른 시험된 품질 속성(예를 들어, TSAC, 전하 분포, 및 중성 글리칸 분포)에 부정적인 영향 없이 부피 활성을 상당히 증가시켰다. 수확일을 10일에서 12일로 늦추면 더 높은 생산성(예를 들어, 부피 활성, 단백질 A 역가, 및 비활성도) 및 약간 더 낮은 TSAC와 연관되었다. 이러한 데이터를 기초로, CHO 공급량의 증가가 본 연구에서 10L 규모에서 추가 평가를 위해서 선택되었다.
물질 및 방법
아스포타제 알파(sTNALP-Fc-D10) 생산의 상류 방법을 하기 시드 트레인 및 세포 배양 방법을 사용하여 작동시켰다: 5 x 105세포/㎖의 표적 종자 밀도로의 세포의 접종물 해동; 3.5 x 105세포/㎖의 표적 시딩 밀도로의 세포 확장(플라스크/롤러 단계); 3.5 x 105세포/㎖의 표적 시딩 밀도로의 접종물 확장(세포 백 단계); 3.5 x 105 세포/㎖의 표적 시딩 밀도로의 접종물 확장(100L - 낮은 수준); 3.5 x 105세포/㎖의 표적 시딩 밀도로의 접종물 확장(100L - 높은 수준); 3.5 x 105세포/㎖의 표적 시딩 밀도를 갖는 1000L 시드 생물반응기(N3 - 낮은수준); 3.5 x 105세포/㎖의 표적 시딩 밀도를 갖는 1000L 시드 생물반응기(N2 - 높은 수준); 3.5 x 105세포/㎖의 표적 시딩 밀도를 갖는 4000L 시드 생물반응기(N1); 5.5 x 105세포/㎖의 표적 시딩 밀도를 갖는 20000L 생산 생물반응기. 본 연구에서, 대조군 생물반응기 방법 및 개선된 생물반응기 방법 둘 모두를 위한 생물반응기에 대한 접종물로서 사용된 소규모 시드 트레인 방법은 하기를 포함하였다: 접종물 해동; 경로 1(1 x 100㎖ 진탕 플라스크, 5 x 105세포/㎖의 표적 시드); 경로 2(2 x 100㎖ 진탕 플라스크, 3.5 x 105세포/㎖의 표적 시드); 경로 3(2 x 1L 스피너, 3.5 x 105세포/㎖의 표적 시드); 경로 4(2 x 15L 스피너, 3.5 x 105세포/㎖의 표적 시드); 8 x 10L 생물반응기, 5.5 x 105세포/㎖의 표적 시드. 본 연구에서 사용된 10L 생물반응기는 사토리우스 바이오스타트(BIOSTAT)(등록상표) B-DCU II 생물반응기 시스템(사토리우스 스테딤 바이오테크(Sartorius Stedim Biotech)) 및 MFCS/윈 3.0 모듈 쉘(Module Shell) 3.0(레벨 32) 데이터 획득 소프트웨어(사토리우스 스테딤 바이오테크)였다. 생산 생물반응기에서 사용된 원료의 목록은 하기를 포함한다: CM69 성장 배지, 100μM MTX(메토트렉세이트), 200mM L-글루타민, CM70 성장 배지, 시그마(Sigma) CHO 공급물, 10% 탄산나트륨, 및 폼어웨이(FoamAway) AOF(깁코(Gibco)).
아스포타제 알파(sTNALP-Fc-D10) 클론(세포주 X)의 개발 작업 셀 뱅크로부터의 세포 바이알을 해동시키고, 시드 트레인을 N-1 단계(이전에 사용된 20,000L 공정에서의 4000L 시드 생물반응기에 동등함)를 통해서 통과시켰다. 15L의 작업 부피를 갖는 2개의 15L 스피너에서 N-1 배양을 수행하였다. 두 N-1 배양물 모두를 접종을 위해서 사용하였다. 교반을 200rpm으로 설정하였고, 총 기체 유동은 20L/시간이었다. 용존 산소 및 pH 측정에 따라서 산소 및 이산화탄소 기체처리를 조정하였다. 8개의 10L 생물반응기에 접종시키고, 10일에 수확하였다. 대조군 공급 전략(1회 공급)을 사용하여 2개의 생물반응기에 공급한 반면, 6개의 나머지 것에는 개선된 공급 전략(2일, 4일, 6일, 및 8일에서의 다회 공급)을 사용하여 공급하였다. 표 19는 이들 생물반응기에 대해서 사용된 세포 배양 공정 파라미터를 요약한다.
20,000L 규모의 제조 방법은 VCD 기반 공급 전략(통상적으로 대략 2일 배양에서, VCD 약 25.0 내지 32.0 x 105세포/㎖의 단일 볼러스)을 사용한다. 본 연구에서, 20K 생물반응기에서의 제조 데이터로부터 계산된 평균 배가 시간 24.5시간을 기준으로 VCD 기준(25.0 내지 32.0 x 105세포/㎖)을 충족시키기 위해서 접종 후 58시간에 일어나도록 온도 이동 시기를 프로그래밍하였다. 이러한 변화는 방법을 단순화하고, 공급 시기를 더 엄격하게 제어할 수 있도록 구현되었다.
결과
모든 생물반응기의 세포 배양 성능을 도 28 내지 도 31에 요약한다.
현재 개선된 방법의 성장 원동력 및 생존력을 대조군 및 이전 20,000L 방법과 비교하였다. 배양 과정에 걸쳐서 VCD는 대조군 및 20,000L 방법과 유사하였다(도 28A, 오차 막대는 ± 1X 표준 편차를 나타냄). 대조군 방법 및 개선된 방법 #4 하의 세포 생존력은 유사한 속도로 감소하였는데, 이는 이전 20,000L-규모 방법 하에서의 속도보다 더 빠르다(도 28B). 최종 생존력은 대조군 및 개선된 방법의 경우에 각각 73% 및 70%인 반면에, 20,000L 방법은 전형적으로 약 80%로 유지된다. 이는 아마도 교반 속도로 인해서 10L 시스템이 갖는 규모 문제인 것으로 보인다. 이것을 제2 물질 생성 블록에서 시험하였고, 그 작동으로부터의 데이터는, 생존력 감소가 이전 방법에서 세포 유형에 대한 것(11 내지 30μM)보다 더 넓은 허용 가능한 세포 직경 범위(5 내지 50μM)를 갖는 제너릭 CHO 유형에 대해서 설정된 바이셀 세포 계수기 설정과 교반 속도의 조합으로 인한 것이었음을 나타내었다.
글루코스 사용 및 락테이트 소모 프로파일을 도 29에 도시한다. 개선된 방법은 대조군의 것과 유사한 글루코스 이용 및 락테이트 프로파일을 나타내었다.
배양 전체에서 아스포타제 알파의 단백질 A 역가 및 비활성도를 도 30에 도시한다. 대조군 및 개선된 방법 둘 모두에 대한 단백질 A 역가는 대등하였다. 그러나, 이들 둘 모두는 20,000L 방법에서 전형적으로 인지되는 역가보다 더 낮았다. 이는 생존력으로 인지되는 규모 차이에 부분적으로 기인될 수 있는데, 그 이유는 본 연구에서 사용된 전력 대 부피비는 제조 시에 사용된 것보다 30% 더 높은 것을 발견하였기 때문이다(제조 규모에서 P/V 비율의 후속 수령에 의해서 확인됨). 개선된 방법에 대한 비활성도(유닛/㎎ 단백질)는 대조군보다 평균 17% 더 높았다(532U/㎎ 대 456U/㎎). 단백질 A 역가 데이터를 사용하여 취한 이들 데이터는, 동일한 양의 단백질이 각각의 방법으로 생산되지만, 생산된 단백질은 배양물이 더 많이 공급되는 경우 더 활성임을 나타낸다.
활성 역가 및 총 부피 활성(도 31에 도시됨)은 개선된 방법이 10L 규모에서 대조군 방법보다 대략 22 내지 24% 더 높은 활성을 생성한다는 것을 나타낸다. 20,000L 규모에서 인지되는 바와 같이 개선된 방법은 대략 동일한 활성 역가를 생성한 반면, 대조군 방법은 약 19% 더 낮았다.
결론
본 연구는, 생성물의 단백질 A 역가를 유지시키면서, 활성 역가가 대략 22 내지 24%로 증가되는 증가된 공급량을 사용하는, 개선된 제조 방법(10L 규모)의 성능을 나타낸다. 대조군과 개선된 방법 간의 아스포타제 알파 비활성도의 비교를 도 32에 도시한다. 명백하게, 6개의 모든 복제된 개선된 방법 조건(각각 3회의 추가 공급물 첨가를 가짐)은 대조군보다 더 높은 비활성도를 나타내었다.
각각의 볼러스 공급물은 약 9μM 만의 염화아연을 함유하는 기저 배지와 비교할 때 1.2mM의 염화아연을 함유하였다. 따라서, 각각의 볼러스 공급물은 전체 배양물 중에서 아연 농도를 약 6μM(0.5 v/v) 증가시킨다. 임의의 특정 이론에 얽매이고자 함은 아니지만, 추가 공급물 보충에 의한 비활성도의 증가는 적어도 부분적으로는 아연 보충에 의한 것으로 추정된다.
실시예 7. 아연 보충물에 의해서 추가로 개선된 아스포타제 알파 활성
이전 실시예에 개시된 제조 방법을 기반으로, 새로운 연구를 수행하여 상류 공정 파라미터를 추가로 최적화하였다. 예시적인 방법 Z 및 Z'를 표 20에 요약하고 비교한다.
이전 방법 Y를 기반으로 추가의 최적화를 수행하였다. 예를 들어, 새로운 방법 Z'는 약 30 내지 90μM의 황산아연을 배양 배지에 보충하고, 총 배양 시간을 약 240시간(즉, 10일)에서 약 288시간(즉, 12일)으로 증가시켰다. 소규모 진탕 플라스크 연구를 수행하여 방법 Z'의 3가지 변형(각각 30, 60, 또는 90μM 아연을 보충함)을 시험하였다. 배양 배지 내의 전면-적재(front-loading)에 의해서 30μM 보충을 수행하였다. 60 및 90μM 보충은 아연을 2개의 동일한 볼러스로 2일 및 6일(60μM 조건의 경우)에 보충하거나, 3개의 동일한 볼러스를 2일, 6일, 및 10일(90μM 조건의 경우)에 보충하는 것을 포함하였다. 도 33에 도시된 바와 같이, 아연 보충(적색선; 상이한 아연 농도를 사용한 3회의 실험의 평균값을 나타냄)은 대조군 방법 Y(청색선)과 비교할 때 아스포타제 알파 비활성도를 효과적으로 개선시켰다. 이러한 증가는 대략 288-시간(즉, 12일) 시간 슬롯에 이의 피크에 도달하였고, 그 후에 감소하였다.
실시예 8. 제조된 아스포타제 알파의 특징 규명
다중 직교 분석 방법(multiple orthogonal analytical method)을 사용한 제조된 아스포타제 알파의 예시적인 특징 규명을 본 명세서에 나타낸다. 이들 방법을 사용하여 생산된 아스포타제 알파의 아이덴터티, 순도, 크기, 구조, 글리코실화, 및 전하 프로파일을 평가하였다. 일부 방법을 또한 사용하여 로트-대-로트 일관성(consistency)을 보장하였다. 추가로, 생성물-관련 물질 및 생성물-관련 불순물을 또한 특징 규명하였다.
