KR20240037935A - 재조합 히알루로니다제의 생산 방법 - Google Patents

재조합 히알루로니다제의 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 히알루로니다제 또는 이의 변이체의 생산방법에 관한 것으로, 구체적으로 배양액 Glucose 농도를 조절하여 배양하는 조건, 감소된 배양 온도에서 특정 배양일로 배양하는 조건 등을 적용함으로써, 상기 단백질의 N-glycan의 함량을 변화시킴으로써 비활성을 10% 이상 증가시켜 품질 및 생산 수율을 향상시키는 것을 특징으로 한다.

Description

재조합 히알루로니다제의 생산 방법{Method for Producing Recombinant Hyaluronidase}
본 발명은 히알루로니다제, 특히 천연형 PH20 또는 성숙된 천연형 PH20, 또는 천연형 PH20 또는 성숙된 천연형 PH20의 아미노산 서열에 있어, 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환을 포함하고, 선택적으로 N-말단 및/또는 C-말단의 아미노산 잔기의 일부가 결실된 히알루로니다제 PH20 변이체의 생산 방법에 관한 것이다.
히알루로니다제는 세포외기질(extracellular matrix)에 위치한 히알루론산을 분해하는 효소이다. 이러한 히알루로니다제는 히알루론산을 가수분해하여 세포외기질의 히알루론산의 점성(viscosity)을 감소시켜 조직(피부)으로의 투과성(permeability)을 증가시킨다 (Bookbinder et al., 2006). 히알루로니다제는 피하 주사 [Muchmore et al., 2012] 또는 근육 내 주사 [Krantz et al., 2016]에 의해 제공되는 체액의 흡수를 향상시키고 국소 마취제의 확산을 개선하기 위해 사용되고 있다 [Clement et al., 2003]. 이러한 방식으로 피하 투여가 촉진된 약물에는 모르핀 [Thomas et al., 2009], 세프트리악손 [Harb et al., 2010], 인슐린 [Muchmore et al., 2012] 및 면역 글로불린 [Wasserman et al., 2014]이 있다. 또한, 정맥 주사 또는 혈종 확산에 조직으로 유출된 체액 또는 약물의 분산을 향상시키는 데 사용되고 있다. 히알루로니다제 중 중성 pH에서 활성을 갖고 있는 인간 PH20의 재조합 단백질은 Halozyme Therapeutic사에 의해 개발되어 Hylenex 상품명으로 판매되고 있다 (Bookbinder et al., 2006).
인간 PH20의 재조합 단백질은 효모(P. pastoris), DS-2 곤충세포, 동물세포 등에서 발현된 것이 보고되었다. 곤충세포와 효모에서 생산된 재조합 PH20 단백질은 단백질 번역 후 변형 과정에서 N-당화의 양상이 인간 PH20과 다르기 때문에 활성에도 영향을 미치며 체내에서의 부작용의 발생 우려가 존재한다.
바이오 의약품 개발의 경우 제품 일관성과 긴 유효기간은 제조 및 유연성을 제공하는 중요한 요소이다. 제조하는 동안 효소 또는 자발적 분해 및 변형으로 인해 크기 및 전하 등의 차이로 다양한 형태의 Microheterogeneity가 발생한다. 탈 아미드화 및 시알릴화와 같은 화학적 및 효소적 변형은 각각 항체에서 순 음전하를 증가시키고 pI 값을 감소시켜 산성 변이체를 형성한다 [Harris RJ et al., 2004]. 또한, C- 말단 라이신 절단은 순 양전하의 손실을 초래하고 산성 변이체 형성을 초래한다. 염기성 변이체의 형성은 C- 말단 라이신 또는 glycine amidation, succinimide 형성, 아미노산 산화 또는 시알산 제거로 인해 발생할 수 있으며, 이는 추가적인 양전하 또는 음전하를 제거하고; 두 가지 유형의 변형은 pI 값을 증가시킨다 [Harris RJ et al., 2004].
당화 (glycosylation)는 세포(진핵생물)의 단백질 번역 후 과정으로써 소포체 및 골지체에서 일어나는 반응이다. N-당화와 O-당화로 나뉘는데 이는 붙는 작용기에 따라 다르다. 세포에서 생성된 단백질에 락토스나 푸코스 등의 당이 붙는 과정을 통틀어 '당화'라고 한다. 당화 과정으로 당사슬이 단백질에 연결되면 단백질이 '폴딩'과정을 거쳐 입체적인 구조물을 형성한다. 이는 단백질이 풀어지지 않고 오랫동안 유지될 수 있는 안정성을 부여한다. 이러한 당사슬은 세포간의 의사소통과 정보교환의 역할도 하여 중요한 과정이다.
단백질에 당사슬이 부가되는 반응에는 N-결합 혹은 O결합 당질화 (N-linked or O-linked Glycosylation)의 두 가지 형태가 있다. 이 두 당질화 과정은 당 사슬 합성 및 부가 메커니즘에서 차이가 있으며, 이 중 N-당질화의 기작과 역할이 보다 잘 알려져 있다. N-당질화를 통해서 부가되는 당 사슬을 N-당사슬 (N-Glycan)이라 부르며 소포체에서 시작된다. 소포체 막에 존재하는 돌리콜 피로인산 (Dolichol Pyrophosphate, PP-Dol)에 ALG (Asparagine-Linked Glycosylation)로 명명된 일련의 ALG 효소들이 N-아세틸 글루코사민 (N-Acetylglucosamine, GlcNAc), 만노즈 (Mannose, Man), 포도당 (Glucose, Glc) 등을 부가하여, 최종적으로 지질과 연결된 올리고당 (Lipid-linked Oligosaccharide, LLO) 형태의 복합 당사슬인 Glc3Man9GlcNAc2 -PP-Dol을 합성하게 된다. 이렇게 합성된 LLO는 8개 이상의 subunit으로 구성된 올리고당 전이효소 (Oligosaccharyltransferase)에 의해서 Co-translational Translocation 기작으로 리보좀에서 소포체로 직접 번역되어 나오는 N-x-S/T를 포함하는 펩타이드의 N-당질화 서열에 전달된다. 이렇게 단백질에 부착된 N-당사슬은 소포체 안에 존재하는 글루코시다아제 (α-Glucosidase I, Gls1p; αglucosidase II, Glsp II)에 의해서 당사슬 맨 끝의 포도당부터 하나씩 제거된다. 두 번째와 세 번째 포도당이 좀 더 천천히 제거되면서 Lectin Chaperone인 Calnexin/Calreticulin의 도움으로 폴딩이 완성된다. 모든 포도당이 다 잘려나가면 단백질 폴딩이 완료된 것으로 인지하고 Man8GlcNAc2 당사슬이 부착된 형태로 골지체로 옮겨지게 된다. 그런데 소포체에서 골지체로 옮겨 가기 전에 한 번 더 당단백질의 폴딩을 검증하는 품질 관리 과정이 있다. 적절한 폴딩이 이루어져 있지 않으면, 포도당 한 분자를 다시 Calnexin /Calreticulin Cycle에 들어가도록 해서 폴딩을 완성할 수 있는 기회를 주는 과정을 반복한다.
상기 기술된 소포체에서 이루어지는 N-당사슬의 초기 생합성 과정은 진핵 미생물인 효모에서 고등생물인 동물에 이르기까지 거의 동일한 과정으로 보존되어 있다. 그러나 골지체로 넘어간 당사슬은 각 종에 특이적으로 다양한 당사슬 수식 과정을 거치게 되며, 그 결과로 효모, 곤충, 식물 및 동물 등에서 완전히 다른 형태의 당사슬들이 만들어지게 된다. 그러나 이렇게 다양한 당사슬들도 핵심 부위는 공통적으로 가지고 있는데, 세 개의 만노즈와 두 개의 GlcNAc이 아스파라긴의 질소에 연결된 구조로 Trimannosyl Core로 불린다. 이 Trimannosyl Core에 주로 만노즈가 연결된 형태를 고만노즈형 (high-mannose type)이라 부르며 효모와 곰팡이 등에서 많이 관찰된다. 전통 효모인 Saccharomyces cerevisiae의 경우에는 골지체에서 만노즈 부가가 계속되어 수십여 개의 만노즈가 부가된 형태가 관찰되기도 한다. 반면에 곤충세포에서는 결핍 만노즈형 (Pauci-mannose type)의 당사슬을 갖는 당단백질들이 관찰된다. 이들은 골지체에서 만노시다제 (Mannosidase IA, IB & IC)들에 의해서 먼저 Man5GlcNAc2 형태로 다듬어지고 여기에 N-Acetylglucosaminyltransferase (GNT) I이 작용해서 GlcNAc이 하나 부가된 후에 만노시다제 II가 작용해서 Trimannosyl Core에 GlcNAc이 하나 부가되어 있는 혼합형 구조가 만들어 진다. 그리고 나서야 부가되었던 GlcNAc이 다시 잘려 나가면서 결핍 만노즈형 당사슬 구조가 만들어지는 것이다. 동물세포는 아스파라진 잔기에 결합되어 있는 첫번째 GlcNAc에 α(1,6)-퓨코스 (Fucose)가 종종 부가된다. 동물에서는 Trimannosyl Core에 GlcNAc이 하나 부가되어 있는 구조에 GNT II가 작용해서 GlcNAc이 하나 더 부가되어서 두 개의 안테나 구조를 갖는 당사슬이 생성된다. 이 후에 GNT IV와 V가 작용해서 네 개의 안테나 구조가 만들어지기도 하며, 일부에서는 GNT VI, IX 또는 VB 등이 작용해서 6개의 안테나 구조까지 만들어지는 경우도 있다. GlcNAc이 부가되어 안테나의 골격이 만들어진 후에 골지체 내에 존재하는 βGalactosyltransferase와 α-Sialyltransferase등이 작용해서 GlcNAc 위에 갈락토즈와 시알산이 부가된 형태의 복합형 당사슬 구조가 만들어 진다.
N-당화는 단백질의 접힘이나 활성 등에 상당한 영향을 미칠 수 있고, 유전공학 방법을 이용하여 자연계에 존재하는 단백질 혹은 변이체들을 산업적으로 이용하기 위하여 생산하는 경우 숙주세포의 종류, 재조합체의 조작방법, 배양조건에 따라 당질화 여부와 당사슬의 구조나 형태가 달라질 수 있는 가능성이 매우 크다(Schilling et al., 2002). 즉, 단백질의 생산과정 중 생산조건의 차이에 따라 당사슬 구조나 당사슬을 구성하는 당 성분들의 양적 차이 등이 발생한다. N-당화에 영향을 미치는 배양 조건에는 배양 배지의 Glucose 또는 Glutamine 농도 (Tachibana et al. 1994), Dissolved oxygen (DO) 농도 (Restelli et al. 2006), 배양액 pH (Borys et al. 1993), 배양액의 ammonia 농도 (Borys et al. 1994;), 배양 온도 (Clark et al. 2004) 등이 있다.
일반적으로 효소는 기질과 특이적으로 결합하여 효소-기질 복합체(enzyme-substrate complex)를 형성함으로써 반응의 활성화 에너지 (activation energy)를 낮추는 촉매 역할을 하여 효소의 반응을 촉진시킨다. 효소는 기질 및 기질과 경쟁하는 분자들을 식별할 수 있는데, 이는 효소의 기질 결합 위치에 상보적인 전하의 분포, 상보적인 구조, 친수성/소수성의 분포로 인하여 기질과 특이적으로 결합이 가능하게 한다. 효소의 결합 위치를 설명하기 위하여 효소와 기질이 서로 상보적이고 기하학적인 형태를 갖고 있어서 결합하기 쉽다고 하는 자물쇠-열쇠 모델이 제시되었지만, 이는 효소-기질 복합체의 전이 상태에 대한 설명이 어렵다. 이를 극복하기 위하여 제시된 유도 적합 모델은 효소 단백질의 유연한 구조를 통해 효소-기질 복합체에서 효소와 기질이 상호 작용을 계속 수행하면서 구조가 변화되는데, 이 과정에서는 활성 부위를 구성하는 아미노산 잔기나 N-당사슬에 의한 주변 전하의 분포, 친수성/소수성 분포에 의해 반응이 더욱 촉진될 수 있다.
