CN105431530A - N末端截短的糖基转移酶 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及具有N末端截短缺失的糖基转移酶变体。与此前的发现相反,发现某些包含保守氨基酸基序(“QVWxKDS”)的截短部分与糖基转移酶酶活性并存,特别是在人唾液酸转移酶(hST6Gal-I)中。因此,公开了哺乳动物糖基转移酶的变体、编码其的核酸、重组产生哺乳动物糖基转移酶变体的方法和手段及其用途,特别是用于唾液酸化作为糖蛋白(如免疫球蛋白)的一部分的聚糖部分的末端受体基团。
Description
本公开涉及具有N末端截短缺失的糖基转移酶变体。与此前的发现相反,某些包含保守氨基酸基序(“QVWxKDS”,SEQ ID NO:2)的截短部分被发现与糖基转移酶酶活性并存,特别是在人唾液酸转移酶(hST6Gal-I)中。因此,公开了哺乳动物糖基转移酶变体、编码其的核酸、重组产生所述哺乳动物糖基转移酶变体的方法和手段及其用途,特别是用于唾液酸化作为糖蛋白(如免疫球蛋白)的一部分的聚糖部分的末端受体基团。
背景
转移酶(EC2)催化官能团从一个物质转移到另一个物质。糖基转移酶,一个酶超家族,其涉及合成糖蛋白、糖脂及葡糖氨基葡聚糖的碳水化合物部分。特定的糖基转移酶通过将经活化的糖供体的单糖部分依次转移到受体分子而合成低聚糖。因此,“糖基转移酶”催化糖部分从其核苷酸供体转移到多肽、脂质、糖蛋白或糖脂的受体部分。这个过程也被称为“糖基化”。作为例如糖蛋白的结构部分的碳水化合物部分也被称为“聚糖”。聚糖是所有已知的翻译后蛋白质修饰中最普遍的。聚糖涉及广泛而多样的生物识别过程,如粘附、免疫应答、神经细胞迁移和轴突延伸。作为糖蛋白的结构部分,聚糖还在蛋白质折叠以及维持蛋白质稳定性与生物活性中起作用。
在糖基转移酶催化中,单糖单元葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、葡糖醛酸(GlcUA)、半乳糖醛酸(GalUA)和木糖作为尿苷二磷酸(UDP)-α-D衍生物被活化;阿拉伯糖作为UDP-β-L衍生物被活化;甘露糖(Man)和岩藻糖分别作为GDP-α-D和GDP-β-L衍生物被活化;而唾液酸(= Neu5Ac;= SA)作为β-D-Neu5Ac的CMP衍生物被活化。
许多不同的糖基转移酶参与了聚糖的合成。糖蛋白的碳水化合物部分的结构多样性尤其大并且由复杂的生物合成途径所确定。在真核生物中,糖蛋白聚糖部分的生物合成在内质网(“ER”)腔内和高尔基体内进行。糖蛋白的单个(支链或直链的)碳水化合物链通常为N-或O-连接的聚糖。在翻译后加工的过程中,碳水化合物通常经由天冬酰胺(“N-连接的糖基化”)或经由丝氨酸或苏氨酸(“O-连接的糖基化”)被连接至多肽。聚糖的合成,无论N-或O-连接的(=“N-/O-连接的”),均受到若干不同的膜锚定型糖基转移酶的活性的影响。糖蛋白可包含一个或多个聚糖连接的氨基酸(=“糖基化位点”)。具体的聚糖结构可以是直链或支链的。支化是碳水化合物值得注意的特征,这与DNA、RNA和多肽典型的直链性质相反。组合其基础结构单元的大的不均一性,单糖、聚糖结构呈现高多样性。此外,在具体的糖蛋白种类的成员中,连接到特定糖基化位点的聚糖结构可能变化,因而导致各自糖蛋白种类的微不均一性,即在种内共享多肽部分的相同氨基酸序列。
唾液酸转移酶(=“ST”)是一种糖基转移酶,其催化唾液酸(=5-N-乙酰神经氨酸 =
Neu5Ac = NANA)残基从供体化合物转移到(i)糖脂或神经节苷脂的末端单糖受体基团,或(ii)糖蛋白的N-/O-连接的聚糖的末端单糖受体基团。对于包括人ST种类的哺乳动物唾液酸转移酶而言,存在共同的供体化合物,即胞苷-5'-一磷酸-N-乙酰神经氨酸(= CMP-Neu5Ac =
CMP-NANA)。唾液酸残基的转移也被称为“唾液酸化(sialylating)”和“唾液酸化作用(sialylation)”。
在唾液酸化的糖蛋白的聚糖结构中,(一个或多个)唾液酸(sialyl)部分通常位于该低聚糖的末端位置。由于该末端,即暴露的位置,唾液酸可以参与许多不同的生物识别现象并作用于各种各样的生物相互作用中。在糖蛋白中,可存在多于一个唾液酸化位点,即能够充当唾液酸转移酶底物并作为适用于唾液酸残基转移的受体基团的位点。原则上,此类多于一个位点可以是锚定在糖蛋白的不同糖基化位点上的多个直链聚糖部分的末端。另外,支链聚糖可具有多个可发生唾液酸化作用的位点。
根据现有知识,末端唾液酸残基可见于(i) α2→3 (α2,3)连接至半乳糖基-R,(ii) α2→6 (α2,6)连接至半乳糖基-R,(iii) α2→6 (α2,6)连接至N-乙酰基半乳糖胺-R,(iv) α2→6 (α2,6)连接至N-乙酰基葡糖胺-R,以及(v) α2→8/9 (α2,8/9)连接至唾液酸基-R,其中-R代表该受体底物部分的其余部分。因此,通常根据其各自的单糖受体底物以及根据其催化的糖苷键的3、6或8/9位置,对在唾液酸缀合物(=“唾液酸化作用”)的生物合成中有活性的唾液酸转移酶进行命名和分类。因此,在本领域已知的文献,例如,Patel
RY等人,Glycobiology 16 (2006) 108-116中,根据形成糖苷键时Neu5Ac残基转移到的受体糖残基的羟基位置,提及了真核生物唾液酸转移酶如(i)
ST3Gal、(ii) ST6Gal、(iii) ST6GalNAc或(v)
ST8Sia。还可以更通用的方式提及唾液酸转移酶,例如,ST3、ST6、ST8;因此,“ST6”具体涵盖催化α2,6 唾液酸化作用的唾液酸转移酶。
二糖部分β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺(= Galβ1,4GlcNAc)是糖蛋白的N-连接的聚糖天线(antennae)的常见末端残基,但也可以存在于O-连接的聚糖中以及糖脂中。酶β-半乳糖苷-α2,6-唾液酸转移酶(= “ST6Gal”)能够催化聚糖的或聚糖支链(= “天线”)的末端Galβ1,4GlcNAc的α2,6-唾液酸化作用。对于其一般方面而言,在文件DallOlio F. Glycoconjugate Journal 17
(2000) 669-676中提及。在人和其它哺乳动物中,存在若干种类的ST6Gal。本公开具体涉及人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I(= hST6Gal-I;EC
2.4.99.1,根据IUBMB酶命名法),但不限于此。
唾液酸转移酶的ST6组包括2个亚组:ST6Gal和ST6GalNAc。ST6Gal酶的活性催化Neu5Ac残基至游离半乳糖残基的C6羟基的转移,该游离半乳糖残基是聚糖或聚糖天线中的末端Galβ1,4GlcNAc的一部分,从而在该聚糖中形成被α2→6连接至Galβ1,4GlcNAc部分的半乳糖残基的末端唾液酸残基。所得的聚糖中新形成的末端部分是Neu5Acα2,6Galβ1,4GlcNAc。
人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I (hST6Gal-I)的野生型多肽,于提交本文件时作为“UniProtKB/Swiss-Prot:
P15907.1”在可公共访问的NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/115445)中被公开。包括编码序列在内的另外的信息作为在数据库条目“Gene ID:6480”下编译的超链接(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/6480)提供。
哺乳动物的唾液酸转移酶与其它哺乳动物的高尔基体内固有的糖基转移酶(所谓“II型结构”)共享(i)短的细胞质N-末端尾区、(ii)跨膜片断随后为(iii)长度可变的茎区以及(iv)面向高尔基体腔内的C末端催化域(Donadio S.等人,于Biochimie
85 (2003) 311-321)。哺乳动物的唾液酸转移酶看似在其催化域展示显著的序列同源性。然而,即便在一般而言大量的真核生物糖基转移酶(即包括唾液酸转移酶和其它糖基转移酶在内的一组酶)中,也在氨基酸序列水平上观察到了保守基序,即SEQ
ID NO:2的QVWxKDS共有基序。如SEQ
