CN105051056A

CN105051056A - 表征溶酶体酶的方法

Info

Publication number: CN105051056A
Application number: CN201480013609.0A
Authority: CN
Inventors: D·S·罗斯曼
Original assignee: Transkaryotic Therapies Inc
Current assignee: Shire Human Genetics Therapies Inc
Priority date: 2013-03-13
Filing date: 2014-03-13
Publication date: 2015-11-11
Also published as: EP2970380B1; CA2902629A1; US9290793B2; AU2014243749A1; US20140294800A1; US20160362719A1; WO2014160456A1; HK1214614A1; EP2970380A1; US10023901B2; JP2016518113A

Abstract

本发明特别提供用于在制造期间表征重组乙酰肝素N-硫酸酯酶(HNS)的方法。本发明使用毛细管区带电泳来确定重组HNS的电荷分布、同工型分布和/或聚糖分布；并且代表酶的批次一致性、储存稳定性、生物半衰期、药代动力学、药效学和生物活性的质量特征。特别是，这种表征方法可能有利于优化条件并且确保用于使用酶替代疗法治疗诊断为圣菲力浦综合征的患者的HNS的制造一致性。

Description

表征溶酶体酶的方法

相关申请

本申请要求于2013年3月13日提交的美国临时申请序列号61/779,767的优先权，所述临时申请的公开内容以引用的方式并入本文。

背景

乙酰肝素N-硫酸酯酶(HNS)是与硫酸乙酰肝素降解有关的溶酶体酶。导致缺乏这种酶的遗传缺陷称为IIIA型粘多糖症或A型圣菲力浦疾病。这种罕见常染色体隐性疾病在活产新生儿中的发生率为1/24,000，并且没有被批准的医学治疗方法可用。目前在临床上正在评估酶替代疗法(ERT)，其中将重组形式的外源酶引入受试者体内以弥补由遗传突变导致的酶缺乏。具体地说，可以将重组HNS酶引入诊断为A型圣菲力浦疾病患者体内，以促进硫酸乙酰肝素的降解和生物转换。为了进行治疗，通常使用基于细胞的表达系统来产生重组HNS糖蛋白。通常，重组酶是包含5个潜在的N-糖基化位点以及若干用于翻译后修饰的附加位点的54.7kDa糖蛋白。这些修饰结构中的一些结构，诸如带有末端甘露糖-6-磷酸者，对于生物功效来说是重要的，而另一些可能在蛋白质稳定性和/或溶解性中有作用。由此，受到上游细胞培养和下游纯化过程两者影响的存在于最终重组产品中的不同糖形的多样性可以对治疗性酶的潜在功效、药效学和药代动力学参数产生较大影响。

因此商业环境中的重组蛋白质治疗剂的生产需要控制制造过程，所述制造过程涉及一系列灵敏分析方法以阐明产品的生理化学特性和监测其纯度、稳定性和/或活性。检测出纯化的批次之间的细微的生理化学差异的能力对于实现受控的可靠生产过程以及一致、安全且有效的产品是很重要的。

发明概述

本发明特别提供改进的方法来阐明重组乙酰肝素N-硫酸酯酶(HNS)蛋白质的重要生理化学特性，从而允许更有效地监测和控制由商业制造过程生产的产品的质量、纯度和稳定性。因此，本发明允许更可靠的生产过程以及用于对A型圣菲力浦疾病进行有效的酶替代疗法的一致、安全且有效的产品。可预料的是，本发明可适用于任何溶酶体酶。

部分地，本发明是基于以下发现：毛细管区带电泳可以用于精确表征编码与溶酶体贮积病相关联的酶的重组蛋白质的生理化学特性。在一些具体实施方案中，重组蛋白质编码HNS酶。可预料的是，溶酶体酶(即，HNS蛋白质)的一种生理化学特性，分子电荷，是一种特别重要的属性。电荷微观异质性的程度可以归因于蛋白质结构的修饰(即，脱酰胺作用)和/或连接至多肽链的碳水化合物部分。重要的是，分子电荷(即，带电碳水化合物结构)的程度已经显示出在HNS蛋白质的生物功效和血清半衰期以及蛋白质抗原性、溶解性和蛋白酶抗性方面具有重要影响。因此，重组溶酶体酶(如HNS)的天然电荷异质性的定量分析和表征是产品开发的重要部分。

已知多种用于监测天然电荷异质性的不同分析技术，包括离子交换色谱法(IEX-HPLC)、凝胶电泳等电聚焦(gel-IEF)、毛细管等电聚焦(cIEF)、成像cIEF和毛细管区带电泳(CZE)。虽然这些技术各自都提供优点和劣势，但是用于解决指定蛋白质的电荷异质性的最佳方法将根据具体情况而确定。如下文实施例部分所描述的，本发明表明毛细管区带电泳特别适于表征溶酶体酶(如HNS)的天然电荷和聚糖分布，从而提供一定测定条件范围内的高水平的再现性和稳定性。因此，本发明允许任何溶酶体酶的商业生产的标准化和最优化。例如，这种方法可用于特别重组的HNS蛋白质。虽然HNS蛋白质用作实施例中描述的CZE分析的实例，但是可以预料的是，本发明可以应用于任何溶酶体酶。

在一个方面中，本发明提供分析溶酶体酶(如乙酰肝素N-硫酸酯酶蛋白质)的方法，其包括通过毛细管区带电泳来表征酶的电荷分布。在一些实施方案中，溶酶体酶是重组产生的。在一些实施方案中，表征步骤包括通过毛细管区带电泳分离对应于电荷变化的峰群的步骤。

在一些实施方案中，电荷分布包括少于14个对应于电荷变体的存在的峰群。在一些实施方案中，电荷分布包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个对应于电荷变体的存在的峰群。在一些实施方案中，电荷分布包括至少14个对应于电荷变体的存在的峰群。在一些实施方案中，电荷分布包括至少14、15、16、17、18、19、20或21个对应于电荷变体的存在的群。在一些实施方案中，峰群对应于与唾液酸的不存在、存在或量改变相关联的电荷变体。在一些实施方案中，峰群对应于与甘露糖6-磷酸(M6P)的不存在、存在或量改变相关联的电荷变体。在一些实施方案中，峰群对应于与唾液酸和/或甘露糖6-磷酸的不存在、存在或量改变相关联的电荷变体。

在一些实施方案中，表征步骤包括定量地确定每个峰群的相对迁移时间。在一些实施方案中，表征步骤包括定量地确定每个峰群的相对峰面积。在一些实施方案中，表征步骤包括定量地确定每个峰群的相对迁移时间和/或相对峰面积。在一些实施方案中，相对于电渗流(EOF)标志物来确定每个峰群的相对迁移时间。在一些实施方案中，使用超过一个的EOF标志物。在一些实施方案中，通过与总峰面积比较的峰面积百分比来计算每个峰群的相对峰面积。

在一些实施方案中，所述方法还包括基于电荷分布来确定总唾液酸含量。在一些实施方案中，所述方法还包括基于电荷分布来确定总甘露糖6-磷酸含量。在一些实施方案中，所述方法还包括基于电荷分布来确定总唾液酸和/或甘露糖6-磷酸含量。在一些实施方案中，确定唾液酸含量的方法包括确定单唾液酸化、双唾液酸化和/或三唾液酸化聚糖的不存在、存在或量。在一些实施方案中，确定M6P含量的方法包括确定单M6P和/或双M6P的不存在、存在或量。

在一些实施方案中，所述方法还包括确定溶酶体酶(例如重组产生的HNS蛋白质)的质量。在一些实施方案中，在制造生产开始时确定蛋白质的质量。在一些实施方案中，在生产期间一次或多次确定溶酶体酶的质量。在一些实施方案中，在生产的不同阶段和/或步骤期间确定溶酶体酶的质量。在一些实施方案中，确定溶酶体酶的质量以监测生产过程中的进展、变化和/或偏差。

在一些实施方案中，使用细胞培养系统来生产重组溶酶体酶蛋白质。在一些实施方案中，溶酶体酶是HNS。在一些实施方案中，细胞培养系统使用哺乳动物细胞。在一些实施方案中，使用的哺乳动物细胞是人类细胞。在一些实施方案中，在微小规模生产速率下生产重组溶酶体酶。在一些实施方案中，在中等生产规模下生产溶酶体酶。在一些实施方案中，在大规模生产速率下生产溶酶体酶。

在一些实施方案中，所述方法包括确定在生产期间重组溶酶体酶(即，HNS)的电荷分布是否存在变化。在一些实施方案中，通过在生产开始时确定酶的电荷分布来鉴定电荷分布的变化。在一些实施方案中，通过在制造期间一次或多次确定酶的电荷来鉴定电荷的变化。在一些实施方案中，通过在生产结束时确定酶的电荷分布来鉴定电荷的变化。在一些实施方案中，通过比较在制造期间一次或多次收集的蛋白质电荷分布来确定酶电荷分布的变化。在一些实施方案中，通过比较从使用相同制造方法生产的酶的一个或多个批次收集的蛋白质电荷分布来确定溶酶体酶电荷分布的变化。在一些实施方案中，通过比较从同一制造批次内生产的酶的一个或多个小批收集的蛋白质电荷分布来确定酶电荷分布的变化。在一些实施方案中，通过比较从使用不同制造方法生产的酶的一个或多个批次收集的蛋白质电荷分布来确定酶电荷分布的变化。

在一些实施方案中，所述方法包括与参照相比，确定重组溶酶体酶的电荷分布是否存在变化。在一些实施方案中，参照是与溶酶体贮积病相关联的酶的电荷分布。在一些实施方案中，参照是与溶酶体贮积病相关联的一种或多种不同酶的平均电荷分布。在一些实施方案中，参照是来自由不同商业批次生产的HNS蛋白质的HNS电荷分布。在一些实施方案中，参照是来自同一商业批次内的两个或多个不同小批的HNS蛋白质测定的HNS电荷分布。在一些实施方案中，参照是来自FDA批准产品的HNS电荷分布。在一些实施方案中，参照是由来自根据相同商业制造过程的一个或多个小批和/或批次所测定的HNS蛋白质所产生的平均HNS电荷分布。在一些实施方案中，参照是由来自根据不同商业制造过程的一个或多个小批和/或批次所测定的HNS蛋白质所产生的平均HNS电荷分布。

在一些实施方案中，通过在生产开始时确定HNS的电荷分布来鉴定电荷分布的变化。在一些实施方案中，通过在制造期间一次或多次确定HNS的电荷来鉴定电荷的变化。在一些实施方案中，通过在生产结束时确定HNS的电荷分布来鉴定电荷的变化。在一些实施方案中，通过比较在制造期间一次或多次收集的HNS电荷分布来确定HNS电荷分布的变化。在一些实施方案中，通过比较从使用相同制造方法生产的HNS酶的一个或多个批次收集的HNS电荷分布来确定HNS电荷分布的变化。在一些实施方案中，通过比较从同一制造批次内生产的HNS酶的一个或多个小批收集的HNS电荷分布来确定HNS电荷分布的变化。在一些实施方案中，通过比较从使用相同制造方法生产的HNS酶的一个或多个批次收集的HNS电荷分布来确定HNS电荷分布的变化。

在一些实施方案中，所述方法包括与参照相比，确定重组溶酶体酶蛋白质的电荷同工型数目的变化。在一些实施方案中，参照是与溶酶体贮积病相关联的酶的通过CZE获得的电荷同工型数目。在一些实施方案中，参照是来自不同商业批次的通过CZE获得的酶电荷同工型数目。在一些实施方案中，参照是来自同一商业批次内的两个或多个不同小批的通过CZE获得的平均酶电荷同工型数目。在一些实施方案中，参照是来自FDA批准产品的酶电荷同工型数目。在一些实施方案中，参照是由根据相同商业制造过程的一个或多个小批和/或批次产生的平均酶电荷同工型数目。在一些实施方案中，参照是由根据不同商业制造过程的一个或多个小批和/或批次产生的平均酶电荷同工型数目。

在一些实施方案中，所述方法包括与参照相比，确定重组HNS蛋白质的电荷同工型数目的变化。在一些实施方案中，参照是与溶酶体贮积病相关联的酶的通过CZE获得的电荷同工型数目。在一些实施方案中，参照是来自不同商业批次的通过CZE获得的HNS电荷同工型数目。在一些实施方案中，参照是来自同一商业批次内的两个或多个不同小批通过CZE获得的平均HNS电荷同工型数目。在一些实施方案中，参照是来自FDA批准产品的HNS电荷同工型数目。在一些实施方案中，参照是由根据相同商业制造过程的一个或多个小批和/或批次产生的平均HNS电荷同工型数目。在一些实施方案中，参照是由根据不同商业制造过程的一个或多个小批和/或批次产生的平均HNS电荷同工型数目。

在一些实施方案中，通过在生产开始时确定酶的电荷分布来鉴定电荷同工型数目的变化。在一些实施方案中，通过在制造期间一次或多次确定酶的电荷同工型数目来鉴定电荷的变化。在一些实施方案中，通过在生产结束时确定酶的电荷同工型数目来鉴定电荷的变化。在一些实施方案中，通过比较在制造期间一次或多次收集的酶的电荷同工型数目来确定酶HNS电荷分布的变化。在一些实施方案中，通过比较从使用相同制造方法生产的酶的一个或多个批次收集的酶的电荷同工型数目来确定酶电荷分布的变化。在一些实施方案中，通过比较从同一制造批次内生产的酶的一个或多个小批收集的酶的电荷分布来确定酶的电荷同工型数目的变化。在一些实施方案中，通过比较从使用相同制造方法生产的酶的一个或多个批次收集的酶的电荷分布来确定酶的电荷同工型数目的变化。

在一些实施方案中，所述方法还包括评估小批间电荷变化性的步骤。在一些实施方案中，评估小批间电荷变化性的方法包括比较在制造批次期间生产的重组溶酶体酶蛋白质的每个小批的相对峰面积相对于峰群的趋势图。