더욱이 기질인 히알루론산을 가수분해하는 히알루로니다제 효소의 반응에 있어서 전하 상호 작용은 필수적인 요소이다. Arming 등은 히알루로니다제 PH20에서 음전하가 다량으로 분포되어 있는 기질인 히알루론산과 결합하기 위해서는 양전하를 갖고 있는 Arginine 잔기가 효소 활성에 필수적인 요소임을 밝혔다 (Arming et al. 1997). 따라서, N-당사슬의 전하 분포도 이러한 효소 활성에 영향을 끼친다고 유추할 수 있으며, 음전하가 많은 기질인 히알루론산과 히알루로니다제가 결합하는 경우, N-당사슬 중 음전하를 띠는 Sialic Acid Capping Sugars의 함량, 즉, Sialylation 함량이 효소-기질 결합체를 구성하거나 효소 반응의 진행에 영향을 미치는지를 입증하는 것이 중요하다. Sialylation 함량을 제한하기 위해서는 Galactose 잔기에 Sialic acid의 전달이 제한되거나, Desialylation되거나, Galactosylation 함량이 제한되어야 한다.
따라서, 재조합 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체의 생산성 및 활성은 N-당사슬의 함량 변화에 따라 영향을 받으므로, 이를 조절하고 유지하여 활성이 우수하고 생산성이 높은 산업적으로 유용하게 사용될 수 있는 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체의 생산 방법에 대한 연구는 효율적인 대규모 생산을 위하여 당업계에서는 요구되고 있다.
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본 발명의 목적은 재조합 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체를 생산하는 숙주 세포의 배양 방법 및 이러한 방법으로 제조된 PH20 또는 이의 변이체를 제공하는 것으로, 특히 효소 활성 및 생산성이 향상된 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체의 생산방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 본 발명 명세서의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명에서는 재조합 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체를 생산하는 숙주세포를 특정한 배양 조건하에서 배양할 경우, 생산된 재조합 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체의 N-당화 특성, 나아가 생산된 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체의 효소 활성이 현저하게 향상되는 것을 확인하였다.
구체적으로 N-당사슬 함량에서 Sialylation 함량, Galactosylation 함량 및/또는Mannosylation 함량, 특히 Sialylation 함량을 조절하여 활성을 높이는 것이 효과적이며, 이 함량을 조절하기 위해서는 배지 내의 Glucose 농도 및/또는 pH를 조절하거나, 배양 온도 변경 후 일정 기간 동안 배양함으로써 본 발명에서 목적하는 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체의 효소 활성 및 생산성을 현저하게 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
구체적으로 본 발명에 따른 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체의 생산 방법은,
(1) 재조합 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체를 발현하는 숙주 세포를 배양 온도 35℃~ 38℃에서 누적생존세포농도 (integral viable cell density)를 기준으로 20x106 ~ 120x106 cells x day/mL까지 되도록 배양하는 단계; 및
(2) 배양 온도를 28℃~ 34℃로 감소시킨 후 배양 온도를 유지하며 2 ~ 18일 동안
(a) 배지 내의 잔류 Glucose 농도를 배양 기간 동안 0.001 g/L ~ 4.5 g/L로 유지하는 배양; 및
(b) 배양액의 pH를 6.8 ~ 7.2로 유지하는 배양;
하는 방법으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 방법으로 배양하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 본 발명에 따른 생산방법으로 생산된 PH20 또는 이의 변이체는 N-당사슬 함량 중 Sialylation 함량이 1~38%이며, 효소 활성이 현저하게 증가된 것을 특징으로 하지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 수치는 10%의 오차 범위를 갖고 있는 실험치이다. 이는 배양 조건을 설정하는 경우에는 배양에 사용하는 기기 및 시험자의 업무 숙달 정도 등등의 조건에 따라 편차가 발생하므로, 본 발명에서 설정한 수치는 제한된 의미에서 보다는 편차를 고려하여 더 광범위한 의미에서 해석되어야 하기 때문이다.
상기 숙주 세포의 배양은 회분 배양법 (batch culture), 반복 회분 배양법 (repeated batch culture), 유가 배양법 (fed-batch culture), 반복 유가 배양법 (repeated fed-batch culture), 연속 배양법 (continuous culture) 및 관류 배양법 (perfusion culture)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법에 의해 배양할 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 히알루로니다제 PH20 단백질 또는 이의 변이체의 생산방법에 의해 높은 생산성과 함께 높은 효소 활성을 갖는 재조합 히알루로니다제 PH20 단백질 또는 이의 변이체의 생산이 가능하여, 재조합 히알루로니다제 PH20 단백질 또는 이의 변이체의 대량 제조 및 공급이 가능하다.
도 1은 천연형 인간 히알루로니다제 PH20 와 그 변이체에 대한 효소 활성, 등전점, N-당사슬 함량 분석 결과로,
도 1의 A는 천연형 인간 히알루로니다제 PH20과 그 변이체에 대한 효소 활성,
도 1의 B는 각 시료의 등전점 전기 영동 결과,
도 1의 C는 N-당사슬 함량을 나타낸다.
도 2는 히알루로니다제 PH20 변이체의 정제 분획에서의 효소 활성과 등전점 분석을 PNGase F 처리, Sialidase A 처리, Sialidase A + Galactosidase 처리를 하여 비교한 결과로,
도 2의 A는 각 시료의 등점점 전기 영동 결과,
도 2의 B는 효소 활성 결과,
도 2의 C는 N-당사슬 함량을 나타낸다.
도 3은 히알루로니다제 PH20 변이체를 생산하는 세포에 대한 N-acetyl-D-Mannosamine 또는 Galactose의 첨가 배양 조건에서의 세포 성장, 세포 생존율, pH, Lactate 농도의 변화를 분석한 결과로,
도 3의 A는 세포 성장,
도 3의 B는 세포 생존율,
도 3의 C는 pH의 변화,
도 3의 D는 Lactate 농도의 변화를 나타낸다.
도 4는 히알루로니다제 PH20 변이체를 생산하는 세포에 대한 N-acetyl-D-Mannosamine 또는 Galactose의 첨가 배양 조건에서 배양 회수액에 대한 활성을 분석한 그래프이다.
도 5는 히알루로니다제 PH20 변이체를 생산하는 세포에 대한 N-acetyl-D-Mannosamine 또는 Galactose의 첨가 배양에서 배양 회수액에 대한 등전점 전기영동 (isoelectric focusing)을 수행하여 분석한 결과이다.
도 6은 히알루로니다제 PH20 변이체를 생산하는 세포에 대한 N-acetyl-D-Mannosamine 또는 Galactose의 첨가 배양에서 배양 회수액에 N-당사슬 구조 분석을 수행하여 분석한 결과이다.
도 7은 히알루로니다제 PH20 변이체를 생산하는 세포에 대한 배양일에 따른 세포 성장 및 세포 생존율, 암모니아 농도 변화를 분석한 결과로,
도 7의 A는 세포 성장,
도 7의 B는 세포 생존율,
도 7의 C는 누적세포 농도,
도 7의 D는 암모니아 농도의 변화를 나타낸다.
도 8은 히알루로니다제 PH20 변이체를 생산하는 세포에 대한 배양일별 회수액에 대한 활성을 분석한 그래프이다.
도 9는 히알루로니다제 PH20 변이체를 생산하는 세포에 대한 배양일별 회수액에 대한 등전점 전기영동 (isoelectric focusing)을 수행하여 분석한 결과이다.
도 10은 히알루로니다제 PH20 변이체를 생산하는 세포에 대한 배양일별 회수액에 N-당사슬 구조 분석 및 활성 결과를 분석한 결과이다.
도 11은 히알루로니다제 PH20 변이체를 생산하는 세포에 대한 Glucose 농도 조건에서의 세포 성장, 세포 생존율, pH 변화, 삼투압 변화, Glucose 농도, Lactate 농도를 분석한 결과로,
도 11의 A는 세포 성장,
도 11의 B는 세포 생존율,
도 11의 C는 pH 변화,
도 11의 D는 삼투압 변화.
도 11의 E는 Glucose 농도의 변화.
도 11의 F는 Lactate 농도의 변화를 나타낸다.
도 12는 히알루로니다제 PH20 변이체를 생산하는 세포에 대한 Glucose 농도 조건에서의 활성을 분석한 그래프이다.
도 13은 히알루로니다제 PH20 변이체를 생산하는 세포에 대한 Glucose 농도 조건에서의 등전점 전기영동 (isoelectric focusing)을 수행하여 분석한 결과이다.
도 14는 히알루로니다제 PH20 변이체를 생산하는 세포에 대한 Glucose 농도 조건에서의 N-당사슬 구조 분석을 수행하여 분석한 결과이다.
도 15는 히알루로니다제 PH20 변이체를 생산하는 세포에 대한 pH 조건에서의 세포 성장, 세포 생존율, pH 변화, 누적세포농도 변화를 분석한 결과로,
도 15의 A는 세포 성장,
도 15의 B는 세포 생존율,
도 15의 C는 pH 변화,
도 15의 D는 누적세포 농도 변화를 나타낸다.
도 16은 히알루로니다제 PH20 변이체를 생산하는 세포에 대한 pH 조건에서의 활성을 분석한 그래프이다.
도 17은 히알루로니다제 PH20 변이체를 생산하는 세포에 대한 pH 조건에서의 등전점 전기영동 (isoelectric focusing)을 수행하여 분석한 결과이다.
도 18은 히알루로니다제 PH20 변이체의 정제 과정에서 얻은 제 1차 음이온교환 수지 크로마토그래피에 의한 정제 크로마토그램이다
도 19는 히알루로니다제 PH20 변이체의 정제 과정에서 얻은 제 2차 음이온교환 수지 크로마토그래피에 의한 정제 크로마토그램이다
도 20은 히알루로니다제 PH20 변이체의 정제 과정에서 얻은 양이온교환 수지 크로마토그래피에 의한 정제 크로마토그램이다.
본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 발명은 유전자 재조합 방법으로 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체를 산업적으로 유용하게 사용하기 위하여 생산함에 있어, N-당사슬 함량 중 Sialylation, Galactosylation 및/또는 Mannosylation 함량, 특히 Sialylation 함량이 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체의 효소 활성 및 생산성에 매우 중요하다는 사실을 확인하여 완성된 것이다.
구체적으로 PH20 또는 이의 변이체의 N-당사슬 함량 중 Sialylation 함량이 1~38%, 바람직하게는 1~30%, 더욱 바람직하게는 1.5~28%, 가장 바람직하게는 2~25%일 경우, 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체의 효소 활성 및 생산성이 예측하지 못할 높은 정도로 향상됨을 확인하였다.
보다 구체적으로, PH20 또는 이의 변이체의 N-당사슬 함량 중 Galactosylation 함량이 1~68%, Sialylation 함량이 1~38%, Mannosylation 함량이 40~63%, 바람직하게는 Galactosylation 함량이 5~60%, Sialylation 함량이 1~30%, Mannosylation 함량이 42~62%, 더욱 바람직하게는 Galactosylation 함량이 10~56%, Sialylation 함량이 1.5~28%, Mannosylation 함량이 44~61%, 가장 바람직하게는 Galactosylation 함량이 15~50%, Sialylation 함량이 2~25%, Mannosylation 함량이 47~60%일 경우 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체의 효소 활성 및 생산성이 예측하지 못할 높은 정도로 향상될 수 있다.
상기의 수치는 실시예 표 1의 실험 결과에서부터 도출된 수치로써 95% 신뢰 구간의 수치를 적용한 것이며, 이 수치도 10%의 오차를 포함할 수 있다. 이는 단백질의 당 함량을 측정하는 경우 실험에 사용하는 기기 및 효소 반응 시간, 시험 온도, 시험자의 업무 숙달 정도 등등의 조건에 따라 편차가 발생하므로, 본 발명에서 측정한 당 함량은 제한된 의미에서 보다는 실험실 간의 편차를 고려하여 더 광범위한 의미에서 해석되어야 하기 때문이다.
본 발명에 있어, N-당사슬 함량 중 Galactosylation % 함량은 N-당사슬 중 G1, G1F, G1F', G2, G2F, A1, A1F, A2, A2F 등 말단에 갈락토스를 포함한 것의 % 함량을 합산한 것이고, Sialylation % 함량은 N-당사슬 중 A1, A1F, A2, A2F 등 말단에 시알산을 포함한 것의 % 함량을 합산한 것이며, Mannosylation % 함량은 N-당사슬 중 M4G0F, M5, M5G0, M6, M7, M8, M9 등 말단에 만노스를 포함한 것의 % 함량을 합산한 것이다.