ID NO:1(野生型序列)所示的人ST6Gal-I(“hST6Gal-I”)也包含此基序,显著地在hST6Gal-I野生型多肽的氨基酸序列的94-100位置,所述hST6Gal-I野生型多肽例如于提交本文件时作为“UniProtKB/Swiss-Prot:P15907.1”在可公共访问的NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/115445)中被公开。
根据Donadio S.等人的出版物(同上),QVWxKDS共有基序的氨基酸序列对于hST6Gal-I的催化域获得生物活性构象而言是必不可少的。Donadio
S.等人在CHO细胞中表达了hST6Gal-I的若干种N末端截短的变体并且发现包含前35、48、60和89个氨基酸的N末端缺失产生尽管如此但仍在将唾液酸转移到外源性受体中有活性的突变酶。但是发现具有前100个氨基酸的N末端缺失的hST6Gal-I突变体在此方面是没有活性的。值得注意的是,hST6Gal-I的这种“Δ100”缺失突变体缺少高度保守的QVWxKDS基序。因此,该基序的存在被Donadio
S.等人(同上)总结为对促进唾液酸转移酶的活性至关重要。
令人惊奇地并与Donadio S.等人(同上)的发现和教导相抵触,本公开的作者发现在糖基转移酶多肽的氨基酸序列中缺失包含整个保守QVWxKDS基序的序列部分实际上可以与糖基转移酶活性,特别是唾液酸转移酶活性并存。
概述
在第一个方面,报道了哺乳动物糖基转移酶变体,其中该变体的多肽包含野生型哺乳动物糖基转移酶的N末端截短的氨基酸序列,该截短部分包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列基序,并且其中该变体展现出糖基转移酶活性。在第二个方面,报道了编码如本文中所公开的哺乳动物糖基转移酶变体的多肽的核苷酸序列。在第三个方面,报道了包含靶基因的表达载体,所述靶基因与在用所述表达载体转化的宿主生物中促进该靶基因表达的序列可操作地连接,其中该靶基因包含如本文中所公开的核苷酸序列。在第四个方面,报道了经转化的宿主生物,其中该宿主生物用如本文中所公开的表达载体转化。在第五个方面,报道了重组产生哺乳动物糖基转移酶变体的方法,该方法包括在经转化的宿主生物中表达编码如本文中所公开的哺乳动物糖基转移酶变体的核苷酸序列的步骤,其中形成多肽,从而产生该哺乳动物糖基转移酶变体。在第六个方面,报道了通过如本文中所公开的方法而获得的糖基转移酶。在第七个方面,报道了如本文中所公开的哺乳动物糖基转移酶变体在将5-N-乙酰神经氨酸残基从供体化合物胞苷-5'-一磷酸-N-乙酰神经氨酸或从其功能等同物转移至受体的用途,该受体为单克隆抗体的聚糖部分中的末端β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺。
附图说明
图1:野生型hST6Gal-I多肽及其N末端部分(于Δ27、Δ48、Δ62、Δ89和Δ108变体中截短)的氨基酸序列的图示。截短部分中缺失的位置用“X”表示。
图2: 在巴斯德毕赤酵母中表达并从其分泌的hST6Gal-I变体的电泳和染色后的SDS凝胶。泳道1和9含有大小标准品,在左侧表明了根据该标准品的以kDa表示的分子量。泳道2: Δ62;泳道3: Δ48;泳道4: Δ27(“克隆103”);泳道5: Δ27(“克隆154”);泳道6: Δ62(“克隆356”);泳道7: Δ48(“克隆9”);泳道8: Δ89(“克隆187”)。
图3:在HEK细胞中瞬时表达并从其分泌的Δ108 hST6Gal-I变体的电泳和染色后的SDS凝胶。泳道1含有大小标准品,在左侧表明了根据该标准品的以kDa表示的分子量。泳道2: Δ108
hST6Gal-I截短变体(在凝胶上,上样5 µg)。
详述
除非上下文另行明确指出,否则术语“一个/种”和“所述”通常包括多个指代物。如本文中所用,“多个”被理解为多于一个。例如,“多个”是指至少两个、三个、四个、五个或更多个。除非特别说明或在上下文中显而易见,如本文中所用,术语“或”被理解为包括性的。
除非特别说明或在上下文中显而易见,如本文中所用,术语“约”被理解为处于本领域中正常容许的范围内,例如在平均值的2个标准偏差以内。“约”可以被理解为在所述值的10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%或0.01%以内。除非上下文中另行指明,本文中提供的所有数值可用术语“约”修饰。
术语“氨基酸”通常是指可以掺入肽、多肽或蛋白质的任何单体单元。如本文中所用,术语“氨基酸”包括以下二十种天然或基因编码的α-氨基酸:丙氨酸(Ala或A)、精氨酸(Arg或R)、天冬酰胺(Asn或N)、天冬氨酸(Asp或D)、半胱氨酸(Cys或C)、谷氨酰胺(Gln或Q)、谷氨酸(Glu或E)、甘氨酸(Gly或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(Ile或I)、亮氨酸(Leu或L)、赖氨酸(Lys或K)、甲硫氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)、脯氨酸(Pro或P)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、色氨酸(Trp或W)、酪氨酸(Tyr或Y)和缬氨酸(Val或V)。在未限定“X”残基的情况下,应当将其定义为“任何氨基酸”。这二十种天然氨基酸的结构在,例如,Stryer等人,Biochemistry,第5版,Freeman and Company (2002)中示出。另外的氨基酸,如硒代半胱氨酸和吡咯赖氨酸,也可以由基因编码(Stadtman
(1996) “Selenocysteine,” Annu Rev Biochem.65:83-100以及Ibba等人(2002) “Genetic code:
introducing pyrrolysine,” Curr
Biol.12(13):R464-R466)。术语“氨基酸”还包括非天然的氨基酸、经修饰的氨基酸(例如,具有经修饰的侧链和/或主链)和氨基酸类似物。参见,例如,Zhang等人(2004)
“Selective incorporation of
5-hydroxytryptophan into proteins in mammalian cells,” Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101(24):8882-8887, Anderson等人(2004) “An expanded
genetic code with a functional quadruplet codon”
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101(20):7566-7571, Ikeda等人(2003)
“Synthesis of a novel histidine analogue
and its efficient incorporation into a protein in vivo,” Protein Eng. Des.Sel.16(9):699-706, Chin等人(2003) “An Expanded
Eukaryotic Genetic Code,” Science
301(5635):964-967, James等人(2001) “Kinetic characterization of ribonuclease S mutants
containing photoisomerizable phenylazophenylalanine residues,” Protein Eng. Des.Sel.14(12):983-991, Kohrer等人(2001) “Import of amber
and ochre suppressor tRNAs into mammalian cells:A general approach to
site-specific insertion of amino acid analogues into proteins,” Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98(25):14310-14315, Bacher等人(2001) “Selection and
Characterization of Escherichia coli Variants Capable of Growth on an Otherwise
Toxic Tryptophan Analogue,” J.