아스포타제 알파의 구조 설명
올리고사카라이드 제거 후 분자량의 매트릭스-보조-레이저-탈착-이온화 비행-시간(MALDI-TOF) 분석
올리고사카라이드 제거 후 아스포타제 알파의 MALDI-TOF 질량 분광분석법 분석을 사용하여 아스포타제 알파의 아이덴터티를 확인하였다. 또한, 아스포타제 알파의 이론적 분자량과 실질적으로 상이한 분자량을 갖는 임의의 상당한 수준의 번역후 변형의 존재가 또한 이 방법에 의해서 검출될 것이다. 다이설파이드 결합이 환원되거나 환원되지 않은 PNGaseF를 사용한 아스포타제 알파의 분해에 의해서 올리고사카라이드의 제거를 달성하였다. 이들 샘플을 탈염처리하고, 아세토나이트릴 및 트라이플루오로아세트산 중의 2,5-다이하이드록시벤조산과 2-하이드록시-5-메톡시벤조산의 90:10 혼합물과 혼합하였다. 샘플을 공기 건조시키고, 이어서 MALDI-TOF 질량 분석기를 사용하여 분석하였다. 질량 스펙트럼은 양성 모드로 획득하였다. 우혈청 알부민(BSA)을 사용하여 장비를 외부에서 보정하였다. 탈글리코실화 후 아스포타제 알파의 질량 스펙트럼을 도 34A에 도시한다. m/z 161,140, 80,571 및 53,748을 갖는 피크는 각각 1가, 2가, 및 3가로 하전된 분자에 상응하다. 161,140Da의 분자량 측정치는 장비의 1% 정확도 한계 내에서 분자량 계산치(161,135.2Da)와 일치하였다. 올리고사카라이드의 환원 및 제거 후 아스포타제 알파의 질량 스펙트럼을 도 34B에 도시한다. m/z 80,545, 40,267, 및 26,808을 갖는 피크는 각각 1가, 2가, 및 3가로 하전된 분자에 상응하다. 80,545Da의 분자량 측정치는 장비의 1% 정확도 한계 내에서 분자량 계산치 80,577.7Da과 일치하였다. 결과는 아스포타제 알파의 아이덴터티를 확인해 주었고, 글리코실화가 아닌 상당한 수준의 번역후 변형이 없음을 나타내었다.
분석적 초원심분리 ( AUC )
AUC를 사용하여 응집물, 이량체 및 단편(존재하는 경우) 및 이에 따른 아스포타제 알파의 순도를 측정하였다. 또한, 그것은 독특한 아미노산 서열 및 번역후 변형으로 인한 분자의 특징인 아스포타제 알파 이량체의 분자량을 측정한다. 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 대한 직교 방법이 고려된다. 아스포타제 알파 샘플을 25mM 포스페이트, 150mM NaCl, pH 7.4를 사용하여 대략 1㎎/㎖로 희석시켰다. 분석적 초원심분리를 사용하여 침강 속도 분석을 수행하였다. 석영 창이 장치된 이중 섹터 셀 사용하였다. 회전자를 진공 하에서 20℃에서 평형화하고, 대략 1시간 후 회전자를 36,000RPM으로 가속시켰다. 280nm에서의 흡수 스캔을 4.5분 간격으로 대략 6시간 동안 획득하였다. 먼저 DCDT를 사용하여 데이터를 분석하여 겉보기 분자량을 측정하였고, c(s) 방법(SEDFIT 소프트웨어)을 사용하여 이량체, 고 분자량 종 및 저 분자량 종의 백분율을 측정하였다. 아스포타제 알파의 분자량은 211kDa이었고, 대표적인 배취에 대한 순도는 96.8%였다.
미손상 분자량의 MALDI - TOF
아스포타제 알파의 분자량의 MALDI-TOF 측정은 모든 번역후 변형, 주로, 글리코실화를 비롯한 분자의 크기를 결정한다. 아스포타제 알파 샘플을 탈염처리하고, 2,5-다이하이드록시벤조산과 2-하이드록시-5-메톡시벤조산의 90:10 혼합물로부터 제조된 매트릭스와 혼합하였다. 샘플을 공기 건조시키고, 이어서 MALDI-TOF 질량 분석기를 사용하여 분석하였다. 질량 스펙트럼은 양성 모드로 획득하였다. 우혈청 알부민(BSA)을 사용하여 장비를 외부에서 보정하였다. 아스포타제 알파의 질량 스펙트럼을 도 35에 도시한다. m/z 180,157, 90,223 및 60,540을 갖는 피크는 각각 1가, 2가, 및 3가로 하전된 분자에 상응하다. 가혹한 장비 설정에 의해서 유발된 단편화로 인해서 다른 낮은 다수의 피크가 형성되었다. 180,157Da의 분자량 측정치는 공지된 아미노산 서열을 기초로 한 161,135.2Da의 분자량 계산치보다 상당히 더 높다. 이러한 결과는 아스포타제 알파의 광범위한 번역후 변형, 주로 글리코실화를 나타내는데, 그 이유는 탈글리코실화된 아스포타제 알파의 MALDI-TOF 및 ESI-TOF 분석은 상당한 수준의 변형을 검출하지 않았기 때문이다.
크기 배제 크로마토그래피 다중-각도 광 산란(SEC- MALS )
SEC-MALS를 사용하여 크기를 기초로 단백질을 분리하고, 이어서 각각의 피크의 분자량을 결정한다. 아스포타제 알파는 SEC-MALS(데이터 나타내지 않음)에 의해서 분석하였다. 7.0 내지 8.2분의 체류 시간 창 내의 피크의 분자량 계산치는 194.1Da인데, 이것은 공지된 아미노산 서열 및 광범위한 글리코실화를 기초로 한 아스포타제 알파의 분자량 계산치와 양호하게 일치하고, 또한 MALDI-TOF에 의해서 관찰된 분자량과 일치한다.
금속 분석법
유도 결합 플라즈마-질량 분석법(ICP-MS)을 사용하여 아연 및 마그네슘의 함량을 측정하였고, 유도 결합 플라즈마-원자 방출 질량 분광분석법(ICP-AES)을 사용하여 칼슘의 수준을 측정하였다. 아스포타제 알파 샘플을 먼저 진한 질산을 첨가하고, 이어서 과산화수소를 첨가하여 열과 함께 마이크로파를 사용하여 분해시켰다. 이어서 샘플을 아연 및 마그네슘의 경우에는 ICP-MS 장비를 사용하여 분석하였고, 칼슘의 경우에는 ICP-AES 장비를 사용하여 분석하였다. 측정된 몰비(이온의 몰/아스포타제 알파 단량체의 몰)는 아연의 경우에는 2.27이었고, 칼슘의 경우에는 0.97이었고, 마그네슘의 경우에는 0.12였다. 아연 및 칼슘의 비는 문헌에 보고된 비와 양호하게 일치하였다(문헌[Stec et al. 2000 J Mol Biol 299:1303-1311] 및 [Mornet et al., 2001 J Biol Chem 276:31171-31178]). 모넷(Mornet)(2001) 등은 칼슘이 TNALP 상의 마그네슘 결합 부위를 차지할 수 있다는 것을 교시하고, 따라서 아스포타제 알파 분자에서 마그네슘의 비는 일(1)보다 작을 수 있다는 것을 제안한다. 그러나, 0.12로서의 시험된 마그네슘 비는 놀랍게도 여전히 낮다.
포스포릴화 부위의 측정
UPLC-MSe를 사용하여 포스포릴화의 부위 및 백분율을 측정하였다. 최종 농도 0.5㎎/㎖에서의 아스포타제 알파를 37℃에서 1시간 동안 40 mM DTT를 사용하여, 0.2M 트리스, pH, 8.6 중의 6M 구아니딘 염화수소의 존재 하에서 변성 및 환원시켰다. 50mM의 최종 농도로 아이오도아세트산을 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션시킴으로써 환원된 샘플을 알킬화시켰다. 이어서 10kDa의 분자량 컷-오프를 갖는 투석 튜브를 사용하여 50mM 중탄산암모늄으로 샘플을 완충액-교환시켰다. 1:50 트립신; 단백질의 최종비(w:w)로 트립신을 사용하여 37℃에서 24시간 동안 샘플을 분해시켰다. 역상 C18 칼럼 및 Q-TOF 질량 분광계가 UPLC 시스템을 사용하여 분해된 샘플을 분석하였다. Ser93을 함유하는 트립신 분해 펩타이드(tryptic peptide)는 포스프릴화 및 비-포스포릴화 둘 모두로서 식별되었다. 도 36에 도시된 바와 같이, MS/MS 스펙트럼은 S93이 y12 이온 및 y13 이온에 의해서 관찰되는 바와 같이, 포스프릴화에 의해서 첨가된 포스페이트의 질량인 +80Da만큼 이동된 것을 나타내었다. 포스포릴화의 상대적인 백분율은 추출 이온 크로마토그램(EIC's) 피크 면적을 사용하여 33.9%로서 측정되었다.
유리 글리칸의 MALDI 분석법
유리 글리칸의 MALDI-TOF 분석법을 사용하여 올리고사카라이드 종 및 이의 상대적인 백분율을 측정하였다. 올리고사카라이드를 PNGaseF 분해에 의해서 아스포타제 알파 참조 표준품으로부터 방출시켰다. 방출된 글리칸을 탑 팁(Top tip) 탄소 역상 칼럼을 사용하여 정제하였다. 방출된 글리칸을 sDHB 매트릭스와 1:1로 혼합하고, 이어서 MALDI-TOF에 의해서 분석하였다. 시알산을 갖는 글리칸의 경우 음성 모드로 분석을 수행하였고, 중성 글리칸의 경우 양성 모드로 수행하였다. 음성 모드를 사용하여 획득된 질량 스펙트럼을 도 37A에 도시한다. 양성 모드를 사용하여 획득된 질량 스펙트럼을 도 37B에 도시한다. 관찰된 분자량을 일반적으로 공지된 올리고사카라이드의 이론 분자량과 매칭시킴으로써 올리고사카라이드 종을 측정하였다. 개별 피크 강도를 모든 글리칸의 총 피크 강도로 나눔으로써 상대적인 백분율을 결정하였다. 주요 올리고사카라이드를 표 21 및 표 22에 요약한다. 분자량을 기초로, 시알산의 구조는 N-아세틸뉴라민산(Neu5Ac 또는 NANA)인 것으로 측정되었다.
2- 아미노벤즈아마이드 (2-AB) 표지된 올리고사카라이드 프로파일링
아스포타제 알파로부터의 방출된 올리고사카라이드를 2-아미노벤즈아마이드(2-AB)에 의해서 표지하고, 이어서 형광 검출을 사용하는 순상 HPLC에 의해서 분석하여 각종 올리고사카라이드의 유형 및 상대적인 백분율을 측정하였다. 아스포타제 알파 샘플을 다이싸이오트레이톨(DTT)을 사용하여 37℃에서 1시간 동안 환원시키고, 37℃에서 밤새 PNGaseF를 사용하여 분해시켜서 N-연결된 올리고사카라이드를 방출시켰다. 분해된 샘플로부터의 단백질을 침전시키고, 차가운 에탄올 및 원심분리에 의해서 방출된 글리칸으로부터 분리하였다. 방출된 글리칸을 함유하는 상청액을 진공 원심분리를 사용하여 건조시키고, 1% 폼산을 사용하여 재구성하고, 실온에서 40분 동안 인큐베이션시키고, 이어서 다시 건조시켰다. 이어서 샘플을 제조원의 지시서(루더(Ludger), 영국 옥스포드셔 소재)에 따라서 2-AB 표지 시약을 사용하여 표지하였다. 표지된 글리칸을 글리칸 S 카트리지(프로자임(Prozyme), 미국 캘리포니아주 헤이웨드 소재)를 사용하여 세척하고, 이어서 330nm의 여기 파장 및 420nm의 방출 파장을 사용하는 형광 검출을 갖는 HPLC를 사용하여 분석하였다. 아스포타제 알파의 분석으로부터의 형광 크로마토그램을 도 38에 도시한다. 분획 수집, 분자량의 질량 분광분석법 분석 및 분자량의 일반적으로 공지된 올리고사카라이드 구조의 분자량에 대한 매칭에 의해서 피크의 아이덴터티를 확립하였다. 2-AB 표지화에 의해서 식별된 올리고사카라이드를 표 23에 요약한다. 아스포타제 알파 참조 표준품의 분석으로부터 수득된 크로마토그램을 도 39에 도시한다.
글리코펩타이드 프로파일링
글리코펩타이드 프로파일을 사용하여 부위-특이적 올리고사카라이드 분포를 측정하였다. 최종 농도 0.5㎎/㎖에서의 아스포타제 알파 샘플을 37℃에서 1시간 동안 40mM DTT를 사용하여, 0.2M 트리스, pH, 8.6 중의 6M 구아니딘 염화수소의 존재 하에서 변성 및 환원시켰다. 50mM의 최종 농도로 아이오도아세트산을 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션시킴으로써 환원된 샘플을 알킬화시켰다. 이어서 10kDa의 분자량 컷-오프를 갖는 투석 튜브를 사용하여 50mM 중탄산암모늄으로 샘플을 완충액-교환시켰다. 1:50 트립신; 단백질의 최종비(w:w)로 트립신을 사용하여 37℃에서 24시간 동안 샘플을 분해시켰다. 역상 C18 칼럼 및 Q-TOF 질량 분광계가 UPLC 시스템을 사용하여 분해된 샘플을 분석하였다. 데이터는 양성 모드로 획득하였다. 용리 시간 창에 걸친 질량 스펙트럼을 각각의 글리코펩타이드에 대해서 평균내었다. 6개의 글리코펩타이드를 아스포타제 알파의 트립신 분해로부터 생성하였고, 이는 아스포타제 알파의 단량체당 6개의 글리코실화 부위에 상응한다. 펩타이드 모이어티는 체류 시간을 결정하는 1차 인자이기 때문에, 글리코펩타이드는 이의 독특한 아미노산 서열을 기초로 분리되고; 따라서 부위-특이적 올리고사카라이드 분포를 수득할 수 있다. 글리코펩타이드의 질량 스펙트럼을 도 40에 도시한다. 각각의 글리코실화 부위와 연관된 올리고사카라이드 종을 표 24에 요약한다.