구체적으로, 본 발명에 따른 N-당사슬 함량 중 Sialylation 함량이 1~38%인 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체의 생산방법은,
(1) 재조합 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체를 발현하는 숙주 세포를 배양 온도 35℃~ 38℃에서 누적생존세포농도 (integral viable cell density)를 기준으로 20x106 ~ 120x106 cells x day/mL까지 되도록 배양하는 단계; 및
(2) 배양 온도를 28℃~ 34℃로 감소시킨 후 배양 온도를 유지하며 2 ~ 18일 동안
(a) 배지 내의 잔류 Glucose 농도를 배양 기간 동안 0.001 g/L ~ 4.5 g/L로 유지하는 배양; 및
(b) 배양액의 pH를 6.8 ~ 7.2로 유지하는 배양;
하는 방법으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 방법으로 배양하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 수치는 10%의 오차 범위를 갖고 있는 실험치이다. 이는 배양 조건을 설정하는 경우에는 배양에 사용하는 기기 및 시험자의 업무 숙달 정도 등등의 조건에 따라 편차가 발생하므로, 본 발명에서 설정한 수치는 제한된 의미에서 보다는 편차를 고려하여 더 광범위한 의미에서 해석되어야 하기 때문이다.
상기 (1) 단계에서 (2) 단계로의 배양 온도 감소는 누적생존세포농도 (integral viable cell density)를 기준으로 20x106 ~ 120x106 cells x day/mL, 바람직하게는 40x106 ~ 100x106 cells x day/mL, 더욱 바람직하게는 60x106 ~ 80x106 cells x day/mL 일 경우에 이루어질 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 (2) 단계에서의 배양 기간은 2 ~ 18일, 바람직하게는 3 ~ 16일, 더욱 바람직하게는 4 ~ 14일 배양할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
예시적으로 본 발명에 따른 PH20 또는 이의 변이체의 생산에서 유가 배양법을 사용하는 경우에 있어, 본 배양 직전 종배양에서 관류 배양법 또는 유가 배양법으로 일정 농도의 세포에 도달할 때까지 35℃~ 38℃에서 배양한 이후 본배양으로 접종하여 35℃미만으로 감소시킨 후 2 ~ 18일, 바람직하게는 3 ~ 16일, 더욱 바람직하게는 4 ~ 14일 배양함으로써 PH20 또는 이의 변이체의 생산성을 극대화시킬 수 있을 뿐 아니라 생산된 PH20 또는 이의 변이체의 효소 활성도 현저하게 증가시킬 수 있다.
상기 본배양 세포접종 농도는 1x105 cells/mL 이상, 바람직하게는 5x105 cells/mL 이상, 더욱 바람직하게는 1x106 cells/mL 이상일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 PH20 또는 이의 변이체의 생산에서 유가 배양법과 관류 배양법을 혼용하여 사용하는 경우에 있어 배양함으로써 PH20 또는 이의 변이체의 생산성을 극대화시킬 수 있을 뿐 아니라 생산된 PH20 또는 이의 변이체의 효소 활성도 현저하게 증가시킬 수 있다.
본 발명에 있어, 상기 배지 내의 잔류 Glucose 농도는 0.001 g/L ~ 4.5 g/L, 바람직하게는 0.01 ~ 4.0 g/L, 더욱 바람직하게는 0.1 ~ 3.5 g/L로 유지하면서 배양할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어, 상기 “배지 내의 잔류 Glucose 농도를 0.001 g/L ~ 4.5 g/L, 바람직하게는 0.01 ~ 4.0 g/L, 더욱 바람직하게는 0.1 ~ 3.5 g/L로 유지하면서 배양”한다는 의미는 배양 기간 동안 배지 내의 잔류 Glucose의 농도를 매 1 ~ 36 시간, 바람직하게는 매 3 ~ 30 시간, 더욱 바람직하게는 매 6 ~ 24 시간으로 간격, 또는 실시간으로 측정하여 배지 내의 잔류 Glucose 농도가 0.001 g/L ~ 4.5 g/L, 바람직하게는 0.01 ~ 4.0 g/L, 더욱 바람직하게는 0.1 ~ 3.5 g/L 내에서 설정된 기준 농도 이하일 경우 해당 기준 농도가 되도록 배지에 Glucose 용액(glucose stock solution)을 첨가하여 배양하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어, 상기 배지 내의 잔류 Glucose 농도의 기준 농도는 0.001 g/L ~ 4.5 g/L, 바람직하게는 0.01 ~ 4.0 g/L, 더욱 바람직하게는 0.1 ~ 3.5 g/L 범위 내에서 설정될 수 있으며, 배양 기간 동안 적절히 그 기준 농도가 변화될 수 있음은 통상의 기술자에게는 자명한 것이다. 예를 들어 초기 1~2일째에는 배지 내의 잔류 Glucose 농도의 기준 농도를 2 g/L로 하여 배양하다가, 3~5일째에는 기준 농도를 1.5 g/L로 낮추어 배양하고, 이후에는 다시 기준 농도를 2 g/L로 하여 배양할 수도 있고, 1.5 g/L 보다 낮은 농도, 즉 1.0 g/L로 기준 농도를 설정하여 배양할 수도 있다.
본 발명에 따른 방법에 의해 생산되고 N-당사슬 함량에서의 특정한 Sialylation 함량 및/또는 Galactosylation 함량과 Mannosylation 함량을 갖는 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체는 히알루로니다제 효소의 배양액에서의 활성이 10,000 unit/mL, 바람직하게는 11,000 unit/mL 이상, 더욱 바람직하게는 12,000 unit/mL 이상인 것을 특징으로 하지만, 이에 제한되는 것은 아니며,
또한, 본 발명에 따른 방법에 의해 생산되고 N-당사슬 함량에서의 특정한 Sialylation 함량 및/또는 Galactosylation 함량과 Mannosylation 함량을 갖는 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체는 통상적인 방법에 의해 생산된 천연형 인간 PH20의 활성보다 10% 이상, 바람직하게는 12% 이상, 더욱 바람직하게는 15% 이상 효소 활성이 증가된 것을 특징으로 할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
*바람직하게는 본 발명에 따른 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체의 생산방법에 있어, 상기 (1) 단계 및/또는 (2) 단계에서의 숙주세포의 배양은
(i) 배지 내에 암모니아를 첨가하거나 배지 내의 암모니아 농도를 5mM 이상으로 증가시키는 조건;
(ii) Glutamine, Glucosamine, Uridine, Glucosamine 및 Sodium Butyrate로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질을 배지에 첨가하는 조건; 및
(iii) Galactose 및 ManNAc을 첨가하지 않는 조건;
으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 조건 하에서 수행될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
보다 구체적으로는 본 발명에 따른 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체의 생산방법에 있어, 상기 (1) 단계 및/또는 (2) 단계에서의 숙주세포의 배양은 상기 배지 내에 암모니아를 첨가하거나 배지 내의 암모니아 농도를 5mM 이상으로 증가시키는 배양, Glutamine 첨가하는 배양, Galactose 및 ManNAc을 첨가하지 않는 배양, Uridine 또는 Glucosamine을 첨가하는 배양, Sodium Butyrate을 첨가하여 배양하는 것을 특징으로 할 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체는 세포외 기질 (extracellular matrix)에 위치한 히알루론산을 분해하는 효소를 의미한다.
본 발명에 따른 “히알루로니다제 PH20”또는 “PH20”은 천연형 PH20과 이의 성숙된 형태를 모두 포함하는 의미로 해석되며, “히알루로니다제 PH20”또는 “PH20”의 “변이체”는 “히알루로니다제 PH20”또는 “PH20”의 아미노산 서열에 있어, 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환, 결실 및 삽입을 포함하고, 선택적으로 N-말단 및/또는 C-말단의 아미노산 잔기의 일부가 결실된 PH20 변이체를 의미하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 히알루로니다제는 동물 및 스테렙토마이세스 등의 미생물 유래의 것으로서, 히알루로니다제 활성을 가지는 모든 것을 의미하며, 이 중 “히알루로니다제 PH20”또는 “PH20”은 동물 및 스테렙토마이세스 등의 미생물 유래의 것으로서, 바람직하게는 인간, 소 또는 양 유래의 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 인간 유래의 “히알루로니다제 PH20”또는 “PH20 변이체”는 국제공개특허 제2020/022791호 및 미국 등록특허 제9,447,401호 등에 기재된 것들이 예시될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니며, “히알루로니다제 PH20”또는 “PH20”의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환, 결실 및 삽입을 포함하고, 선택적으로 N-말단 및/또는 C-말단의 아미노산 잔기의 일부가 결실된 것으로서 히알루로니다제의 효소 활성을 가진 것이라면 모두 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
본 발명에서 히알루로니다제 단백질의 발현에 사용하는 숙주 세포로는 동물 세포(animal cell), 효모(yeast), 방선균(Actinomycetes) 및 곤충 세포(insect cell), 등이 사용될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
동물 세포는 포유동물 세포가 바람직하다. 더욱 바람직하게는 CHO 세포, HEK 세포, COS 세포, 3T3 세포, 미엘로마 세포, BHK 세포, HeLa 세포, Vero 세포 등 일반적으로 사용되고 있는 동물 배양 세포를 사용하고, 대량 발현을 목적으로 하는 경우에는 특히 CHO 세포가 바람직하다. 또한, 원하는 단백질을 제조하기 위해서는, 특히, DHFR 유전자를 결손한 CHO 세포인 dhfr- CHO 세포 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220)나 CHO K-1 세포 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275) 등 원하는 유전자를 도입하는 데에 적합한 세포인 것이 바람직하다. 상기 CHO 세포로는 특히, DG44 주, DXB-11 주, K-1 주 또는 CHO-S 주가 바람직하고, 숙주 세포로의 벡터의 도입은 인산칼슘법, DEAE 덱스트란법, 일렉트로 포레이션법, 리포펙션 등의 방법으로 실시하는 것이 가능하다.
효모로는 사카로마이세스(Sacchromyces sp.), 한세눌라(Hansenula sp.), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 및 피키아(Pichia sp.) 등이 예시될 수 있으며, 방선균으로는 스테렙토마이세스(Streptomyces) 등이 예시될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체의 생산방법에 있어, 상기 (1) 단계 및/또는 (2) 단계에서의 숙주세포의 배양은 회분 배양법 (batch culture), 반복 회분 배양법 (repeated batch culture), 유가 배양법 (fed-batch culture), 반복 유가 배양법 (repeated fed-batch culture), 연속 배양법 (continuous culture) 및 관류 배양법 (perfusion culture)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법에 의해 이루어질 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
회분 배양법은 배양 중에 새롭게 배지를 추가하거나 또는 배양액을 배출하거나 하지 않고, 세포를 증식시키는 배양 방법이다. 연속 배양법은 배양 중에 연속적으로 배지를 추가하고, 또한 연속적으로 배출시키는 배양 방법이다. 또, 연속 배양법에는 관류 배양 (perfusion culture)도 포함된다. 유가 배양법은 회분 배양법과 연속 배양법의 중간에 해당되므로, 반(半) 회분 배양법 (semi-batch culture) 이라고도 불리고, 배양 중에 연속적으로 또는 축차적으로 배지가 추가되는데, 연속 배양법과 같은 연속적인 배양액의 배출이 실시되나 세포의 유출이 되지 않는 배양 방법이다. 본 발명에서 어느 배양 방법을 사용해도 되는데, 바람직하게는, 유가 배양법 또는 연속 배양법이 사용되고, 특히 바람직하게는, 유가 배양법이 사용된다.
앞에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 생산방법에 의해 생산된 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체는 효소의 비활성이 일반적인 방법에 의해 생산된 것에 비해 10% 이상 증가될 수 있으며, 특히 천연형 인간 PH20의 활성보다 10% 이상 향상된 것을 특징으로 한다. 이러한 효소 활성의 증가는 본 발명에 따른 생산방법에 의해 생산된 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체의 N-당화 특성 변화 및/또는 전하 변형에 따른 것이다.
특히 N-당화 중 Sialylation 함량 및/또는 Galactosylation 함량과 Mannosylation 함량의 변화에 따라 효소 활성이 증가하는데, 본 발명에 따른 생산방법에 의해 이러한 N-당화 특성, 특히 Sialylation 함량 및/또는 Galactosylation 함량과 Mannosylation 함량이 조절될 수 있다.