Bacteriol.183(18):5414-5425, Hamano-Takaku等人(2000)
“A Mutant Escherichia coli Tyrosyl-tRNA
Synthetase Utilizes the Unnatural Amino Acid Azatyrosine More Efficiently than
Tyrosine,” J. Biol.Chem.275(51):40324-40328以及Budisa等人(2001) “Proteins with {beta}-(thienopyrrolyl)alanines as
alternative chromophores and pharmaceutically active amino acids,” Protein Sci.10(7):1281-1292。为了进一步说明,氨基酸通常为包含取代或未取代的氨基、取代或未取代的羧基以及一个或多个侧链或基团或任何这些基团的类似物的有机酸。示例性侧链包括,例如,巯基、硒基、磺酰基、烷基、芳基、酰基、酮基、叠氮基、羟基、肼、氰基、卤素、酰肼、烯基、炔基、醚、硼酸盐(borate)、硼酸酯(boronate)、二氧磷基(phospho)、膦酰基、膦、杂环、烯酮、亚胺、醛、酯、硫羰酸、羟胺或这些基团的任何组合。其它代表性的氨基酸包括,但不限于:包含可光激活的交联接头的氨基酸、金属结合的氨基酸、自旋标记的氨基酸、荧光氨基酸、含金属的氨基酸、具有新型官能团的氨基酸、与其它分子共价或非共价地相互作用的氨基酸、光罩的(photocaged)和/或可光异构化的氨基酸、放射性氨基酸、包含生物素或生物素类似物的氨基酸、糖基化的氨基酸、其它碳水化合物修饰的氨基酸、包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸、重原子取代的氨基酸、可化学裂解和/或可光裂解的氨基酸、碳连接的含糖氨基酸、有氧化还原活性的氨基酸、含氨基硫羰酸的氨基酸以及包含一个或多个有毒部分的氨基酸。
术语“蛋白质”是指作为核糖体翻译加工产物的多肽链(氨基酸序列),其中该多肽链已经历翻译后折叠过程而形成三维的蛋白质结构。术语“蛋白质”还涵盖具有一种或多种翻译后修饰(如,但不限于,糖基化、磷酸化、乙酰化和泛素化)的多肽。
如本文中所公开的任何蛋白质,特别是如本文中所公开的重组产生的蛋白质,可在具体的实施方案中包含“蛋白质标签”,其为经基因嫁接到重组蛋白质上的肽序列。蛋白质标签可包含具有特定蛋白酶切割位点的接头序列以便于通过蛋白水解来移除该标签。作为具体的实施方案,将“亲和标签”添加在靶蛋白质上使得可以采用亲和技术从其粗生物来源纯化该靶标。例如,该来源可以是表达靶蛋白质的经转化的宿主生物或是由经转化的宿主生物分泌靶蛋白质至其中的培养上清液。亲和标签的具体实施方案包括几丁质结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)。多聚(His)标签是广泛使用的蛋白质标签,其促进对某些金属螯合基质的结合。
术语“嵌合蛋白”、“融合蛋白”或“融合多肽”是指一种蛋白质,其氨基酸序列代表了来自至少两种不同蛋白质的氨基酸序列的子序列的融合产物。融合蛋白通常不经由对氨基酸序列的直接操纵来产生,而是从编码该嵌合氨基酸序列的“嵌合的”基因表达。
术语“重组的”是指已经通过重组方法有意修改过的氨基酸序列或核苷酸序列。本文中术语“重组核酸”意指呈一般非天然存在的形式的核酸,其最初一般通过用核酸内切酶操纵核酸而在体外形成。因此,呈线状的、分离的、突变体DNA聚合酶核酸,或通过连接通常不相连的DNA分子而在体外形成的表达载体,对于本发明目的而言均被认为是重组的。应当理解,一旦重组核酸被制造并再引入宿主细胞中,其将非重组地复制,即采用该宿主细胞的体内细胞机器而非体外操纵;然而,这类核酸,一旦被重组产生,尽管之后被非重组地复制,对于本发明目的而言其依然被认为是重组的。“重组蛋白”或“重组产生的蛋白质”是采用重组技术(即,通过表达如上所述的重组核酸)制造的蛋白质。
当将其与另一个核酸序列置于功能关系中时,核酸是“可操作连接的”。例如,启动子或增强子可操作地连接编码序列,如果其影响了该序列的转录;或者核糖体结合位点可操作地连接编码序列,如果其被安置成便于翻译。
术语“宿主细胞”既是指单细胞原核生物也是指真核生物(例如,哺乳动物细胞、昆虫细胞、细菌、酵母和放线菌)以及当在细胞培养中生长时,来自高等植物或动物的单个细胞。
术语“载体”是指一段通常为双链的DNA,可在其中已插入一段外源DNA。该载体或可以是,例如,质粒来源。载体含有“复制子”多核苷酸序列,其促进该载体在宿主细胞中的自主复制。外源DNA被定义为异源DNA,即并非天然存在于该宿主细胞中的DNA,其(例如)复制载体分子、编码可选择的或可筛选的标记物或编码转基因。载体被用于将该外源或异源DNA转运到合适的宿主细胞中。一旦处于宿主细胞中,载体可以独立于宿主染色体DNA复制或与之同时复制,并且可生成该载体及其插入的DNA的若干个拷贝。此外,载体还可以包含必要的元件,其使得插入的DNA转录成mRNA分子或另外引起所述插入的DNA复制成多个RNA拷贝。一些表达载体额外包含与插入的DNA相邻的序列元件,其增加所表达的mRNA的半衰期和/或允许mRNA翻译成蛋白质分子。因而可以迅速合成许多由插入的DNA编码的mRNA和多肽分子。
术语“核酸”或“多核苷酸”可以互换使用并且指代可对应于核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)聚合物或其类似物的聚合物。这包括核苷酸聚合物,如RNA和DNA及其合成形式、修饰(例如,化学或生化修饰)形式,以及混合的聚合物(例如,包括RNA和DNA亚单位两者)。示例性的修饰包括:甲基化、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸、核苷酸间的修饰如不带电荷的键合(例如,膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯(phosphoamidates)、氨基甲酸酯等)、悬垂部分(例如,多肽)、嵌入剂(例如,吖啶、补骨脂素等)、螯合剂、烷化剂以及经修饰的键合(例如,α异头核酸等)。还包括合成分子,其模拟多核苷酸的通过氢键键合和其它化学相互作用结合指定序列的能力。通常,核苷酸单体通过磷酸二酯键连接,尽管合成形式的核酸可以包含其它键合(例如,如在Nielsen等人(Science 254:1497-1500, 1991)中所述的肽核酸)。核酸可以是或可以包括,例如,染色体或染色体区段、载体(例如,表达载体)、表达盒、裸露的DNA或RNA聚合物、聚合酶链式反应(PCR)的产物、寡核苷酸、探针以及引物。核酸可以是,例如,单链的、双链的或三链的并且不限于任何特定长度。除非另外指明,否则除任何明确指出的序列以外,具体的核酸序列包含或编码互补序列。
术语“糖基化”指代将糖基残基共价耦合至受体基团的化学反应。一种具体的受体基团为羟基,例如,另一糖的羟基。“唾液酸化作用”是糖基化的一种具体形式,其中受体基团与唾液酸(= N-乙酰神经氨酸)残基反应。此类反应通常由唾液酸转移酶采用胞苷-5'-一磷酸-N-乙酰神经氨酸作为供体化合物或共底物来催化。
术语“糖基化”指代将糖基残基共价耦合至受体基团的化学反应。一种具体的受体基团为羟基,例如,另一糖的羟基。“唾液酸化作用”是糖基化的一种具体形式,其中受体基团与唾液酸(= N-乙酰神经氨酸)残基反应。此类反应通常由唾液酸转移酶采用胞苷-5'-一磷酸-N-乙酰神经氨酸作为供体化合物或共底物来催化。
“唾液酸化作用”是在允许其的条件下,糖基转移酶酶活性(在该具体情况下的唾液酸转移酶酶活性)结果的一个具体实施方案。一般来说,本领域技术人员应认识到能在其中进行糖基转移酶酶促反应(=“允许糖基转移酶酶活性”)的水性缓冲液需要使用缓冲盐缓冲,如Tris、MES、磷酸盐、醋酸盐或另一种缓冲盐,其具体能够在pH 6至pH 8的pH范围内缓冲、更具体在pH 6至pH 7的范围内、甚至更具体能够缓冲约pH 6.5的溶液。该缓冲液还可包含中性盐如但不限于NaCl。另外,在具体实施方案中,本领域技术人员可考虑向所述水性缓冲液中加入包含二价离子如Mg2+或Mn2+的盐,例如,但不限于MgCl2和MnCl2。本领域中已知的允许糖基转移酶酶活性的条件包括环境(室内)温度,但更一般地说,在0℃至40℃范围内的温度,特别是10℃至30℃、尤其是20℃。
术语“聚糖”是指多糖或低聚糖,即指经酸水解而产生多个单糖的多聚化合物。糖蛋白包含一个或多个共价耦合至多肽链侧基的聚糖部分,该共价耦合通常经由天冬酰胺或精氨酸(“N-连接的糖基化”)或经由丝氨酸或苏氨酸(“O-连接的糖基化”)。
糖基转移酶用于酶促合成复合聚糖结构的用途是获得复合生物活性糖蛋白的有吸引力的手段。例如,Barb等人Biochemistry 48 (2009) 9705-9707采用分离的人ST6Gal-I制备了免疫球蛋白G的Fc片段的高效力经唾液酸化的形式。然而,对糖蛋白治疗应用的愈加关注导致对包括唾液酸转移酶在内的糖基转移酶日益增长的需求。Bork
K.等人J. Pharm.Sci.98 (2009) 3499–3508描述了不同的策略以增加或修饰糖蛋白的唾液酸化作用。一种有吸引力的策略是重组产生的蛋白质(如但不限于免疫球蛋白和生长因子),特别是治疗蛋白的体外唾液酸化作用。为此,若干研究团队描述了在经转化的生物中表达唾液酸转移酶并纯化该重组产生的唾液酸转移酶。由于原核生物来源的糖基转移酶通常不对复合糖蛋白(例如,抗体)起作用,所以更倾向于研究哺乳动物来源的唾液酸转移酶。
本公开和本文件的所有方面以及本文中的各方面及实施方案所涉及的具体糖蛋白包括但不限于:细胞表面糖蛋白和以可溶形式存在于血清中的糖蛋白(“血清糖蛋白”)、特别是哺乳动物来源的糖蛋白。“细胞表面糖蛋白”应理解为其一部分位于膜表面上并通过该表面糖蛋白多肽链的膜锚定部分结合到膜表面上的糖蛋白,其中所述膜为生物细胞的一部分。术语细胞表面糖蛋白还涵盖所述细胞表面糖蛋白的分离形式及其可溶性片段,所述可溶性片段,例如,通过蛋白水解切割或通过重组产生该可溶性片段而从所述膜锚定部分分离。“血清糖蛋白”应理解为存在于血清中的糖蛋白,即存在于全血的非细胞部分中的血液蛋白,例如,在细胞血液成分沉淀后的上清液中。在没有限制的情况下,所具体提到和包括的血清糖蛋白为免疫球蛋白。此处提及的具体免疫球蛋白属于IgG组(以γ重链表征),特别是四个IgG亚组中的任何一个。对于本文中的公开、方面和实施方案而言,术语“血清糖蛋白”还涵盖单克隆抗体;人工单克隆抗体是本领域熟知的并且可以,例如,通过杂交瘤细胞产生或采用经转化的宿主细胞重组产生。另外的血清特异性糖蛋白是载体蛋白如血清白蛋白、胎球蛋白或胎球蛋白为其成员的富含组氨酸糖蛋白超家族的另一个糖蛋白成员。另外,在没有限制的情况下,于本文中的全部公开、方面和实施方案中所具体提到和包括的血清糖蛋白为糖基化的蛋白质信号分子。此组的具体分子为促红细胞生成素(EPO)。
对于糖蛋白的体外改造,糖基转移酶可被用作有效的工具(Weijers 2008)。哺乳动物来源的糖基转移酶与作为底物的糖蛋白相容,而细菌糖基转移酶通常修饰更简单的底物如低聚糖。有鉴于此,使用哺乳动物糖基转移酶作为选择工具有利于制造糖蛋白聚糖部分中的合成变化。然而,对于糖基转移酶在糖工程中的大规模应用而言,需要大(即工业级的)量合适的酶的可用性。本文所述的发明具体提供了若干具有截短缺失的变体。特别地及令人惊奇地,Δ108
hST6Gal-I展现出唾液酸化hST6Gal-I酶活性。
给予本文中所述的各截短变体“Δ”(= “Δ”)标号指明各截短缺失的最末位氨基酸位置的编号,该编号从根据SEQ
ID NO:1的野生型hST6Gal-I多肽的N末端起计数。对若干不同的N末端截短变体,特别是Δ108 hST6Gal-I(氨基酸序列示于SEQ ID NO:7中)进行了更细致的研究。
在甲醇营养型酵母巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中成功表达了呈可溶形式的若干人糖基转移酶(包括hST6Gal-I)。然而,仅表达了少量蛋白质,例如,ST6Gal-I:0.3单位/L(Malissard等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.267 (2000) 169-171)。若干作者描述了使用可选的表达系统以改善重组ST6Gal-I的表达速率和可溶性。例如,在家蚕幼虫中表达FLAG标记的重组ST6Gal-I,然而产率依然很低(Ogata M.等人,BMC Biotechnol.9 (2009) 54)。另一组在大肠杆菌(E.