분자량 측정치 및 다른 분석 결과(예를 들어, 질량 스펙트럼 데이터 및 2-아미노벤즈아마이드(2-AB) 표지된 올리고사카라이드 프로파일링 데이터)를 기초로, 아스포타제 알파의 주요 글리칸(4% 이상의 상대적인 존재비)의 구조를 도 41 및 도 42에서 결정하였다.
모세관 등전점 맞춤( cIEF )
cIEF는 단백질을 이의 등전점을 기초로 분리하며, 이것을 사용하여 아스포타제 알파 전하 변이체를 모니터링하였다. 우레아, 메틸 셀룰로스, 수크로스, 파말라이트(pharmalyte), 및 pI 마커를 함유하는 완충제 중의 최종 농도 0.5㎎/㎖의 아스포타제 알파 샘플을 모세관 전기이동 시스템을 사용하여 분석하였다. 샘플을 0.1분 동안 1500V에서 포커싱하고, 이어서 14분 동안 3000V에서 포커싱하였다. 분리된 단백질 변이체를 280nm에서의 UV 흡수를 사용하여 검출하였다. 아스포타제 알파의 대표적인 배취로부터의 전기영동도를 도 43에 도시한다. cIEF에 의해서 6개의 피크가 관찰되었다. 전형적으로, 피크 1은 넓은 pI 범위를 갖는다. 피크 4 및 5의 경우에는 추가적인 숄더가 관찰되었다. 이러한 결과는, 아스포타제 알파가 전하와 관련하여 매우 불균질하다는 것을 나타내었고, 이는 각각의 부위에서 시알산의 다양한 수 및 수준을 갖는 다수의 글리코실화 부위의 존재로 인한 것이라고 예상되었다. 대표적인 배취의 각각의 피크의 pI 및 아스포타제 알파의 이의 상대적인 백분율을 표 25에 요약한다.
생성물-관련 물질
스포타제 알파는 CHO 세포주에서 발현되기 때문에 번역후 변형으로 인한 아스포타제 알파의 구조적 이질성이 예상된다. 상기에 기술된 바와 같이, 아스포타제 알파의 이질성은 전하 변이체로서 반영되고, 여기서 cIEF에 의해서 분석되는 경우 6개의 피크가 관찰된다. 아스포타제 알파의 전하 프로파일의 일관된 패턴이 임상 및 PV 배취에서 입증되었다. 대표적인 물질을 사용한 AUC, SDS-PAGE, SEC 및 AEX에 의해서 측정되는 바와 같이, 아스포타제 알파는 순도가 최소 96%인데, 이는 cIEF에 의해서 관찰된 다수의 피크가 생산된 아스포타제 알파를 완전히 대표하고, 모든 피크가 생성물-관련 물질이라는 것을 제안한다.
생성물-관련 불순물
생성물-관련 불순물은 활성, 효능, 및 안전성과 관련하여 목적하는 아스포타제 알파와 대등한 특성을 갖지 않는 분자 변이체이다(산업 가이드라인, Q6B 규격: 생물공학/생물학적 제품에 대한 시험 절차 및 허용 기준, 1999년 8월(Guidance for Industry, Q6B specifications: test procedures and acceptance criteria for biotechnological/biological products, August 1999, ICH). 생성물-관련 불순물은 3가지 검정법에 의해서 관찰되고, 각각의 불순물의 특징은 표 26에 요약되어 있다.
SDS-PAGE 밴드의 특징 규명
아스포타제 알파를 비-환원 SDS-PAGE 및 환원 SDS-PAGE에 의해서 분석하였다. SDS-PAGE 분석법의 결과는, 밴드 1이 미손상 아스포타제 알파에 상응하고, 밴드 2이 단지 하나의 효소 암을 갖는 미손상 아스포타제 알파에 상응하고, 밴드 3이 아스포타제 알파의 환원된 형태(단량체)(데이터에 도시지 않음)에 상응한다는 것을 제안한다.
예상된 바와 같이, 효소 부분 및 IgG1-Fc 부분 둘 모두로부터의 펩타이드가 환원 SDS-PAGE로부터 관찰되었다. 환원 SDS-PAGE 상의 밴드의 겉보기 분자량에 더하여, 이러한 결과는, 주 밴드가 이의 환원 형태의 아스포타제 알파에 상응한다는 것을 나타낸다. 밴드 특징 규명을 표 27에 요약한다.
SEC 피크의 특징 규명
고 분자량 종(응집물), 아스포타제 알파 이량체, 및 저 분자량 종을 분리함으로써 SEC-HPLC를 순도 검정법으로서 사용하였다. 전형적인 SEC 크로마토그램 상에서, 가장 풍부한 피크는 아스포타제 알파 호모-이량체에 상응한다. 주 피크 이전에 용리된 피크는 고 분자량 종에 상응한다. 주 피크 이후에 용리된 피크는 저 분자량 종에 상응한다. 고 분자량 종 및 주 피크 둘 모두에 상응하는 분획을 수집하고, SDS-PAGE에 의해서 그 다음 인-겔 분해 및 질량 분광분석법 분석에 의해서 분석하였다. 펩타이드 분자량 측정치를 알고 있는 아미노산 서열로부터 유래된 분자량 이론치에 매칭시키면 주 피크의 경우 86.6%의 서열 커버리지 및 고 분자량 종의 경우 70.7%의 서열 커버리지를 나타내었다. 따라서, 고 분자량 종은 생성물-관련 불순물을 나타낸다고 결론지었다.
AEX 피크의 특징 규명
AEX를 사용하여 아스포타제 알파의 전하 변이체를 모니터링하였다. 출발 물질과 함께 5개의 AEX 분획을 GP-HPLC 및 비-환원 SDS-PAGE 및 환원 SDS-PAGE(데이터 나타내지 않음)에 의해서 분석하였다. 데이터는 AEX 염기성 피크가 주로 아스포타제 알파를 함유하고, 가능하게는 적은 백분율의 고 분자량 종을 함유한다는 것을 제안한다. AEX 산성 피크는 아스포타제 알파 고 분자량 종을 함유한다. 염기성 종 및 산성 종은 MALDI-TOF 분석법에 의한 펩타이드 핑거 프린팅에 의해서 확인된 바와 같이 생성물-관련된다.
아스포타제 알파는 다양한 분석 기술을 사용하여 양호하게 특징 규명되었다. 이의 아이덴터티는 MALDI-TOF 및 ESI-MS에 의한 N-말단 서열분석, 아미노산 분석법, 및 분자량 분석법에 의해서 확인되었다. 생산된 아스포타제 알파의 순도를 AUC, SDS-PAGE, GP-HPLC 및 AEX에 의해서 모니터링하였다. 아스포타제 알파의 크기를 올리고사카라이드를 갖는 분자의 MALDI-TOF 및 SEC-MALS 분석법에 의해서 평가하였다. 또한, 아스포타제 알파의 분자량 분석을 또한 AUC 및 SDS-PAGE에 의해서 수행하였다. 아스포타제 알파의 일관된 더 높은 분자량이 이들 직교 방법에 의해서 관찰되였고, 이는 글리코실화의 분석에 의해서 확인된, 다수의 부위에서의 분자의 광범위한 글리코실화를 제안한다. 아스포타제 알파의 고차 구조를 원-UV 및 근-UV CD에 의해서 측정하였다. 분자의 수력학적 크기는 또한 AUC 및 SEC-MALS 둘 모두의 분석법으로부터 결정될 수 있는데, 이는 스포타제 알파가 공유 이량체로서 존재한다는 것을 추가로 확인해 주었다. 적은 양의 응집물이 SEC, AUC 및 SEC-MALS에 의해서 검출되었다. 네이티브 다이설파이드 결합 구조 및 102에서의 유리 시스테인의 위치를 비-환원 펩타이드 맵의 LC-MS 분석법에 의해서 확인하였다. 단지 하나의 주 유리 시스테인의 존재는 유리 설프하이드릴의 총량의 평가에 의해서 추가로 확인되었다. LC-MS 분석법은 활성 부위 세린 잔기가 부분적으로 포스포릴화되었음을 나타내었다. 문헌에 보고된 바와 같이, 아연, 칼슘 및 마그네슘을 비롯한, 3종의 금속이 아스포타제 알파 약물 물질에서 검출되었다. MALDI-TOF, 2-AB 표지된 올리고사카라이드의 순상 HPLC 분석법, 글리코펩타이드의 LC-MS 분석법, 및 총 시알산 측정을 사용한 유리 글리칸 분석법에 의해서 아스포타제 알파의 글리코실화를 광범위하게 측정하였다. 아스포타제 알파의 단량체당 6개의 글리코실화 부위 전부가 올리고사카라이드의 불균질 집단과 연관된다는 것을 발견하였다. 주로 시알산의 존재로 유발된 전하 프로파일인, 불균질성을 cIEF에 의해서 분석하였는데, 여기서 6개의 피크가 관찰되었다. cIEF에 의한 6개의 피크의 관찰에 의해서 생성물-관련 물질이 반영된다. 낮은 수준의 생성물-관련 불순물은 SEC, AEX 및 SDS-PAGE에 의해서 검출하였다.
실시예 9. 2,000L (2K) 규모 및 20,000L(20K) 규모에서 제조된 아스포타제 알파의 동등성
본 실시예에서, 아스포타제 알파 약물 물질을 2,000L(2K) 규모 및 20,000L(20K) 방법을 사용하여 제조하였다. 상이한 규모로 생산된 아스포타제 알파의 동등성을 예증하기 위해서, 2K(#35, #36 및 #38) 방법을 사용하여 생산된 아스포타제 알파의 3개의 배취 및 20K 방법(#40, #42, 및 #34)을 사용하여 생산된 아스포타제 알파의 3개의 배취를 가능한 경우 표 28에 기술된 방법을 사용하여 물리화학적 특성에 대해서 병렬로 분석하였다. 2K의 특정 배취 및 20K의 특정 배취를 임상 용도를 기반으로 선택하였고, 이전에 시험된 배취는 모든 2K 배취 및 20K 배취에 대한 배취 대 배취 일관성을 입증하였다.
시험된 물리화학적 특성은 아스포타제 알파 순도, 전하 변이체, 크기, 아이덴터티, 구조, 글리코실화 및 활성을 확립하였다. 시험 결과를 표 29에 요약한다. 병렬 강제 분해 연구(side-by-side forced degradation study)를 사용하여 제조 동등성을 추가로 평가하였는데, 여기서 상기에 언급된 2K 배취 및 20K 배취의 분해 경로 및 동역학을 비교하였다. 샘플을 40℃에서 0, 14, 24, 및 48시간 동안 인큐베이션시키고, 표 30에 열거된 방법에 의해서 분석하였다. 온도 강제 분해 연구에 대한 시험 결과를 표 31에 요약한다.
전체 결과는, 2K 방법 및 20K 방법을 사용하여 제조된 아스포타제 알파가 대등함을 나타낸다.