본 발명에서 당과 단백질의 공유결합은 단백질을 구성하는 아스파라긴 잔기에 N-아세틸-D-글루코사민이 공유결합된 N-글리코시드 결합(N-글리코시드 결합 당쇄), 세린 또는 트레오닌 잔기에 N-아세틸-D-갈락토사민이 공유결합된 O-글리코시드 결합(O-글리코시드 결합 당쇄) 등이 있지만, 본 발명의 당단백질에 있어서의 당과 단백질과 공유결합의 양식에 특별한 한정은 없고, N-글리코시드 결합 당쇄와 O-글리코시드 결합 당쇄 중 어느 한쪽 및 양쪽을 갖는 당단백질도 본 발명의 당단백질에 포함된다.
이러한 관점에서 본 발명은 N-당사슬 함량 중 Sialylation 함량이 1~38%, 바람직하게는 1~30%, 더욱 바람직하게는 1.5~28%, 가장 바람직하게는 2~25%인 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체에 대한 것이다.
보다 구체적으로는 N-당사슬 함량 중 Galactosylation 함량이 1~68%, Sialylation 함량이 1~38%, Mannosylation 함량이 40~63%, 바람직하게는 Galactosylation 함량이 5~60%, Sialylation 함량이 1~30%, Mannosylation 함량이 42~62%, 더욱 바람직하게는 Galactosylation 함량이 10~56%, Sialylation 함량이 1.5~28%, Mannosylation 함량이 44~61%, 가장 바람직하게는 Galactosylation 함량이 15~50%, Sialylation 함량이 2~25%, Mannosylation 함량이 47~60%인 것을 특징으로 하는 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체에 대한 것이다.
상기의 수치는 실시예 표 1의 실험 결과에서부터 도출된 수치로써 95% 신뢰 구간의 수치를 적용한 것이며, 이 수치도 10%의 오차를 포함할 수 있다. 왜냐하면, 단백질의 당 함량을 측정하는 경우 실험에 사용하는 기기 및 효소 반응 시간, 시험 온도, 시험자의 업무 숙달 정도 등등의 조건에 따라 편차가 발생하므로, 본 발명에서 측정한 당 함량은 제한된 의미에서 보다는 실험실 간의 편차를 고려하여 더 광범위한 의미에서 해석되어야 하기 때문이다. 또한 상기 PH20 또는 이의 변이체의 전하 변형체는 등전점 전기영동 (isoelectric focusing)을 통해 확인될 수 있다.
본 발명에 따른 N-당사슬 함량 중 특정한 Sialylation 함량 및/또는 Galactosylation 함량과 Mannosylation 함량을 갖는 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체는 본 발명에 따른 생산방법에 의해 생산된 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 통상의 기술자의 상식에 비추어 변형 가능한 다른 방법에 의해 생산될 수 있음은 당연한 것이다.
본 발명에 있어서, 세포를 배양하여 당단백질을 발현시키기 위해 이용한 배지는 무혈청 배지가 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니며, DMEM/F12 배지 (DMEM과 F12의 혼합 배지)를 기본 배지로서 사용할 수 있다. 또한, 상업적으로 이용가능한 무혈청 배지, 예를 들면, HycellCHO 배지, ActiPro 배지 (이상 Hyclone사, 미국), CD OptiCHOTM 배지, CHO-S-SFM II 배지 또는 CD CHO 배지 (이상 Gibco사, 미국), IS CHO-VTM 배지(Irvine Scientific사, 미국), EX-CELL® Advanced CHO Fed-Batch Medium (Sigma-Aldrich사, 미국) 등을 기본 배지로서 사용할 수도 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 세포를 배양하여 당단백질을 발현시키기 위해 이용한 피드 배지는 무혈청 배지로서, 예를 들면, Cell BoostTM 1, Cell BoostTM 2, Cell BoostTM 3, Cell BoostTM 4, Cell BoostTM 5, Cell BoostTM 6, Cell BoostTM 7a/7b (이상 Hyclone사, 미국), CD CHO EfficientFeedTM A AGTTM, CD CHO EfficientFeedTM B AGTTM, CD CHO EfficientFeedTM C AGTTM, CD CHO EfficientFeedTM A plus AGTTM, CD CHO EfficientFeedTM B plus AGTTM, CD CHO EfficientFeedTM C plus AGTTM(이상 Gibco사, 미국), BalanCD® CHO Feed 4(Irvine Scientific사, 미국), EX-CELL® Advanced CHO Feed(Sigma-Aldrich사, 미국), CHO-U Feed Mix U1B7/ CHO-U Feed Mix U2B13 (Kerry사, 미국) 등을 피드 배지로서 사용할 수도 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용된 "피드 배지" 및 "농축 영양물 배지" 란 용어는 아미노산, 비타민, 염, 미량 원소, 지질 및 포도당 등의 특정 영양소 또는 복수의 영양소로 구성된 배지로서 기본 배지의 농축 산물일 수 있으며, 배양하는 세포에 따라 피드 배지의 구성 성분과 농도를 다양하게 제작하여 사용할 수 있다. 또한, 상업적으로 이용할 수 있는 피드 배지, 예를 들면, Cell Boost Series supplement 배지 (Hyclone사, 미국), EfficientFeed Supplement 배지, GlycanTune 피드 배지 (이상 Gibco사, 미국), BalanCD CHO 피드 배지 (Irvine Scientific사, 미국), Cellvento®CHO Cell Culture 피드 배지 (Merck사, 미국), EX-CELL®Advanced CHO 피드 배지 (Sigma-Aldrich사, 미국)등을 피드 배지로서 사용할 수도 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용된 식물 유래의 가수분해물은 동물 유래성분은 함유하지 않으면서, 가든피, 목화씨, 또는 밀글루텐, 대두 등에서 추출된 산물을 말하며, 아미노산, 펩타이드, 비타민, 탄수화물, 뉴클레오티드, 미네랄, 기타 성분이 풍부하게 함유되어 있는 보충제로서 이 또한, 배양하는 세포에 따라 식물 유래 가수분해물의 구성 성분과 성분 농도를 다양하게 제작하여 사용 가능하다. 또한, 상업적으로 이용가능한 식물 유래 가수분해물, 예를 들면, Hy-Pea™7404, UltraPep™ Cotton, HyPep™7504, HyPep™(이상 Kerry사, 미국), Cotton 100, Cotton 200, Phytone™Soy 100 (이상 Gibco사, 미국) 등을 보충제로서 사용할 수도 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용된 당 단백질의 N-당사슬 함량을 증가 또는 감소시키기 위해 사용한 첨가물은 일반적으로 단백질 당화를 관여한다고 알려져 있는 성분을 말한다. 특히, Sialylation 함량을 제한하기 위해서는 Galactose 잔기에 Sialic acid의 전달이 제한되거나, Desialylation되거나, Galactosylation 함량이 제한되어야 하는데 이러한 첨가물로는 세포를 배양할 때에 배지에 소정 농도의 N-아세틸-D-만노사민, Glucose, Mannose, Glutamine 및 Galactose, 암모니아, 부티르산 등의 당화 전구체가 되는 구성 성분 등이 있다.
대부분의 동물세포 배양에서는 주로 혈청이 포함된 배지를 사용하고 있지만 혈청이 포함된 배지는 화학적으로 성분이 명확하지 않은 복합 구성물이므로 단백질의 생산에 적합한 배지를 설계하는데 어려움이 따른다. 혈청을 사용할 때는 비용이나 재현성 확보의 문제뿐만 아니라 분리 및 정제에도 부정적인 영향을 줄 수 있기 때문에 무혈청 배지나 저혈청 배지를 주로 사용한다. 무혈청 배지에서는 탄소원인 Glucose 농도가 현저히 낮기 때문에 세포의 성장을 유지하고 높은 농도의 목적 단백질을 생산하기 위해서는 배지에 추가적으로 주 탄소원인 Glucose를 첨가하여 배양하며, 추가적으로 Glutamine을 첨가하여 배양할 수도 있다. 특히, 단백질 의약품 생산에서는 체내 반감기를 증가시키기 위해서 Sialylation 함량을 증가하기 위하여 배지 내 Glucose 및 Glutamine을 고갈시키지 않고 일정 농도 이상으로 유지하여야 하며, 배양액의 pH도 특정한 값을 유지하여야 한다. 배양액에서 측정된 Glucose 및 Glutamine 농도는 세포가 사용하고 남아 있는 각각의 잔류 농도를 의미한다. 또한, Siltation 함량을 증가시키는데 관련된 효소들의 활성 촉진제나 Desialylation을 억제하는 억제제를 사용하기도 한다. 또한, N-당사슬의 전구체를 첨가하거나 관련된 효소의 활성 촉진제나 배양 조건을 조절하여 Galactosylation 함량을 증가시켜 Sialylation 함량을 증가시키기도 한다.
하지만 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체의 생산에서는 위와 같은 방법으로는 N-당사슬 함량을 조절할 수가 없지만, 본 발명에 따른 생산방법에 따라 생산할 경우에는 목적하는 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체의 N-당사슬 함량 특성 및 이에 따른 높은 효소 활성을 갖는 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체의 생산이 가능하다.
본 발명에 따른 생산방법은 추가적으로 생산된 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체의 분리 정제 단계가 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체의 분리 정제는 친화력 결합 특성을 이용하지 않고, 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체의 이온결합 특성 및/또는 소수성 상호작용 특성을 이용하여 분리 정제되는 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
구체적으로, 본 발명에 따른 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체의 분리 정제는 친화크로마토그래피(affinity chromatography)를 이용하지 않고, 양이온교환 크로마토그래피(cation exchange chromatography) 및/또는 음이온교환크로마토그래피(anion exchange chromatography) 등의 이온교환크로마토그래피(ion exchange chromatography)와 소수성작용 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography)를 이용하여 수행될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 따른 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체의 분리 정제 단계는 효소 활성이 낮은 산성을 띠는 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체가 제거되는 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 상기 산성을 띠는 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체의 제거는 이온교환크로마토그래피를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 한다.
효소의 산업적 이용 가능성을 확인하기 위하여서는 효소의 촉매 반응 속도에 대한 분석이 필요하다. 효소 반응은 고정된 반응성의 활성 부위를 갖는 효소 반응과 다양한 반응성을 가진 여러 활성 부위를 갖는 효소 반응으로 나뉠 수 있다. 히알루로니다제와 같이 고정된 반응성의 단일 활성 부위를 갖는 효소의 촉매 반응의 속도는 Michaelis-Menten의 속도 공식에 따르는 것으로 알려져 있다.
Michaelis-Menten의 효소 반응 속도론은 다음의 식과 같이 효소(E) - 기질(S)의 복합체[ES] 형성단계에서의 가역 반응 단계와 ES 복합체의 해리로 인한 생성물(P)가 생성되는 비가역 반응 단계의 2단계 반응체계로 효소 반응을 가정하는 것을 전제로 한다. 이 경우, kf, kr, kcat은 각 방향으로의 반응의 속도 상수이다 (Alan Fersht (1977) Enzyme structure and mechanism).
효소 반응은 효소와 기질이 반응하여 ES 복합체를 형성하는 과정이 빠르게 평형 상태로 도달한다고 가정하거나, 충분히 높은 기질 농도를 유지하는 반응을 수행하여 효소의 농도를 충분히 낮게 하여 d[ES]/dt≒이라 가정할 수 있는 유사 정상상태라고 할 수 있다. 빠른 평형을 가정하거나 유사 정상상태를 가정하는 속도식은 모두 동일하게 유도되기 때문에, 대부분의 실험은 초기에 효소농도에 비해 높은 기질농도를 유지하는 유사 정상상태로 가정한다.
이와 같은 가정하에서 “효소의 양은 반응 전후에 일정하다.”와 “”화학 반응에서 화학 평형점에 도달할 경우, 생성물이 만들어지는 반응속도와 이 물질이 다시 분해되는 속도는 같다.”라는 조건을 이용하면, 최종 생성물의 반응 속도는 다음과 같은 Michaelis-Menten 속도 공식으로 표현할 수 있다. 이 때, K M = (k r + k cat ) / k f 이며, Vmax = k cat [E]0이다.