Coli )中表达了ST6Gal-I的可溶形式,其缺乏胞质区和膜区,并且与麦芽糖结合蛋白(MBP)标签融合。然而,纯化目标酶后,仅得到少量(Hidari等人,Glycoconjugate Journal 22 (2005) 1-11)。US 5,032,519描述了在哺乳动物和昆虫细胞中表达及分离截短的大鼠ST6Gal-I。该酶包含天然存在(野生型)基因的氨基酸58-403,其包括了茎区的主要部分。
本文所公开的第一个方面是哺乳动物糖基转移酶变体(=其突变体等位基因),其中该变体的多肽包含野生型哺乳动物糖基转移酶(参照)的N末端截短的氨基酸序列,该截短部分包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列基序,并且其中该变体展现出糖基转移酶活性。因此,新近发现的哺乳动物糖基转移酶变体之一通过自N末端的缺失而被截短,其中该缺失包含SEQ ID NO:2的基序(“QVWxKDS”)。令人惊奇地,该变体保留了糖基转移酶活性。在本文所报道的所有方面的一个实施方案中,所述变体为野生型哺乳动物糖基转移酶多肽的缺失突变体,其中该缺失包含连续的N末端部分(截短),所述N末端部分包含含有保守基序“QVWxKDS”的氨基酸序列,其中在该保守基序中,“x”指代单个可变的氨基酸,并且其中所述缺失突变保留了糖基转移酶活性。在本文所报道的所有方面的一个具体实施方案中,“x”指代天冬酰胺(= Asn或N)。
在本文所报道的所有方面的一个实施方案中,糖基转移酶,即本文所公开的糖基转移酶变体的活性,催化包括将5-N-乙酰神经氨酸(= Neu5Ac)残基从供体化合物转移至受体基团的化学反应。在本文所报道的所有方面的一个实施方案中,所述糖基转移酶为唾液酸转移酶。在本文所报道的所有方面的一个具体实施方案中,作为Neu5Ac残基的转移靶标的所述受体基团为糖蛋白或糖脂的聚糖部分中的末端β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺(= Galβ1,4GlcNAc)的半乳糖残基。在本文所报道的所有方面的一个具体实施方案中,所述供体化合物为胞苷-5'-一磷酸-N-乙酰神经氨酸(= CMP-Neu5Ac或CMP-NANA)或其功能等同物。就这方面而言,一种具体的功能等同物为CMP-9-氟-NANA。更一般地说,CMP-Neu5Ac的功能等同物能够通过提供经活化的糖或糖衍生物而充作唾液酸转移酶的共底物,其中所述糖或糖衍生物通过唾液酸转移酶的酶催化而被转移至受体基团。
在CMP-Neu5Ac作为供体化合物的具体情形中,以及在本文所报道的所有方面的一个实施方案中,糖基转移酶活性催化化学反应,该化学反应包括将来自供体化合物CMP-Neu5Ac的Neu5Ac残基与Galβ1,4GlcNAc的半乳糖残基中处于C6位置的羟基反应,其中形成了N-乙酰神经氨酸基-α2,6-β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺(= Neu5Acα2,6Galβ1,4GlcNAc)。
在本文所报道的所有方面的一个实施方案中,本文所公开的哺乳动物糖基转移酶变体的野生型参照分子是天然来源的,即其为天然存在的哺乳动物糖基转移酶,具体地讲,天然存在的唾液酸转移酶。其特定的实施方案为人来源的酶,尤其是人唾液酸转移酶,并且更具体的是能够催化α2,6唾液酸化作用的唾液酸转移酶。甚至更具体的是,本文所公开的哺乳动物糖基转移酶变体的野生型参照分子为人β-半乳糖苷-α2,6-唾液酸转移酶(hST6Gal)。在本文所报道的所有方面的一个实施方案中,所述哺乳动物糖基转移酶变体源自SEQ
ID NO:1的野生型参照分子。在其特定的实施方案中,所述变体包含根据SEQ ID NO:1的野生型哺乳动物糖基转移酶的氨基酸序列,其自N末端经缺失而截短,并且该缺失包含SEQ
ID NO:2的基序,其中X为天冬酰胺(N)。
然而此前发现(i)短的N末端胞质尾区、(ii)跨膜结构域或(iii)茎区的缺失与唾液酸转移酶活性并存,影响催化域的截短则完全消除酶活性。与本公开相反,现有技术教导人ST6Gal-I的N末端氨基酸的某些较小程度的截短似乎对于酶活性至关重要。此前的报道公开了在hST6Gal-I氨基酸序列中,茎结构域与催化域之间的分界线位于位置86的氨基酸和位置104的氨基酸之间(Chen C & Colley K.J.Glycobiology 10 (2000) 531-538)。通过渐进式N末端截短进行实验以确定具有催化活性的hST6Gal-I的最小大小。正如可预期的,具有覆盖前80个氨基酸的缺失的变体是具有酶活性的。然而,百个氨基酸的截短消除酶活性(Legaigneur等人,J. Biol.Chem.276 (2001) 21608-21617)。在另一出版物中,发现了通过截短得到的无活性的酶,该截短部分包含hST6Gal-I氨基酸序列中的残基94-100;从该结果得出结论:当缺失时,处于位置94-100的氨基酸残基对于酶活性是关键的。hST6Gal-I多肽的氨基酸序列中的残基94-100对应于QVWxKDS基序(Donadio等人,同上)。
本文所报道的所有方面的特定实施方案包括hST6Gal-I变体,其中野生型参照多肽的氨基酸序列为SEQ
ID NO:1,并且hST6Gal-I变体通过选自以下的截短来表征:(i)SEQ
ID NO:1的位置1至位置100、(ii)SEQ ID NO:1的位置1至位置101、(iii)SEQ ID NO:1的位置1至位置102、(vi)SEQ ID NO:1的位置1至位置103、(v)SEQ ID NO:1的位置1至位置104、(vi)SEQ ID NO:1的位置1至位置105、(vii)SEQ ID NO:1的位置1至位置106、(viii)SEQ ID NO:1的位置1至位置107以及(ix)SEQ ID NO:1的位置1至位置108。
因此,本文所报道的所有方面的另外的特定实施方案包括具有选自以下的氨基酸序列的多肽:(i)SEQ ID NO:1的位置101至位置406、(ii)SEQ ID NO:1的位置102至位置406、(iii)SEQ ID NO:1的位置103至位置406、(vi)SEQ ID NO:1的位置104至位置406、(v)SEQ ID NO:1的位置105至位置406、(vi)SEQ ID NO:1的位置106至位置406、(vii)SEQ ID NO:1的位置107至位置406、(viii)SEQ ID NO:1的位置108至位置406以及(ix)SEQ ID NO:1的位置109至位置406。
对于糖蛋白的体外改造,糖基转移酶可被用作有效的工具(Weijers 2008)。哺乳动物来源的糖基转移酶与作为底物的糖蛋白相容,而细菌糖基转移酶通常修饰更简单的底物如低聚糖。有鉴于此,使用哺乳动物糖基转移酶作为选择工具有利于制造糖蛋白聚糖部分中的合成变化。然而,对于糖基转移酶在糖工程中的大规模应用而言,需要大(即工业级的)量合适的酶的可用性。本文所述的发明具体提供了具有hST6Gal-I酶活性的蛋白质,其可被用于具有一个或多个可接近的半乳糖基底物部分的靶糖蛋白的体外唾液酸化作用。合适的靶标包括去唾液酸糖蛋白,即唾液酸残基已通过唾液酸酶的作用从其移除的糖蛋白。
当在甲醇营养型酵母巴斯德毕赤酵母中表达野生型hST6Gal-I并且已经将所表达的多肽靶向宿主生物的分泌途径时,观察到了重组产生的hST6Gal-I的不同的经截短的变体。通常,hST6Gal-I来源的蛋白质经层析纯化,并且尤其通过质谱法以及通过确定自N末端的氨基酸序列(Edman降解)进行分析。通过这些方式,详细表征了hST6Gal-I的截短,尤其是N末端的截短。