순도
분석적 초원심 분리 ( AUC )
분석적 초원심분리에 의해서 측정된 % 단량체 수준은 2K 배취와 20K 배취 사이에 대등하였다. 모든 값은 94.5% 내지 97.6% 범위 이내였고, 20K 평균은 96.8%였고, 2K 평균은 95.6%였다. 이러한 차이는, 또한 유사한 분자량을 갖는 당단백질인, IgG1 항체(문헌[Pekar and Sukumar 2007 Quantitation of aggregates in therapeutic proteins using sedimentation velocity analytical ultracentrifugation: Practical considerations that affect precision and accuracy. Analytical Biochemistry, 367: 225-237])의 검정법에 대해서 이미 예증된 바와 같이 AUC의 검정 변수 이내이다. GP-HPLC 데이터(하기에 나타냄)는 단량체의 동등성 %를 나타내는데, 이것은 AUC에 의해서 검출된 배취들 간의 약간의 차이는 검정법내 편차(예컨대 장비 셀들 간의 차이)로 인한 것임을 추가로 나타낸다. 2.5(s)에서의 작은 추가 피크가 예시적인 방법 #35로부터 생산된 아스포타제 알파에 대해서 검출되었는데, 이는 c(s) 분석법의 인공물(artifact)이었다. 아스포타제 알파의 이량체에 상응하는, #35 피크의 이동(대략 11(s))은, 방법의 오차 한계 이네인 것으로 간주된다. 아스포타제 알파 AUC 데이터는, 유니버시티 오브 코네티컷, 어날리티컬 울트라센트리퓨게이션 퍼실리티, 바이오테크놀로지 바이오서비스즈 센터(University of Connecticut, Analytical Ultracentrifugation Facility, Biotechnology Bioservices Center)로부터 획득하였다. 이 방법은 이량체 또는 더 큰 종으로 이루어진 응집물로부터 아스포타제 알파 단량체를 구별하고, 응집물 연속적 침강 계수 분포를 기초로 이의 상대적인 %를 구별한다.
SDS-PAGE/ LoC (랩 온 칩)
SDS-PAGE에 의해서 측정된 주 밴드 %: 비-환원 및 환원 둘 모두에 대한 랩칩(LABCHIP)(등록상표)(퍼킨 엘머) GXII 단백질 검정법은 2K 배취와 20K 배취 간에 대등하였다. 표 29에 요약된 바와 같이, 주 밴드 %는 3개의 2K 배취의 경우 100.0%(비-환원) 및 99.8%(환원)였고, 20K 배취의 경우 100.0%(비-환원) 및 99.8%(환원)였다. 또한, 비-환원 분석법 및 환원 분석법 둘 모두의 전기영동도에 의해서 예증되는 바와 같이 대등한 밴드 패턴이 2K 배취 및 20K 배취에 대해서 관찰되었다. 이 시험은 단백질의 분자량을 기초로 단백질을 분리하고, 백분율 주 밴드로서 표현되는 미손상 단백질의 순도의 분석법을 제공한다. 검정법을 랩칩 GXII 프로테인 어세이 퀵 가이드, HT 프레테인 익스프레스 랩칩 키트, 버전 2(LabChip GXII Protein Assay Quick Guide, HT Protein Express LabChip Kit, Version 2)(2010년 3월 개정)에 따라서 수행하였다.
SDS-PAGE
3개의 2K 배취 및 3개의 20K 배취를 SDS-PAGE를 사용하여 병렬로 분석하였다. 농도계에 의한 분석법은 비-환원 SDS-PAGE 및 환원 SDS-PAGE 둘 모두의 경우 모든 배취에 대해서 100%를 차지하는 주 밴드를 생성하였다. 주 밴드에 더하여, 아스포타제 알파 이량체의 것보다 더 높은 겉보기 분자량을 갖는 정량 한계보다 낮은 희미한 밴드가 모든 배취에 대해서 관찰되었다. 모든 배취의 경우 환원 SDS-PAGE에 의해서 단지 하나의 밴드가 관찰되었다. 이 시험은 단백질의 분자량을 기초로 단백질을 분리하고, 백분율 주 밴드로서 표현되는 미손상 단백질의 순도의 분석법을 제공한다. 단백질 샘플을 겔 상에서 분리하고, 시각화를 위해서 쿠마시 블루 스테인(Coomassie Blue Stain)으로 염색하고, 탈염색하고, 농도계에 의해서 분석하였다. 아스포타제 알파의 분자량, 분해 생성물, 및 방법 관련 불순물을 알고 있는 분자량 표준품과의 비교에 의해서 예측하였다. 스캐닝 및 농도계 분석법에 의한 분석에 의해서 분리된 단백질의 정량 측정을 수행하였다.
GP - HPLC
아스포타제 알파의 순도를 GP-HPLC에 의해서 병렬로 분석하였다. 2K 평균(96.5%) 및 20K 평균(98.6%)을 표 29에 나타낸다. 20K 배취의 % 아스포타제 알파는 2K 배취의 것보다 약간 더 높다. 그러나, 배취 데이터는 유사한 % 이량체를 나타내었는데, 이는 주로 샘플 이력에서의 차이, 예컨대 재령(material age)의 차이로 인한 2K 배취의 약간 더 낮은 % 이량체를 제안한다. GP-HPLC 크로마토그램은 또한 2K 배취 및 20K 배취로부터 대등한 생성물을 나타내었다. 동일한 체류 시간에서의 동일한 피크는 동일한 종이 관찰되었음을 나타낸다. 이 방법은 아스포타제 알파를 더 큰 종 및 더 작은 단편으로부터 구별한다.
음이온 교환 크로마토그래피 ( AEX )
모든 2K 배취 및 20K 배취에 대한 AEX에 의한 주 피크의 %는 표 29에 도시된 바와 같이 93.62% 내지 96.84%의 좁은 범위 이내였다. 2K 평균은 94.17%였고, 20K 평균은 96.38%였다. 후반 용리 피크의 감소로 인해서 주 피크의 약간 더 높은 %가 20K 배취에 대해서 관찰되었다. 20K 배취에서 주 피크의 약간 더 높은 수준은 생성물의 더 높은 순도를 나타낸다. AEX크로마토그램은 2K 배취 및 20K 배취에 대해서 동일한 체류 시간에 겹쳐진 피크를 나타내었는데, 이는 모든 배취로부터의 생성물이 동일한 종을 가졌음을 제안한다. 이 방법은 순 표면 음이온 전하가 증가하는 순서로 단백질을 분리한다. 분리된 단백질은 280nm에서 자외선 흡수에 의해서 검출되고, 이어서 피크 면적 백분율로서 정량화된다.
전하 프로파일
모세관 등전점 맞춤( cIEF )
2K 배취 및 20K 배취의 각각의 피크의 피크 프로파일 및 상대적인 %는 아스포타제 알파를 cIEF에 의해서 분석하는 경우 대등하였다. 모든 샘플은 약 6.57 내지 약 6.85의 등전점(pI) 범위에서 6개의 현저한 피크를 나타내고, 이 피크를 좌측으로부터 우측으로 피크 1, 2, 3, 4, 5 및 6으로서 지칭한다. 각각의 하전된 변이체 종에 대해서 2K 배취 및 20K 배취에서 검출된 피크 면적은 표 29에 도시된 바와 같이 대등하다. 2K 배취와 20K 배취의 cIEF 피크 % 간의 동등성을 표 32에 나타낸 바와 같이 모든 배취의 T-시험 분석법을 사용하여 확인하였다(모든 p-값은 0.05를 초과하였고, 이는 로트 사이에 어떤 관찰된 차이도 유의하지 않다는 것을 나타낸다). 2K 배취 및 20K 배취의 cIEF 전기영동도는 동일한 pI 범위에서 유사한 피크 프로파일을 나타내었다. cIEF는 단백질 아이소폼 pI를 기초로 하전된-변이체 종의 반-정량적 분리를 제공한다. 분리된 단백질은 280nm 흡광도에서 검출되었다.
분자 크기
크기 배제 크로마토그래피 다중-각도 광 산란(SEC- MALS )
2K 배취 및 20K 배취의 SEC-MALS에 의해서 측정된 아스포타제 알파의 분자량은 대등하였다. 표 29에 도시된 바와 같이 2K 배취의 평균 분자량은 189.2kDa이고, 20K 배취의 평균 분자량은 189.2kDa이다. 유사한 피크 프로파일이 UV 크로마토그램 상에서 모든 배취에 대해서 관찰되었다(배취 #36으로부터의 샘플은 샘플 입수 가능성으로 인해서 그 다음 날 수행되고, 이로 인해서 이의 피크 프로파일은 다른 샘플과 완전히 매칭되지 않았다). SEC-MALS 방법은 SEC 칼럼을 조합하여 MALS 장비를 사용하여 크기에 의해서 단백질 종을 분리하여 피크의 분자량을 측정한다. 광 산란 신호 및 굴절률(RI)에 의해서 결정되는 바와 같이, 고 분자량 종(표 29에 열거됨)의 분자량의 큰 변동은 낮은 풍부 종의 측정에 대한 보다 높은 방법 편차로 인한 것이다. UV 크로마토그램을 기초로, 아스포타제 알파에 대한 고 분자량 종의 상대적인 체류 시간은 6개의 배취 모두에 대해서 유사하며, 이는 고 분자량 종의 분자량이 또한 유사할 것임을 나타낸다.
미손상 분자량 분석법 ( MALDI - ToF -MS)
표 29에 도시된 바와 같이 2K 배취의 평균 분자량은 180,902Da이고, 20K 배취의 평균 분자량은 180,019Da이었다. 20K 배취 및 2K 배취의 분자량은 외부적으로 보정된 MALDI-ToF의 1% 질량 정확도 이내이고, 따라서 대등하다. 2K 분자량의 약간 더 높은 경향성은 더 큰 올리고사카라이드, 예컨대 시알산을 갖는 올리고사카라이드가 약간 더 높은 양으로 존재하기 때문인 것 같다. 아스포타제 알파 2K 배취 및 20K 배취에 대한 MALDI-ToF 미손상 분자량(IMW) 스펙트럼은 동일한 피크 프로파일을 검출하였다. 배취 #36은 상이한 장비 보정을 사용하여 별개의 경우에 대해서 분석되었지만, 동등성의 완전성을 위해서 포함되었다. 스펙트럼에 존재하는 추가 질량은 검정법 유도된 단편화 및/또는 다중 하전된 이온으로 인한 것이다. 식별된 종에 대해서 관찰된 강도 차이는 매트릭스 결정화 및 레이저 효과의 결과이다. 이 방법은 분자량을 기초로 분자를 식별한다. 시험 샘플을 고체상-추출하고, sDHB 매트릭스 용액과 혼합하고, MALDI 표적 상에서 공-침전시켰다. 이러한 건조된 샘플을 레이저를 사용하여 ToF 질량 분광계 내에서 이온화시켰다. m /z 스펙트럼을 각각의 샘플로부터 수집하였고, 미손상 m/z를 분자량으로 전환하였다.
식별
탈글리코실화 /환원 및 탈글리코실화 분자량 분석법( MALDI - ToF -MS)
NIST 분자량 및 10개의 다이설파이드 결합을 형성하는 20개의 시스테인을 사용한 동위원소 백분율을 사용하여 726개의 아미노산의 2개의 동일한 폴리펩타이드 아미노산 서열의 1차 아미노산 서열로부터 탈글리코실화 아스포타제 알파에 대한 분자량을 계산하였다. 탈글리코실화 아스포타제 알파 분자량은 161,135.20Da인 것으로 계산되었다.
20K 배취 및 2K 배취로부터의 탈글리코실화 아스포타제 알파의 분자량은 모두 표 29에 나타낸 바와 같이 계산된 탈글리코실화 분자량의 1%(외부적으로 보정된 MALDI-TOF의 질량 정확도) 이내였다. 표 29에 도시된 바와 같이 20K 배취의 평균 분자량은 160,881Da이고, 2K 배취의 평균 분자량은 161,050Da이었다. 2K 배취 및 20K 배취에 대한 MALDI-ToF 스펙트럼은 유사한 피크 프로파일을 검출하였다. 스펙트럼에 존재하는 추가 질량은 검정법 유도된 단편화, 불완전 탈글리코실화 및/또는 다중 하전된 이온으로 인한 것이었다. 식별된 종에 대해서 관찰된 강도 차이는 매트릭스 결정화 및 레이저 효과의 결과이다.
NIST 분자량 및 동위원소 백분율을 사용하여 726개의 아미노산의 폴리펩타이드 아미노산 서열의 1차 아미노산 서열로부터 환원 및 탈글리코실화 아스포타제 알파에 대한 분자량을 계산하였다. 환원 및 탈글리코실화 아스포타제 알파 분자량은 80,577.68Da인 것으로 계산되었다.