이와 같은 Michaelis-Menten 속도 공식을 이용하여 효소 반응속도의 분석을 실험적으로 수행하기 위하여서 Lineweaver-Burk 방정식을 이용한다. 이 방정식은 실험에서 주어진 기질 농도의 역수 1/[S]에 대해 실험적으로 측정한 반응속도의 역수 1/V의 값과의 관계를 보여주는 방정식이다. 이 방정식이 1차 방정식임을 통계적으로 확인하게 되면, 효소 반응이 Michaelis-Menten의 속도 공식에 따르는 반응임을 확인할 수 있으며, 이 방정식을 이용하여 K M 과 Vmax 를 구할 수 있다.
효소는 화학 반응을 촉매하는데 있어, 활성 부위에서 기질과 결합한 후 전이 상태를 갖게 되는데, 높은 에너지를 갖는 전이 상태로 도달하기 위한 활성화 에너지는 기질과의 여러 결합을 통하여 낮아지게 된다. 이러한 전이 상태로 도달하기 위한 평형 상수는 k cat / K M 에 비례하게 된다. 여기서 1 / K M 은 효소와 기질이 결합하여 효소-기질 복합체를 만드는 정도와 효소-기질 복합체가 분해되지 않고 유지되는 정도를 합친 지표이고, k cat 은 효소-기질 복합체가 생성물을 만들어지는 평형 상수이므로 k cat / K M 은 기질과 효소로부터 얼마만큼의 생산물을 얻어낼 수 있는지에 대한 지표, 즉 효소의 촉매 효율을 나타내는 것이라 할 수 있다.
히알루로니다제의 산업적 이용 가능성은 효소 촉매 효율과 비례한다. 특히, 단클론 항체와 같은 고분자 약리 활성 물질과 함께 피하로 주사하는 경우에는 히알루로니다제의 효소 촉매 효율이 중요한 역할을 한다. 본 발명에 따른 변이체가 천연형 PH20보다 k cat / K M 이 높은 경우에는 고분자 약리 활성 물질에 포함된 히알루로니다제가 피하로 투여될 때, 피하 내에 존재하는 히알루론산을 더 빠르게 분해함으로 약리 활성 물질이 빨리 분산될 수 있게 하는 우월한 효과를 준다. 또한 본 발명에 따른 변이체가 야생형 PH20보다 k cat 이 큰 경우에는 동일한 효소 농도에서는 최대 반응 속도인 Vmax가 증가하여 동일한 시간에 더 많은 양의 히알루론산을 분해하게 되어 보다 넓은 범위에 약리 활성 물질을 분산시킬 수 있게 하는 우월한 효과를 준다.
따라서, 본 발명에 따른 PH20변이체의 효소학적 특성을 확인하기 위하여 각 변이체의 효소 반응 속도를 분석하고 이의 K M (50% Vmax 조건에서 기질 농도), k cat (기질 전환율), k cat / K M (효소 촉매 효율) 결과를 실시예 4에서 비교하였다. 이 결과를 보면, 야생형 PH20 대비하여 본 발명에 따른 PH20 변이체의 우월성을 입증할 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하고자 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 히알루로니다제의 활성과 N-당사슬, 등전점과의 관계
천연형 인간 히알루로니다제 PH20과 그의 변이체 HM46에 대해서 활성과 등전점, N-당사슬 함량 분석을 한 결과를 도 1에 제시하였다. 두 히알루로니다제의 활성 단위의 차이가 2배 이상이지만, 등전점 범위와 N-당사슬 함량은 크게 다르지 않았다.
히알루로니다제 PH20에서의 N-당사슬 함량과 등전점, 활성과의 관계에 대해서 확인하는 실험을 진행하였다. 히알루로니다제 PH20 변이체를 정제하는 과정에서 염기성 분획(Fraction 1)과 산성 분획(Fraction 2)를 분리할 수 있었고, 이 각 분획을 시료로 하여 PNGase F로 처리하여 N-당사슬을 모두 제거한 시료와 Sialidae A로 처리하여 말단의 시알산을 제거한 시료, Sialidae A와 Galactosidase를 처리하여 말단의 시알산과 갈락토오즈를 제거한 시료에 대해서 등전점과 효소 활성을 분석한 결과를 도 2에 제시하였다. 두 분획은 등전점의 범위에 차이가 있었으며, 산성 분획에서 효소 활성이 감소하는 결과를 나타내었다. PNGase F 처리시에는 두 분획 모두 활성이 없어졌으며, 등전점의 범위는 유사한 범위를 가지게 되었다. 이러한 결과를 통해 N-당사슬의 함량이 효소 활성과 밀접한 관계가 있음을 알 수 있었다. 더욱이, 말단의 시알산을 제거하는 경우에는 산성 분획의 등전점 범위나 효소 활성이 염기성 분획의 것과 유사해지는 현상을 통해 말단의 시알산 함량과 효소 활성의 관련은 있음을 알 수 있었다. 하지만, 말단의 시알산 함량이 낮은 염기성 분획이 시알산 함량이 높은 산성 분획보다 히알루로니다제의 효소 활성이 증가한 결과를 나타내었다.
이러한 효소 활성과 N-당사슬 함량과의 관계는 배양을 위한 Cell source를 다르게 한 천연형이나 다양한 변이체에서의 조사 결과 (표 1)에 의해 관련성을 더 알 수 있었다.
Hyaluronidase type Preparation Relative
activity		 N-Glycan content
Galactosyl-
ation (%)		 Sialyl-
ation (%)		 Mannosyl-
ation (%)
천연형 인간
PH20		 임시발현 배양 100% 32.9 15.2 57.2
천연형 인간 PH20 세포주 배양 100% 42.5 21.7 54.8
HM46 임시발현 배양 167% 37.1 7.4 48.1
HM46 세포주클론시험배양#1 115% 46.9 18.6 48.9
HM46 세포주클론시험배양#2정제분획#1 161% 40.6 16.4 54.4
HM46 세포주클론시험배양#2정제분획#2 86% 42.1 28 56.8
HM46 세포주시험배양#1 158% 49.6 14.4 48.1
HM46 세포주시험배양#2 186% 31.2 5.5 48.3
HM46 세포주시험배양#3 152% 30.6 4 48.7
HM46 세포주시험배양#4 174% 15.8 4.5 52.8
HM46 세포주배양#1 170% 14.8 2.8 49.9
HM46 세포주배양#2 161% 16.4 2.5 47.9
HM46 세포주배양#3 162% 17.9 4.4 49.1
HM46 세포주배양#4 158% 18.5 3.8 48.1
양 PH20 임시발현 배양 193% 35.5 7.9 58.3
Bonobo PH20 임시발현 배양 72% 38.7 18.8 55.5
Relative Activity: (시료의 활성) / (천연형 인간 PH20의 활성)을 백분율로 표시한 활성Galactosylation % 함량: N-당사슬 중 G1, G1F, G1F', G2, G2F, A1, A1F, A2, A2F 등 말단에 갈락토스를 포함한 것의 % 함량을 합산함.Sialylation % 함량: N-당사슬 중 A1, A1F, A2, A2F 등 말단에 시알산을 포함한 것의 % 함량을 합산함.
Mannosylation % 함량: N-당사슬 중 M4G0F, M5, M5G0, M6, M7, M8, M9 등 말단에 만노스를 포함한 것의 % 함량을 합산함.
천연형 인간 PH20과 HM46은 국제공개특허 제2020/022791호에 서열이 제시되어 있음.
양 PH20, Bonobo PH20은 실시예 10에 제시된 방법으로 제조한 시료이며, 서열은 표 3에 제시되어 있음.
표 1에서와 같이 다양한 히알루로니다제 PH20 및 변이체 단백질을 제조하고 N-당사슬 함량을 조사하였다. 이를 위하여 재조합 유전자를 ExpiFectamine CHO Reagent (Gibco사, 미국)를 이용하여 ExpiCHO cell에 배양시마다 형질 주입하여 생산하는 임시발현 배양, 재조합 유전자를 이용하여 제조한 세포주 클론을 이용한 세포주 클론 배양과 생산성이 높은 단일 클론을 선별하여 이를 이용한 세포주 배양 등의 다양한 Cell Source를 사용한 배양을 진행하였다. 여기서, 세포주 클론 배양이란 재조합 유전자를 Transfection한 동물 세포의 클론에서 Selective Marker를 사용하여 선별한 생산성이 높은 세포주 클론을 이용한 배양을 말하며, 이는 다클론 세포주이며 단일 클론 세포주를 생산하기 위하여 제작하는 것이다. 세포주는 연구용 세포주 (RCB), 생산용 마스터 세포주 (MCB), 생산용 세포주 (WCB)로 구성되어 있다. 또한, 배양 방법에도 생산의 최적화를 위하여 다양한 조합의 시험 배양을 시도하였고, 이 경우에도 활성과 N-당사슬 함량에 대하여 차이가 발생하였다는 것을 발견하였다.
세포주클론시험배양#1은 HycellCHO 배지(Hyclone사, 미국)를 사용하여 2 L 규모에서 배양 온도 변경 없이 37℃로 회분 배양한 조건이다. 세포주클론시험배양#2 정제분획#1과 세포주클론시험배양#2 정제분획#2는 8 L 규모에서 EX-CELL® Advanced CHO Fed-Batch 배지(Sigma-Aldrich사, 미국)에 Cotton 100UF(Gibco사, 미국)를 첨가한 후 BalanCD®CHO Feed 4(Irvine Scientific사, 미국)를 첨가하는 유가 배양 방법으로 온도 변경 없이 37℃로 배양한 배양액을 대상으로 Anion Exchange Chromatography 정제 분획을 구분한 것으로 정제 분획#1은 Low Salt Elution 분획이며, 정제 분획#2는 High Salt Elution 분획이고, 세포주 시험배양#1은 2 L 규모에서 EX-CELL® Advanced CHO Fed-Batch 배지(Sigma-Aldrich사, 미국)에 Cotton 100UF(Gibco사, 미국)를 첨가한 후 BalanCD®CHO Feed 4(Irvine Scientific사, 미국)를 첨가하는 유가 배양 방법으로 배양 온도 37℃에서 배양하여 일정 누적세포농도에 도달할 때 32℃로 변경한 조건이다. 세포주시험배양#2은 10 L 규모에서 EX-CELL® Advanced CHO Fed-Batch 배지(Sigma-Aldrich사, 미국)에 Cotton 200UF(Gibco사, 미국)를 첨가한 후 CD CHO EfficientFeedTM B plus AGTTM(Gibco사, 미국)을 첨가하는 유가 배양 방법으로 배양 온도 37℃에서 배양하여 일정 누적세포농도에 도달할 때 32℃로 변경하고 12일 배양한 조건이다. 세포주시험배양#3은 50 L 규모에서 EX-CELL® Advanced CHO Fed-Batch 배지(Sigma-Aldrich사, 미국)에 Cotton 200UF(Gibco사, 미국)를 첨가한 후 CD CHO EfficientFeedTM B plus AGTTM(Gibco사, 미국)을 첨가하는 유가 배양 방법으로 배양 온도 37℃에서 배양하여 일정 누적세포농도에 도달할 때 2℃로 변경한 조건이고, 세포주시험배양#4는 10 L 규모에서 EX-CELL® Advanced CHO Fed-Batch 배지(Sigma-Aldrich사, 미국)에 Cotton 200UF(Gibco사, 미국)를 첨가한 후 CD CHO EfficientFeedTM B plus AGTTM(Gibco사, 미국)을 첨가하는 유가 배양 방법으로 배양 온도 37℃에서 배양하여 일정 누적세포농도에 도달할 때 32℃로 변경하고 13일 배양한 조건이다. 세포주배양#1, 세포주배양#2, 세포주배양#3, 세포주배양#4는 각각 연구용 세포주 (RCB), 생산용 마스터 세포주 (MCB), 생산용 세포주 (WCB)를 대상으로 200 L 규모에서 EX-CELL® Advanced CHO Fed-Batch 배지(Sigma-Aldrich사, 미국)에 Cotton 200UF(Gibco사, 미국)를 첨가한 후 CD CHO EfficientFeedTM B plus AGTTM(Gibco사, 미국)을 첨가하는 유가 배양 방법으로 배양 온도 37℃에서 배양하여 일정 누적세포농도에 도달할 때 32℃로 변경하고 12일 배양한 조건이다. 이러한 내용을 바탕으로 실시예 2~5의 배양 조건에 대한 실험을 진행하여 N-당사슬 함량을 유지하는 배양 방법을 확립하였다.