在经转化的毕赤酵母(Pichia)菌株的上清液中鉴定到若干值得注意的截短变体。所述变体可能是在所述酵母细胞分泌过程中由位点特异性蛋白水解切割引起的,或是由存在于培养的毕赤酵母(Pichia)菌株的上清液中的一种或多种细胞外蛋白酶的内切蛋白酶切割引起的。
给予每个鉴定的截短变体“Δ”(= “Δ”)标号指明各截短缺失的最末位氨基酸位置的编号,该编号从根据SEQ
ID NO:1的野生型hST6Gal-I多肽的N末端起计数。对hST6Gal-I的五种不同的N末端截短变体:Δ27 (SEQ ID NO:3)、Δ48
(SEQ ID NO:4)、Δ62 (SEQ ID NO:5)、Δ89 (SEQ ID NO:6)和Δ108
(SEQ ID NO:7)进行了更细致的研究。
令人惊奇地发现hST6Gal-I的截短变体Δ108(即hST6Gal-I蛋白质变体,其具有缺少在对应的野生型多肽中存在的处于位置1-108的氨基酸的多肽)具有酶活性;也就是说,hST6Gal-I的Δ108截短变体能够催化Neu5Ac残基转移至游离半乳糖残基的C6羟基,所述游离半乳糖残基是聚糖或聚糖天线中末端Galβ1,4GlcNAc的部分,从而在所述聚糖中形成α2→6连接至Galβ1,4GlcNAc部分的半乳糖残基的末端唾液酸残基。此外,hST6Gal-I的Δ108截短变体适于糖工程应用以合成地改变糖蛋白聚糖部分的组成。此外,hST6Gal-I的Δ108截短变体非常适合于在不同宿主生物中的重组表达,从而允许以高量和合理的成本生产所述酶。
另外值得注意的是:hST6Gal-I的Δ108 N末端截短变体(参见实施例14中表1的“批次5”、“批次7”)活性更高,即相比含有 Δ114截短变体(参见实施例14中表1中的“批次3”)的制备物,活性高约20倍。因此,去除hST6Gal-I的各N末端部分仍然留下能够催化唾液酸化反应的酶部分。然而,不能完全排除在其中检测到Δ114截短变体的制备物中额外含有痕量的Δ108或另一种具有酶活性的hST6Gal-I变体,其可能导致所观察到的残留活性。如果是这种情况,那么所述Δ114变体可能没有活性。
构建表达载体用于在各种宿主生物中表达hST6Gal-I野生型蛋白质以及选定的截短变体,所述宿主生物包括原核生物如大肠杆菌(E.
coli)和芽胞杆菌属种(Bacillus sp.)、酵母如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德毕赤酵母以及哺乳动物细胞如CHO细胞和HEK细胞。不仅为hST6Gal-I的Δ108截短变体,也为其它四种鉴定的人ST6Gal-I的截短形式(Δ27ST6、Δ48ST6、Δ62ST6和Δ89ST6)制造了具有表达构建体的载体。为利于纯化重组表达的靶蛋白质,由所述构建体编码的截短变体多肽通常包含N末端His标签。
在具体的一系列实验中,表达构建体被插入载体中用于在巴斯德毕赤酵母菌株KM71H中复制。表达通常由诱导型启动子如AOX1启动子控制。将His标签化的截短变体另外融合至前导肽,该前导肽能够将所表达的初级翻译产物靶向经转化的宿主的分泌途径。因此,翻译后加工包括将各His标签化的截短变体分泌到周围的培养基中,同时通过分泌机器的内切蛋白酶切除前导肽。
通常在液体培养基中培养经转化的毕赤酵母细胞。在诱导表达后,所述经转化的细胞被培养一定时间以产生各靶蛋白质。在培养步骤结束后,将细胞和存在于培养物中的其它不溶性物质从上清液分离。对澄清的上清液中的hST6Gal-I的截短变体进行分析。
采用N末端His标签化的野生型hST6Gal-I作为靶蛋白质进行毕赤酵母中的首批实验。然而,当使用填充有Ni螯合亲和基质的层析柱时,从上清液中纯化所述酶的尝试失败了,因为有活性的酶并未被保留在柱上而是存在于流通液中。随后用具有N末端His标签化的hST6Gal-I截短变体上得到类似的结果。尽管如此,使用阳离子交换树脂纯化所述酶(野生型和变体)得到了高度富集的酶制备物。但是,此纯化程序一般似乎会负面影响所述酶的活性。
令人惊奇地,当用SDS凝胶电泳表征时,所有经阳离子交换层析纯化的hST6Gal-I蛋白质均显示出约36 kDa的表观分子量。与试图采用Ni螯合亲和基质进行纯化的负面结果一致,N末端测序和质谱法确认了缺少N末端His标签。对于由经转化的毕赤酵母分泌的不同种经截短的hST6Gal-I蛋白质纯化样品,发现若干N末端序列对应于具有Δ108、Δ112和Δ114截短的变体。广谱的蛋白水解产物似乎表明若干种截短机制,最可能是因为由不止一种类型的蛋白酶进行蛋白水解消化。
对经截短的hST6Gal-I蛋白质样品的进一步分析揭示:从多肽中移除具有大于112个氨基酸的连续N末端部分显著降低了hST6Gal-I的酶活性。这一发现与自N末端108个氨基酸的截短(其似乎是有活性的hST6Gal-I酶)截然相反。然而,相比Δ89截短变体,Δ108酶展现出约50%的相对活性。
从一个设计用于表达和分泌N末端His标签化的Δ62 ST6Gal-I构建体的巴斯德毕赤酵母克隆中,分离出并且更详细研究了具有均一大小的高活性的hST6Gal-I酶。再次地,上清液中的所述酶缺少His标签。所述N末端序列被确定为“LQKIWKNYLS”,其对应于hST6Gal-I的Δ108变体。初始的初级翻译产物为具有N末端信号肽部分随后为His标签随后为Δ62 hST6Gal-I的氨基酸序列的多肽。因为Δ108截短变体存在于上清液中,所以得出结论: 仅在分泌过程完成后,才发生了从Δ62到Δ108的进一步截短。若此截短发生在分泌前,则由于所述信号肽部分的过早丧失,将不会分泌所述Δ108多肽。因此,该发现表明:His标签化的hST6Gal-IΔ62变体是在细胞区室外经蛋白水解消化而被截短的。
本公开的一个具体方面是哺乳动物糖基转移酶变体,尤其是hST6Gal-I的Δ108变体的用途,其用于将5-N-乙酰神经氨酸残基从供体化合物转移至具有受体基团的靶糖蛋白的聚糖部分的末端β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺的半乳糖残基中处于C6位置的羟基。其一个实例为G类免疫球蛋白的单克隆抗体。在本文所公开的所有方面的一个具体实施方案中,所述靶分子不含经α2,6 唾液酸化的末端天线(受体)残基。获得此类靶分子的若干方式之一是用具有糖苷酶活性(并且特别是唾液酸酶活性)的酶来移除任何末端唾液酸残基。因此,使用此类“缺乏唾液酸基的(asioalo)”但保留了唾液酸化作用受体位点的靶蛋白质,本公开(尤其是以上用途和方法)使技术人员能够制备选自糖蛋白和糖脂的经唾液酸化的靶分子。
如本文中所例示的,所述Δ108变体在使用重组产生的人单克隆IgG4抗体作为复合靶标(底物)的唾液酸化实验中是有活性的; 使用人IgG1单克隆抗体作为唾液酸化作用靶标得到了类似的发现。制造了编码Δ108变体的表达构建体,在巴斯德毕赤酵母KM71H中克隆并且大量表达。所重组表达的蛋白质被分泌到液体生长培养基中并从中纯化。此外,将所述Δ108变体的表达构建体引入HEK 293细胞中,瞬时表达、分泌并纯化。分析确认了在HEK细胞中表达的此变体也具有酶活性,即能够唾液酸化单克隆抗体。
检测到经截短的但有酶活性的人ST6Gal-I变体(Δ108
ST6Gal-I)是新的且令人惊奇的发现,并且是对现有知识的贡献,现有知识认为:大于100个氨基酸的缺失完全消除hST6Gal-I的酶活性(Chen&
Colley, 2000; Legaigneur等人,(2001) J. Biol.