在一些实施方案中，所述方法还包括评估批次间电荷变化性的步骤。在一些实施方案中，评估批次间电荷变化性的方法包括比较每个由不同批次生产的重组溶酶体酶蛋白质的相对峰面积相对于峰群的趋势图。

在一些实施方案中，所述方法还包括评估生产方法电荷变化性的步骤。在一些实施方案中，评估生产方法电荷变化性的方法包括比较每个由不同制造方法生产的重组溶酶体酶蛋白质的相对峰面积相对于峰群的趋势图。

在一些实施方案中，毛细管区带电泳(CZE)在使得较长的迁移时间对应于增加负电荷的物质的条件下进行。在一些实施方案中，使用包含Tris的缓冲液进行CZE。在一些实施方案中，缓冲系统包含浓度在约20-30mM范围内的Tris。在一些实施方案中，缓冲系统包含浓度为约25mM的Tris。在一些实施方案中，缓冲系统具有约7.5-8.5范围内的pH。在一些实施方案中，缓冲系统具有约8.0的pH。

在一些实施方案中，使用裸露熔融石英毛细管柱进行毛细管区带电泳(CZE)。在一些实施方案中，使用聚乙烯醇(PVA)涂布的毛细管柱进行CZE。在一些实施方案中，使用长度在50-110cm之间的范围内的毛细管进行CZE。在一些实施方案中，使用长度为72cm的毛细管进行CZE。在一些实施方案中，使用长度为104cm的毛细管进行CZE。

在另一个方面中，本发明提供分析溶酶体酶蛋白质(如乙酰肝素N-硫酸酯酶)的制造方法，其包括通过毛细管区带电泳来表征酶的电荷分布。在一些实施方案中，表征步骤包括通过毛细管区带电泳分离对应于电荷变体的峰群的步骤。

在一些实施方案中，电荷分布包括至少14个对应于电荷变体的存在的峰群。在一些实施方案中，电荷分布包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个对应于电荷变体的存在的峰群。在一些实施方案中，电荷分布包括至少14个对应于电荷变体的存在的峰群。在一些实施方案中，电荷分布包括至少14、15、16、17、18、19、20或21个对应于电荷变体的存在的峰群。在一些实施方案中，峰群对应于与唾液酸的不存在、存在或量改变相关联的电荷变体。在一些实施方案中，峰群对应于与甘露糖6-磷酸(M6P)的不存在、存在或量改变相关联的电荷变体。在一些实施方案中，峰群对应于与唾液酸和/或甘露糖6-磷酸的不存在、存在或量改变相关联的电荷变体。

在一些实施方案中，表征步骤包括定量地确定每个峰群的相对迁移时间。在一些实施方案中，表征步骤包括定量地确定每个峰群的相对峰面积。在一些实施方案中，表征步骤包括定量地确定每个峰群的相对迁移时间和/或相对峰面积。在一些实施方案中，每个峰群的相对迁移时间相对于电渗流(EOF)标志物来确定。在一些实施方案中，使用超过一个EOF标志物。在一些实施方案中，通过与总峰面积比较的峰面积百分比来计算每个峰群的相对峰面积。

在一些实施方案中，所述制造方法还包括基于电荷分布来确定总唾液酸含量。在一些实施方案中，所述制造方法还包括基于电荷分布来确定总甘露糖6-磷酸含量。在一些实施方案中，所述制造方法还包括基于电荷分布来确定总唾液酸和/或甘露糖6-磷酸含量。在一些实施方案中，确定唾液酸含量的制造方法包括确定单唾液酸化、双唾液酸化和/或三唾液酸化聚糖的不存在、存在或量。在一些实施方案中，确定M6P含量的制造方法包括确定单M6P和/或双M6P的不存在、存在或量。

在一些实施方案中，所述制造方法还包括确定生产的溶酶体酶蛋白质的质量。在一些实施方案中，在制造生产开始时确定酶的质量。在一些实施方案中，在生产期间一次或多次确定酶的质量。在一些实施方案中，在生产的不同阶段和/或步骤期间确定酶的质量。在一些实施方案中，确定酶的质量以监测生产过程中的进展、变化和/或偏差。

在一些实施方案中，使用细胞培养系统来生产重组溶酶体酶蛋白质。在一些实施方案中，细胞培养系统使用哺乳动物细胞。在一些实施方案中，使用的哺乳动物细胞是人类细胞。在一些实施方案中，在微小规模生产速率下生产重组溶酶体酶。在一些实施方案中，在中等生产规模下生产溶酶体酶。在一些实施方案中，在大规模生产速率下生产溶酶体酶。在某些具体实施方案中，溶酶体酶是HNS。

在一些实施方案中，所述制造方法包括确定在生产期间重组溶酶体酶蛋白质的电荷分布是否存在变化。在一些实施方案中，通过在生产开始时确定蛋白质电荷分布来鉴定电荷分布的变化。在一些实施方案中，通过在制造期间一次或多次确定蛋白质电荷来鉴定电荷的变化。在一些实施方案中，通过在生产结束时确定蛋白质电荷分布来鉴定电荷的变化。在一些实施方案中，通过比较在制造期间一次或多次收集的蛋白质电荷分布来确定酶电荷分布的变化。在一些实施方案中，通过比较从使用相同制造方法生产的酶的一个或多个批次收集的蛋白质电荷分布来确定酶电荷分布的变化。在一些实施方案中，通过比较同一制造批次内生产的酶的一个或多个小批收集的蛋白质电荷分布来确定酶电荷分布的变化。在一些实施方案中，通过比较从使用不同制造过程生产的酶的一个或多个批次收集的蛋白质电荷分布来确定酶电荷分布的变化。

在一些实施方案中，所述制造方法包括与参照相比，确定重组溶酶体酶蛋白质的电荷分布是否存在变化。在一些实施方案中，参照是与溶酶体贮积病相关联的酶的电荷分布。在一些实施方案中，参照是与溶酶体贮积病相关联的一种或多种不同酶的平均电荷分布。在一些实施方案中，参照是来自通过不同商业批次生产的HNS蛋白质的HNS电荷分布。在一些实施方案中，参照是来自由同一商业批次内的两个或多个不同小批的HNS蛋白质测定的HNS蛋白质的HNS电荷分布。在一些实施方案中，参照是来自FDA批准产品的HNS电荷分布。在一些实施方案中，参照是由来自根据相同商业制造过程的一个或多个小批和/或批次的所测定的HNS蛋白质产生的平均HNS电荷分布。在一些实施方案中，参照是由来自根据不同商业制造过程的一个或多个小批和/或批次的所测定的HNS蛋白质产生的平均HNS电荷分布。

在一些实施方案中，通过在生产开始时确定HNS电荷分布来鉴定电荷分布的变化。在一些实施方案中，通过在制造期间一次或多次确定HNS电荷来鉴定电荷的变化。在一些实施方案中，通过在生产结束时确定HNS电荷分布来鉴定电荷的变化。在一些实施方案中，通过比较在制造期间一次或多次收集的HNS电荷分布来确定HNS电荷分布的变化。在一些实施方案中，通过比较从使用相同制造过程生产的HNS酶的一个或多个批次收集的HNS电荷分布来确定HNS电荷分布的变化。在一些实施方案中，通过比较从同一制造批次内生产的HNS酶的一个或多个小批收集的HNS的电荷分布来确定HNS电荷分布的变化。在一些实施方案中，通过比较从使用相同制造过程生产的HNS酶的一个或多个批次收集的HNS电荷分布来确定HNS电荷分布的变化。

在一些实施方案中，所述制造方法包括与参照相比，确定重组溶酶体酶蛋白质的电荷同工型数目的变化。在一些实施方案中，参照是与溶酶体贮积病相关联的酶的通过CZE获得的电荷同工型数目。在一些实施方案中，参照是来自不同商业批次的通过CZE获得的酶电荷同工型数目。在一些实施方案中，参照是来自同一商业批次内的两个或多个不同小批的通过CZE获得的平均酶电荷同工型数目。在一些实施方案中，参照是来自FDA批准产品的酶电荷同工型数目。在一些实施方案中，参照是由根据相同商业制造过程的一个或多个小批和/或批次产生的平均酶电荷同工型数目。在一些实施方案中，参照是由根据不同商业制造过程的一个或多个小批和/或批次产生的平均酶电荷同工型数目。

在一些实施方案中，通过在生产开始时确定酶电荷分布来鉴定电荷同工型数目的变化。在一些实施方案中，通过在制造期间一次或多次确定酶电荷同工型数目来鉴定电荷的变化。在一些实施方案中，通过在生产结束时确定酶电荷同工型数目来鉴定电荷的变化。在一些实施方案中，通过比较在制造期间一次或多次收集的酶电荷同工型数目来确定HNS电荷分布的变化。在一些实施方案中，通过比较从使用相同制造过程生产的酶的一个或多个批次收集的酶电荷同工型数目来确定酶电荷分布的变化。在一些实施方案中，通过比较同一制造批次内生产的酶的一个或多个批次收集的酶电荷分布来确定酶电荷同工型数目的变化。在一些实施方案中，通过比较从使用相同制造过程生产的酶的一个或多个批次收集的酶电荷分布来确定酶电荷同工型数目的变化。

在一些实施方案中，所述制造方法还包括评估小批间电荷变化性的步骤。在一些实施方案中，评估小批间电荷变化性的方法包括比较在制造批次期间生产的溶酶体酶蛋白质的每个小批的相对峰面积相对于峰群的趋势图。

在一些实施方案中，所述制造方法还包括评估批次间电荷变化性的步骤。在一些实施方案中，评估批次间电荷变化性的方法包括比较每个由不同批次生产的溶酶体酶蛋白质的相对峰面积相对于峰群的趋势图。

在一些实施方案中，所述制造方法还包括评估生产方法电荷变化性的步骤。在一些实施方案中，评估生产方法电荷变化性的方法包括比较每个由不同制造过程生产的溶酶体酶蛋白质的相对峰面积相对于峰群的趋势图。

在一些实施方案中，使用裸露熔融石英毛细管柱进行毛细管区带电泳(CZE)。在一些实施方案中，使用聚乙烯醇(PVA)涂布的毛细管柱进行CZE。在一些实施方案中，使用长度在50-110cm之间的范围内的毛细管进行CZE。在一些实施方案中，使用长度在72-104cm范围内的毛细管进行CZE。

在一些实施方案中，所述制造方法还包括基于电荷分布的分析来调节制造条件的步骤。在一些实施方案中，分析步骤在纯化前进行。在一些实施方案中，分析步骤在纯化期间进行。在一些实施方案中，分析步骤在制造过程期间进行一次或多次。在一些实施方案中，分析步骤在释放一定批量用于商业销售前进行。

在另一方面中，本发明提供包含基本上纯的溶酶体酶蛋白质的药物组合物，所述基本上纯的溶酶体酶蛋白质如通过毛细管区带电泳所确定表征为电荷分布包括至少14个对应于溶酶体酶蛋白质电荷变体的峰群。

在另一方面中，本发明提供包含基本上纯的乙酰肝素N-硫酸酯酶(HNS)蛋白质的药物组合物，所述基本上纯的乙酰肝素N-硫酸酯酶(HNS)蛋白质如通过毛细管区带电泳所确定表征为电荷分布包括至少14个对应于HNS蛋白质电荷变体的峰群。

在一些实施方案中，峰群对应于与唾液酸的不存在、存在或量改变相关联的电荷变体。在一些实施方案中，峰群对应于与甘露糖6-磷酸(M6P)的不存在、存在或量改变相关联的电荷变体。在一些实施方案中，峰群对应于与唾液酸和/或甘露糖6-磷酸的不存在、存在或量改变相关联的电荷变体。

在一些实施方案中，电荷变体选自由单唾液酸化、双唾液酸化或三唾液酸化聚糖组成的组。在一些实施方案中，电荷变体选自由单M6P或双M6P基团组成的组。在一些实施方案中，电荷变体选自由单唾液酸化、双唾液酸化、三唾液酸化、单M6P、双M6P基团及其组合所组成的组。

在一些实施方案中，对应于单M6P的峰群具有总峰面积的约8-12％的相对峰面积。在一些实施方案中，对应于双M6P的峰群具有总峰面积的约10-15％的相对峰面积。

在一些实施方案中，重组溶酶体酶是一种或多种在表2中列出的溶酶体酶。在一些实施方案中，溶酶体酶可以是天然存在的溶酶体酶。在一些实施方案中，合适的溶酶体酶可以是天然存在的溶酶体酶的重组型式。

在一些实施方案中，适用于本发明的溶酶体酶(例如但不限于在表2中发现的那些)可以具有野生型或天然存在的序列。在一些实施方案中，适用于本发明的溶酶体酶可以具有修饰的序列，所述修饰的序列与野生型或天然存在的序列具有显著的同源性或同一性(例如，与野生型或天然存在的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％的序列同一性)。

在一些实施方案中，重组HNS蛋白质具有由包含SEQIDNO:1的核酸序列编码的核酸。在一些实施方案中，编码HNS的核酸序列与SEQIDNO:1至少70％相同。在一些实施方案中，编码HNS的核酸序列与SEQIDNO:1包含至少80％同源性。在一些实施方案中，重组HNS蛋白质具有包含SEQIDNO:2的氨基酸序列。在一些实施方案中，重组HNS蛋白质具有与SEQIDNO:2至少70％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，HNS蛋白质具有与SEQIDNO:2相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，使用细胞培养系统来生产重组HNS蛋白质。在一些实施方案中，细胞培养系统使用哺乳动物细胞。在一些实施方案中，使用的哺乳动物细胞是人类细胞。在一些实施方案中，在微小规模生产速率下生产重组HNS。在一些实施方案中，在中等生产规模下生产HNS。