표 1의 천연형 인간 히알루로니다제 PH20 및 변이체, 그리고 포유동물의 히알루로니다제 PH20의 N-당사슬 함량은 Galactosylation: 15~50%, Sialylation: 2.5~28%, Mannosylation: 47~60%의 범위를 갖고 있으며, 시험 결과들의 95% 신뢰 구간을 적용하면, Galactosylation: 1~68%, Sialylation 함량: 1~38%, Mannosylation: 40~63%의 범위를 가져야 산업적으로 유용한 히알루로니다제의 활성을 가질 수 있음을 알 수 있었다. 산업적으로 유용한 히알루로니다제의 활성은 천연형 인간 PH20의 활성의 50% 이상을 의미한다. 상기의 수치는 10%의 오차를 포함할 수 있다. 왜냐하면, 단백질의 당 함량을 측정하는 경우 실험에 사용하는 기기 및 효소 반응 시간, 시험 온도, 시험자의 업무 숙달 정도 등등의 조건에 따라 실험실 마다 편차가 발생하므로, 본 발명에서 측정한 당 함량은 제한된 의미에서 보다는 실험실 간의 편차를 고려하여 더 광범위한 의미에서 해석되어야 하기 때문이다.
그리고 특히, 활성과 Sialylation의 관계를 살펴보면, Sialylation은 약 30% 이하로 제한되어야 천연형 인간 PH20의 활성 이상으로 산업적인 효율이 높은 히알루로니다제를 생산할 수 있음을 알 수 있다. 상기의 수치는 실험 결과에서부터 도출된 수치로써 10%의 오차를 포함할 수 있다.
이러한 N-당사슬 함량을 유지하는 고품질의 히알루로니다제는 임시발현 배양을 통하여 확인을 하였고, 이를 안정적인 상업 생산을 하기 위하여 생산성이 높은 단일 클론 균주를 선정하여 세포주를 제조하였다. 이러한 세포주를 사용하여 실시예 2, 3, 4, 5의 결과를 적용한 방법으로 배양인 표 1의 세포주 시험배양#2, #3, #4, 세포주 배양#1, #2, #3, #4의 경우에는 모두 10,000 unit/mL 이상의 효소 발현량을 보였기 때문에 고품질의 히알루로니다제를 저비용으로 생산할 수 있는 효율을 증명하였다.
실시예 2. 첨가물 조정 배양
*히알루로니다제(Hyaluronidase) PH20 변이체를 EX-CELL® Advanced CHO Fed-Batch 배지(Sigma-Aldrich사, 미국)에 Cotton 200UF(Gibco사, 미국)를 첨가한 후 20mM N-acetyl-D-mannosamine(NZP사, 네덜란드) 또는 50mM Galactose(Pfanstiehl사, 미국)을 추가로 첨가 또는 미첨가된 배지가 들어있는 3개의 125mL 삼각 플라스크 (Erlenmeyer flask)에 동일하게 2x106cells/mL로 접종하고, 37°C, 8% CO2 인큐베이터(incubator)에서 회분 배양으로 성장시킨 다음, 누적 생존 세포 농도 (integral viable cell density, IVCD)가 변경 범위에 도달하였을 때, 32℃로 온도를 낮추어 유가 배양하였다. 피드 배지인 CD CHO EfficientFeedTM B plus AGTTM 배지(Gibco사, 미국)는 플라스크 내의 배양 시작 부피의 1.88%로 매일 공급하였다. 세포 샘플은 배양으로부터 매일 취하여 생존 세포수, 세포 생존율, pH, Lactate의 수준을 측정하였고, 배양 종료 후 2,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 배양액 상등액을 확보하였다. 상기 조건으로 배양된 시료는 HPLC 및 탁도 분석으로 활성을 확인하였고, 등전점 전기영동 (isoelectric focusing) 및 당화 분석을 수행하여 단백질 패턴과 N-당사슬 수준을 확인하였다. 50mM Galactose를 첨가한 배지는 미첨가된 배지보다 Galactosylation이 24% 증가한 반면 활성은 2% 감소하였고, 20mM N-acetyl-D-mannosamine 첨가한 배지는 미첨가된 배지보다 Sialylation은 35% 증가한 반면 활성은 20% 감소한 것으로 확인되었다 (도 3, 도 4, 도 5, 도 6).
실시예 3. 배양일 조건 배양
히알루로니다제(Hyaluronidase) PH20 변이체를 과발현하는 세포를 Sartorius 200 L 생물반응기(bioreactor) 내에서 EX-CELL® Advanced CHO Fed-Batch 배지(Sigma-Aldrich사, 미국)에 2x106 cells/mL로 접종하였다. 배양 2일차에 Cotton 200UF(Gibco사, 미국)및 농축 영양물 배지인 CD CHO EfficientFeedTM B plus AGTTM 배지(Gibco사, 미국)를 공급물 배지로서 사용하는 유가 배양법(fed-batch culture)으로 진행하였고 pH 7.2±0.4와 DO 40%로 설정하여 47rpm의 속도로 교반 하였다. 37℃조건으로 초기 배양을 진행한 후 누적 생존세포농도가 변경 범위에 도달하면 32℃로 온도 변화시켜 유가 배양하였다. 피드 배지인 CD CHO EfficientFeedTM B plus AGTTM 배지(Gibco사, 미국)는 생물반응기(bioreactor)내의 배양 시작 부피의 1.88%로 매일 공급하였다. 배양일은 세포 생존율이 40% 이하가 되는 조건까지 배양을 진행하여 배양 19일에 종료하였고, 세포의 다양한 상태는 배양으로부터 매일 취하여 생존 세포수, 세포 생존율, 누적생존세포농도, 암모늄 이온의 수준을 측정하였으며 배양 종료 후 Depth filter를 사용하여 배양액을 회수하였다. 상기 조건으로 배양된 시료는 HPLC 및 탁도 분석으로 활성을 확인하였고, 등전점 전기영동 (isoelectric focusing) 및 당화 분석을 수행하여 단백질 패턴과 N-당사슬 수준을 확인하였다. 배양일이 증가할수록 Galactosylation 및 Sialylation 함량이 감소하고 활성은 증가하는 경향을 확인하였다 (도 7, 도 8, 도 9, 도 10).
실시예 4. 배양액 Glucose 농도 조절 배양
히알루로니다제(Hyaluronidase) PH20 변이체를 과발현하는 세포를 Sartorius 2 L 생물반응기(bioreactor) 내에서 EX-CELL® Advanced CHO Fed-Batch 배지(Sigma-Aldrich사, 미국)에 2x106cells/mL로 접종하였다. 배양 2일차에 Cotton 200UF(Gibco사, 미국)및 농축 영양물 배지인 CD CHO EfficientFeedTM B plus AGTTM 배지(Gibco사, 미국)를 공급물 배지로서 유가 배양법(fed-batch culture)으로 진행하였고 pH 7.2±0.4와 DO 40%로 설정하여 120rpm의 속도로 교반 하였다. 37℃조건으로 초기 배양을 진행한 후 누적 생존세포농도가 변경 범위에 도달하면 32℃로 온도 변화시켜 유가 배양하였다. 피드 배지인 CD CHO EfficientFeedTM B plus AGTTM 배지(Gibco사, 미국)는 생물반응기(bioreactor)내의 배양 시작 부피의 1.88%로 매일 공급하였다. 세포의 다양한 상태는 배양으로부터 매일 취하여 생존 세포수, 세포 생존율, pH, 삼투압, Glucose, Lactate의 수준을 측정하였다.
Glucose 농도 조절은 배양액 내 Glucose 농도를 매일 측정하여 배지에 포함된 Glucose 농도가 세포 성장에 따라 소모되어 기준 농도인 2, 4 또는 6 g/L 이하로 측정된 시점부터 농도를 조절하였다. 측정된 Glucose 농도가 각각의 기준 농도인 2, 4 또는 6 g/L 이하일 때 200 g/L Glucose stock 용액을 기준 농도에 달하는 양으로 3시간 이내 첨가하고, 기준 농도 이상으로 측정이 되면 첨가를 하지 않는 방식으로 각각의 농도 조건을 유지하였다. 일반적으로 동물 세포 배양에서 3시간 이내에는 Glucose의 함량의 변화가 세포 성장에 미치는 영향이 미미하다.
이 경우, 2 g/L을 기준 농도로 유지하는 조건을 1 g/L (±1 g/L) 농도 조건이라 하고, 4 g/L을 기준 농도로 유지하는 조건을 3 g/L (±1 g/L) 농도 조건이라 하고, 6 g/L을 기준 농도로 유지하는 조건을 5 g/L (±1 g/L) 농도 조건이라 하였다. 예를 들면, Glucose 농도 유지 조건 1 g/L (±1 g/L)농도 이란 의미는 Glucose 농도의 조절 범위의 하한선을 0 g/L로 설정하고, Glucose의 농도 조절 범위의 상한선을 2 g/L로 설정한다는 의미이며 실제 배양에서는 배양액의 측정된 Glucose 농도가 하한선은 0 g/L에 도달할 때, 최대 2 g/L의 Glucose 농도가 되도록 추가로 200 g/L의 Glucose stock 용액을 첨가하며, 배양액 내의 Glucose 농도가 상한선인 2 g/L에 도달할 때, 200 g/L의 Glucose stock 용액을 첨가하지 않는 것을 의미한다. 따라서, 1 g/L (±1 g/L) 농도, 3 g/L (±1 g/L) 농도의 2가지 농도조건에서 2 g/L의 농도 조건은 1 g/L (±1 g/L) 농도에서는 상한선 조건을 말하며, 3 g/L (±1 g/L) 농도에서는 하한선인 조건을 말하므로 전혀 다른 작용이 진행되는 조건이므로 중복된 조건이라고 할 수 없다.
배양 종료 후 4℃10,000 rpm으로 60분간 원심분리하여 배양액 상등액을 확보하였다. 상기 조건으로 배양된 시료는 HPLC 및 탁도 분석으로 활성을 확인하였고, 등전점 전기영동 (isoelectric focusing) 및 당화 분석을 수행하여 단백질 패턴과 N-당사슬 수준을 확인하였다. 배양액 내 Glucose 농도가 증가할수록 Galactosylation 및 Sialylation 함량이 증가하고 활성은 감소하는 결과를 확인하였다 (도 11, 도 12, 도 13, 도 14).
실시예 5. 배양 pH 조절 배양
히알루로니다제(Hyaluronidase) PH20 변이체를 과발현하는 세포를 Sartorius 2 L 생물반응기(bioreactor) 내에서 EX-CELL® Advanced CHO Fed-Batch 배지(Sigma-Aldrich사, 미국)에 2x106cells/mL로 접종하였다. 배양 2일차에 Cotton 200UF(Gibco사, 미국)및 농축 영양물 배지인 CD CHO EfficientFeedTM B plus AGTTM 배지(Gibco사, 미국)를 사용하는 유가 배양법(fed-batch culture)으로 진행하였고 DO 40%로 설정하여 120rpm의 속도로 교반 하였다. 37℃조건으로 초기 배양을 진행한 후 누적 생존세포농도가 변경 범위에 도달하면 32℃로 온도 변화시켜 유가 배양하였다. 피드 배지인 CD CHO EfficientFeedTM B plus AGTTM 배지(Gibco사, 미국)는 생물반응기(bioreactor)내의 배양 시작 부피의 1.88%로 매일 공급하였다. 배양 온도 변경 후 배양 pH를 기존 조건인 pH 7.2±0.4보다 개선된 조건을 찾기 위하여 pH 6.8±0.1, pH 7.0±0.1, pH 7.2±0.1, pH 7.4±0.1의 4가지 조건으로 나누어서 진행하였다. 이러한 4가지 조건은 pH의 조절 기능이 포함된 통상의 배양기를 사용한 배양의 pH의 조절 범위를 설정한 것으로 예를 들면, pH 7.0±0.1이란 의미는 pH의 조절 범위의 하한선을 pH 6.9로 설정하고, pH의 조절 범위의 상한선을 pH 7.1로 설정한다는 의미이며 실제 배양에서는 배양액의 pH가 하한선인 pH 6.9에 도달할 때, pH를 상승시켜주는 염기가 추가되며, 배양액의 pH가 상한선인 pH 7.1에 도달할 때, pH를 감소시켜주는 이산화탄소가 추가됨을 의미한다. 따라서, pH 6.8±0.1과 pH 7.0±0.1의 2가지 조건에서 pH 6.9의 조건은 pH 6.8±0.1에서는 상한선인 조건을 말하며, pH 7.0±0.1에서는 하한선인 조건을 말하므로 전혀 다른 작용이 진행되는 조건이므로 중복된 조건이라고 할 수 없다. 배양일은 세포 생존율이 40% 이하가 되는 조건까지 배양을 진행하였고, 세포의 다양한 상태는 배양으로부터 매일 취하여 생존 세포수, 세포 생존율, pH, 누적생존세포 농도의 수준을 측정하였으며, 배양 종료 후 4℃10,000 rpm으로 60분간 원심분리하여 배양액 상등액을 확보하였다. 상기 조건으로 배양된 시료는 HPLC 및 탁도 분석으로 활성을 확인하였고, 등전점 전기영동 (isoelectric focusing) 분석을 수행하여 단백질 패턴을 확인하였다. 배양액 pH에 따라 활성이 변화되는 양상이 관찰되었으며, 기존 조건보다 개선 조건인 pH 7.0±0.1에서 가장 높은 활성과 가장 낮은 Sialylation 함량이 관찰되었다. (표 2, 도 15, 도 16, 도 17)
N-Glycan pattern pH 7.2±0.4
(기존조건)		 pH 6.8±0.1 pH 7.0±0.1 pH 7.2±0.1 pH 7.4±0.1
Galactosylation (%) 39.6 49.4 37.0 42.1 47.6
Sialylation (%) 14.6 12.7 6.3 13.9 20.9
Mannosylation (%) 48.4 43.3 50.5 50.3 49.3
Total afucosylation (%) 53.4 46.2 51.2 56.2 57.2
Afucosylation (%) 7.7 5.9 4,2 8.9 10.7
Relative Specific activity (%) 100% 92% 115% 104% 98%
실시예 6. 동물 세포 배양 상층액을 이용한 히알루로니다제 정제
단계 1: 배양 상층액의 완충액 교환/계면활성제 처리
배양액은 제 1 차 음이온 교환 컬럼 평형화 조건까지 조정되도록 30 kDa MWCO 막 필터를 사용한 UF/DF에 의해 pH 및 전도도의 조정으로 재조정되었다. 재조정된 용액에 바이러스 불활성화를 위해 용매/계면활성제를 적절한 농도로 처리하여 실온 조건하에서 약 60분 동안 반응하였다.