환원 및 탈글리코실화 아스포타제 알파 20K 배취에 대한 분자량을 2K 배취와 비교하고, 표 29에 나타난 바와 같이 모든 값은 환원 및 탈글리코실화 분자량의 1%(외부적으로 보정된 MALDI-ToF의 질량 정확도) 이내였다. 2K 배취의 평균은 80,530Da이었고, 20K 배취의 평균은 80,539Da이었다. 2K 배취 및 20K 배취에 대한 MALDI-ToF 스펙트럼은 대등한 피크 프로파일을 검출하였다. 스펙트럼에 존재하는 추가 질량은 검정법 유도된 단편화 및/또는 다중 하전된 이온으로 인한 것이다. 식별된 종에 대해서 관찰된 강도 차이는 매트릭스 결정화 및 레이저 효과의 결과이다. 이 방법은 분자량을 기초로 분자를 식별한다. 시험 샘플을 고체상-추출하고, sDHB 매트릭스 용액과 혼합하고, MALDI 표적 상에서 공-침전시켰다. 이러한 건조된 샘플을 레이저를 사용하여 ToF 질량 분광계 내에서 이온화시켰다. m/z 스펙트럼을 각각의 샘플로부터 수집하였고, 미손상 m/z를 분자량으로 전환하였다.
2K 배취 및 20K 배취의 탈글리코실화 아스포타제 알파의 분자량은 대등하였고, 모든 값은 표 29에 나타낸 바와 같이 계산된 탈글리코실화 분자량의 100ppm(이것은 외부적으로 보정된 ESI-ToF-MS의 질량 정확도임) 이내였다. 2K 배취의 분자량은 161,137.39Da이었고, 20K 배취의 분자량은 161,137.28Da이었고, 그 값은 161,135.20Da의 계산된 탈글리코실화 분자량과 일치하였다. 2K 배취의 주 피크에 대한 환원 및 탈글리코실화 분자량 값은 20K 배취의 것에 대등하였고, 모든 값은 표 29에 나타낸 바와 같이 계산된 환원 및 탈글리코실화 분자량의 정확히 100ppm(이것은 외부적으로 보정된 ESI-ToF-MS의 질량 정확도임) 이내였다. 2K 배취의 평균 분자량은 80,575.52Da이고, 20K 배취의 평균 분자량은 80,574.76Da이었다. 이 값은 80,577.68Da의 아스포타제 알파에 대한 계산된 환원 및 탈글리코실화 분자량 값과 일치하였다. 이 방법은 미손상 분자량을 기초로 분자를 식별한다. 시험 샘플을 C4 RP-HPLC 칼럼 상에 주입하고, 수성:유기 용매 구배를 사용하여 용리시켰다. 이어서, 용리물을 ToF 질량 분광계에 전자분사하고, 크로마토그래프 피크의 상부 절반으로부터의 스펙트럼을 디컨볼루션시켜 미손상 분자량을 제공하였다.
3개의 20K 배취 및 3개의 2K 배취에 대한 유도 결합 플라즈마-질량 분광분석법(ICP-MS)에 의해서 측정된 아연 및 마그네슘 이온 몰비는 표 29에 나타낸 바와 같이 대등하였다. 20K 배취 및 2K 배취에 대한 플라즈마-원자 방출 분광학(ICP-AES)에 의해서 측정된 칼슘 이온 몰비는 표 29에 나타낸 바와 같이 대등하였다. 아연 및 칼슘에 대한 이온 몰비는 또한 문헌과 일치하였고, 여기서 2개의 아연 및 하나의 칼슘이 각각의 알칼린 포스파타제 효소 단량체와 회합되었다(문헌[E. Mornet et al. 2001 "Structural evidence for a functional role of human tissue non-specific alkaline phosphatase in bone mineralization." JBC, 276: 31171-31178]; 및 [B. Stec, KM. Holtz and ER. Kantrowitz. 2000 "A revised mechanism for the alkaline phosphatase reaction involving three metal ions." JMB, 299: 1303-1311]). 모든 배취에 대한 마그네슘 이온 몰비는 놀랍게도 문헌에 보고된 예상된 값보다 더 낮았다. ICP-AES가 칼슘 분석을 위해서 선택되었는데, 그 이유는 ICP-AES는 ICP-MS에서 칼슘 동위원소에 대해서 관찰되는 아르곤 다원자 간섭을 겪지 않기 때문이다. 아스포타제 알파 ICP 데이터는 상업적으로 획득되었다. 이들 방법은 마그네슘, 아연 및 칼슘의 양(㎍/㎖)을 측정하며, 이것으로부터 이온 몰비를 아스포타제 알파에 대해서 계산하였다.
UPLC - MSe를 통한 포스포릴화 부위 식별 및 정량분석
포스포릴화의 부위 및 상대적인 백분율을 UPLC-MS 트립신 분해 펩타이드 맵핑에 의해서 측정하였다. 알칼린 포스파타제는 세린-포스페이트 중간체를 형성할 수 있는 활성 부위에 세린 잔기를 함유한다고 공지되어 있다(문헌[pp 28-29 of 2006 "Mammalian Alkaline Phosphatases." Wiley-VCH] 참고). 동일한 세린 잔기 93이 표 29에 나타낸 바와 같이 35.7% 내지 31.2% 범위의 백분율로 모든 배취에서 포스포릴화된 것으로 발견되었다. 포스포릴화의 백분율은 아스포타제 알파 비활성도(pNPP), HA 결합, Km, 및 K촉매(데이터 나타내지 않음)와 상관관계가 없는 것을 발견하였다. 상관관계가 없기 때문에, 포스포릴화 중간체는 아스포타제 알파의 활성에 대한 속도 제한 단계가 아니다. 아스포타제 알파에서 S93에서의 포스포릴화 부위의 확인 및 식별은 UPLC-MSe 펩타이드 맵핑을 통해서 확인되었다. 아스포타제 알파의 이론적인 서열 및 예상되는 트립신 분해 절단을 분석법을 위해서 사용하였다. 생성된 LC-MSe 데이터를 수집하고, 워터스 바이오파말린스(Waters Biopharmalynx) v.1.2를 사용하여 처리하였다. 바이오파말린스 소프트웨어(워터스)는 1차 서열(T13)로부터 제13 트립신 분해 펩타이드를 식별하였는데, 이것은 S93, 즉 ac로 캡핑된 Cys 102를 갖는 분자의 효소 부분으로부터의 활성 부위 세린을 함유하며, S93은 포스포릴화 및 비-포스포릴화 둘 모두로서 존재한다. 펩타이드 맵의 일부로서 식별되면, 추출된 이온 크로마토그램(EIC's)을 이들 펩타이드 각각에 대해서 추출하고, 매끄럽게 하고, 통합하였다. 생성된 EIC 피크 면적으로부터, 포스포릴화된 펩타이드 피크 면적 대 총 피크 면적은 S93에서 포스포릴화의 상대적인 백분율을 제공한다. 포스포릴화된 세린 측쇄와 연관된 +80Da의 확인은 도 36에 도시된 바와 같이 제안된 포스포릴화된 T13 펩타이드에 대해서 생성된 MSe 단편화 패턴을 조사함으로써 수행되었다. 이러한 단편화 패턴은 S93이 y12 이온 및 y13 이온에 의해서 관찰되는 +80Da(포스포릴화의 질량)만큼 이동된 것을 확인해 주었다. 아스포타제 알파의 각각의 배취를 환원 및 알킬화시키고, 이어서 트립신으로 분해시켰다. 양성 이온 전자분사 모드로 작동하는, 워터스 어퀴티(Waters Acquity) UPLC 및 시납트(Synapt) Q-ToF 질량 분광계를 사용하는 ESI-Q-ToF-MS에 의해서 검출을 수행하였다.
글리코실화
N-연결된 올리고사카라이드 질량 프로파일링( MALDI - ToF -MS)
3개의 2K 배취 및 3개의 20K 배취로부터의 방출된 올리고사카라이드를 MALDI-ToF에 의해서 분석하였고, 그 결과를 표 29에 나타낸다. 유사한 상대적인 백분율로 동일한 글리칸 종이 20K 배취 및 2K 배취에서 관찰되었다. 이 방법은 분자량에 의해서 약물 물질과 연관된 글리칸을 식별한다. PNGase-F 분해 및 후속 산성화를 사용하여 글리칸을 약물 물질로부터 효소적으로 절단하였다. 이어서 글리칸을 고체상-추출하고, 슈퍼 3,4-다이하이드록시벤조산 매트릭스 용액 매트릭스 용액과 혼합하고, MALDI 표적 상에서 공-침전시켰다. 이러한 건조된 샘플을 레이저를 사용하여 ToF 질량 분광계 내에서 이온화시켰다. m/z (M+Na) + 스펙트럼을 수집하였다.
2-AB 표지된 N-연결된 올리고사카라이드 프로파일링( HPLC )
글리코폼의 유형 및 각각의 글리코폼의 상대적인 백분율을 2-AB 표지 및 HPLC 분석법에 의해서 분석하였다. 그 결과를 표 29에 나타낸다. 동일한 체류 시간에서 유사한 상대적인 백분율을 갖는 피크가 모든 배취(데이터 나타내지 않음)에서 관찰되었는데, 이는 동일한 유형의 올리고사카라이드 및 유사한 수준을 제안한다. 배취 #36 샘플을 다음 날에 작동시켰다. 예로서, 주 글리코폼 FA2의 백분율을 효소 활성에 대해서 플로팅하였다. 백분율 FA2 및 비활성도(pNPP), HA 결합, Km, 및 K촉매(데이터 나타내지 않음) 간에는 어떤 상관관계도 관찰되지 않았다.
이 검정법은 형광 태깅된 유리-올리고사카라이드의 체류 시간 및 피크 면적을 기초로 약물 분자와 연관된 올리고사카라이드를 측정함으로써 글리코실화 패턴을 특징 규명한다. 약물 물질로부터의 유리 올리고사카라이드를 효소적으로 방출시키고, 환원성 아미노화(amination)에 의해서 2-아미노벤즈아마이드(2-AB)로 태깅하였다. 이어서, 샘플을 루더 칼럼이 구비된 HPLC 시스템 상에 주입하고, 2AB 태깅된 올리고사카라이드를 분리하고, 형광 검출기; 330nm 여기, 420nm 방출을 사용하여 검출하였다. 각각의 배취의 크로마토그램을 비교하였고, 각각의 해석된 피크의 피크 면적을 사용하여 각각의 배취로부터의 올리고사카라이드의 상대적인 양을 측정하였다.
UPLC - QToF -MS에 의한 글리코펩타이드 프로파일
UPLC-MS에 의한 글리코펩타이드의 분석에 의해서 각각의 글리코실화 부위에서 올리고사카라이드 프로파일을 평가하였다. 조직 비-특이적 알칼린 포스파타제(TNAP)는 5개의 N-글리코실화 부위를 갖는다(문헌[pp 54-55 of 2006 Wiley-VCH] 참고). 아스포타제 알파는 Fc 영역 내에 추가적인 N-글리코실화 부위를 함유하며, 이는 단량체당 총 6개의 N-글리코실화 부위를 제공한다. 도 44 내지 도 49는 T15-16에서 N123, T26-27에서 N213, T33에서 N254, T35에서 N286, T45-46에서 N413 및 T55에서 N564에 대한 글리코펩타이드 핑거프린트 프로파일을 나타낸다. 합쳐진 N-연결된 올리고사카라이드의 UPLC-Q-ToF-MS 글리코펩타이드 핑거프린트는 N-글리코실화의 상세한 특징 규명을 제공하였다. 원(raw) 글리코펩타이드 질량 핑거프린트 스펙트럼에서 관찰된 다중 전하 상태를 각각의 부위에 대해서 단일 하전되고 탈동위원소화된 스펙트럼으로 변환시킴으로써 각각의 종의 질량 분석법 및 상대적인 정량분석에 의한 글리코펩타이드 종의 식별을 수행하였다. 이들 변환의 결과를 표 29에 나타낸다. 그것은 글리코폼에 대해서 관찰된 모든 질량 및 각각의 관찰된 N-연결된 올리고사카라이드 부위에서 총 글리코폼 함량에 5% 이상으로 기여하는 글리코폼에 대한 이의 상대적인 %를 열거한다. 이 검정법에서, 아스포타제 알파를 환원 및 알킬화시키고, 이어서 트립신으로 분해시켰다. 양성 이온 전자분사 모드로 작동하는, 워터스 어퀴티 UPLC 및 시납트 Q-ToF 질량 분광계를 사용하는 ESI-Q-ToF-MS에 의해서 검출을 수행하였다. 아스포타제 알파의 이론적인 서열 및 예상되는 트립신 분해 절단을 분석법을 위해서 사용하였다. 이론적인 글리코펩타이드에 대한 분자량을 NIST 분자량 및 동위원소 백분율을 사용하여 계산하였다. 글리코펩타이드는 밀접하게 관련된 용리 시간을 갖는 관련된 글리코폼의 수집물로서 관찰되고, 따라서 특정 부위에 대한 완전한 글리코펩타이드 보체가 관찰되는 것을 보장하는 스펙트럼의 합계가 요구된다. 시험된 각각의 배취에 대해서 아스포타제 알파에서 N-연결된 올리고사카라이드 부위를 각각 함유하는 가장 풍부한 펩타이드 종 각각에 대해서 부위-특이적의 합계 스펙트럼(글리코펩타이드 질량 핑거프린트)을 수득하였다.