在一些实施方案中，使用裸露熔融石英毛细管柱进行毛细管区带电泳(CZE)。在一些实施方案中，使用聚乙烯醇(PVA)涂布的毛细管柱进行CZE。在一些实施方案中，使用长度在50-110cm之间的范围内的毛细管进行CZE。在一些实施方案中，使用长度在72-104cm之间的范围内的毛细管进行CZE。

在另一方面中，本发明提供治疗A型圣菲力浦综合征的方法，所述方法包括向需要治疗的受试者施用包含基本上纯的乙酰肝素N-硫酸酯酶(HNS)蛋白质的药物组合物，所述基本上纯的乙酰肝素N-硫酸酯酶(HNS)蛋白质如通过毛细管区带电泳所确定表征为电荷分布包括至少14个对应于HNS蛋白质电荷变体的峰群。

在一些实施方案中，电荷变体选自由单唾液酸化、双唾液酸化和/或三唾液酸化聚糖组成的组。在一些实施方案中，电荷变体选自由单M6P或双M6P基团组成的组。在一些实施方案中，电荷变体选自由单唾液酸化、双唾液酸化、三唾液酸化、单M6P、双M6P基团及其组合所组成的组。

在一些实施方案中，重组溶酶体酶蛋白质是一种或多种在表2中列出的溶酶体酶。在一些实施方案中，溶酶体酶可以是天然存在的溶酶体酶。在一些实施方案中，合适的溶酶体酶可以是天然存在的溶酶体酶的重组型式。

在一些实施方案中，适用于本发明的溶酶体酶(例如但不限于在表2中发现的那些)可具有野生型或天然存在的序列。在一些实施方案中，适用于本发明的溶酶体酶可以具有修饰的序列，所述修饰的序列与野生型或天然存在的序列具有显著的同源性或同一性(例如，与野生型或天然存在的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％的序列同一性)。

在一些实施方案中，溶酶体酶是HNS。在一些实施方案中，HNS是重组产生的。在一些实施方案中，重组HNS蛋白质具有由包含SEQIDNO:1的核酸序列编码的核酸。在一些实施方案中，编码HNS的核酸序列与SEQIDNO:1至少70％相同。在一些实施方案中，编码HNS的核酸序列包含与SEQIDNO:1至少80％的同源性。在一些实施方案中，重组HNS蛋白质具有包含SEQIDNO:2的氨基酸序列。在一些实施方案中，重组HNS蛋白质具有与SEQIDNO:2至少70％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，HNS蛋白质具有与SEQIDNO:2相同的氨基酸序列。

附图说明

共同构成附图的以下描述的图仅用于示例的目的而非限制。

图1A和B.展示使用相同的制造过程生产的两个不同小批的重组HNS酶(rHNS)的表征。使用毛细管区带电泳(A)和等电聚焦凝胶测定两个制造小批(rHNS小批1和rHNS小批2)的电荷分布。较长的迁移时间对应于负电荷增加的同工型。

图2A-C.展示在毛细管区带电泳期间缓冲液强度对峰分离的影响。通过使用浓度为(A)100mM、(B)50mM和(C)25mM的Tris缓冲液进行的毛细管区带电泳来分析重组HNS的电荷分布。

图3.描绘通过使用一定缓冲液浓度范围内的pH8.0的Tris缓冲液进行的(B)毛细管区带电泳和(A)相对峰面积所分析的重组HNS的电荷分布。

图4A-D.示出在毛细管区带电泳期间缓冲液pH对峰分离的影响。通过使用(A)pH8.5、(B)pH8.0、(C)pH7.5和(D)pH7.0的Tris缓冲液进行的毛细管区带电泳来分析重组HNS的电荷分布。

图5A&B.描绘使用不同pH下的浓度为25mM的Tris缓冲液，通过(B)毛细管区带电泳和(A)相对峰面积所分析的重组HNS的电荷分布。

图6.示出在毛细管区带电泳期间毛细管长度对峰分离的影响。通过使用长度为(A)72cm或(B)104nm的裸露熔融石英毛细管柱进行的毛细管区带电泳来分析重组HNS的电荷分布。

图7A和B.示出允许具有不同电荷分布的14HNS同工型的(A)分离和(B)整合的示例性毛细管区带电泳条件。

图8.描绘同一制造小批的过毛细管区带电泳进行分析、使用三重复注射进行测定的重组HNS酶的电荷分布的试验间重复性。

图9.描绘重组HNS酶的电荷分布的日间重复性。通过毛细管区带电泳分析重组人类HNS酶的在四个月的过程中7个独立的实验操作。数据表示为相对迁移时间(RMT)和相对峰面积(％)以确定任何再现性的变化。

图10A和B.描绘两个不同小批的重组HNS酶的电荷分布，所述重组HNS酶是使用相同制造过程生产，通过(A)毛细管区带电泳进行分析以确定(B)14个不同HNS电荷同工型的相对峰面积(％)。

图11.描绘四个不同小批的重组HNS酶的电荷分布，所述重组HNS酶是使用相同制造过程生产，并且通过毛细管区带电泳进行分析以确定14个不同HNS电荷同工型的相对峰面积(％)。

图12A&B.描绘两个不同小批的重组HNS酶的电荷分布，所述重组HNS酶是使用相同制造过程生产，并且在制造过程的(A)早期和(B)结束时通过毛细管区带电泳进行分析。

图13A和B.描绘重组HNS酶的电荷分布，所述重组HNS酶是使用两种不同的制造过程生产，通过(A)毛细管区带电泳进行分析以确定(B)不同HNS电荷同工型的相对峰面积(％)。标记X和Y指示在先前识别的14种同工型之外存在另外的峰。

图14A和B.描绘重组HNS电荷异质性的糖表征。(A)重组HNS使用磷酸酶、神经氨酸酶或两者预处理，或不处理作为对照，然后通过毛细管区带电泳进行分析。(B)通过高效阴离子交换色谱利用脉冲电流检测分析释放的聚糖，产生总N-聚糖分析的聚糖图。

图15A-D.描绘通过毛细管区带电泳进行分析时，(A)重组HNS酶的天然电荷分布以及使用(B)磷酸酶和神经氨酸酶、(C)磷酸酶、和(D)神经氨酸酶预处理的重组HNS的电荷分布。

定义

为了更加容易地理解本发明，首先对某些术语进行定义。以下术语和其它术语的另外的定义将在说明书中阐述。

氨基酸：如本文所用，术语“氨基酸”在其广义上来说，是指任何可以合并至多肽链中的化合物和/或物质。在一些实施方案中，氨基酸具有一般结构H₂N-C(H)(R)-COOH。在一些实施方案中，氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸是合成氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是D-氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是L-氨基酸。“标准氨基酸”是指通常在天然存在的肽中发现的20种标准L-氨基酸中任一者。“非标准氨基酸”是指除标准氨基酸以外的任何氨基酸，不管它是合成制备或是从天然来源获得。如本文所用，“合成氨基酸”涵盖化学修饰的氨基酸，包括但不限于盐、氨基酸衍生物(如酰胺)、和/或取代。包括肽中的羧基端和/或氨基端氨基酸在内的氨基酸可以通过甲基化、酰胺化、乙酰化、保护基和/或被可以改变肽的循环半衰期而不会不利地影响其活性的其它化学基团取代来修饰。氨基酸可以参与二硫键。氨基酸可以包含一个或翻译后修饰，如与一个或多个化学实体(例如甲基、乙酸酯基、乙酰基、磷酸酯基、甲酰基部分、类异戊二烯基团、硫酸根基团、聚乙二醇部分、脂质部分、碳水化合物部分、生物素部分等)结合。在一些实施方案中，本发明的氨基酸可以提供于或用于补充用于细胞培养的培养基。在一些实施方案中，提供于或用于补充细胞培养基的氨基酸可以以盐的形式或以水合物形式提供。

大约：如本文所使用，在应用于一个或多个目标值时，术语“大约”或“约”是指类似于所说明的参考值的值。在某些实施方案中，术语“大约”或“约”是指在所说明的参考值的任一方向上的(大于或小于)25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小范围内的值范围，除非另外说明或以另外的方式从上下文显而易见(除了这样的数值将超过可能值的100％)。

批次：如本文所用，术语“批次”是指完成的制造轮次，在所述轮次中生产产品、成品或组分。在一些实施方案中，批次包含多个“小批”。如本文所用，术语“小批”是指在商业批次制造期间产生的总完成产品的部分或份。在一些实施方案中，批次由单个小批组成。在一些实施方案中，批次由多个小批组成。在一些实施方案中，批次基于样品规模、FDA要求和/或运送条件而分割为个别小批。在一些实施方案中，批次基于在批次制造期间产生的特定份而分割为小批。

生物活性：如本文所使用，短语“生物活性”是指在生物系统(例如细胞培养物、生物体等)中具有活性的任何物质的特征。例如，在向生物体施用时对所述生物体具有生物效应的物质被认为具有生物活性。还可以通过体外测定(例如，体外酶测定，如硫酸酯释放测定)来确定生物活性。在蛋白质或多肽具有生物活性的具体实施方案中，所述蛋白质或多肽中共享蛋白质或多肽的至少一种生物活性的部分通常称为“生物活性”部分。在一些实施方案中，蛋白质由当施用至受试者时显示生物活性的细胞培养系统产生或纯化。在一些实施方案中，为了变得具有生物活性，蛋白质需要进一步加工。在一些实施方案中，为了变得具有生物活性，蛋白质需要翻译后修饰，例如但不限于，糖基化(例如，唾液酸化)、法尼基化、裂解、折叠、甲酰甘氨酸转化及其组合。在一些实施方案中，产生为原型(即未成熟形式)的蛋白质可能需要另外的修饰以变得具有生物活性。

对照：如本文所用，术语“对照”在本领域理解的含义是与结果进行比较的标准。通常，使用对照以便通过分离变量来增强实验的完整性，从而得到关于这些变量的结论。在一些实施方案中，对照是与测试反应或测定同时进行的反应或测定以提供比较物。在一个实施方案中，应用“测试”(即，测试的变量)。在第二个实施方案中，未应用“对照”，即所测试的变量。在一些实施方案中，对照是历史对照(即，之前进行的测试或测定，或之前已知的量或结果)。在一些实施方案中，对照是或包括印刷的或以其它方式保存的记录。对照可以是阳性对照或阴性对照。在一些实施方案中，对照可以是“参考对照”，即用于与测试样品进行比较的样品，以寻找差异或用于表征的目的。

酶替代疗法(ERT)：如本文所用，术语“酶替代疗法(ERT)”是指通过提供缺少的酶来校正酶缺乏的任何治疗策略。在一些实施方案中，通过鞘内施用来提供缺少的酶。在一些实施方案中，通过输注到血流中来提供缺少的酶。一旦施用，酶就被细胞吸收并且转运至溶酶体，在溶酶体中酶起作用以消除由于酶缺乏而积累在溶酶体中的物质。通常，为了使溶酶体酶替代疗法有效，将治疗酶递送至表现出贮积缺陷的目标组织中的合适细胞中的溶酶体。

基因：如本文所用的术语“基因”是指任何核苷酸序列DNA或RNA，其至少一些部分编码在细胞过程的一些方面中起作用的独立最终产物，通常但不限于为多肽。但并不打算所述术语仅指编码多肽或其它独立最终产物的编码序列，而是也可以涵盖调节基础表达水平的在编码序列之前和之后的区域，以及在个别编码区段(“外显子”)之间的间插序列(“内含子”)。在一些实施方案中，基因可以包含调控序列(例如，启动子、增强子、聚腺苷酸化序列、终止序列、Kozak序列、TATA盒等)和/或修饰序列。在一些实施方案中，基因可以包含不编码蛋白质而是编码功能性RNA分子(如tRNA、RNAi诱导剂等)的核酸的参照物。

基因产物或表达产物：如本文所用，术语“基因产物”或“表达产物”通常是指自基因转录的RNA(加工前和/或加工后)或由自基因转录的RNA编码的多肽(修饰前和/或修饰后)。

同源性：如本文所使用，术语“同源性”是指聚合物分子之间例如核酸分子(例如，DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。在一些实施方案中，如果聚合物分子的序列为至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同，则认为它们是彼此“同源的”。在一些实施方案中，如果聚合物分子的序列为至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相似，则认为它们是彼此“同源的”。

同一性：如本文所使用，术语“同一性”是指聚合物分子之间例如核酸分子(例如，DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。两个核酸序列的同一性百分比的计算例如可通过出于最佳比对目的对准两个序列来进行(例如，为了最佳对准可在第一核酸序列和第二核酸序列之一或两者中引入间隙并且出于比对目的可忽视不相同的序列)。在某些实施方案中，出于比对目的对准的序列的长度为参照序列长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或基本上100％。然后比较对应核苷酸位置上的核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中的对应位置相同的核苷酸占据时，则分子在所述位置上相同。两个序列之间的同一性百分比为将出于两个序列最佳对准而需要引入的间隙的数目和每个间隙的长度考虑在内，序列共有的相同位置数的函数。可使用数学算法来完成序列比对和两个序列之间同一性百分比的确定。例如，可使用Meyers和Miller的算法(CABIOS，1989，4:11-17)确定两个核苷酸序列之间的同一性百分比，所述算法已使用PAM120权重残基表、间隙长度罚分12和间隙罚分4而结合到ALIGN程序(2.0版)中。或者可使用GCG软件包中的GAP程序、使用NWSgapdna.CMP矩阵确定两个核苷酸序列之间的同一性百分比。各种其它序列对准程序可以获得并且可以用于确定序列同一性，例如像Clustal。

改进、增加或减少：如本文所用，术语“改进”、“增加”或“减少”或语法等价物表示与基线测量值(如在起始本文所述的治疗之前的同一个体中的测量值，或在不存在本文所述的治疗时的对照个体(或多个对照个体)中的测量值)相关的值。“对照个体”是罹患与所治疗的个体相同形式的溶酶体贮积病的的个体，其与所治疗的个体年龄大致相同(以确保治疗的个体的疾病阶段与对照个体相当)。