단계 2: 제 1차 음이온교환(Q Sepharose Fast Flow) 컬럼 크로마토그래피
여과한 단백질 용액을 음이온 교환수지 의해 히알루로니다아제를 포획하도록 제 1차 음이온 교환 컬럼에 통과시켰고, 뒤이어 높은 염농도에서 그 컬럼으로부터 용출시켰다. 로딩 전에, 그 컬럼은 30mM의 염농도에서 pH 8.0의 트로메타민 완충액을 이용하여 평형화되었다. 로딩 후에, 그 컬럼을 동일한 완충액 (제 1 세척)를 이용하여 세척하였다. 제 1 세척 단계 다음에, 그 컬럼을 pH 8.0의 동일한 완충액으로, 그러나 전도도는 제 1 세척 단계의 염농도 보다 높은 60mM 염농도에서 세척하였다. 제 2 세척 단계 후에, 원하는 단백질인, 히알루로니다아제 용출을 도 18에 나타낸 바와 같이 200mM 염농도에서 pH 8.0의 적절한 완충제를 이용하여 수행하였다.
단계 3: 제 2차 음이온교환(Capto Q) 컬럼 크로마토그래피
여과한 단백질 용액을 음이온 교환수지 의해 히알루로니다아제의 acidic variant를 제거하기 위해 제 2차 음이온 교환 컬럼에 통과시켰고, 뒤이어 높은 염농도에서 그 컬럼으로부터 용출시켰다. 로딩 전에, 컬럼은 염이 없는 pH6.0의 비스트리스 완충액를 이용하여 평형화되었다. 로딩 후에, 그 컬럼을 동일한 pH6.0의 비스트리스 완충액(제 1 세척)를 이용하여 세척하였다. 제 1 세척 단계 다음에, 그 컬럼을 비스트리스 완충액으로, 그러나 전도도는 제 1 세척 단계의 염농도 보다 높은 20mM 염농도에서 세척하였다. 제 2 세척 단계 후에, 원하는 단백질인, 히알루로니다아제 용출을 도 19에 나타낸 바와 같이 염농도에서 비스트리스 완충액를 이용하여 수행하였다.
단계 4: 양이온교환(Capto MMC) 컬럼 크로마토그래피
재조정한 단백질 용액을 양이온 교환수지 의해 히알루로니다아제의 acidic variant를 제거하기 위해 컬럼에 통과시켰고, 뒤이어 높은 pH와 염농도에서 그 컬럼으로부터 용출시켰다. 로딩 전에, 컬럼은 80mM의 염농도에서 pH 5.5의 시트레이트 완충액를 이용하여 평형화되었다. 로딩 후에, 그 컬럼을 동일한 완충액 (제 1 세척)를 이용하여 세척하였다. 제 1 세척 단계 다음에, 그 컬럼을 pH 7.5의 적절한 비스트리스 완충액으로 세척하였다. 제 2 세척 단계 후에, 원하는 단백질인, 히알루로니다아제 용출을 도 20에 나타낸 바와 같이 400mM의 염농도에서 pH 8.0의 비스트리스 완충액를 이용하여 수행하였다.
단계 5: 나노-여과 / Formulation
양이온 교환 컬럼 단계 이후에, 원하는 히알루로니다아제를 포함하는 단백질 용액은 1um 필터로 여과하고 나노-여과 단계를 수행하였다. 나노 여과를 통과한 단백질 용액을 10mg/mL의 고농도로 농축하고 145mM 염이 함유된 pH7.0의 히스티딘 완충제로 교환하기 위해 8 kDa MWCO 막 필터를 사용한 UF/DF에 의해 재조정하였다.
실시예 7. 히알루로니다제의 효소 활성 분석
히알루로니다제 PH20 및 기타 히알루로니다제의 효소 활성을 다음과 같은 Turbidimetric assay를 이용하여 측정하였다.
Turbidimetric assay은 히알루론산과 알부민(BSA) 혼합 시 생성되는 침전을 흡광도를 이용하여 측정하는 방법으로, PH20에 의해 히알루론산이 가수분해되면 알부민과 혼합 시 흡광도가 감소한다. 일반적으로는 다음과 같이 진행하였다. 히알루로니다제 PH20 (Sigma)를 1, 2, 5, 7.5, 10, 15, 20, 30, 50, 60 units/mL되게 희석하여 각 튜브에 준비하였다. 정제된 단백질 샘플을 enzyme diluent buffer (20 mM Tris·HCl, pH 7.0, 77 mM NaCl, 0.01% (w/v) bovine serum albumin)에 용해하여 100X, 300X, 600X, 1200X, 2400X 되게 희석하여 각 튜브에 준비하였다. 새로운 튜브에 3 mg/mL인 히알루론산 용액의 농도가 0.3 mg/mL 되게 10배 희석하여 각 튜브의 부피가 180 ㎕가 되게 하였다. 희석한 히알루론산 용액에 효소를 60 ㎕ 넣고 혼합하여 37℃에서 45분간 반응시켰다. 반응이 끝나면 96-well plate에 반응시킨 효소 50 ㎕와 acidic albumin solution 250 ㎕를 각 well에 넣고 10분간 진탕한 후 600 nm에서 분광 광도계로 흡광도를 측정하였다. 이 활성 단위를 알고 있는 표준품의 시험 결과와 시료의 시험 결과를 이용하여 시료의 활성 단위를 구하였다.
실시예 8. 히알루로니다제의 등전점 전기 영동 분석
히알루로니다제의 등전점 전기영동은 Invitrogen사의 Precast Gel (pH 3-7)과 등전점 전기영동용 완충용액을 사용하여 분석하였다. Precast Gel에 정제한 히알루로니다제 시료를 Loading한 후, Novex사의 전기 영동 장치를 이용하여 100 V 로 1시간, 200 V 로 1시간, 500 V로 30분 간 수행하여 전개하였다. 전개가 완료된 Gel은 정제수로 세척을 하고, 12% TCA 용액으로 단백질을 고정한 후 Coomassie Blue R-250 염색용액으로 염색을 한 후, 초산-메탄올 용액으로 탈색을 하여 Gel에 나타난 단백질 띠를 분석하였다.
실시예 9. 히알루로니다제의 N-당사슬 함량 분석
히알루로니다제의 N-당사슬 함량은 히알루로니다제를 PNGase F (N-glycosidase F)로 처리하여 분리한 N-당사슬 시료를 2-AB (2-aminobanzamide)로 Labelling하여 ACQUITY UPLC Glycan BEH Amide column (Waters사)을 이용하여 UPLC (Ultra High Performance Liquid Chromatography)를 실시하여 분석하였다. 정제한 히알루로니다제 시료는 탈염하여 PNGase F로 37℃에서 16-18시간 동안 반응하여 N-당사슬을 분리하였고, 이는 건조한 후 2-AB Labelling을 65℃에서 3시간 반응하였고 과량의 2-AB를 제거하였다. 라벨이 된 N-당사슬 시료는 72%-20% Acetonitrile gradient로 HPLC를 진행하여 분리하였다. 분리된 시료는 FLD (Flourescence detector)로 검출하여 N-당사슬 함량을 분석하였다. 분리된 각 N-당사슬을 분류하여 N-당사슬 말단에 갈락토스를 포함한 N-당사슬 (G1, G1F, G1F', G2, G2F, A1, A1F, A2, A2F 등)의 각 함량을 모두 합하여 Galactosylation % 함량을 구하고, N-당사슬 말단에 시알산을 포함한 N-당사슬 (A1, A1F, A2, A2F 등)의 각 함량을 모두 합하여 Sialylation % 함량을 구하며, N-당사슬 말단에 만노스를 포함한 N-당사슬 (M4G0F, M5, M5G0, M6, M7, M8, M9 등)의 각 함량을 모두 합하여 Mannosylation % 함량을 구하였다.
실시예 10. 동물 유래 히알루로니다제의 제조 및 N-당사슬 함량 분석
(1) Bonobo와 양의 히알루로니다제 PH20의 유전자 제조
동물 유래 즉, 유인원인 Bonobo와 우제류인 양의 히알루로니다제 PH20의 활성과 N-당사슬 함량을 조사하기 위하여 다음과 같이 각각 히알루로니다제 PH20를 제조하였다. 각각의 천연형 유전자로부터 cDNA를 합성하고, pcDNA3.4-TOPO vector의 Xho I과 Not I 제한효소 자리에 삽입하였다. ExpiCHO 세포에서의 발현을 위해 PH20의 고유한 신호 펩티드 대신 인간 성장호르몬, 인간 혈청 알부민, 또는 인간 Hyal1의 신호 펩티드 중 하나를 신호 펩티드로 사용하였다. HisTrap 컬럼을 이용한 단백질 정제를 위해 PH20 cDNA의 3'-말단에 His-tag의 DNA 서열이 위치하게 하였다. 각 서열의 확인은 DNA sequencing을 이용하였다. 표 3은 동물 유래 히알루로니다제의 서열을 제시하였다.
동물유래
히알루로니다제		 아미노산 서열
양 PH20 LDFRAPPLISNTSFLWAWNAPAERCVKIFKLPPDLRLFSVKGSPQKSATGQFITLFYADRLGYYPHIDEKTGNTVYGGIPQLGNLKNHLEKAKKDIAYYIPNDSVGLAVIDWENWRPTWARNWKPKDVYRDESVELVLQKNPQLSFPEASKIAKVDFETAGKSFMQETLKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHNYNQPTYNGNCSDLEKRRNDDLDWLWKESTALFPSVYLNIKLKSTPKAAFYVRNRVQEAIRLSKIASVESPLPVFVYHRPVFTDGSSTYLSQGDLVNSVGEIVALGASGIIMWGSLNLSLTMQSCMNLGNYLNTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCHDEGVCTRKQWNSSDYLHLNPMNFAIQTGKGGKYTVPGKVTLEDLQTFSDKFYCSCYANINCKKRVDIKNVHSVNVCMAEDICIEGPVKLQPSDH
Bonobo PH20 LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINVTGQDVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDIYKNRSIELVQQQNVQLNLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFVYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGTLSIMRSMKSCLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEESQIFY
(2) Bonobo와 양의 히알루로니다제 PH20의 발현발현은 ExpiCHO 발현 시스템을 사용하였다. ExpiCHO 세포의 세포수가 6x106/mL이 되었을 때 히알루로니다제 PH20의 cDNA가 pcDNA3.4-TOPO 벡터에 삽입된 플라스미드로 ExpiFectamine CHO Reagent를 이용하여 ExpiCHO 세포를 형질주입 시켰다. 세포배양액은 ExpiCHO Expression Medium (100~500 mL)을 이용하였다. 형질주입 후 ExpiCHO 세포를 총 6일간 130 rpm에서 진탕 배양하였으며, 이 기간 동안 37 ℃에서 1일 배양하고, 온도를 32 ℃로 낮추어서 5일간 더 배양하였다. 배양 완료 시 10,000 rpm에서 30분간 원심 분리하여 세포 상등액을 회수하였다.