총 시알산 함량( TSAC )
총 시알산 함량을 HPAE-PAD에 의해서 측정하였다. 표 29에 나타낸 바와 같이, 각각의 배취에 대한 시알산 함량은 단량체 몰당 0.9 내지 3.5몰의 시알산의 규격 이내이다. 시알산의 상대적으로 더 적은 양으로 인한 시알산 함량의 변동을 고려하여, 2K 배취 및 20K 배취는 대등하였다. TSAC 값 및 비활성도(pNPP), HA 결합, Km, 및 K촉매 간에는 어떤 상관관계도 관찰되지 않았다.
활성
비활성도( pNPP )
아스포타제 알파의 비활성도를 3개의 20K 배취 및 3개의 2K 배취에 대해서 측정하였다. 20K 배취의 평균 비활성도는 981.7U/㎎이고, 3개의 2K 배취의 경우 861.7U/㎎이다. 모든 배취의 비활성도는 620 내지 1250U/㎎의 규격 이내였고, 이것은 20K 배취 및 2K 배취에 대해서 대등하였다. 이러한 방법은 기질로서 pNPP를 사용하는 아스포타제 알파 효소 활성의 측정을 위해서 사용된다. 아스포타제 알파는 인간 조직 비-특이적 알칼린 포스파타제 효소로부터의 하나의 도메인을 갖는 재조합 단백질이다. 이 도메인은 촉매 활성이고, 포스페이트 에스터를 가수분해시킨다. 검정법을 효소 포화에서 수행하여 측정 기간 동안 V최대에 도달하고 유지시킨다. pNPP는 황색 생성물(405nm에서 최대 흡광도)로 가수분해된다. 반응 속도는 효소 활성에 정비례한다. 1 유닛(U)은 사용된 방법 조건 하에서 분당 형성된 pNPP 1μ㏖에 상응한다. pNPP에 의한 비활성도(단백질 ㎎ 당 효소 활성)는 효소 활성 및 A280에 의한 단백질 농도로부터 계산하였다. 그 결과를 표 29에 나타낸다.
수산화인회석 결합
아스포타제 알파 2K 배취의 HA 결합 검정법에 의해서 측정된 % 수산화인회석 결합은 20K 배취에서와 대등하였고, 모든 값은 85 내지 97% 범위였다. 평균 % HA 결합은 20K 배취 및 2K 배취 둘 모두의 경우 91%이다(표 29). HA 결합 검정법은 수산화인회석에 결합될 때 pNPP에 대한 아스포타제 알파 복합체의 효소 활성을 측정한다. 아스포타제 알파에 의해서 가수분해될 때, 합성 기질, 파라-나이트로페닐 포스페이트(pNPP)는 405nm에서의 흡광도에 의해서 정량분석될 수 있는 황색 생성물을 생성한다. 반응 기간 동안 V최대에 도달하고 이것을 유지하기 위해서 이러한 검정법을 기질 포화에서 수행하였다.
생리학적 관련 물질을 사용한 PPi 효소 동역학 검정법
동역학 파라미터 Km 및 K촉매를 PPi 동역학 검정법에 의해서 측정하였다. 샘플을 참조 표준품을 사용하여 여러 번 헤드-투-헤드로 작동시켰다. 비교를 위해서, Km 및 K촉매를 샘플 시험 시에 실시된 참조 표준값의 백분율로서 그래프화한다(표 29). 모든 Km 값은 병렬로 실시된 참조 표준값의 30% 이내였고, 이는 대등한 것으로 간주된다. 모든 K촉매 값은 병렬로 실시된 참조 표준품의 20% 이내였고, 이는 대등한 것으로 간주된다. 2K 배취에 대한 참조군의 Km % 및 K촉매 %는 20K 배취에 대해서와 대등하였다. PPi 동역학 검정법은 PPi, 중성 알칼린 포스파타제 기질을 사용하여 정제된 아스포타제 알파 효력(효소 활성)을 측정하고, 생리 조건(37℃, pH 7.4) 하에서 PPi 가수분해의 동역학 상수 Km 및 K촉매를 결정한다.
알파 온도 강제 분해
2K 배취 및 20K 배취의 동등성을 추가로 보장하기 위해서, 병렬 강제 분해 연구를 수행하여 분해 경로 및 동역학을 비교하였다. 표 33에 상술된 3개의 2K 배취(#35, #36, 및 #38) 및 3개의 20K 배취(#40, #42, 및 #34)를 본 연구를 위해서 사용하였다. 일부 배취는 제한된 BDS 샘플 입수 가능성으로 인해서 의약품(DP) 물질의 사용을 필요로 하였다.
배취 #35, #36, #40, #42, 및 #34를 아스포타제 알파 제형 완충제(25mM 인산나트륨 및 150mM 염화나트륨, pH 7.4)를 사용하여 40㎎/㎖로 희석시켜 배취 #38의 단백질 농도를 맞추었다. 분해 동역학을 설립하기 위한 분해의 실질적인 수준을 달성하기 위해서, 예비 강제 분해 조건 스크리닝을 기초로 강제 분해 조건을 선택하였다. 분취물(200㎕)을 각각의 시간 지점(0, 14, 24 및 48시간)에서 각각의 시험 검정법을 위해서 생성하였다. T0 분취물을 시험 시까지 5℃에서 유지시켰다. 나머지 샘플 분취물을 40℃에서 14, 24 및 48시간 동안 인큐베이션시켰다. 샘플을 표 30에 열거된 바와 같은 SDS-PAGE, GP-HPLC, AEX, RP-HPLC, 펩타이드 맵핑, 및 효력에 의해서 분석하여 동등성을 결정하였다. 온도 강제 분해 연구에 대한 시험 결과를 3개의 20K 및 3개의 2K 배취에 대해서 표 31에 열거한다.
SDS-PAGE (비-환원 및 환원)
T0 및 T48시간 샘플을 순도에 대해서 SDS-PAGE(비-환원 및 환원)에 의해서 분석하였다. 비-환원 SDS-PAGE에 의한 주 밴드 %는 T=0에 모든 배취에 대해서 100%였고, 표 31에 표시된 바와 같이 20K 배취의 경우 97.3%의 평균으로 감소되었고, 2K 배취의 경우 96.8%의 평균으로 감소되었다. 분해 경향성은 20K 배취 및 2K 배취에 대해서 대등하다. 고 분자량 종이 6개의 배취 모두에 대해서 T48 시간에 검출되었다. 이러한 종은 환원 시 사라졌다. 이러한 결과는, 다이설파이드 결합-관련 응집물의 형성이 모든 배취에 대한 분해 경로임을 제안한다. T=0 및 T=48 시간에서 20K 배취 및 2K 배취 둘 모두에 대해서 환원 SDS-PAGE에 의해서 추가의 밴드가 관찰되지 않았는데, 이는 펩타이드 결합이 분해되지 않았음을 나타낸다. 이 시험은 단백질의 분자량을 기초로 단백질을 분리하고, 백분율 주 밴드로서 표현되는 미손상 단백질의 순도의 분석법을 제공한다. 단백질 샘플을 겔 상에서 분리하고, 시각화를 위해서 쿠마시 블루 스테인으로 염색하고, 탈염색하고, 농도계에 의해서 분석한다. 아스포타제 알파의 분자량, 분해 생성물, 및 방법 관련 불순물을 알고 있는 분자량 표준품과의 비교에 의해서 예측한다. 스캐닝 및 농도계 분석법에 의한 분석에 의해서 분리된 단백질의 정량 측정을 수행하였다.
GP - HPLC
열 응력에 의해서 유발되는 응집물 및 단편을 형성하기 위한 분해를 GP-HPLC에 의해서 모니터링하고, 그 결과를 표 31에 나타낸다. T=0에서 모든 배취에 대한 피크 프로파일은 유사하였는데, 이는 동일한 종의 존재를 제안한다. 열 응력은 대략 6분에 큰 응집물에 상응하는 피크의 출현을 유발하였는데, 이는 시간에 따라서 증가되었다. T=14시간, T=24시간 및 T=48시간에서 모든 배취의 피크 프로파일은 유사하였는데, 이는 유사한 분해 경로를 나타낸다. 모든 배취에 대해서 시간에 따른 주 피크의 감소 기울기는 사용된 물질이 상이한 연령이라는 것을 고려할 때 유사하였다. 유사한 기울기는 유사한 분해 동역학을 나타낸다.
음이온 교환 크로마토그래피( AEX )
아스포타제 알파의 분해를 또한 AEX에 의해서 모니터링하였는데, 이것은 전하를 기초로 단백질을 분리한다. T=0에서 모든 배취에 대해서 동일한 피크 프로파일이 관찰되었는데, 이는 모든 배취 중의 동일한 종을 제안한다. 열 응력은 대략 22 내지 26분의 체류 시간 창에서 피크의 증가를 유발하였다. 모든 배취에 대한 대등한 피크 프로파일이 T=14시간, T=24시간 및 T=48시간에서 모든 배취에 대해서 관찰되었는데, 이는 열 분해에 의한 동일한 종의 형성을 나타낸다. T=0에서의 약간의 차이(이미 개시된 바와 같음) 및 상이한 배취의 연령 차이를 고려하면, 주 피크의 감소에 의해서 모니터링된, 분해의 유사한 기울기가 모든 배취에 대해서 관찰되었다.
RP- HPLC
RP-HPLC에 의해서 분석되는 경우, 대략 21.2 내지 21.3분의 체류 시간 창의 평균 피크가 모든 배취에 대해서 관찰되었는데, 이는 모든 배취에서의 동일한 종을 나타낸다. 주 피크는 T=0에서 모든 배취에 대해서 관찰된 유일한 주요 피크였다. 열 응력은 주 피크 직후에 용리되는 피크의 증가를 유발하였다. T=14, T=24 및 T=48시간에서 모든 배취에 대해서 관찰된 열 분해로부터의 동일한 피크는 동일한 분해 경로를 제안한다. 주 피크의 감소에 의해서 모니터링되는 바와 같은 분해 동역학은 모든 배취의 유사한 기울기에 의해서 증명되는 바와 같이 모든 배취에 대해서 대등하였다.
펩타이드 맵핑
잠재적인 화학적 분해를 평가하기 위해서 20K 배취 및 2K 배취에 대한 T0, T24 및 T48시간 샘플을 펩타이드 맵핑에 의해서 분석하였다. 모든 시간 지점(T=0시간 및 T=48시간)에서 20K와 2K 간에 상당한 차이가 관찰되지 않았다. 이 방법은 구아니딘 염화수소, 다이싸이오트레이톨 및 아이오도아세테이트로 단백질을 변성, 환원 및 알킬화시키고, 그 다음 프로테아제 트립신으로 분해시킨다. 생산된 펩타이드 단편을 구배 역상 HPLC에 의해서 분리하고, 210nm에서 검출한다.
비활성도( pNPP )
각각의 시간 지점(T0, T14, T24, 및 T48)에서 40℃에서 인큐베이션시킨 후 효소 검정법에 의해서 아스포타제 알파 20K 배취 및 2K 배취의 비활성도(pNPP)를 측정하였다. 20K 배취의 활성은 각각의 시간 지점에서 2K 배취와 대등하였다. 열 응력에 의해서 유발된 활성 감소는 시간에 따라서 모든 배취에 대해서 유사한 기울기를 따른다. 단백질 포스파타제, 효소는 단백질 분자로부터의 포스페이트(PO4 3-) 기의 제거를 제어한다. pNPP 포스파타제 검정법을 사용하여 포스파타제 활성을 검출하고, 20K 배취 및 2K 배취를 비교하였다. 이러한 방법은 기질로서 pNPP를 사용하는 아스포타제 알파 효소 활성의 측정을 위해서 사용된다. 아스포타제 알파는 인간 조직 비-특이적 알칼린 포스파타제 효소로부터의 하나의 도메인을 갖는 재조합 단백질이다. 이 도메인은 촉매 활성이고, 포스페이트 에스터를 가수분해시킨다. 검정법을 효소 포화에서 수행하여 측정 기간 동안 V최대에 도달하고 유지시킨다. pNPP는 황색 생성물(405nm에서 최대 흡광도)로 가수분해된다. 반응 속도는 효소 활성에 정비례한다. 1유닛(U)은 사용된 방법 조건 하에서 분당 형성된 pNPP 1μ㏖에 상응한다. pNPP에 의한 비활성도(단백질 ㎎ 당 효소 활성)는 효소 활성 및 A280에 의한 단백질 농도로부터 계산한다.