分离的：如本文所用，术语“分离的”是指物质和/或实体已(1)与它在最初产生时(无论在自然界中和/或在实验环境中)与之相关联的至少一些组分分离，和/或(2)手动产生、制备和/或制造。分离的物质和/或实体可以与约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或多于99％的与其相关联的其它组分分离。在一些实施方案中，分离的药剂为约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或高于约99％纯。如本文所使用，如果物质基本上不含其它组分，则它为“纯的”。如本文所用，分离的物质和/或实体的纯度百分比的计算不应包括赋形剂(例如，缓冲剂、溶剂、水等)。

核酸：如本文所用，术语“核酸”在其广义上来说，是指作为寡核苷酸链或者可以合并至寡核苷酸链中的化合物和/或物质。在一些实施方案中，核酸是作为寡核苷酸链或可以通过磷酸二酯键并入寡核苷酸链中的化合物和/或物质。在一些实施方案中，“核酸”是指个别核酸残基(例如核苷酸和/或核苷)。在一些实施方案中，“核酸”是指包含个别核酸残基的寡核苷酸链。如本文所用，术语“寡核苷酸”与“多核苷酸”可互换使用。在一些实施方案中，“核酸”涵盖RNA以及单链和/或双链DNA和/或cDNA。此外，术语“核酸”、“DNA”、“RNA”和/或类似术语包含核酸类似物，即，不具有磷酸二酯主链的类似物。例如，在本领域中已知并且在主链中具有肽键而不是磷酸二酯键的所谓“肽核酸”被认为在本发明范围内。术语“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此为简并型式和/或编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和/或RNA的核苷酸序列可能包含内含子。核酸可以从天然来源纯化，使用重组表达系统产生并且任选地纯化、化学合成等。在适当的情况下，例如在化学合成分子的情况下，核酸可以包括核苷类似物，如具有化学修饰的碱基或糖、主链修饰等的类似物。除非另有说明，否则核酸序列以5’到3’方向提供。本文使用术语“核酸区段”来指作为较长的核酸序列的一部分的核酸序列。在许多实施方案中，核酸区段包含至少3、4、5、6、7、8、9、10或更多个残基。在一些实施方案中，核酸是或包含天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷、和脱氧胞苷)，核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧腺苷、8-氧鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤和2-硫胞苷)，化学修饰的碱基，生物修饰的碱基(例如，甲基化碱基)，插入碱基，修饰糖(例如，2’-氟核糖、核糖、2′-脱氧核糖、阿拉伯糖、和己糖)，和/或修饰磷酸酯基(例如，硫代磷酸酯和5’-N-氨基磷酸酯键)。在一些实施方案中，本发明特别涉及“未修饰的核酸”，其意指为了促进或实现递送而未被化学修饰的核酸(例如，多核苷酸和残基，包括核苷酸和/或核苷)。

蛋白质：如本文所用，术语“蛋白质”是指多肽(即一串至少两个通过肽键彼此连接的氨基酸)。蛋白质可以包含除了氨基酸以外的部分(例如，可以是糖蛋白、蛋白聚糖等)，和/或可以其它方式加工或修饰。本领域的普通技术人员将理解，“蛋白质”可以是由细胞产生的完整多肽链(含或不含信号序列)，或者可以是其特征部分。在一些实施方案中，蛋白质有时可以包括一个以上例如通过一个或多个二硫键连接或通过其它手段缔合的多肽链。在一些实施方案中，多肽可以包含L-氨基酸、D-氨基酸或两者，并且可以包含本领域已知的多种氨基酸修饰或类似物中任一者。有用的修饰包括例如末端乙酰化、酰胺化、甲基化等。在一些实施方案中，蛋白质可以包含天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸及其组合。术语“肽”通常用于指代长度小于约100个氨基酸、小于约50个氨基酸、小于20个氨基酸或小于10个氨基酸的多肽。在一些实施方案中，蛋白质是抗体、抗体片段、其生物活性部分和/或其特征部分。

重组蛋白质和重组多肽：本文所用的这些术语是指由宿主细胞表达的多肽，其中所述宿主细胞已经过遗传工程改造以表达所述多肽。在一些实施方案中，重组蛋白质可以在来源于动物的宿主细胞中表达。在一些实施方案中，重组蛋白质可以在来源于昆虫的宿主细胞中表达。在一些实施方案中，重组蛋白质可以在来源于酵母菌的宿主细胞中表达。在一些实施方案中，重组蛋白质可以在来源于原核生物的宿主细胞中表达。在一些实施方案中，重组蛋白质可以在来源于哺乳动物的宿主细胞中表达。在一些实施方案中，重组蛋白质可以在来源于人类的宿主细胞中表达。在一些实施方案中，重组表达的多肽可以与通常在宿主细胞中表达的多肽相同或相似。在一些实施方案中，重组表达的多肽对于宿主细胞可以是外来的，即与通常在宿主细胞中表达的肽异源。或者，在一些实施方案中，重组表达的多肽可以是嵌合体，其中所述多肽的部分包含与通常在宿主细胞中表达的多肽相同或相似的氨基酸序列，而其它部分对于宿主细胞来说是外来的。

替代酶：如本文所用，术语“替代酶”是指可以用来至少部分替代欲治疗的疾病中缺乏或缺失的酶的任何酶。在一些实施方案中，术语“替代酶”是指可以用来至少部分替代欲治疗的溶酶体贮积病中缺乏或缺失的溶酶体酶的任何酶。在一些实施方案中，替代酶能够减少哺乳动物溶酶体中的积累物质，或者可以挽救或改善一种或多种溶酶体贮积病症状。适用于本发明的替代酶包括野生型或修饰的溶酶体酶，并且可以使用重组和合成方法产生或由天然来源纯化。替代酶可以是重组、合成、基因活化或天然的酶。

受试者：如本文所用，术语“受试者”意指任何哺乳动物，包括人类。在本发明的某些实施方案中，受试者是成人、青少年或婴幼儿。本发明还涵盖施用药物组合物和/或实施子宫内治疗方法。

基本上：如本文所用，术语“基本上”是指展现总体或接近总体范围或程度的目标特征或特性的定性情况。生物领域的普通技术人员将了解生物和化学现象很少(如果曾发生)达到完全和/或进行至完全或达成或避免绝对结果。因此，本文使用术语“基本上”来获得在许多生物现象和化学现象中固有的潜在完全性缺乏。在一些实施方案中，短语“基本上纯的”或“基本上纯化的”是指基本上不含污染的内源性物质的蛋白质(天然或重组)，所述污染的内源性物质例如像其它蛋白质、脂质、碳水化合物、核酸和在天然环境与之相关联的其它生物物质。例如，基本上纯的分子以干重计，可以为至少约60％，优选约70％、80％、90％、95％或99％的目标分子。

治疗：如本文所用，术语“治疗”(还有“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指部分或完全减轻、改善、缓解、抑制特定疾病、病症和/或病状(例如，圣菲力浦综合征)的一种或多种症状或特征、延迟其发作、降低其严重程度和/或减少其发生率的治疗性蛋白质(例如，溶酶体酶)的任何施用。这种治疗可以用于未显示相关疾病、病症和/或病症的体征的受试者，和/或仅表现出疾病、病症和/或病症的早期体征的受试者。或者或另外，这种治疗可以用于显示相关疾病、病症和/或病症的一种或多种已确立体征的受试者。

发明详述

本发明特别提供用于生产允许更有效的用于治疗溶酶体贮积病的酶替代疗法的重组溶酶体酶(即，乙酰肝素N-硫酸酯酶蛋白质)的改进的方法和组合物。在一些具体实施方案中，溶酶体酶是乙酰肝素N-硫酸酯酶，并且所述方法和组合物允许更有效地治疗A型圣菲力浦综合征。本发明包括以下发现：可以使用毛细管区带电泳通过确定重组酶的电荷和/或聚糖分布来在商业产品期间精确表征重组酶(即,乙酰肝素N-硫酸酯酶)。根据本发明的溶酶体酶表征允许重组蛋白质异质性的标准化和商业产品的优化。由于酶组合物的很多特征可以不利地影响酶活性，因此本发明允许更有效地大规模生产生物活性重组溶酶体酶蛋白质。虽然重组HNS在实施例中展示，但是本文所述的各种创新方法和组合物可适用于其它溶酶体酶。

本发明的各种方面在以下章节中更详细地描述。所述章节的使用并不意味着限制本发明。每个章节将适用于本发明的任何方面。在本申请中，除非另外陈述，否则使用“或”意指“和/或”。

溶酶体酶

可以使用本发明来描绘和/或表征任何与溶酶体贮积病相关联的酶。特别的是，本发明可以用于在商业制造期间表征重组产生的溶酶体酶。根据本发明，当靶向溶酶体时，溶酶体酶意欲涵盖适用于治疗溶酶体贮积病的任何酶或蛋白质。作为非限制性实例，特别适合的溶酶体酶为乙酰肝素N-硫酸酯酶(HNS)蛋白质，其在A型圣菲力浦综合征中是缺乏的。另外的示例性溶酶体酶在表2中示出。

乙酰肝素N-硫酸酯酶(HNS)

如本文所用，HNS蛋白质是可以替代天然存在的乙酰肝素N-硫酸酯酶(N-磺基葡糖胺解硫酶)蛋白质的至少部分活性或挽救与HNS缺乏和A型圣菲力浦综合征有关的一种或多种表型或症状的任何蛋白质或蛋白质的部分。如本文所用，术语“HNS酶”和“HNS蛋白质”以及语法等价物可以互换使用。

通常，人类HNS蛋白质以前体形式产生。人类HNS的前体形式包含信号肽(全长前体的氨基酸残基1-20)和链(全长前体的氨基酸残基21-502)。通常，前体形式也称为包含502个氨基酸的全长前体或全长HNS蛋白质。信号肽已经被移除的成熟形式的氨基酸序列(SEQIDNO:2)和典型野生型或天然存在的人类HNS蛋白质的全长前体(SEQIDNO:3)在表1中示出。信号肽有下划线。

表1.人类乙酰肝素N-硫酸酯酶(N-磺基葡糖胺解硫酶)

在一些实施方案中，HNS酶是成熟人类HNS蛋白质(SEQIDNO:1)。如本文所公开的，SEQIDNO:1代表人类HNS蛋白质的经典氨基酸序列。在一些实施方案中，HNS蛋白质可能是由在HNS基因的5’UTR内的替代起始位点进行转录所产生的SEQIDNO:1的剪接同工型和/或变体。在一些实施方案中，合适的替代酶可以是成熟人类HNS蛋白质的同源物或类似物。例如，与野生型或天然存在的HNS蛋白质(例如，SEQIDNO:1)相比，成熟人类HNS蛋白质的同源物或类似物可以是包含一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入的修饰的成熟人类HNS蛋白质，同时保持大部分HNS蛋白质活性。因此，在一些实施方案中，适合于本发明的替代酶与成熟人类HNS蛋白质(SEQIDNO:1)是基本上同源的。在一些实施方案中，适合于本发明的替代酶具有与SEQIDNO:1具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，适合于本发明的替代酶与成熟人类HNS蛋白质(SEQIDNO:1)是基本上相同的。在一些实施方案中，适合于本发明的替代酶具有与SEQIDNO:1具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，适合于本发明的替代酶包含成熟人类HNS蛋白质的片段或部分。

或者，HNS酶是全长HNS蛋白质。在一些实施方案中，HNS酶可以是全长人类HNS蛋白质的同源物或类似物。例如，与野生型或天然存在的全长HNS蛋白质(例如，SEQIDNO:2)相比，全长人类HNS蛋白质的同源物或类似物可以是包含一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入的修饰的全长人类HNS蛋白质，同时保持大部分HNS蛋白质活性。因此，在一些实施方案中，HNS酶与全长人类HNS蛋白质(SEQIDNO:2)是基本上同源的。在一些实施方案中，适合于本发明的HNS酶具有与SEQIDNO:2具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，适合于本发明的HNS酶与SEQIDNO:2基本上是相同的。在一些实施方案中，适合于本发明的HNS酶具有与SEQIDNO:2具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，适合于本发明的HNS酶包含全长人类HNS蛋白质的片段或部分。如本文所用，全长HNS蛋白质通常包含信号肽序列。

人类HNS蛋白质的同源物或类似物可以根据用于改变多肽序列的方法来制备，所述方法为本领域的普通技术人员已知，如在汇编这些方法的参考文献中所发现。在一些实施方案中，氨基酸的保守取代包括在以下群内的氨基酸间进行的取代：(a)M、I、L、V；(b)F、Y、W；(c)K、R、H；(d)A、G；(e)S、T；(f)Q、N；和(g)E、D。在一些实施方案中，“保守氨基酸取代”是指不改变进行氨基酸取代的蛋白质的相对电荷或尺寸特征的氨基酸取代。

在一些实施方案中，HNS酶包含能与细胞表面的受体结合以促进细胞摄取和/或溶酶体靶向的部分。例如，这样的受体可以是结合甘露糖-6-磷酸(M6P)残基的不依赖阳离子的甘露糖-6-磷酸受体(CI-MPR)。另外，CI-MPR还结合其它的蛋白质，包括IGF-II。合适的溶酶体靶向部分可以是IGF-I、IGF-II、RAP、p97及其变体、同源物或片段(例如，包括具有与野生型成熟人类IGF-I、IGF-II、RAP、p97肽序列至少70％、75％、80％、85％、90％或95％相同的序列的那些肽)。在一些实施方案中，M6P残基结合的合适的受体可以是依赖阳离子的。

另外的溶酶体酶

如本文所用，溶酶体酶被理解为包括可以代替天然存在的蛋白质的至少部分活性或挽救与溶酶体贮积病相关的一种或多种表型或症状的任何蛋白质或蛋白质部分。如本文所用，术语“溶酶体酶蛋白质”、“溶酶体蛋白质”，以及“溶酶体酶”是等同的，并且可以互换使用。