(3) Bonobo와 양의 히알루로니다제 PH20의 정제
ExpiCHO 세포에서 생산한 C-말단 His-tag이 붙은 동물 유래 히알루로니다제 PH20의 재조합 단백질은 AKTA prime 장비(GE Healthcare사)를 이용하여 2단계의 컬럼 크로마토그래피로 정제하였는데, 이 Bonobo PH20의 경우에는 pI가 6이므로 Anion Exchange Chromatography인 Q Sepharose를 사용하였고, 양 PH20의 경우에는 pI가 8 이상이므로 Cation Exchange Chromatography인 Capto S 컬럼을 사용하여 1단계 정제를 실시하였고, 각 단백질은 His-Tag 친화 Chromatography인 HisTrap HP 컬럼으로 2 단계 정제를 실시하였다.
Q Sepharose 컬럼을 이용한 단백질 정제를 위해서 버퍼 A (20 mM sodium phosphate, pH 7.5)와 버퍼 B (20 mM sodium phosphate, pH 7.5, 0.5 M NaCl)를 제조하였다. 단백질을 Q Sepharose 컬럼에 결합시키고, 버퍼 A를 5 CV 흘려주어 비 특이적으로 결합한 단백질을 제거한 후, 0~100%의 농도 기울기로 버퍼 B를 5 CV 흘려주어 단백질을 용출하였다.
Capto S 컬럼을 이용한 단백질 정제를 위해서 버퍼 A (20 mM sodium phosphate, 15 mM NaCl, pH 6.0)와 버퍼 B (20 mM sodium phosphate, 500 mM NaCl, pH 6.0)를 각각 제조하였다. 배양액의 pH와 conductivity를 Buffer A와 동일하게 맞추고 0.22 μm pore 크기의 membrane에 배양액을 여과하였다. 다음 Capto S 컬럼에 단백질을 결합시킨 후 버퍼 A를 3 column volume (CV) 흘려주어 비특이적(non-specific)으로 결합한 단백질을 제거하였다. Buffer B를 4 CV 순차적으로 흘려주어 타겟 단백질을 용출하였다.
HisTrap HP 컬럼을 이용한 단백질 정제를 위해서 Buffer A (20 mM sodium phosphate, 500 mM NaCl, pH 7.5)와 Buffer B (20 mM sodium phosphate, 500 mM NaCl, 500 mM Imidazole, pH 7.5)를 각각 제조하였다. 단백질 시료를 HisTrap HP 컬럼에 결합시킨 후 비특이적으로 결합된 단백질을 제거하고자 7% Buffer B를 7 CV 흘려주었으며, 타겟 단백질의 용출을 위해 40% Buffer B를 3 CV 흘려주었다. 컬럼 용출액은 Dialysis buffer (20 mM sodium phosphate, 100 mM NaCl, pH 7.0)를 이용하여 투석하였다.
(4) Bonobo와 양의 PH-20 히알루로니다제의 분석
활성 분석은 실시예 7과 동일한 방법으로 측정하였고, N-당사슬 함량 분석은 실시예 9와 동일한 방법으로 측정하였다. 결과는 표 1에 제시하였다.
실시예 11. N-당사슬 함량에 따른 변이체의 효소 반응 속도 (Enzyme kinetics) 분석
본 발명에 따른 변이체의 효소 반응 속도 (Enzyme kinetics)를 분석하기 위해 Morgan-Elson 방법 (Takahashi, T. et al (2003) Anal Biochem 322:257-263)으로 효소 활성을 측정하였다. Morgan-Elson 방법은 히알루론산이 히알루로니다제에 의해 가수분해되었을 때, 생성된 N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc)의 환원 말단과 Ehrlich's Reagent인 para-dimetylaminobenzaldehyde (DMAB)의 반응에 의해 생성되는 붉은색 물질을 정량(545 nm)하는 비색분석법이다. N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc, Sigma)를 희석 완충 용액 (0.1 M NaPi, 0.1 M NaCl, 1.5 mM Saccharic Acid 1,4-lactone, pH 5.35)로 0.25, 0.50, 0.75, 1.00, 1.25 mM 되게 희석하여 준비한 각 시험관에 Tetraborate를 처리하여 환원 후, DMAB를 첨가하여 발색 반응시켰다. 반응 후 545 nm에서 흡광도를 측정하여 GlcNAc의 표준 반응 곡선을 작성하였다. 기질인 히알루론산을 희석 완충 용액으로 0.54, 0.65, 0.87, 1.23, 2.17 μM 되게 희석하여 준비한 각 시험관에 히알루로니다제를 첨가하여 37℃에서 5분간 반응시키고 100℃에서 5분간 가열하여 효소 반응을 종료시키고, Tetraborate를 처리하여 환원 후, DMAB를 첨가하여 발색 반응시켰다. 반응 후 545 nm에서 흡광도를 측정하여서 위의 GlcNAc의 표준 반응 곡선을 이용하여 효소 활성을 측정하였다. 이 방법을 사용하여 서열번호 1의 야생형 PH20 및 본 발명에 따른 PH20 변이체의 효소 반응 속도 (Enzyme kinetics)를 분석하면 Lineweaver-Burk 곡선의 직선성이 확인되어 본 발명에 따른 PH20 변이체는 Michaelis-Menten 효소 반응 속도 공식에 따르는 것을 확인하였다.
표 4는 실시예 1의 표1의 시료 중 세포주 클론 시험배양#2로 제조하여 얻어진 분획#1, #2의 효소 반응 속도를 분석하였다. 그 결과, Galactosylation 함량과 Mannosylation 함량이 유사한 범위에 있으면서 Sialylation 함량이 낮은 경우에는 효소의 촉매 효율( k cat / K m )이 크기 때문에 재조합 히알루로니다제의 효소 활성이 증가 함을 알수 있다.
이 실험 결과는 동일한 아미노산의 구조를 가진 효소의 경우에도 당화의 변화 더 나아가서는 Sialylation 함량의 변화에 의해서도 효소의 활성이 영향을 받음을 확인할 수 있음을 증명한다. 따라서, 재조합 방법으로 천연형 PH20 혹은 천연형 PH20의 변이체 히알루로니다제를 대량 생산하여 산업적으로 유용한 히알루로니다제를 생산하고자 하는 경우 Sialyation 함량을 조정함으로써 산업적 이용 가능성이 더 큰 효소를 개발할 수 있는 것을 확인하였다.
Hyaluroni-dase type Preparation Relative
activity		 N-Glycan content K M
(μM) 		k cat
(1/sec) 		k cat /K M
(sec
/μM)
Galactosyl-
ation
(%)		 Sialyl-
ation
(%)		 Mannosyl-
ation
(%)
HM46 세포주클론
시험배양#2
정제분획#1		 161% 40.6 16.4 54.4 1.11
±0.07		 47.6
±3.8		 42.7
±0.7
HM46 세포주클론
시험배양#2
정제분획#2		 86% 42.1 28.0 56.8 1.05
±0.15		 33.9
±4.9		 32.4
±0.1
이상 기술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (12)

  1. N-당사슬 함량 중 Galactosylation 함량이 1~68%, Sialylation 함량이 1~21.7%, Mannosylation 함량이 40~63%이며, Galactosylation 함량은 N-당사슬 중 G1, G1F, G1F', G2, G2F, A1, A1F, A2, A2F 말단에 갈락토스를 포함한 것의 % 함량을 합산한 값이고, Sialylation 함량은 N-당사슬 중 A1, A1F, A2, A2F 말단에 시알산을 포함한 것의 % 함량을 합산한 값이며, Mannosylation 함량은 N-당사슬 중 M4G0F, M5, M5G0, M6, M7, M8, M9 말단에 만노스를 포함한 것의 % 함량인 것을 특징으로 하며, 히알루로니다제 효소의 배양액에서의 활성이 10,000 unit/mL 이상인 것을 특징으로 하는 PH20 또는 이의 변이체.
  2. 제1항에 있어서, N-당사슬 함량 중 Galactosylation 함량이 1~49.6%, Sialylation 함량이 1~21.7%, Mannosylation 함량이 40~58.3%인 것을 특징으로 하는 PH20 또는 이의 변이체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 PH20 또는 이의 변이체의 효소 비활성이 천연형 인간 PH20의 활성보다 10% 이상 향상된 것을 특징으로 하는 PH20 또는 이의 변이체.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, PH20의 변이체는 천연형 PH20의 아미노산 서열에 있어 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환을 포함하고, 선택적으로 N-말단 및/또는 C-말단의 아미노산 잔기의 일부가 결실된 것을 특징으로 하는 PH20 또는 이의 변이체.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 숙주 세포는 동물 세포(animal cell), 효모(yeast), 방선균(Actinomycetes) 또는 곤충 세포(insect cell)인 것을 특징으로 하는 PH20 또는 이의 변이체.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 PH20 또는 이의 변이체는
    (1) 재조합 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체를 발현하는 숙주 세포를 배양 온도 35~ 38℃?에서 누적생존세포농도 (integral viable cell density)를 기준으로 20x106 ~ 120x106 cells x day/mL까지 되도록 배양하는 단계; 및
    (2) 배양 온도를 28~ 34℃?로 감소시킨 후 배양 온도를 유지하며 2 ~ 18일 동안
    (a) 배지 내의 잔류 Glucose 농도를 배양 기간 동안 0.001 g/L ~ 4.5 g/L로 유지; 및
    (b) 배양액의 pH를 6.8 ~ 7.2로 유지; 하는 방법으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 방법으로 배양하는 단계;
    를 포함하는 방법으로 생산된 것임을 특징으로 하는 PH20 또는 이의 변이체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 (1) 단계 및/또는 (2) 단계에서의 숙주세포의 배양은 회분 배양법 (batch culture), 반복 회분 배양법 (repeated batch culture), 유가 배양법 (fed-batch culture), 반복 유가 배양법 (repeated fed-batch culture), 연속 배양법 (continuous culture) 및 관류 배양법 (perfusion culture)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 PH20 또는 이의 변이체.
  8. 제6항에 있어서, 상기 (1) 단계 및/또는 (2) 단계에서의 숙주세포의 배양은
    (i) 배지 내에 암모니아를 첨가하거나 배지 내의 암모니아 농도를 5mM 이상으로 증가시키는 조건;
    (ii) Glutamine, Glucosamine, Uridine, Glucosamine 및 Sodium Butyrate로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질을 배지에 첨가하는 조건; 및
    (iii) Galactose 및 ManNAc을 첨가하지 않는 조건;
    으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 조건 하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 PH20 또는 이의 변이체.
  9. 제6항에 있어서, 상기 PH20 또는 이의 변이체는 친화력 결합 특성을 이용하지 않고, PH20 또는 이의 변이체의 이온결합 특성 및/또는 소수성 상호작용 특성을 이용한 분리 정제 단계를 더 거쳐 생산되는 것을 특징으로 하는 PH20 또는 이의 변이체.
  10. 제9항에 있어서, 상기 PH20 또는 이의 변이체의 분리 정제 단계는 친화크로마토그래피(affinity chromatography)를 이용하지 않고, 이온교환크로마토그래피(ion exchange chromatography)와 소수성작용 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography)를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 PH20 또는 이의 변이체.
  11. 제9항에 있어서, 상기 분리 정제 단계를 거쳐 산성을 띠는 PH20 또는 이의 변이체가 제거된 것을 특징으로 하는 PH20 또는 이의 변이체.
  12. 제11항에 있어서, 상기 산성을 띠는 PH20 또는 이의 변이체의 제거는 이온교환크로마토그래피를 이용하여 이루어진 것을 특징으로 하는 PH20 또는 이의 변이체.

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