20K 규모로 제조된 아스포타제 알파와 2K 규모로 제조된 아스포타제 알파의 동등성을 확립하였다. 가능한 경우 물리화학적 방법을 사용하여 각각의 규모로부터의 3개의 배취를 병렬로 분석하여 아스포타제 알파 순도, 불순물, 전하 변이체, 크기, 구조, 글리코실화, 다이설파이드 결합, 유리 싸이올 및 활성을 평가하였다. 또한, 병렬 강제 분해 연구를 수행하여 분해 경로 및 동역학을 평가하였다. 결과는, 20K 규모 및 2K 규모로 제조된 생성물이 대등하였음을 예증한다.
배취의 순도를 분석적 초원심분리, SDS-PAGE/LoC, SDS-PAGE, GP-HPLC, 및 AEX에 의해서 평가하였다. 결과는 모든 배취에 대해서 대등한 순도를 나타내었다. 매우 낮은 대등한 수준의 동일한 유형의 응집물이 모든 배취에서 AUC, SDS-PAGE 및 GP-HPLC에 의해서 검출되었다.
재조합 단백질에 대해서 일반적인, 전하 변이체를 cIEF에 의해서 평가하였다. 대등한 수준의 동일한 종이 모든 배취에 대해서 관찰되었는데, 이는 번역후 변형의 일관된 수준을 제안한다.
배취의 분자 크기를SEC-MALS, 및 미손상 MALDI-ToF 분자량에 의해서 평가하였다. 아이덴터티를 탈글리코실화/환원 및 탈글리코실화 MALDI-ToF 분자량 및 탈글리코실화/환원 및 탈글리코실화 ESI-ToF 분자량에 의해서 확인하였다. 구조를 또한 CD, 다이설파이드 결합 및 유리 싸이올(LC/MS), 총 유리 싸이올 검정법, 금속 함량 분석법(ICP-MS/ICP-AES), 및 포스포릴화 부위 점유에 의해서 평가하였다. 대등한 분자량 및 대등한 수력학적 크기가 모든 배취에 대해서 수득되었는데, 이는 모든 배취의 아스포타제 알파의 유사한 변형 및 유사한 컨포메이션을 나타낸다.
아스포타제 알파 글리코실화를 MALDI-ToF 유리 글리칸, 2AB 표지된 올리고사카라이드 fHPLC, LC-MS 글리코펩타이드 분석법, 및 총 시알산 함량에 의해서 평가하였다. 대등한 수준의 동일한 올리고사카라이드 종이 모든 배취에 대해서 수득되었다.
약물 물질의 활성을 비활성도(pNPP), HA 결합 및 PPi 활성에 의해서 평가하였다. 결과는, 아스포타제 알파 20K 배취가 아스포타제 알파 2K 배취와 대등하였음을 나타내었다.
마지막으로, 20K 배취 및 2K 배취의 동일한 분해 경로 및 유사한 분해 동역학이 열 응력을 사용한 병렬 강제 분해 연구에 의해서 관찰되었다.
요약하면, 아스포타제 알파 20K 배취 및 2K 배취는 다중 직교 방법 및 병렬 강제 분해 연구를 사용한 확장된 특징 규명에 의해서 입증된 바와 같이 대등하다. 따라서, 20K 배취로부터의 물질은 2K 배취로부터의 물질과 대등한 안전성 및 효율을 가질 것이다.
실시예 10. 2,000L (2K) 규모 및 20,000L(20K) 규모에서 제조된 아스포타제 알파의 추가적인 동등성
아스포타제 알파의 7개의 배취를 20,000L 규모로 생산하였고, 아스포타제 알파의 5개의 추가 배취를 2,000L 규모를 사용하여 생산하였다. 두 규모 모두에 대한 생성물을 분석하였고, 대등한 것을 발견하였다(데이터 나타내지 않음).
SEQUENCE LISTING <110> ALEXION PHARMACEUTICALS, INC. <120> MANUFACTURING OF ALKALINE PHOSPHATASES <130> WO/2017/031114 <140> PCT/US2016/047166 <141> 2016-08-16 <150> US 62/206,001 <151> 2015-08-17 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 726 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 1 Leu Val Pro Glu Lys Glu Lys Asp Pro Lys Tyr Trp Arg Asp Gln Ala 1 5 10 15 Gln Glu Thr Leu Lys Tyr Ala Leu Glu Leu Gln Lys Leu Asn Thr Asn 20 25 30 Val Ala Lys Asn Val Ile Met Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Val Ser 35 40 45 Thr Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu Lys Gly Gln Leu His His Asn Pro 50 55 60 Gly Glu Glu Thr Arg Leu Glu Met Asp Lys Phe Pro Phe Val Ala Leu 65 70 75 80 Ser Lys Thr Tyr Asn Thr Asn Ala Gln Val Pro Asp Ser Ala Gly Thr 85 90 95 Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Ala Asn Glu Gly Thr Val Gly 100 105 110 Val Ser Ala Ala Thr Glu Arg Ser Arg Cys Asn Thr Thr Gln Gly Asn 115 120 125 Glu Val Thr Ser Ile Leu Arg Trp Ala Lys Asp Ala Gly Lys Ser Val 130 135 140 Gly Ile Val Thr Thr Thr Arg Val Asn His Ala Thr Pro Ser Ala Ala 145 150 155 160 Tyr Ala His Ser Ala Asp Arg Asp Trp Tyr Ser Asp Asn Glu Met Pro 165 170 175 Pro Glu Ala Leu Ser Gln Gly Cys Lys Asp Ile Ala Tyr Gln Leu Met 180 185 190 His Asn Ile Arg Asp Ile Asp Val Ile Met Gly Gly Gly Arg Lys Tyr 195 200 205 Met Tyr Pro Lys Asn Lys Thr Asp Val Glu Tyr Glu Ser Asp Glu Lys 210 215 220 Ala Arg Gly Thr Arg Leu Asp Gly Leu Asp Leu Val Asp Thr Trp Lys 225 230 235 240 Ser Phe Lys Pro Arg Tyr Lys His Ser His Phe Ile Trp Asn Arg Thr 245 250 255 Glu Leu Leu Thr Leu Asp Pro His Asn Val Asp Tyr Leu Leu Gly Leu 260 265 270 Phe Glu Pro Gly Asp Met Gln Tyr Glu Leu Asn Arg Asn Asn Val Thr 275 280 285 Asp Pro Ser Leu Ser Glu Met Val Val Val Ala Ile Gln Ile Leu Arg 290 295 300 Lys Asn Pro Lys Gly Phe Phe Leu Leu Val Glu Gly Gly Arg Ile Asp 305 310 315 320 His Gly His His Glu Gly Lys Ala Lys Gln Ala Leu His Glu Ala Val 325 330 335 Glu Met Asp Arg Ala Ile Gly Gln Ala Gly Ser Leu Thr Ser Ser Glu 340 345 350 Asp Thr Leu Thr Val Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Thr Phe 355 360 365 Gly Gly Tyr Thr Pro Arg Gly Asn Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro Met 370 375 380 Leu Ser Asp Thr Asp Lys Lys Pro Phe Thr Ala Ile Leu Tyr Gly Asn 385 390 395 400 Gly Pro Gly Tyr Lys Val Val Gly Gly Glu Arg Glu Asn Val Ser Met 405 410 415 Val Asp Tyr Ala His Asn Asn Tyr Gln Ala Gln Ser Ala Val Pro Leu 420 425 430 Arg His Glu Thr His Gly Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ser Lys Gly 435 440 445 Pro Met Ala His Leu Leu His Gly Val His Glu Gln Asn Tyr Val Pro 450 455 460 His Val Met Ala Tyr Ala Ala Cys Ile Gly Ala Asn Leu Gly His Cys 465 470 475 480 Ala Pro Ala Ser Ser Leu Lys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 485 490 495 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 500 505 510 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 515 520 525 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 530 535 540 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 545 550 555 560 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 565 570 575 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 580 585 590 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 595 600 605 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 610 615 620 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 625 630 635 640 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 645 650 655 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 660 665 670 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 675 680 685 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 690 695 700 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Asp Ile Asp Asp Asp Asp 705 710 715 720 Asp Asp Asp Asp Asp Asp 725

Claims (51)

  1. a. 100L 내지 25,000L의 유가식 생물반응기(fed-batch bioreactor)를 제공하는 단계로서, 상기 유가식 생물반응기는,
    i. 서열번호 1의 서열을 갖는 재조합 아스포타제 알파 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있는 세포, 및
    ii. 상기 발현을 수행하기에 적합하고, 약 25μM 내지 약 300μM의 아연을 포함하는 배양 배지를 포함하는, 상기 유가식 생물반응기를 제공하는 단계;
    b. 상기 세포를 상기 재조합 아스포타제 알파 폴리펩타이드를 발현시키기에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계로서; 상기 배양 배지의 pH는 약 6.7 내지 약 7.1이고, 아연은 상기 배양 배지 중의 아연 농도가 약 25μM 내지 약 300μM의 아연 농도로 유지되도록 상기 배양 배지 중에 첨가된, 상기 배양하는 단계
    를 포함하는, 재조합 아스포타제 알파 폴리펩타이드의 생산 방법이며,
    상기 재조합 아스포타제 알파 폴리펩타이드는 1.8 ㏖ 시알산/단백질 단량체 ㏖의 최소 총 시알산 함량(TSAC)을 포함하는 것인,
    재조합 아스포타제 알파 폴리펩타이드의 생산 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 배양 배지 중의 상기 아연 농도는 약 25μM 내지 약 150μM의 아연 농도로 유지되는, 재조합 아스포타제 알파 폴리펩타이드의 생산 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 배양 배지 중의 상기 아연 농도는 약 60μM 내지 약 150μM의 아연 농도로 유지되는, 재조합 아스포타제 알파 폴리펩타이드의 생산 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 배양 배지 중의 상기 아연 농도는 약 28μM의 아연 농도로 유지되는, 재조합 아스포타제 알파 폴리펩타이드의 생산 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 배양 배지의 상기 pH는 약 6.8 내지 약 7.0으로 유지되는, 재조합 아스포타제 알파 폴리펩타이드의 생산 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 배양 배지의 상기 pH는 약 6.9로 유지되는, 재조합 아스포타제 알파 폴리펩타이드의 생산 방법.
  7. 제1항에 있어서, 아연을 상기 배양 배지 중에 적어도 하나의 볼러스(bolus)로, 연속적으로 또는 반-연속적으로 첨가하는, 재조합 아스포타제 알파 폴리펩타이드의 생산 방법.
  8. 제1항에 있어서, 배양 동안 적어도 1개, 2개, 3개 또는 4개의 공급 볼러스(들)를 상기 배양 배지에 첨가하는 단계를 더 포함하는, 재조합 아스포타제 알파 폴리펩타이드의 생산 방법.
  9. 제8항에 있어서, 적어도 4개의 공급 볼러스를 상기 배양 배지에 첨가하는, 재조합 아스포타제 알파 폴리펩타이드의 생산 방법.
  10. 제8항에 있어서, 공급 볼러스는 아연, 아미노산 및 비타민 중 하나 이상을 포함하고, 공급 볼러스의 첨가는 재조합 아스포타제 알파 폴리펩타이드의 비활성도(specific activity)를 개선시키는, 재조합 아스포타제 알파 폴리펩타이드의 생산 방법.
  11. 제1항에 있어서, 적어도 약 2.5 x 106개의 생존 가능한 세포의 세포 밀도에 도달할 때까지 상기 세포를 제1 온도에서 배양하는 단계, 및 재조합 폴리펩타이드 발현을 위해서 상기 제1 온도보다 더 낮은 제2 온도로 이동시키는 단계를 더 포함하는, 재조합 아스포타제 알파 폴리펩타이드의 생산 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 제1 온도는 약 35℃ 내지 약 37.5℃인, 재조합 아스포타제 알파 폴리펩타이드의 생산 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 제2 온도는 약 29℃ 내지 약 35℃인, 재조합 아스포타제 알파 폴리펩타이드의 생산 방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 제1 온도는 약 37℃이고, 상기 제2 온도는 약 30℃인, 재조합 아스포타제 알파 폴리펩타이드의 생산 방법.