本发明可以用于表征任何溶酶体酶，所述溶酶体酶可以用于治疗任何溶酶体贮积病，特别是那些具有CNS病因和/或症状的溶酶体贮积病，包括但不限于，天冬氨酰基葡糖胺尿症、胆固醇酯贮积病、酸性酯酶缺乏症、胱氨酸病、Danon病、Fabry病、Farber脂肪肉芽肿病、Farber病、岩藻糖苷贮积症、I/II型半乳糖唾液酸沉积症、I/II/III型戈谢病、球形细胞脑白质病变、克拉伯病、II型糖原贮积病、庞佩氏病、I/II/III型GM1-神经节苷脂沉积症、I型GM2神经节苷脂沉积症、黑蒙性家族性痴愚、II型GM2-神经节苷脂沉积症、桑德霍夫病、GM2神经节苷脂沉积症、I/II型α-甘露糖苷过多症、β-甘露糖苷过多症、异染性脑白质营养不良、I型粘脂贮积病、I/II型唾液酸贮积症、II/III型粘脂贮积病、I-细胞病、IIIC型粘多糖症假胡尔勒氏多种营养不良、I型粘多糖贮积病、II型粘多糖贮积病、IIIA型粘多糖贮积病、圣菲力浦综合征、IIIB型粘多糖贮积病、IIIC型粘多糖贮积病、IIID型粘多糖贮积病、IVA型粘多糖贮积病、莫尔基奥综合征、IVB型粘多糖贮积病、VI型粘多糖贮积病、VII型粘多糖贮积病、Sly综合征、IX型粘多糖贮积病、多发性硫酸酯酶缺乏症、神经元蜡样脂褐质症、CLN1巴藤病、CLN2巴藤病、A型/B型尼曼-皮克病、C1型尼曼-匹克病、C2型尼曼-匹克病、致密性成骨不全症，I/II型辛德勒病、戈谢病和唾液酸贮积症。

溶酶体贮积病的遗传病因、临床表现和分子生物学的详细回顾详述于Scriver等编辑，TheMetabolicandMolecularBasisofInheritedDisease，第7版，第II卷，McGrawHill，(1995)中。因此，上述疾病的酶缺乏是本领域技术人员已知的，其中的一些列举在下面的表2中：

表2.与溶酶体贮积病相关联的酶

在一些实施方案中，合适的溶酶体酶可以是天然存在的溶酶体酶。在一些实施方案中，合适的溶酶体酶可以是天然存在的溶酶体酶的重组型式。

在一些实施方案中，适用于本发明的溶酶体酶可具有野生型或天然存在的序列。在一些实施方案中，适用于本发明的溶酶体酶可以具有修饰的序列，所述修饰的序列与野生型或天然存在的序列具有显著的同源性或同一性(例如，与野生型或天然存在的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％的序列同一性)。

重组人类HNS的生产

本发明认识到对于通过各种制造方法高水平商业生产生物活性HNS的需要。因为大量的生产因素可以影响翻译后修饰和HNS子序列的体内生物活性，所以本发明公开了通过CZE来表征和生产经过表征的HNS蛋白质的方法。

在某些方面中，本发明可以用于表征通过多种方式生产的重组HNS蛋白质。例如，可以通过利用经过工程改造以表达HNS编码核酸的宿主细胞系统来重组生产HNS蛋白质。本说明书公开的核酸分子指向宽范围的原核和真核细胞和/或细胞系，包括但不限于，来源于细菌菌株、酵母菌株、昆虫细胞、动物细胞、哺乳动物细胞和人类细胞的细胞系。或者，可以通过活化的内源HNS基因来生产HNS蛋白质。

编码HNS的核酸

在一些实施方案中，提供包含编码目标重组基因(本文称为转基因)的核酸序列的核酸分子，如本文多个实施方案中所述的HNS蛋白质。在一些实施方案中，编码转基因的核酸可以被修饰以使得所编码的HNS蛋白质的表达增加，这也称为密码子优化。例如，可以通过改变编码序列的开放阅读框来修饰编码转基因的核酸。如本文所用，术语“开放阅读框”与“ORF”同义，并且意指可能编码蛋白质或蛋白质的部分的任何核苷酸序列。通常开放阅读框开始于起始密码子(在标准密码中表示为例如AUG(用于RNA分子)和ATG(DNA分子中))，并且以密码子三联体阅读直到该框结束于终止密码子(在标准密码中表示为例如UAA、UGA或UAG(用于RNA分子的)和TAA、TGA或TAG(DNA分子中))。如本文所用，术语“密码子”意指核酸分子中在蛋白质合成期间指定具体的氨基酸的三个核苷酸的序列；也称为三联体或密码子三联体。例如，在标准遗传密码中的64个可能的密码子中，两个密码子GAA和GAG编码氨基酸谷氨酰胺，而密码子AAA和AAG指定氨基酸赖氨酸。在标准遗传密码中，三个密码子是终止密码子，它们不指定氨基酸。如本文所用，术语“同义密码子”意指编码单个氨基酸的密码子中的任一个和全部。除了甲硫氨酸和色氨酸以外，氨基酸由二至六个同义密码子编码。例如，在标准遗传密码中，编码氨基酸丙氨酸的四个同义密码子为GCA、GCC、GCG和GCU，指定谷氨酰胺的两个同义密码子为GAA和GAG，以及编码赖氨酸的两个同义密码子为AAA和AAG。

在一些实施方案中，可以使用标准密码子优化方法来修饰编码HNS蛋白质的开放阅读框的核酸。多种用于密码子优化的商业算法是可用的并且可以用于实施本发明。通常，密码子优化不改变所编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，密码子优化可以导致氨基酸改变(如取代、缺失或插入)。通常，这样的氨基酸改变基本上不改变蛋白质活性。编码HNS的示例性核酸序列在SEQIDNO：3中示出。

编码乙酰肝素N-硫酸酯酶(HNS)的示例性核酸序列

ATGAGCTGCCCCGTGCCCGCCTGCTGCGCGCTGCTGCTAGTCCTGGGGCTCTGCCGGGCGCGTCCCCGGAACGCACTGCTGCTCCTCGCGGATGACGGAGGCTTTGAGAGTGGCGCGTACAACAACAGCGCCATCGCCACCCCGCACCTGGACGCCTTGGCCCGCCGCAGCCTCCTCTTTCGCAATGCCTTCACCTCGGTCAGCAGCTGCTCTCCCAGCCGCGCCAGCCTCCTCACTGGCCTGCCCCAGCATCAGAATGGGATGTACGGGCTGCACCAGGACGTGCACCACTTCAACTCCTTCGACAAGGTGCGGAGCCTGCCGCTGCTGCTCAGCCAAGCTGGTGTGCGCACAGGCATCATCGGGAAGAAGCACGTGGGGCCGGAGACCGTGTACCCGTTTGACTTTGCGTACACGGAGGAGAATGGCTCCGTCCTCCAGGTGGGGCGGAACATCACTAGAATTAAGCTGCTCGTCCGGAAATTCCTGCAGACTCAGGATGACCGGCCTTTCTTCCTCTACGTCGCCTTCCACGACCCCCACCGCTGTGGGCACTCCCAGCCCCAGTACGGAACCTTCTGTGAGAAGTTTGGGCAACGGAGAGAGCGGCATGGGTCGTATCCCAGACTGGACCCCCCAGGCCTACGACCCACTGGACGTGCTGGTGCCTTACTTCGTCCCCAACACCCCGGCAGCCCGAGCCGACCTGCCGCTCAGTACACCACCGTCGGCCGCATGGACCAAGGAGTTGGACTGGTGCTCCAGGAGCTGCGTGACGCCGGTGTCCTGAACGACACACTGGTGATCTTCACGTCCGACAACGGGATCCCCTTCCCCAGCGGCAGGACCAACCTGTACTGGCCGGGCACTGCTGAACCCTTACTGGTGTCATCCCCGGAGCACCCAAAACGCTGGGGCCAAGTCAGCGAGGCCTACGTGAGCCTCCTAGACCTCACGCCCACCATCTTGGATTGGTTCTCGATCCCGTACCCCAGCTACGCCATCTTTGGCTCGAAGACCATCCACCTCACTGGCCGGTCCCTCCTGCCGGCGCTGGAGGCCGAGCCCCTCTGGGCCACCGTCTTTGGCAGCCAGAGCCACCACGAGGTCACCATGTCCTACCCCATGCGCTCCGTGCAGCACCGGCACTTCCGCCTCGTGCACAACCTCAACTTCAAGATGCCCTTTCCCATCGACCAGGACTTCTACGTCTCACCCACCTTCCAGGACCTCCTGAACCGCACCACAGCTGGTCAGCCCACGGGCTGGTACAAGGACCTCCGTCATTACTACTACCGGGCGCGCTGGGAGCTCTACGACCGGAGCCGGGACCCCCACGAGACCCAGAACCTGGCCACCGACCCGCGCTTTGCTCAGCTTCTGGAGATGCTTCGGGACCAGCTGGCCAAGTGGCAGTGGGAGACCCACGACCCCTGGGTGTGCGCCCCCGACGGCGTCCTGGAGGAGAAGCTCTCTCCCCAGTGCCAGCCCCTCCACAATGAGCTGTGACCATCCCAGGAGGCCTGTGCACACATCCCAGGCATGTCCCAGACACATCCCACACGTGTCCGTGTGGCCGGCCAGCCTGGGGAGTAGTGGCAACAGCCCTTCCGTCCACACTCCCATCCAAGGAGGGTTCTTCCTTCCTGTGGGGTCACTCTTGCCATTGCCTGGAGGGGGACCAGAGCATGTGACCAGAGCATGTGCCCAGCCCCTCCACCACCAGGGGCACTGCCGTCATGGCAGGGGACACAGTTGTCCTTGTGTCTGAACCATGTCCCAGCACGGGAATTCTAGACATACGTGGTCTGCGGACAGGGCAGCGCCCCCAGCCCATGACAAGGGAGTCTTGTTTTCTGGCTTGGTTTGGGGACCTGCAAATGGGAGGCCTGAGGCCCTCTTCAGGCTTTGGCAGCCACAGATACTTCTGAACCCTTCACAGAGAGCAGGCAGGGGCTTCGGTGCCGCGTGGGCAGTACGCAGGTCCCACCGACACTCACCTGGGAGCACGGCGCCTGGCTCTTACCAGCGTCTGGCCTAGAGGAAGCCTTTGAGCGACCTTTGGGCAGGTTTCTGCTTCTTCTGTTTTGCCCCATGGTCAAGTCCCTGTTCCCCAGGCAGGTTTCAGCTGATTGGCAGCAGGCTCCCTGAGTGATGAGCTTGAACCTGTGGTGTTTCTGGGCAGAAGCTTATCTTTTTTGAGAGTGTCCGAAGATGAAGGCATGGCGATGCCCGTCCTCTGGCTTGGGTTAATTCTTCGGTGACACTGGCATTGCTGGGTGGTGATGCCCGTCCTCTGGCTTGGGTTAATTCTTCGGTGACACTGGCGTTGCTGGGTGGCAATGCCCATCCTCTGCCTTGGGTTAATTCTTCGGTGACACTGGCGTTGCTGGGTGGCGATGCCCGTCCTCTGGCTTGGGTTAATTCTTGGATGACGTCGGCGTTGCTGGGAGAATGTGCCGTTCCTGCCCTGCCTCCACCCACCTCGGGAGCAGAAGCCCGGCCTGGACACCCCTCGGCCTGGACACCCCTCGAAGGAGAGGGCGCTTCCTTGAGTAGGTGGGCTCCCCTTGCCCTTCCCTCCCTATCACTCCATACTGGGGTGGGCTGGAGGAGGCCACAGGCCAGCTATTGTAAAAGCTTTTTATTTTAGTAAAATATACAGAAGTTCTTTTTCTGAAAA(SEQIDNO：3)

在一些实施方案中，核苷酸变化可以改变开放阅读框内的同义密码子以适合在选用于表达HNS的特定异源细胞中发现的内源密码子用法。或者或另外地，核苷酸变化可以改变开放阅读框内的G+C含量以更好地匹配存在于异源宿主细胞中的内源核酸序列中发现的开放阅读框的平均G+C含量。核苷酸变化还可以改变HNS序列中发现的聚单核苷酸区域或内部调控或结构位点。因此，可以预见各种修饰或优化的核苷酸序列，包括但不限于使得HNS蛋白质在原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞中的表达增加的核酸序列。

因此，在一些实施方案中，适合于本发明的编码HNS蛋白质的核酸具有与SEQIDNO:1具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的核苷酸序列。通常，经过修饰的核酸编码具有或不具有氨基酸序列改变的HNS蛋白质。如果有氨基酸改变，那么这样的改变通常基本上不改变HNS蛋白质活性。

表达载体/细胞系

如本申请所述的编码溶酶体酶蛋白质的核酸序列可以在分子水平上克隆(插入)到合适的载体中用于在宿主细胞中增殖或表达。多种表达载体可以用于实施本发明，包括但不限于，原核表达载体、酵母表达载体、昆虫表达载体和哺乳动物表达载体。适合于本发明的示例性载体包括但不限于，基于病毒的载体(例如，基于AAV的载体，基于逆转录病毒的载体，基于质粒的载体)。通常，编码溶酶体酶蛋白质的核酸可操作地连接至各种调控序列或元件。

如本文所用，术语“宿主细胞”是指可以用于产生重组溶酶体酶的细胞。具体来说，宿主细胞适合于大规模产生重组溶酶体酶。合适的宿主细胞可以来源于多种生物体，包括但不限于，哺乳动物、植物、鸟类(例如，禽类系统)、昆虫、酵母和细菌。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，合适的宿主细胞不是内体酸化缺陷型细胞。