Chem., 276, 21608-17; Donadio等人2003)。
本文所公开的另一个方面是包含本文所公开的哺乳动物糖基转移酶变体的多肽的融合多肽。
本文所公开的又另一个方面是编码本文所公开的哺乳动物糖基转移酶变体的核苷酸序列。
本文所公开的又另一个方面是表达载体,所述表达载体包含靶基因以及在经所述表达载体转化的宿主生物中促进所述靶基因表达的序列,其中所述靶基因包含本文所公开的核苷酸序列。
本文所公开的又另一个方面是经转化的宿主生物,其中所述宿主生物经本文所公开的表达载体转化。人胚肾293(HEK)细胞以其特殊优势可被用于实践本文公开的教导。这些细胞的一项特殊优势在于其为转染随后为后续培养非常合适的靶标。因此,HEK细胞可以被有效地用于通过重组表达和分泌产生靶蛋白质。尽管如此,HeLa、COS和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是熟知的替代物并作为本文所公开的所有方面的具体实施方案被包括于此。
本文所公开的又另一个方面是重组产生哺乳动物糖基转移酶变体的方法,所述方法包括在用表达载体转化的宿主生物中表达编码本文所公开的哺乳动物糖基转移酶变体的核苷酸序列的步骤,其中形成多肽,从而产生哺乳动物糖基转移酶变体。
下列各项进一步提供了实践本文所提供的教导的本公开的具体方面以及具体实施方案。
1. 哺乳动物糖基转移酶变体,其中所述变体的多肽包含野生型哺乳动物糖基转移酶的N末端截短的氨基酸序列,所述截短部分包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列基序,并且其中所述变体展现出糖基转移酶活性。
2. 根据项目1的变体,其中所述糖基转移酶活性催化这样的化学反应,所述化学反应包括将5-N-乙酰神经氨酸(= Neu5Ac, NANA)残基从供体化合物转移至受体基团。
3. 根据项目2的变体,其中所述受体基团为糖蛋白或糖脂的聚糖部分中的末端β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺(= Galβ1,4GlcNAc)的半乳糖残基。
4. 根据项目2和3中任一项的变体,其中所述供体化合物为胞苷-5'-一磷酸-N-乙酰神经氨酸(= CMP-Neu5Ac)或其功能等同物。
5. 根据项目4的变体,其中由所述糖基转移酶活性催化的所述化学反应包括使来自供体化合物CMP-Neu5Ac的Neu5Ac残基与β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺的半乳糖残基中处于C6位置的羟基反应,其中形成了N-乙酰神经氨酸基-α2,6-β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺(Neu5Acα2,6Galβ1,4GlcNAc)。
6. 根据项目1至5中任一项的变体,其中所述野生型哺乳动物糖基转移酶为天然来源的。
7. 根据项目6的变体,其中所述野生型哺乳动物糖基转移酶是人来源的。
8. 根据项目7的变体,其中所述野生型哺乳动物糖基转移酶为人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶。
9. 根据项目8的变体,其中所述变体的多肽包含根据SEQ
ID NO:1的野生型哺乳动物糖基转移酶的N末端截短的氨基酸序列,所述截短部分包含SEQ
ID NO:2的氨基酸序列基序,其中X为天冬酰胺(N)。
10. 根据项目9的变体,其中所述截短部分为选自以下的序列:(i)SEQ
ID NO:1的位置1至位置100、(ii)SEQ ID NO:1的位置1至位置101、(iii)SEQ ID NO:1的位置1至位置102、(vi)SEQ ID NO:1的位置1至位置103、(v)SEQ ID NO:1的位置1至位置104、(vi)SEQ ID NO:1的位置1至位置105、(vii)SEQ ID NO:1的位置1至位置106、(viii)SEQ ID NO:1的位置1至位置107以及(ix)SEQ ID NO:1的位置1至位置108。
11. 根据项目9的变体,其中所述自N末端的缺失为SEQ ID NO:1的位置1至位置108的序列。
12. 根据项目1至11中任一项的变体,其中将所述变体的多肽的N末端或C末端融合至亲和标签。
13. 根据项目12的变体,其中所述亲和标签包含四个、五个、六个或更多个连续的组氨酸残基。
14. 根据项目12和13中任一项的变体,其中肽酶切割位点位于所述亲和标签与所述变体的多肽的N末端或C末端之间。
15. 根据项目1至14中任一项的变体,其中所述变体的多肽还包含N末端甲硫氨酸残基。
16. 包含根据项目1至15中任一项的哺乳动物糖基转移酶变体的多肽的融合多肽。
17. 编码根据项目1至15中任一项的哺乳动物糖基转移酶变体的多肽的核苷酸序列。
18. 编码融合多肽的多肽的核苷酸序列,所述融合多肽包含根据项目1至15中任一项的哺乳动物糖基转移酶变体的多肽。
19. 包含靶基因的表达载体,所述靶基因与在用所述表达载体转化的宿主生物中促进所述靶基因表达的序列可操作地连接,其中所述靶基因包含根据项目17或项目18的核苷酸序列。
20. 经转化的宿主生物,其中所述宿主生物用根据项目19的表达载体转化。
21. 重组产生哺乳动物糖基转移酶变体的方法,所述方法包括在经转化的宿主生物中表达编码根据项目1至15中任一项的哺乳动物糖基转移酶变体的核苷酸序列的步骤,其中形成多肽,从而产生所述哺乳动物糖基转移酶变体。
22. 根据项目21的方法,其中所产生的酶从所述宿主生物分泌。
23. 根据项目21和22中任一项的方法,其中所述宿主生物为真核细胞。
24. 根据项目23的方法,其中所述宿主生物选自酵母细胞和哺乳动物细胞。
25. 根据项目24的方法,其中所述宿主生物为选自HEK细胞、COS细胞、CHO细胞和HeLa细胞的哺乳动物细胞。
26. 根据项目21至25中任一项的方法,其中纯化所述哺乳动物糖基转移酶变体。
27. 通过根据项目21至26中任一项的方法获得的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I的变体,其中所述宿主生物选自巴斯德毕赤酵母细胞、CHO细胞和HEK细胞。
28. 根据项目1至15中任一项的哺乳动物糖基转移酶变体或通过根据项目21至26中任一项的方法获得的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I的变体用于将5-N-乙酰神经氨酸残基从供体化合物转移至单克隆抗体的聚糖部分的末端β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺的半乳糖残基中处于C6位置的羟基的用途。
29. 唾液酸化糖蛋白的方法,包括在水溶液中允许糖基转移酶酶活性的条件下接触以下化合物的步骤: (i)在聚糖部分具有末端 β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺受体基团的糖蛋白、(ii)供体化合物、(iii)人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I的变体,其中所述变体的多肽包含野生型哺乳动物糖基转移酶的N末端截短的氨基酸序列,所述截短部分包含SEQ
ID NO:2的氨基酸序列基序,并且其中所述变体展现出糖基转移酶活性,从而形成N-乙酰神经氨酸基-α2,6-β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺残基,从而唾液酸化糖蛋白。
30. 根据项目29的方法,其中所述糖蛋白为免疫球蛋白,并且具体来说,为单克隆抗体。
以下实施例是对本公开的具体实施方案及其各种用途的说明。其仅出于解释的目的进行描述,并且不被视为对本公开的限制。
实施例1
针对共享QVWxKDS共有基序的真核生物糖基转移酶的数据库搜索
使用公共可得的数据库,尤其是“swissprot”数据库进行搜索,并采用了搜索算法,例如,BLAST(=“基本局部比对搜索工具”),其根据Altschul S.F.等人Nucleic Acids Res.25 (1997) 3389-3402的公开。基序QVWxKDS(SEQ ID NO:2)存在于下列多肽序列的每一个中,以举例的方式提供了所述序列:
(a) 序列ID: sp|Q64685.2|SIAT1_MOUSE; β-半乳糖苷 α-2,6-唾液酸转移酶I
(b) 序列ID: sp|P13721.1|SIAT1_RAT; β-半乳糖苷 α-2,6-唾液酸转移酶I
(c) 序列ID: sp|P15907.1|SIAT1_HUMAN; β-半乳糖苷 α-2,6-唾液酸转移酶I。
实施例2
hST6Gal-I的克隆和表达