  15. 제11항에 있어서, 상기 제1 온도는 약 36.5℃이고, 상기 제2 온도는 약 33℃인, 재조합 아스포타제 알파 폴리펩타이드의 생산 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 세포는 CHO, NS0/1, PER.C6, COS-7, 인간 배아 신장 세포주(kidney line), BHK, TM4, CVl, VERO-76, HeLa, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, MMT 060562, TRI, MRC 5, FS4 세포, 및 Hep G2 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 아스포타제 알파 폴리펩타이드의 생산 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    a) 상기 세포는 CHO 세포이거나;
    b) 상기 인간 배아 신장 세포주는 293이거나 현탁 배양물 중에서의 성장을 위해서 서브클로닝된 293 세포인,
    재조합 아스포타제 알파 폴리펩타이드의 생산 방법.
  18. 서열번호 1의 서열을 갖는 재조합 아스포타제 알파 폴리펩타이드 및/또는 재조합 아스포타제 알파 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있는 세포를 포함하는 유가식 생물반응기로서, 상기 생물반응기는 약 25μM 내지 약 300μM의 아연을 포함하는 적어도 100L의 배양 배지의 부피를 포함하고, 상기 배양 배지의 pH는 6.7 내지 7.1이며, 상기 재조합 아스포타제 알파 폴리펩타이드는
    (i) 620 내지 1250유닛/㎎의 p-나이트로페닐 포스페이트(pNPP) 비활성도; 및
    (ii) 1.8 내지 3.0㏖ 시알산/단백질 단량체 ㏖의 평균 총 시알산 함량(TSAC) 값
    을 갖는, 유가식 생물반응기.
  19. 제18항에 있어서, 상기 배양 배지는 포유동물 세포 배양물을 포함하고, 상기 재조합 아스포타제 알파 폴리펩타이드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는, 유가식 생물반응기:
    a) 등전점 맞춤(isoelectric focusing: IEF) 약 5.2 내지 약 6.7;
    b) 도 41 또는 도 42에 제시된 바와 같은 주 글리칸 구조;
    c) 도 38 또는 도 39에 제시된 바와 같은 2-AB 표지된 올리고사카라이드 크로마토그램 프로파일;
    d) 도 40 또는 도 44 내지 도 49에 도시된 바와 같은 MALDI-ToF 글리코펩타이드 핑거 프린팅 프로파일;
    e) 약 88 내지 108kDa의 분자량 및 생산된 재조합 아스포타제 알파 폴리펩타이드의 총량의 약 85% 이상을 갖는 환원 SDS-PAGE 상의 주 밴드;
    f) 약 194 내지 273kDa의 분자량 및 생산된 재조합 아스포타제 알파 폴리펩타이드의 총량의 약 85% 이상을 갖는 비-환원 SDS-PAGE 상의 주 밴드;
    g) 크기 배제 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해서 재조합 아스포타제 알파 폴리펩타이드의 이량체 약 95.0% 이상 및 응집물 약 5.0% 이하;
    h) 역상 고압 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)를 통해서 순도 약 95.0% 이상;
    i) 음이온 교환 크로마토그래피(AEX)를 통해서 주 피크 약 90.0% 이상, 산성 피크 약 6.0% 이하, 및 염기성 피크 약 4.0% 이하;
    j) 수산화인회석(HA) 결합 백분율 약 75 내지 약 125%;
    k) 무기 파이로포스페이트(PPi) 가수분해 검정법에서 Km 약 13μM 내지 약 69μM;
    l) 무기 파이로포스페이트(PPi) 가수분해 검정법에서 K촉매 약 65s-1 내지 약 165s-1;
    m) 모세관 전기이동 상의 모든 피크에 대한 pI 범위 약 6.45 내지 약 6.95;
    n) 탈글리코실화 후 도 34A에 제시된 바와 같은 MALDI-ToF 질량 스펙트럼 상의 피크;
    o) 환원 및 탈글리코실화 후 도 34B에 제시된 바와 같은 MALDI-ToF 질량 스펙트럼 상의 피크;
    p) 도 35에 제시된 바와 같은 MALDI-ToF 질량 스펙트럼 상의 피크;
    q) 도 36에 제시된 바와 같은 포스포릴화 프로파일;
    r) 도 37A에 제시된 바와 같은 음성 MALDI-ToF 질량 스펙트럼 상의 시알릴화 글리칸 프로파일;
    s) 도 37B에 제시된 바와 같은 양성 MALDI-ToF 질량 스펙트럼 상의 중성 글리칸 프로파일;
    t) 재조합 아스포타제 알파 폴리펩타이드 몰당 마그네슘 몰비 약 0.03 내지 약 0.15;
    u) 재조합 아스포타제 알파 폴리펩타이드 몰당 칼슘 몰비 약 0.5 내지 약 1.5; 및
    v) 재조합 아스포타제 알파 폴리펩타이드 몰당 아연 몰비 약 0.5 내지 약 3.0.
  20. 제18항에 있어서, 상기 재조합 아스포타제 알파 폴리펩타이드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는, 유가식 생물반응기:
    a) 절반 분자당 약 0.7 내지 약 1.19개의 유리 시스테인;
    b) 약 13.5% 내지 약 35.7%의 재조합 아스포타제 알파 폴리펩타이드의 Ser 93에서의 포스포릴화;
    c) AEX 크로마토그램 상에 약 90.0% 이상의 주 피크, 약 6.0%의 이하의 산성 피크, 및 약 4.0% 이하의 염기성 피크;
    d) AEX 크로마토그램 상에 약 93.7% 이상의 주 피크, 약 4.9% 이하의 산성 피크, 및 약 3.4% 이하의 염기성 피크;
    e) 약 0.15 미만의 마그네슘의 몰비;
    f) 크기 배제 HPLC에 의해서 측정되는 경우 적어도 약 95.0%의 상기 재조합 아스포타제 알파 폴리펩타이드의 이량체 및 약 5.0% 이하의 폴리펩타이드 응집물;
    g) RP-HPLC에 의해서 측정되는 경우 약 95.0% 이상의 순도; 및
    h) 약 75 내지 약 125%의 평균 수산화인회석(HA) 결합 백분율.
  21. 제20항에 있어서,
    a) 평균 총 시알산 함량(TSAC) 값은 약 1.9 내지 약 2.7㏖ 시알산/단백질 단량체 ㏖, 또는 약 1.85 내지 약 2.28㏖ 시알산/단백질 단량체 ㏖이거나;
    b) 마그네슘의 몰비는 약 0.05 내지 약 0.10이거나, 또는 약 0.12이거나;
    c) 재조합 아스포타제 알파 폴리펩타이드는 적어도 약 96.8%의 이량체 및 약 3.2% 이하의 폴리펩타이드 응집물, 또는 적어도 약 97.6%의 이량체 및 약 2.4% 이하의 응집물을 포함하거나;
    d) P-HPLC에 의해서 측정되는 경우 순도는 약 97.6% 이상이거나;
    e) 평균 HA 결합은 약 85% 내지 약 97% 또는 약 90% 내지 약 91%이거나;
    f) 평균 비활성도(pNPP)는 약 904.0 내지 약 907.7U/㎎인,
    유가식 생물반응기.
  22. 제18항에 있어서, 200L 내지 20,000L 또는 2,000L 내지 20,000L인 유가식 생물반응기.
  23. 서열번호 1을 갖는 재조합 아스포타제 알파 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물로서, 상기 재조합 아스포타제 알파 폴리펩타이드는
    (i) 620 내지 1250유닛/㎎의 p-나이트로페닐 포스페이트(pNPP) 비활성도;
    (ii) 1.8 내지 3.0㏖ 시알산/단백질 단량체 ㏖의 평균 총 시알산 함량(TSAC) 값
    을 갖고;
    (iii) 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는, 약제학적 조성물:
    a) 등전점 맞춤(IEF) 약 5.2 내지 약 6.7;
    b) 도 41 또는 도 42에 제시된 바와 같은 주 글리칸 구조;
    c) 도 38 또는 도 39에 제시된 바와 같은 2-AB 표지된 올리고사카라이드 크로마토그램 프로파일;
    d) 도 40 또는 도 44 내지 도 49에 도시된 바와 같은 MALDI-ToF 글리코펩타이드 핑거 프린팅 프로파일;
    e) 약 88 내지 108kDa의 분자량 및 생산된 재조합 아스포타제 알파 폴리펩타이드의 총량의 약 85% 이상을 갖는 환원 SDS-PAGE 상의 주 밴드;
    f) 약 194 내지 273kDa의 분자량 및 생산된 재조합 아스포타제 알파 폴리펩타이드의 총량의 약 85% 이상을 갖는 비-환원 SDS-PAGE 상의 주 밴드;
    g) 크기 배제 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해서 재조합 아스포타제 알파 폴리펩타이드의 이량체 약 95.0% 이상 및 응집물 약 5.0% 이하;
    h) 역상 고압 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)를 통해서 순도 약 95.0% 이상;
    i) 음이온 교환 크로마토그래피(AEX)를 통해서 주 피크 약 90.0% 이상, 산성 피크 약 6.0% 이하, 및 염기성 피크 약 4.0% 이하;
    j) 수산화인회석(HA) 결합 백분율 약 75 내지 약 125%;
    k) 무기 파이로포스페이트(PPi) 가수분해 검정법에서 Km 약 13μM 내지 약 69μM;
    l) 무기 파이로포스페이트(PPi) 가수분해 검정법에서 K촉매 약 65s-1 내지 약 165s-1;
    m) 모세관 전기이동 상의 모든 피크에 대한 pI 범위 약 6.45 내지 약 6.95;
    n) 탈글리코실화 후 도 34A에 제시된 바와 같은 MALDI-ToF 질량 스펙트럼 상의 피크;
    o) 환원 및 탈글리코실화 후 도 34B에 제시된 바와 같은 MALDI-ToF 질량 스펙트럼 상의 피크;
    p) 도 35에 제시된 바와 같은 MALDI-ToF 질량 스펙트럼 상의 피크;
    q) 도 36에 제시된 바와 같은 포스포릴화 프로파일;
    r) 도 37A에 제시된 바와 같은 음성 MALDI-ToF 질량 스펙트럼 상의 시알릴화 글리칸 프로파일;
    s) 도 37B에 제시된 바와 같은 양성 MALDI-ToF 질량 스펙트럼 상의 중성 글리칸 프로파일;
    t) 재조합 아스포타제 알파 폴리펩타이드 몰당 마그네슘 몰비 약 0.03 내지 약 0.15;
    u) 재조합 아스포타제 알파 폴리펩타이드 몰당 칼슘 몰비 약 0.5 내지 약 1.5; 및
    v) 재조합 아스포타제 알파 폴리펩타이드 몰당 아연 몰비 약 0.5 내지 약 3.0.
  24. 제23항에 있어서,
    a) 상기 재조합 아스포타제 알파 폴리펩타이드는 제1항의 방법으로 생성되거나,
    b) 상기 약제학적 조성물은 적어도 1종의 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 또는 부형제를 추가로 포함하는,
    약제학적 조성물.
  25. 제23항에 있어서,
    a) 대상체에서 무기 파이로포스페이트(PPi)의 절단을 증가시는데 사용되거나;
    b) 알칼린 포스파타제 결핍과 연관된 병태를 앓고 있는 대상체를 치료하는데 사용되고, 상기 대상체에게 알칼린 포스파타제 결핍과 연관된 병태를 치료하기 위한 치료적 유효량으로 투여되도록 제형화된,
    약제학적 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 알칼린 포스파타제 결핍과 연관된 병태는 저인산증(HPP) 또는 신경섬유종증 I형(NF1)인, 약제학적 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 상기 저인산증(HPP)은 주산기(perinatal), 유아, 청소년, 또는 성인 HPP인, 약제학적 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 상기 알칼린 포스파타제 결핍과 연관된 병태는 탈미네랄화된 골 기질 및/또는 골 및 치아의 저-미네랄화를 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 상기 탈미네랄화된 골 기질은 구루병 및/또는 골연화증으로 이어지는, 약제학적 조성물.
  30. 제25항에 있어서, 상기 대상체는 인간인, 약제학적 조성물.
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