哺乳动物细胞系

任何易于进行细胞培养和表达多肽的哺乳动物细胞或细胞类型都可根据本发明而用作宿主细胞。根据本发明可以使用的哺乳动物细胞的非限制性实例包括人类胚肾293细胞(HEK293)、HeLa细胞；BALB/c小鼠骨髓瘤细胞系(NSO/l，ECACC编号：85110503)；人类成视网膜细胞(PER.C6(CruCell，Leiden，TheNetherlands))；经过SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCCCRL1651)；人类胚肾细胞系(293或亚克隆用于悬浮培养的293细胞，Graham等，J.GenVirol.，36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCCCCL10)；中国仓鼠卵巢细胞+/-DHFR(CHO，Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77:4216(1980))；小鼠足细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.，23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1ATCCCCL70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCCCRL-1587)；人类子宫颈癌细胞(HeLa，ATCCCCL2)；犬肾细胞(MDCK，ATCCCCL34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL3A，ATCCCRL1442)；人类肺细胞(W138，ATCCCCL75)；人类肝细胞(HepG2，HB8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT060562，ATCCCCL51)、TRI细胞(Mather等，AnnalsN.Y.Acad.Sci.，383:44-68(1982))；MRC5细胞、FS4细胞和人类肝细胞瘤细胞系(HepG2)。在一些实施方案中，合适的哺乳动物细胞不是内体酸化缺陷型细胞。

另外，根据本发明可以使用任何数量的表达多肽或蛋白质的市售或非市售杂交瘤细胞系。本领域的技术人员将理解杂交瘤细胞系可以具有不同的营养要求和/或可能需要不同的培养条件用于最佳生长和多肽或蛋白质表达，并且需要时将能够修改条件。

非哺乳动物细胞系

任何易于进行细胞培养和表达多肽的非哺乳动物来源的细胞或细胞类型都可根据本发明而用作宿主细胞。可根据本发明使用的非哺乳动物宿主细胞和细胞系的非限制性实例包括来源于以下的细胞和细胞系：酵母中的毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、奥默毕赤酵母、粟酒裂殖糖酵母、酿酒酵母，以及解脂耶氏酵母；昆虫中的草地夜蛾、粉纹夜蛾、黑腹果蝇和烟草天蛾；和细菌中的大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、脆弱拟杆菌、产气荚膜梭状芽胞杆菌、艰难梭菌；以及来自两栖动物的滑爪蟾。

适于附着生长对悬浮生长

在某些实施方案中，宿主细胞是基于在选用于培养细胞的特定条件下的某些优选属性或生长而选择用于产生细胞系。本领域技术人员将理解，这样的属性可以基于已建立的细胞系(即经过表征的市售细胞系)的已知特征和/或性状或通过经验评估而确定。在一些实施方案中，细胞系可以根据其在细胞的饲养层上生长的能力来进行选择。在一些实施方案中，细胞系可以根据其在悬浮液中生长的能力来进行选择。在一些实施方案中，细胞系可以根据其生长为粘附细胞单层的能力来进行选择。在一些实施方案中，这些细胞可以用于任何组织培养容器或任何由合适的附着底物处理的容器。在一些实施方案中，合适的附着底物选自由以下组成的组：胶原蛋白(例如，胶原蛋白I、II、II或IV)、明胶、纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白、纤维蛋白原、BD基质胶^TM、基底膜基质、硫酸皮肤素蛋白聚糖、聚-D-赖氨酸和/或其组合。在一些实施方案中，粘附的宿主细胞可以在特定生长条件下进行选择和修饰以在悬浮液中生长。这种修饰粘附细胞以在悬浮液中生长的方法在本领域中是已知的。例如，通过随时间逐步除去生长培养基中的动物血清，可以对细胞进行调节以便在悬浮培养物中生长。

细胞培养系统和方法

可以使用各种细胞培养基和条件以产生重组溶酶体酶蛋白质。例如，可以在含血清或无血清培养基中产生重组溶酶体酶蛋白质。在一些实施方案中，重组HNS蛋白质在无血清培养基中产生。在一些实施方案中，重组HNS蛋白质在无动物培养基(即缺乏动物来源组分的培养基)中产生。在一些实施方案中，重组HNS蛋白质在化学成分确定的培养基中产生。如本文所用，术语“化学成分确定的培养基”是指基本上所有化学组分都已知的培养基。在一些实施方案中，化学成分确定的培养基不含动物来源的组分，如血清、血清来源的蛋白质(例如，白蛋白或胎球蛋白)以及其它组分。在某些情况下，化学成分确定的培养基包含一种或多种蛋白质(例如，蛋白质生长因子或细胞因子)。在某些情况下，化学成分确定的培养基包含一种或多种蛋白质水解产物。在某些情况下，化学成分确定的培养基是不含蛋白质的培养基，即不含蛋白质、水解产物或未知组成的组分的无血清培养基。

在一些实施方案中，化学成分确定的培养基可以补充有一种或多种动物来源的组分。这种动物来源的组分包括但不限于胎牛血清、马血清、山羊血清、驴血清、人类血清和血清来源的蛋白质如白蛋白(例如，牛血清白蛋白或人类血清白蛋白)。虽然添加血清是合乎需要的，因为它包含诸如维生素、氨基酸、生长因子和激素等成分，但是它还构成可以阻碍重组蛋白质纯化的外源蛋白质的集中来源。因此，在一些实施方案中，合适的培养基是无异源培养基，例如，不含任何牛血清或牛血清来源的组分的培养基。例如，无异源培养基可以包含人类血清白蛋白、人类转铁蛋白、人类胰岛素、和人类脂质中一种或多种。在一些实施方案中，合适的培养基包含耗乏胎球蛋白的血清。可以使用各种本领域已知的各种方法从血清中耗乏胎球蛋白。例如，通过抗体亲和色谱从血清中耗乏胎球蛋白。(参见，例如ToroianD和PricePA，CalcifTissueInt(2008)82:116-126)。在一些实施方案中，合适的培养基不含胎球蛋白。

可以使用多种细胞培养条件以大规模生产重组溶酶体酶蛋白质，包括但不限于，滚瓶培养、生物反应器分批培养和生物反应器补料分批培养。在一些实施方案中，重组溶酶体酶蛋白质是由悬浮培养的细胞产生。在一些实施方案中，重组溶酶体酶蛋白质是由粘附细胞产生。

表达的溶酶体酶蛋白质的纯化

可以使用各种方法来纯化或分离根据本文所述的各种方法产生的溶酶体酶蛋白质。在一些实施方案中，表达的酶分泌至培养基中，并且从而可以去除细胞和其它固体，如通过离心或过滤，例如，作为纯化过程的第一步。或者或另外地，表达的酶与宿主细胞的表面结合。在这个实施方案中，使表达多肽或蛋白质的宿主细胞裂解以进行纯化。可以通过本领域普通技术人员熟知的任何数量的方式来实现哺乳动物宿主细胞的裂解，包括借助于玻璃珠进行物理破坏和暴露于高pH条件下。

可以通过标准方法分离和纯化溶酶体酶蛋白质，包括但不限于，色谱法(例如，离子交换、亲和、尺寸排阻和羟基磷灰石色谱)、凝胶过滤、离心、或差异溶解度、乙醇沉淀或任何其它用于蛋白质纯化的可用技术(参见，例如，Scopes，ProteinPurificationPrinciplesandPractice第2版，Springer-Verlag，NewYork，1987，Higgins，S.J.和Hames，B.D.(编辑)，ProteinExpression：APracticalApproach，OxfordUnivPress，1999，和Deutscher，M.P.，Simon，M.I.，Abelson，J.N.(编辑)，GuidetoProteinPurification：MethodsinEnzymology(MethodsinEnzymologySeries，第182卷)，AcademicPress，1997,均通过引用的方式并入本文)。特别是对于免疫亲和色谱，可以通过使蛋白质与包含针对所述蛋白质产生并且固定于固定支撑物的抗体的亲和柱结合来分离蛋白质。或者，可以通过标准重组技术使亲和标签如流感病毒外壳序列、多聚组氨酸或谷胱甘肽-S-转移酶连接至蛋白质以允许借助于在适当的亲和柱上通过来便利地纯化。可以在任何或所有阶段加入蛋白酶抑制剂如苯基甲基磺酰氟(PMSF)、亮抑蛋白酶肽、胃酶抑素或抑肽酶以便减少或消除多肽或蛋白质在纯化过程中的降解。当细胞必须裂解以便分离和纯化表达的多肽或蛋白质时，蛋白酶抑制剂特别合乎需要。

纯化的溶酶体酶蛋白质的表征

如本申请所述的纯化的溶酶体酶蛋白质可以通过测定若干种生物学特性来表征。如本文所用，术语“生物学特性”是指对应于生物活性和/或功能的化学、生理或分子特征，并且可以因经典核酸或氨基酸序列的添加、缺失和/或修饰而改变(即，增强、减弱、破坏和/或干扰)。在一些实施方案中，可以表征溶酶体酶蛋白质的一种或多种生物学特性以在参考非均质混合物中的其它蛋白质的情况下确定其纯度。

在一些实施方案中，可以通过将未表征的溶酶体酶蛋白质与已知的表征过的参考蛋白质相比较来表征溶酶体酶蛋白质的生物学特性，以确定和/或预测未表征溶酶体酶蛋白质的化学或物理特性。在一些实施方案中，参考蛋白质是市售的标准蛋白质。在一些实施方案中，参考蛋白质是与溶酶体贮积病相关联的纯化的酶。在一些实施方案中，参考蛋白质是纯化的溶酶体酶。在一些实施方案中，参考蛋白质是纯化的重组溶酶体酶。在一些实施方案中，参考蛋白质是使用多种本领域已知的方法中的任一种修饰过的重组溶酶体酶蛋白质，例如但不限于本说明书所述的那些方法。

在一些实施方案中，参考蛋白质是纯化的HNS蛋白质。在一些实施方案中，参考蛋白质是纯化的重组HNS蛋白质。在一些实施方案中，参考蛋白质是使用多种本领域已知的方法中的任一种修饰过的重组HNS蛋白质，例如但不限于本说明书所述的那些方法。

在一些实施方案中，可以表征溶酶体酶蛋白质如HNS的特定生物学特性以评估潜在的制造方法。在一些实施方案中，可以表征溶酶体酶蛋白质以将其生物学特性中的一种或多种与使用相同制造过程产生的另一种溶酶体酶蛋白质的生物学特性相比较。在一些实施方案中，可以表征溶酶体酶蛋白质以将其生物学特性中的一种或多种与使用相同制造过程产生的不同小批的溶酶体酶蛋白质相比较。在一些实施方案中，可以表征溶酶体酶蛋白质以将其生物学特性中的一种或多种与不同制造批次中产生的溶酶体酶蛋白质相比较。在一些实施方案中，可以表征溶酶体酶蛋白质以将其生物学特性中的一种或多种与使用不同制造过程产生的溶酶体酶蛋白质相比较。在一些实施方案中，可以表征溶酶体酶以蛋白质将其生物学特性中的一种或多种与制造的不同阶段期间产生的一种或多种溶酶体酶蛋白质相比较。在一些实施方案中，可以表征溶酶体酶蛋白质以将其生物学特性中的一种或多种与另一种纯化的HNS蛋白质(使用相同或不同制造方法)相比较，用于改变、修饰、监测和/或更改潜在制造过程的目的。

在一些实施方案中，可以表征HNS溶酶体酶蛋白质的生物学特性以预测其在体外执行其已知和/或预测的生物学功能的能力。在一些实施方案中，可以表征溶酶体酶蛋白质的生物学特性以预测其在体外执行其已知和/或预测的生物学功能的能力。在一些实施方案中，可以表征溶酶体酶蛋白质的生物学特性以预测其药理学特性的变化(增加和/或减少)，例如但不限于，药物动力学、药代动力学、生物利用度、体积分布、分解代谢、稳态血清水平和/或清除。在一些实施方案中，可以表征溶酶体酶蛋白质的生物学特性以预测其在体内的细胞摄取。

纯度和浓度

在一些实施方案中，可以根据蛋白质大小、形状或浓度来表征溶酶体酶的纯度。具体地说，可以通过在制造的不同阶段过程中或最终产品中存在的各种杂质(例如，宿主细胞蛋白质或宿主细胞DNA)的水平来测量纯化的重组HNS的纯度。例如，可以通过ELISA或SDS-PAGE来测量溶酶体酶蛋白质的纯度和/或浓度。在一些实施方案中，可以通过任何用于确定蛋白质浓度的本领域已知的合适方法来确定重组溶酶体酶蛋白质的蛋白质浓度。在一些具体实施方案中，通过紫外线吸光度测定法来确定蛋白质浓度。这种吸光度测定通常在约280nm波长(A₂₈₀)下进行。可以使用多种测定对照，特别是，管理机构(如FDA)可接受的那些。

酶活性

还可以通过评估功能和/或生物活性来表征纯化的重组溶酶体酶蛋白质。可以使用本领域已知的方法来确定重组溶酶体酶组合物的酶活性。通常所述方法包括检测N-连接硫酸酯部分从合成底物的移除，这称为硫酸酯释放测定。酶活性测定的一个实例涉及使用离子色谱。这种方法对借助于重组乙酰肝素硫酸酯酶(即，HNS)从底物酶促释放的硫酸根离子的量进行定量。底物可以是天然底物或合成底物。在一些情况下，底物是硫酸肝素、硫酸皮肤素或其功能等价物。在一些实施方案中，可以通过测量从4-甲基伞形酮酰-硫酸酯(4-MUF-硫酸酯)底物去除硫酸酯形成荧光甲基7-羟基香豆素来确定生物活性。在这个实例中，由测试样品产生的荧光信号可以用于使用4-MUF标准物来计算酶活性(以mU/mL计)。将一毫单位的活性定义为在37℃下1分钟内将1纳摩尔的4-MUF-硫酸酯转化成4-MUF所需的酶的量。接着可以通过将酶活性除以蛋白质浓度来计算比活性。