针对巴斯德毕赤酵母作为宿主生物设计了第一批表达构建体。通常,应用Invitrogen手册“毕赤酵母表达试剂盒(Pichia Expression Kit)”版本M 011102 25-0043以及“pPICZα A、B和C”版本E 010302 25-0150中建议和描述的方法。还参照了其中提到的另外的载体、酵母菌株和培养基。应用如,例如,Sambrook,
Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第3版,CSHL Press, 2001中所述的基本的分子生物学方法。
在每种情况下,各hST6Gal-I构建体的表达均处于巴斯德毕赤酵母AOX1启动子的控制之下,所述启动子由甲醇诱导。
使用限制性位点XhoI和NotI,将每种所述构建体作为盒插入pPICZαB载体。通过这种方式,将信号肽的编码序列(编码来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的α-因子信号肽的核苷酸序列)框内与His标签化的hST6Gal-I多肽序列(即全长hST6Gal-I多肽或其变体)的编码序列融合。
在所述前体多肽序列中,于所述信号肽与所述His标签之间的结合区存在KEX2样的加工位点,即在分泌过程中,从所述前体蛋白上切除信号肽时所需的信号肽酶切割位点。发现所述N末端信号肽适于将各初级翻译产物引导至酵母的分泌途径。因此,重组表达的hST6Gal-I多肽被排出进入重组巴斯德毕赤酵母菌株培养于其中的液体培养基中。
编码hST6Gal-I的截短变体Δ27、Δ48、Δ62、Δ89、Δ108的经密码子优化的(用于在巴斯德毕赤酵母中表达)核苷酸序列分别示于SEQ ID NO: 8、10、12、14和16中。SEQ ID NO:9、11、13、15和17示出了在巴斯德毕赤酵母中进行表达实验的His标签化的序列。产生了来自每种变体的培养上清液,并对其中包含的hST6Gal-I酶变体进行了纯化和表征。
实施例3
hST6Gal-I的截短变体
如在以上实施例2中所技术性描述的,在巴斯德毕赤酵母中表达了若干种截短变体。
图1公开了人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I(ST6Gal-I, E.C
2.4.99.1; UniProtKB/Swiss-Prot 数据库条目“P15907”)的氨基酸序列SEQ ID NO:1,并且呈现更详细表征的多肽N末端部分中的缺失的示意图。
对于每种变体,N末端缺失的氨基酸位置以“X”标明。以下划线标出根据SEQ ID NO:2的位置94-100的“QVWNKDS”基序的残基,其中X为天冬酰胺。
实施例4
转化以及经转化的巴斯德毕赤酵母的发酵
在巴斯德毕赤酵母KM71H中表达人ST6Gal-I基因的变体。在复合甘油培养基中于30℃和pH
5.2生长细胞至OD578(= 在波长578 nm测得的光密度)为200。在将温度降至20℃后,通过向所述细胞给料甲醇诱导在各自表达盒中ST6Gal-I基因的表达。在最终OD578为400时,将培养基冷却至4℃并将所述细胞通过离心分离。将含有ST6Gal-I酶变体的上清液保存在-20℃。
实施例5
克隆pM1MT表达构建体用于在哺乳动物宿主细胞中的瞬时基因表达(TGE)
采用促红细胞生成素信号肽序列(Epo)和四个氨基酸的肽间隔区(“APPR”)克隆人ST6Gal-I的截短变体Δ108用于瞬时表达。针对Epo-APPR-Δ108 hST6Gal-I构建体,合成了经密码子优化的cDNA。将天然hST6Gal-I来源的mRNA前导序列和N末端蛋白质序列与促红细胞生成素信号序列和“APPR”接头序列交换,以确保通过HEK宿主细胞系的分泌机器对所述多肽的正确加工。此外,所述表达盒特征在于SalI和BamHI位点,其用于克隆进入预消化的pM1MT载体片段(Roche Applied Science)的多克隆位点。从而将hST6Gal-I编码序列的表达置于人巨细胞病毒(CMV)立即早期增强子/启动子区域的控制之下;所述表达载体进一步特征在于“内含子A”,其用于调控的表达以及BGH多腺苷酸化信号。
如实施例6所述,进行在HEK细胞中表达Epo-APPR-Δ108 hST6Gal-I构建体(SEQ ID NO:18)和Δ108
hST6Gal-I蛋白质分泌到细胞上清液中。
实施例6
转化HEK细胞和瞬时表达及分泌
通过质粒DNA转染的瞬时基因表达(TGE)是在哺乳动物细胞培养物中产生蛋白质的快速策略。为了高水平表达重组人蛋白质,使用了基于适应悬浮的人胚肾(HEK)293细胞系的TGE平台。在无血清培养基的条件下,在37℃于摇瓶中培养细胞。根据制造商的指导,采用复合有293-Free™(Merck)转染试剂的pM1MT表达质粒(0.5至1 mg/L细胞培养物)以大致2x 106 vc/ml转染细胞。转染后三小时,加入丙戊酸(一种HDAC抑制剂)(最终浓度4 mM)以加强表达(Backliwal等人,(2008), Nucleic Acids Research 36, e96)。每天,为所述培养物补充6%(v/v)的基于大豆蛋白胨水解产物的给料。在转染后的第7天,通过离心收集培养上清液。
实施例7
测试唾液酸转移酶酶活性
通过测量唾液酸向去唾液酸胎球蛋白的转移来确定酶活性。反应混合物(0.1 M MES, pH
6.0)在51 µL的总体积中包含2.5
µg 酶样品、5 µL 去唾液酸胎球蛋白(10
mg/ml)和4 µL CMP-9-氟-NANA(0.2 mM)。将所述反应混合物在37℃温育30分钟。通过加入10 µL的抑制剂CTP(10 mM)终止反应。将所述反应混合物上样至经0.1 M
Tris/HCl,pH 8.5平衡的PD10脱盐柱中。用平衡缓冲液将胎球蛋白从柱上洗脱。级分大小为1 mL。采用荧光分光光度计确定所形成的胎球蛋白的浓度。激发波长为490
nm,在520 nm测量发射。以RFU(相对荧光单位)表示酶活性。
实施例8
SDS凝胶电泳
采用NuPAGE凝胶(4-12%,
Invitrogen)实施分析型SDS凝胶电泳。样品用SimplyBlue
SafeStain(Invitrogen)染色。根据制造商的推荐进行所有程序。
实施例9
通过Edman降解的N末端测序
通过Edman降解使用得自Life
Technologies的试剂和设备来分析所表达的人ST6Gal-I变体的N末端序列。如ProSorb样品制备筒(目录号401950)和ProBlott Mini
PK/10膜(目录号01194)的使用手册中所述完成制备样品。将Procise
Protein Sequencing Platform用于测序。
实施例10
质谱法
在质谱法中分析于毕赤酵母和HEK细胞中表达的人ST6Gal-I变体的分子量。因此,制备了人ST6Gal-I的糖基化形式和去糖基化形式,并且使用Micromass
Q-Tof Ultima和Synapt G2 HDMS设备(Waters UK)和MassLynx V 4.1软件进行分析。
实施例11
糖基化的人ST6Gal-I酶的质谱法
将样品缓冲于电喷雾介质(20 % 乙腈 + 1 % 甲酸)中用于质谱法测量。采用illustra™ MicroSpin™ G-25
柱(GE-Healthcare)进行缓冲液交换。将20 µg 唾液酸转移酶变体以1
mg/ml的浓度施加到预平衡的柱上并通过离心洗脱。采用电喷雾电离质谱法分析所得洗脱液。
实施例12
去糖基化的人ST6Gal-I酶的质谱法
对于去糖基化,将唾液酸转移酶样品变性并还原。向100 µg 唾液酸转移酶中加入45 µL 变性缓冲液(6 M 盐酸胍)和13 µL TCEP(0.1
mM,稀释在变性缓冲液中)。另外加入适当体积的超纯水,使得盐酸胍的整体浓度为约4 M。然后将所述样品在37℃温育1小时。进行再缓冲以除去变性与还原剂。因此使用了经超纯水预平衡的Bio-SpinR 6 Tris柱(Bio Rad)。将整个样品施加到柱上并通过离心洗脱。向所得洗脱液中加入5.5
µL 0.1 U/µl 的PNGase F溶液并在37℃温育过夜。之后,将所述样品调整至30% ACN和1% FA并采用电喷雾电离质谱法分析。
实施例13
在经转化的巴斯德毕赤酵母KM71H中重组表达且从中分泌的人ST6Gal-I变体的纯化
从巴斯德毕赤酵母KM71H的发酵上清液中纯化人ST6Gal-I的变体。基本上通过两种层析方法进行纯化。在第一步中,将两升上清液离心(15 min,8500 rpm)。超滤步骤(0.2 µm)后,将所述溶液对缓冲液A(20 mM 磷酸钾,pH 6.5)透析并浓缩。将所述透析液上样到经缓冲液A平衡的S-Sepharose™ Fast Flow柱(5.0 cm x 5.1 cm)上。在用600 mL缓冲液A洗涤后,采用100 mL 缓冲液A与100 mL 缓冲液A + 200 mM NaCl的线性梯度将酶洗脱,接着是使用300 mL 缓冲液A +
200 mM NaCl的洗涤步骤。通过分析型SDS凝胶(4-12%)对级分(50 mL)进行分析。合并含有ST6Gal-I的级分,并对缓冲液C(50 mM MES,pH 6.0)透析。将所述透析液上样到经缓冲液C平衡的Capto MMC柱(1.6 cm x 3.0 cm)上。在用150 mL缓冲液C洗涤后,采用60 mL 缓冲液C与60 mL 缓冲液D(50 mM MES,pH 6.0,2 M NaCl)的线性梯度将酶洗脱。通过分析型SDS凝胶电泳(4-12%)对级分(6 mL)进行分析。合并含有ST6Gal-I的级分,并对缓冲液A +
100 mM NaCl透析。
蛋白质浓度作为在280 nm波长的消光度(E280nm)测定,且1.802的消光值对应于溶液中10 mg/ml的蛋白质浓度。测定了经纯化的酶的比活性。
通过SDS凝胶电泳检查了制备物的纯度。从hST6Gal-I变体Δ27、Δ48、Δ62和Δ89的每个样品上清液中,得到了具有明显一致的约36 kDa分子量的主要蛋白质条带(参见图2)。观察到的对应于此条带的分子量表明与上清液中hST6Gal-I变体的预测大小的偏差。然而,在分泌Δ89变体的克隆的上清液中,还观察到了另外一条(但丰度较低)对应于分子量在40至50 kDa的蛋白质条带。从一致得到的约36 kDa的主要条带,得出结论:所分泌的蛋白质在分泌过程后,据推测由毕赤酵母细胞释放到上清液中的蛋白酶进行了蛋白水解切割。
实施例14
来自经转化的巴斯德毕赤酵母KM71H的人ST6Gal-I变体的酶表征
如实施例13中所述并由图2进一步所示,在巴斯德毕赤酵母KM71H中表达了基因构建体的若干克隆,并且从上清液中进行了纯化。所分泌的人ST6Gal-I变体纯化后由质谱法(MS)进行分析。在表1(下文)中,对于每种酶样品,基于MS数据中所得的相对峰的大小,给出了由各种经蛋白水解截短的种类所组成的组成。因此,在表1中标明了特定hST6Gal-I变体种类的相对丰度。另外,基于MS分析过程中所生成片段的飞行时间数据,收集了关于所述人ST6Gal-I变体N末端片段的组成的更多信息。此外,测定了比活性(RFU/µg;参见实施例7)。
对于Δ27变体,未在上清液中发现有活性的酶;因此,在此例中未进行进一步的分析。
发现构建体Δ62:克隆356 的若干个经纯化的样品展现出较高的比活性。测定了存在于所述样品中的hST6Gal-I变体的N末端序列。N末端“LQKIWKNYLS”一致地存在于所述样品中;其对应于人ST6Gal-I的Δ108 N末端截短变体。
从一个单独培养批次的Δ62:克隆356 的上清液中得到了另一种制备物;发现其包含约75%的Δ114
hST6Gal-I与约25%的Δ112
hST6Gal-I的混合物。其展现出的比活性为对Δ108 hST6Gal-I变体所测定的比活性的约10%。从这一相对低的比活性,得出结论:112个或更多个氨基酸残基的缺失显著降低hST6Gal-I截短变体酶的活性。主要由Δ114
hST6Gal-I组成的酶制备物被发现具有大大降低的但仍可测量的活性。然而,可测量的活性可能是由少量仍未检测到的更大的截短变体引起的。
表1:
分离自经转化的巴斯德毕赤酵母KM71H上清液的重组表达的人ST6Gal-I的经截短的变体Δ48、Δ62和Δ108的分析数据。
实施例15
从经转化的HEK细胞的上清液中纯化人ST6Gal-I的Δ108 N末端截短变体
如实施例6中所述转化HEK细胞。如实施例5中所述制备表达构建体。具体的hST6Gal-I编码序列为编码Δ108 hST6Gal-I N末端截短变体的核苷酸序列,因此,所表达的构建体为Epo-APPR-Δ108-hST6Gal-I。
采用简化的纯化方案从HEK细胞发酵的上清液中纯化酶变体。在第一个步骤中,将0.1升的培养上清液过滤(0.2 µm),对缓冲液A(20 mM 磷酸钾,pH 6.5)透析溶液。将所述透析液上样到经缓冲液A平衡的S-Sepharose™ ff(Fast Flow)柱(1.6 cm x 2 cm)上。在用100
mL缓冲液A洗涤后,采用10 mL
缓冲液A与10 mL
缓冲液A + 200 mM NaCl的线性梯度将酶洗脱,接着是使用48 mL 缓冲液A +
200 mM NaCl的洗涤步骤。通过分析型SDS凝胶电泳对级分(4 mL)进行分析。合并含有酶的级分,并对存储缓冲液(20 mM 磷酸钾,100
mM 氯化钠,pH 6.5)透析。采用1.871的摩尔消光系数在280 nm的波长测定蛋白质浓度。对由经Epo-APPR-Δ108-hST6Gal-I表达构建体转化的HEK细胞所分泌的重组蛋白质的质谱分析确认了N末端序列“APPR”,因此指示了信号肽酶对EPO信号序列的预期切割。对于来自HEK细胞的重组人Δ108 hST6Gal-I变体,测定比活性为
>600 RFU/µg。
Claims (17)
1.哺乳动物糖基转移酶变体,其中所述变体的多肽包含野生型哺乳动物糖基转移酶的N末端截短的氨基酸序列,截短部分包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列基序,并且其中所述变体展现出糖基转移酶活性。
2.根据权利要求1的变体,其中所述糖基转移酶活性催化这样的化学反应,所述化学反应包括将5-N-乙酰神经氨酸残基从供体化合物胞苷-5'-一磷酸-N-乙酰神经氨酸或从其功能等同物转移至受体,所述受体为糖蛋白或糖脂的聚糖部分中的末端β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺。
3.根据权利要求1和2中任一项的变体,其中由所述糖基转移酶活性催化的所述化学反应包括使来自所述供体化合物胞苷-5'-一磷酸-N-乙酰神经氨酸或来自其功能等同物的所述5-N-乙酰神经氨酸残基与β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺的半乳糖残基中处于C6位置的羟基反应,其中形成了N-乙酰神经氨酸基-α2,6-β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺。
4.根据权利要求1至3中任一项的变体,其中所述野生型哺乳动物糖基转移酶为人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶。
5.根据权利要求4的变体,其中所述变体的多肽包含根据SEQ ID NO:1的野生型哺乳动物糖基转移酶的N末端截短的氨基酸序列,所述截短部分选自:(i)SEQ ID NO:1的位置1至位置100、(ii)SEQ ID NO:1的位置1至位置101、(iii)SEQ ID
NO:1的位置1至位置102、(vi)SEQ ID NO:1的位置1至位置103、(v)SEQ ID NO:1的位置1至位置104、(vi)SEQ ID
NO:1的位置1至位置105、(vii)SEQ ID NO:1的位置1至位置106、(viii)SEQ ID NO:1的位置1至位置107以及(ix)SEQ ID
NO:1的位置1至位置108。
6.根据权利要求5的变体,其中所述变体的多肽由SEQ ID NO:1的位置109至位置406的氨基酸序列组成。
7.根据权利要求1至6中任一项的变体,其中将所述变体的多肽的N末端或C末端融合至亲和标签。
8.根据权利要求7的变体,其中肽酶切割位点位于所述亲和标签与所述变体的多肽的N末端或C末端之间。
9.核苷酸序列,其编码根据权利要求1至8中任一项的哺乳动物糖基转移酶变体的多肽。
10.包含靶基因的表达载体,所述靶基因与在用所述表达载体转化的宿主生物中促进所述靶基因表达的序列可操作地连接,其中所述靶基因包含根据权利要求9的核苷酸序列。
11.经转化的宿主生物,其中所述宿主生物用根据权利要求10的表达载体转化。
12.重组产生哺乳动物糖基转移酶变体的方法,所述方法包括在经转化的宿主生物中表达编码根据权利要求1至8中任一项的哺乳动物糖基转移酶变体的核苷酸序列的步骤,其中形成多肽,从而产生所述哺乳动物糖基转移酶变体。
13.根据权利要求12的方法,其中所产生的哺乳动物糖基转移酶变体从所述宿主生物分泌。
14.根据权利要求12和13中任一项的方法,其中所述宿主生物为真核细胞。
15.根据权利要求12至14中任一项的方法,其中纯化所述哺乳动物糖基转移酶变体。
16.人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I的变体,其通过根据权利要求12至15中任一项的方法获得。
17.根据权利要求1至8中任一项的哺乳动物糖基转移酶变体或通过根据权利要求12至15中任一项的方法获得的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I用于将5-N-乙酰神经氨酸残基从供体化合物胞苷-5'-一磷酸-N-乙酰神经氨酸或从其功能等同物转移至受体的用途,所述受体为单克隆抗体的聚糖部分中的末端β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺。
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