电荷分布

还可以通过与蛋白质相关联的电荷分布来表征纯化的重组溶酶体酶蛋白质。通常，蛋白质电荷分布反映通常存在于蛋白质的表面的残基侧链电荷的型态。如本文所用，术语“电荷分布”是指代表因蛋白质在指定pH下的天然电荷而在指定点从管柱和/或毛细管洗脱的蛋白质的量的一组值。与蛋白质相关联的电荷的差异可以受若干因素影响，例如但不限于蛋白质的翻译后修饰。例如，在糖蛋白(如许多人类溶酶体酶，包括HNS)的情况下，认为电荷变化的结果可归因于带电末端碳水化合物部分，例如唾液酸和甘露糖-6-磷酸(M6P)。不希望受任何理论的限制，认为聚糖键以及分支结构的形状和复杂性可能会影响体内清除、溶酶体靶向、生物利用度、和/或功效。

因此，应理解术语“电荷分布”可以进一步表征为不同电荷相关分类，例如“电荷同工型数目”和“聚糖图”。如本文所用，术语“电荷同工型数目”是指存在于非均质样品中的蛋白质的不同带电型式的数目。例如，在一些实施方案中，使用本文所述的方法通过CZE对重组人类HNS进行表征产生14个不同的峰，各自对应于不同的电荷同工型。

在一些实施方案中，使用毛细管区带电泳确定纯化的溶酶体酶蛋白质的电荷分布。一般来说，将纯化的溶酶体酶蛋白质置于包含平衡至特定pH的缓冲液的毛细管中。施加强电磁场引起朝向阴极的总体流动，其中洗脱速率受若干种变量(例如pH、缓冲液组成和缓冲强度)影响。电渗流引起溶质的总体移动，导致样品基于每种个别分析物的电荷与质量比的分离。高负电荷的(酸性较高的)溶酶体酶蛋白质(即，HNS物质)的洗脱早于低负电荷的(酸性较低的)溶酶体酶蛋白质(即，HNS物质)。

在一些实施方案中，通过CZE使用选自由Tris、硼酸盐、HEPES、磷酸盐、Gly-Gly和/或其组合组成的组的缓冲液确定溶酶体酶蛋白质的电荷分布。在一些实施方案中，通过CZE使用Tris缓冲液来确定HNS蛋白质的电荷分布。在一些实施方案中，通过CZE使用浓度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50mM的缓冲液来确定HNS蛋白质的电荷分布。在一些实施方案中，通过CZE使用浓度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100mM的Tris缓冲液来确定HNS蛋白质的电荷分布。在一些实施方案中，通过CZE使用浓度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100mM的硼酸盐缓冲液来确定HNS蛋白质的电荷分布。在一些实施方案中，通过CZE使用浓度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100mM的HEPES缓冲液来确定HNS蛋白质的电荷分布。在一些实施方案中，通过CZE使用浓度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100mM的磷酸盐缓冲液来确定HNS蛋白质的电荷分布。在一些实施方案中，通过CZE使用浓度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100mM的Gly-Gly缓冲液来确定HNS蛋白质的电荷分布。在一些实施方案中，通过CZE使用浓度为25、50或100mM的Tris缓冲液来确定溶酶体酶蛋白质的电荷分布。在一些实施方案中，通过CZE使用浓度为25mM的Tris缓冲液来确定HNS蛋白质的电荷分布。

在一些实施方案中，通过CZE使用平衡至pH为6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9.0的缓冲液来确定溶酶体酶蛋白质的电荷分布。在一些实施方案中，通过CZE使用pH为6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9.0的Tris缓冲液来确定HNS蛋白质的电荷分布。在一些实施方案中，通过CZE使用pH为6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9.0的硼酸盐缓冲液来确定溶酶体酶蛋白质的电荷分布。在一些实施方案中，通过CZE使用pH为6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9.0的磷酸盐缓冲液来确定HNS蛋白质的电荷分布。在一些实施方案中，通过CZE使用pH为6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9.0的Gly-Gly缓冲液来确定溶酶体酶蛋白质的电荷分布。在一些实施方案中，通过CZE使用pH在7.9和8.11之间的Tris缓冲液来确定溶酶体酶蛋白质的电荷分布。在一些实施方案中，通过CZE使用pH为8.0的Tris缓冲液来确定溶酶体酶蛋白质的电荷分布。

在一些实施方案中，通过CZE使用裸露熔融石英毛细管来确定溶酶体酶蛋白质的电荷分布。在一些实施方案中，通过CZE使用聚乙烯醇毛细管来确定溶酶体酶蛋白质的电荷分布。在一些实施方案中，通过CZE使用长度为50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、115或120cm的毛细管来确定溶酶体酶蛋白质的电荷分布。在一些实施方案中，通过CZE使用长度在50-110cm之间的范围内的毛细管来确定溶酶体酶蛋白质的电荷分布。在一些实施方案中，通过CZE使用长度为72cm的毛细管来确定溶酶体酶蛋白质的电荷分布。在一些实施方案中，通过CZE使用长度为104cm的毛细管来确定溶酶体酶蛋白质的电荷分布。

在一些实施方案中，通过CZE使用i.d.(内径)为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、或60μm的毛细管来确定溶酶体酶蛋白质的电荷分布。在一些实施方案中，通过CZE使用i.d在25-110μm之间的范围内的毛细管来确定溶酶体酶蛋白质的电荷分布。

在一些实施方案中，通过CZE使用5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40kV的电压来确定溶酶体酶蛋白质的电荷分布。在一些实施方案中，通过CZE使用15-30kV之间的电压来确定溶酶体酶蛋白质的电荷分布。在一些实施方案中，通过CZE使用30kV的电压来确定溶酶体酶蛋白质的电荷分布。

在一些实施方案中，通过CZE使用20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50℃的温度来确定溶酶体酶蛋白质的电荷分布。在一些实施方案中，通过CZE使用30℃的温度来确定溶酶体酶蛋白质的电荷分布。

在一些实施方案中，纯化的溶酶体酶蛋白质组合物在其电荷分布中显示至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个不同的电荷同工型峰。在一些实施方案中，纯化的溶酶体酶蛋白质组合物在其电荷分布中显示至少14个不同的电荷同工型峰。HNS的示例性电荷分布描绘于实施例部分和图7中。如图7所示，14个峰以负电荷递增和对色谱图的总峰面积的贡献递减的次序被标记为(1-14)。在一些实施方案中，取决于蛋白质表面上的负电荷或正电荷的量，纯化的重组溶酶体酶蛋白质组合物的电荷分布包含不同数目、尺寸、形状或时间间隔的峰。在一些实施方案中，重组溶酶体酶蛋白质组合物具有包括少于14个(例如，少于5、4、3或2个)峰的电荷分布。通常，如果峰越少，则电荷分布被认为越均匀。

聚糖图

在一些实施方案中，纯化的重组溶酶体酶蛋白质的特征可在于它们的蛋白聚糖组成，通常称为聚糖图。如本文所用，术语“聚糖图”是指在酶促蛋白质裂解后的色谱电荷分离期间产生的蛋白质的特征图或足迹。例如，在一些实施方案中，可以通过在酶促裂解后使用本文所述的方法进行CZE，随后进行HPLC色谱以产生简要聚糖图来对重组溶酶体酶蛋白质进行表征。

可以使用多种酶用于酶促消化，包括但不限于，合适的糖基化酶、肽酶(例如，内肽酶、外肽酶)、蛋白酶、和磷酸酶。在一些实施方案中，合适的酶是碱性磷酸酶。在一些实施方案中，合适的酶是神经氨酸酶。可以通过色谱分析来检测聚糖(例如，磷酸聚糖)。例如，可以通过高效阴离子交换色谱连同脉冲电流检测(HPAE-PAD)或尺寸排阻高效液相色谱(HPLC)来检测磷酸聚糖。根据本领域已知并在本文中公开的方法，可以利用聚糖(例如，磷酸聚糖)的标准曲线来计算由聚糖图上的每个峰表示的聚糖(例如，磷酸聚糖)的量。

在一些实施方案中，根据本发明的溶酶体酶蛋白质例如HNS展现聚糖图，其包含7个峰群，分别指示中性(峰群1)、单唾液酸化(峰群2)、双唾液酸化(峰群3)、单磷酸化(峰群4)、三-唾液酸化(峰群5)，四-唾液酸化(峰群6)和二磷酸化(峰群7)。I2S的示例性聚糖图描绘于图14B中。在一些实施方案中，纯化的重组I2S具有包括少于7个峰群的聚糖图(例如，具有6、5、4、3或2个峰群的聚糖图)。在一些实施方案中，纯化的重组I2S具有多于7个峰群(例如，8、9、10、11、12或更多个)的聚糖图。在一些实施方案中，可以基于与预定参考标准中的相应峰群面积相关的峰群面积来确定对应于每个峰群的聚糖的相对量。多种用于聚糖图的参考标准在本领域中是已知的并且可以用于实施本发明。

药物组合物和施用

纯化的重组溶酶体酶蛋白质可以依照已知方法施用至患有溶酶体贮积病的患者。在一些具体实例中，纯化的HNS蛋白质可以依照已知方法施用至A型圣菲力浦综合征患者。例如，纯化的重组溶酶体酶蛋白质例如HNS可以静脉内、皮下、肌内、肠胃外、透皮或经粘膜(例如，口服或鼻腔施用)递送。

在一些实施方案中，通过静脉内施用将重组溶酶体酶蛋白质或包含重组溶酶体酶蛋白质的药物组合物施用至受试者。

在一些实施方案中，通过鞘内施用将重组溶酶体酶蛋白质或包含重组溶酶体酶蛋白质的药物组合物施用至受试者。如本文所用，术语“鞘内施用”或“鞘内注射”是指注射进脊椎管中(脊髓周围的鞘内空间)。可以使用的多种技术包括但不限于通过头颅钻孔进行的侧脑室注射或脑池或腰穿刺等。在一些实施方案中，根据本发明的“鞘内施用”或“鞘内递送”是指经由腰部区或区域进行的IT施用或递送(即，腰部IT施用或递送)。如本文所用，术语“腰部区”或“腰部区域”是指第三和第四腰椎(下背)之间的区域，以及更广泛地，L2-S1脊柱的区域。

在一些实施方案中，通过皮下(即，皮肤下方)施用将重组溶酶体酶蛋白质或包含重组溶酶体酶蛋白质的药物组合物施用至受试者。出于这种目的，可以使用注射器来注射制剂。然而，可以使用其它用于施用制剂的装置，例如注射装置(例如，Inject-ease^TM和Genject^TM装置)；注射笔(例如，GenPen^TM)；无针装置(例如，MediJector^TM和BioJector^TM)；和皮下贴片递送系统。

在一些实施方案中，可以将鞘内施用与其它施用路径(例如，静脉内、皮下、肌内、肠胃外、透皮或经粘膜(例如，口服或鼻腔施用))结合使用。

本发明涵盖单次以及多次施用治疗有效量的本文所述的重组溶酶体酶蛋白质或包含重组溶酶体酶蛋白质的药物组合物。根据受试者病状的性质、严重性和程度，可以规定的时间间隔来施用重组HNS或包含重组HNS的药物组合物。在一些实施方案中，可以规定的时间间隔(例如，每年一次、每六个月一次、每五个月一次、每三个月一次、两月一次(每两个月一次)、每月一次(每个月一次)、两周一次(每两周一次)、每周、每天或连续不断)定期施用治疗有效量的重组溶酶体酶蛋白质或包含重组溶酶体酶蛋白质的药物组合物。

重组溶酶体酶蛋白质或包含重组溶酶体酶蛋白质的药物组合物可以与生理学上可接受的载剂或赋形剂配制以制备药物组合物。载剂和治疗剂可以是无菌的。制剂应该适合于施用模式。

合适的药学上可接受的载剂包括但不限于水、盐溶液(例如，NaCl)、盐水、缓冲盐水、醇、甘油、乙醇、阿拉伯胶、植物油、苄醇、聚乙二醇、明胶、碳水化合物(如乳糖、直链淀粉或淀粉)、糖(如甘露醇、蔗糖、或其它)、右旋糖、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、芳香油、脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等，以及它们的组合。必要时，药物制剂可与助剂混合(例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、调味剂和/或芳香物质等)，这些助剂不会与活性化合物产生有害反应或干扰其活性。在一些实施方案中，使用适于静脉内施用的水溶性载剂。

必要时，组合物或药剂还可包含少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳液、片剂、药丸、胶囊、持续释放制剂或散剂。组合物还可用传统粘合剂和载剂(如甘油三酯)配制成栓剂。口服制剂可以包括标准载剂如医药级甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。

组合物或药剂可根据常规程序配制为适用于施用至人类的药物组合物。例如，在一些实施方案中，用于静脉内施用的组合物通常是无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，组合物还可以包含增溶剂和局部麻醉剂以减轻注射部位的疼痛。通常，成分被分开供应或以单位剂型混合在一起，例如呈在气密性密封容器如指示活性剂的量的安瓿或药囊中的干燥冻干粉末或无水浓缩物的形式。当组合物欲通过输注施用时，它可以用包含无菌药用级水、盐水或右旋糖/水的输注瓶来分配。在组合物是通过注射施用时，可以提供注射用无菌水或盐水的安瓿以使得成分可以在施用之前混合。

如本文所用，术语“治疗有效量”很大程度上是基于包含在本发明的药物组合物中的治疗剂的总量而确定的。通常，治疗有效量足以达成对受试者有意义的益处(例如，治疗、调节、医治、预防和/或改善潜在的疾病或病状)。例如，治疗有效量可以是足以达成理想的治疗和/或预防效果的量，例如足以调节溶酶体酶受体或它们的活性由此治疗这种溶酶体贮积病或其症状的量(例如，将本发明的组合物施用至受试者后，减少或消除“斑马体”或细胞空泡化的存在或发生)。通常，施用至有需要的受试者的治疗剂(例如，重组溶酶体酶)的量将取决于受试者的特征。这些特征包括受试者的病状、疾病严重性、一般健康状况、年龄、性别和体重。本领域的普通技术人员将能够根据这些和其它相关因素容易地确定合适的剂量。另外，可以任选采用客观和主观测定以鉴定最优的剂量范围。

治疗有效量通常是以可包括多个单位剂量的给药方案来施用。对于任何特定治疗性蛋白质，治疗有效量(和/或有效给药方案内的适当单位剂量)可例如视施用途径、与其它药剂的组合而变化。另外，用于任何特定患者的具体治疗有效量(和/或单位剂量)可取决于多种因素，包括所治疗的病症和病症的严重性；所用具体药剂的活性；所用具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用时间、施用途径和/或所用具体融合蛋白质的排泄或代谢速率；治疗持续时间；以及类似因素，如医学领域中所熟知。

实施例

实施例1.重组HNS的CZE分析的开发

本实施例示出重组HNS蛋白质的CZE分析的初始开发。

化学品和试剂

氢氧化钠溶液(1.0N和0.1N)和超纯水由AgilentTechnologies(Wilmington，DE，USA)提供。三-(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)和三-(羟甲基)氨基甲烷(Tris碱)由Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)供应。通过制备25mM的Tris-HCl和Tris碱原液来制备背景电解质缓冲液(BGE)。使用pH计，使用Tris碱溶液将Tris-HCl的pH调节至pH8。溶液通过0.22um的尼龙或特氟龙过滤器进行过滤并且储存于塑料瓶中。碱性磷酸酶和神经氨酸酶从RocheDiagnostics购买。

样品制备

人类乙酰肝素-N-硫酸酯酶(HNS)在人类纤维肉瘤细胞系中产生。通过多个色谱分析步骤的组合获得纯化的HNS批次。蛋白质在5mM磷酸钠、145mM氯化钠，pH7.0中配制成浓度为15mg/mL。在CZE分析前，将样品在0.1XBGE中稀释至约1mg/mL。每个电泳图上的负峰值标记代表具有零净电荷的溶质迁移的位置的电渗流(EOF)突破。这通过使用异丙叉丙酮作为迁移至相同位置(数据未显示)的中性标志物来证实。

CZE条件

CZE在配备光电二极管阵列检测器和来自AgilentTechnologies(Wilmington，DE，USA)的ChemStation软件的Agilent7100仪器上进行。裸露熔融石英毛细管柱(104cmx50μmid，L＝112.5cm)由AgilentTechnologies(Wilmington，DE，USA)供应。在首次使用前，毛细管用1.0N的NaOH冲洗1小时，用水冲洗5分钟，然后用pH8.0的25mMTris(BGE)冲洗10分钟。毛细管在BGE中保存过夜以提供最优迁移时间精确度。通过在50mbar的压力下加压注射2sec将样品引入毛细管的阳极末端。电压为+30kV，产生约8μA的电流。毛细管温度为30℃。检测波长为200nm且带通为8nm。不使用参考波长。以<0.006min(0.062sec的响应时间和40Hz)的峰宽度收集数据。注射之间，毛细管用水冲洗0.5min，用0.1NNaOH冲洗3min，用水冲洗0.5min，并且用BGE冲洗6min。对于每个样品，对单一制剂进行3次分开的注射。通过将峰的绝对面积除以全部十四个峰的总绝对面积来计算出各峰的相对面积。报告的值由三次注射的平均值组成。制备新的缓冲液制剂用于7个测定中的5个并且使用总共4个不同的毛细管。

重组人类乙酰肝素-N-硫酸酯酶(HNS)在人类纤维肉瘤细胞系中产生，通过多个色谱分析步骤的组合进行纯化，并且在5mM磷酸钠、145mM氯化钠，pH7.0中配制成浓度为15mg/mL。在CZE分析前，样品在0.1XBGEA中稀释至约1mg/ml，通过阴离子交换色谱分析纯化的HNS样品，总共产生7个个别峰。毛细管等电聚焦在3-10的pH梯度范围内产生8个峰(数据未显示)；而毛细管区带电泳在pH为8.0时提供14个离散峰的部分分离(图7)。如图1所显示，传统方法如凝胶等电聚焦缺乏定量识别使用商业制造方法生产的重组蛋白质的天然电荷分布中的离散的，但有时微妙的差异所需要的灵敏度水平。

实施例2.确定峰分离中的实验CZE条件的评估

通过等电聚焦SDS-PAGE确定天然HNS具有在约5.1-6.5范围内的pI(数据未显示)。这个相当广泛的pI范围是糖蛋白(以及通常人类溶酶体酶)常见的特性，并且往往是由翻译后修饰所产生的带电末端碳水化合物部分(如唾液酸和甘露糖-6-磷酸(M6P))的变化的结果。在图7中所示，使用CZE评估HNS的天然电荷分布得到14个离散峰的分离。若干变量，例如pH、缓冲液组成、缓冲液强度和柱长均能影响电荷同工型的分离和解析。因此，检测这些变量中的每一个以确定它们对通过CZE进行的HNS表征的总体影响。此外，使用这种审视来确定测定容忍度和可再现性。

缓冲液组成对峰分离的影响

为确定缓冲液组成对HNS峰分离的影响，使用如上所述的纯化的重组HNS蛋白质，在配备光电二极管阵列检测器和来自AgilentTechnologies(Wilmington，DE，USA)的ChemStation软件的Agilent^TM7100仪器上进行CZE。裸露熔融石英毛细管柱(104cmx50μmid，L＝112.5cm)用1.0NNaOH冲洗1小时，用水冲洗5分钟，然后用pH8.0的25mMTris冲洗10分钟。通过在50mbar的压力下加压注射2sec将样品引入毛细管的阳极末端。电压为+30kV，产生约8μA的电流。毛细管温度为30C。检测波长为200nm且带通为8nm。不使用参考波长。以<0.006min(0.062sec的响应时间)(40Hz)的峰宽度收集数据。注射之间，毛细管用水冲洗0.5min，用0.1NNaOH冲洗3min，并且用水冲洗0.5min。

对于所述实验，使用下述平衡至pH8.0的缓冲液来评估HNS峰分离：25mMTris、15mM硼酸盐、25mM硼酸盐、25mMHEPES、25mMGly-Gly和磷酸盐(表3)。数据表明，在pH8.0下使用Tris缓冲液通过CZE进行的HNS分离得到良好的每个HNS电荷同工型的分离、检测和解析。而HEPES缓冲液和Gly-Gly缓冲液都产生与Tris相当的HNS电荷同工型分离，由于每种缓冲液的紫外吸收在波长为200nm，导致高背景信号检测而减少了检测。硼酸盐和磷酸盐缓冲液都显示出HNS同工型分离水平降低以及峰解析较差。还测试了若干种佐剂进一步增强在25mMTris中电荷同工型分离的能力(数据未显示)。数据表明，添加25mM的氯化钠、尿素、羟乙基纤维素或EDTA至25mMTris缓冲液中降低了峰解析和同工型分离。

表3.不同缓冲液评估的概述

缓冲液浓度对峰分离的影响

基于上述研究结果，进行另外的研究以探讨Tris缓冲液浓度对HNS峰分离的影响。如上所述的纯化的重组HNS使用配备光电二极管阵列检测器和来自AgilentTechnologies(Wilmington，DE，USA)的ChemStation软件的Agilent^TM7100仪器进行CZE。裸露熔融石英毛细管柱(104cmx50μmid，L＝112.5cm)用1.0NNaOH冲洗1小时，用水冲洗5分钟，然后用平衡至pH8.0的所需实验Tris缓冲液浓度冲洗10分钟。通过在50mbar的压力下加压注射2sec将样品引入毛细管的阳极末端。电压为+30kV，产生约8μA的电流。毛细管温度为30℃。检测波长为200nm且带通为8nm。不使用参考波长。以<0.006min(0.062sec的响应时间)(40Hz)的峰宽收集数据。注射之间，毛细管用水冲洗0.5min，用0.1NNaOH冲洗3min，并且用水冲洗0.5min。

对于初始实验，使用下述反应条件在宽pH范围内评估HNS峰分离：100mMTris缓冲液，pH8.0(图2A)；50mMTris缓冲液，pH8.0(图2B)；和25mMTris缓冲液，pH8.0(图2C)。数据表明，在pH8.0下使用Tris缓冲液通过CZE进行HNS分离得到接近25mM缓冲液浓度的电荷同工型的更好分离。如图2A和2B中所指示，在Tris缓冲液浓度大于25mM时，HNS分离减少，导致个别同工型峰分离的解析较差。

基于这些初步发现，进行另外的研究以评估在HNS表征期间较小Tris缓冲液浓度变化的CZE测定容忍度。使用与上所述相同的CZE条件，使用20mM、25mM或30mM的Tris缓冲液通过CZE来分析纯化的重组HNS蛋白质(图3B)。如图3所示出，Tris缓冲液浓度的较小波动仍然提供了稳定的峰分离(B)以及14个不同电荷同工型的明显解析(A)。所述数据强烈表明，使用CZE来确定HNS电荷分布是既稳定又灵敏的方法。此外，这些发现还表明，至少20-30mMTris缓冲液的范围可以用于人类HNS的CZE表征。虽然在20mM下见到解析度有轻微的损失(见早期峰)(图3B)，但是似乎对峰定量没有影响。这些数据表明，在目标缓冲液浓度的20％以内所述方法是稳定的。

pH对峰分离的影响

为确定pH对HNS峰分离的影响，使用如上所述的纯化的重组HNS蛋白质，在配备光电二极管阵列检测器和来自AgilentTechnologies(Wilmington，DE，USA)的ChemStation软件的Agilent^TM7100仪器上进行CZE。裸露熔融石英毛细管柱(104cmx50μmid，L＝112.5cm)在实验所需的pH下用1.0NNaOH冲洗1小时，用水冲洗5分钟，然后用25mMTris冲洗10分钟。通过在50mbar的压力下加压注射2sec将样品引入毛细管的阳极末端。电压为+30kV，产生约8μA的电流。毛细管温度为30C。检测波长为200nm且带通为8nm。不使用参考波长。以<0.006min(0.062sec的响应时间)(40Hz)的峰宽收集数据。注射之间，毛细管用水冲洗0.5min，用0.1NNaOH冲洗3min，并且用水冲洗0.5min。

对于所述实验，在很宽的pH条件范围内评估HNS峰分离：pH8.5(图4A)，pH8.0(图4B)，pH7.5(图4C)和pH7.0(图4D)的Tris缓冲液。这些数据表明，在pH8.0下通过CZE进行HNS分离得到较好的电荷分离，且可分辨的同工型峰的数量最大。这些数据还表明，对于人类HNS，几乎完全没有分离，因为在pH7.0左右达到碱性较强的同工型的pI(图4D)

基于这些初步发现，进行另外的研究以评估在HNS表征期间pH较小变化的CZE测定容忍度。使用与如上所述相同的CZE条件，使用平衡至7.89、8.0或8.11的pH的25mMTris缓冲液通过CZE来分析纯化的重组HNS蛋白质(图5B)。如所示，pH8.0左右的较小波动仍然产生稳定的峰分离(图5B)以及14个不同电荷同工型的明显解析(图5A)。所述数据强烈表明，使用CZE来确定HNS电荷分布是既稳定又灵敏的方法。此外，这些发现还表明，在25mMTris缓冲液中至少7.89-8.11的pH范围可以用于人类HNS的CZE表征。

毛细管组成和长度对峰分离的影响

为确定毛细管组成和长度对HNS峰分离的影响，使用如上所述的纯化的重组HNS蛋白质，在装备有光电二极管阵列检测器和来自AgilentTechnologies(Wilmington，DE，USA)的ChemStation软件的Agilent^TM7100仪器上进行CZE。长度为72或104cm的聚乙烯醇(PVA)或裸露熔融石英毛细管柱(104cmx50μmid)用1.0NNaOH冲洗1小时，水冲洗5分钟，并且然后用pH8.0的25mMTris冲洗10分钟。通过在50mbar压力下加压注射2sec将样品引入毛细管的阳极末端。电压为+30kV，产生约8μA的电流。毛细管温度为30C。检测波长为200nm且带通为8nm。不使用参考波长。以<0.006min(0.062sec响应时间)(40Hz)的峰宽收集数据。注射之间，毛细管用水冲洗0.5min，用0.1NNaOH冲洗3min，并且用水冲洗0.5min。

初步实验显示，与裸露熔融石英毛细管柱不同，聚乙烯醇(PVA)涂布的毛细管柱导致14个个别电荷同工型中的每一个的分离水平降低和解析度较差。表明，分离由于蛋白质和管柱的PVA涂层之间的相互作用而延迟，表明对于人类HNS糖形分离，带负电荷的蛋白质和毛细管壁之间的斥力可能对于最佳分离是必不可少的。通常最好使用短的毛细管柱并且优化缓冲液和缓冲添加剂。对于HNS，这种做法是不可能的。因此，评估毛细管长度以帮助优化HNS同工型分离。采用在仪器卡匣中适配的毛细管的最长长度104cm。尽管毛细管长度较长，但是由于稳定的电渗流(EOF)，分离在16min内完成。图6示出在72cm和104cm毛细管上的分离之间的归一化比较。虽然操作时间从约6min增加至14min，但是较长的毛细管上解析度提高，尽管场强度降低。

实施例3.可重复性和精确度

对于本实施例，检查上述CZE方法在表征HNS时的可重复性和精确度，以评估产品开发过程中其用于定量分析和表征重组HNS的天然电荷的异质性的可能性。对于本实施例，通过测量CZE性能(作为迁移时间和相对峰面积的函数)和本方法分辨重组HNS的相似和不同制造小批之间的糖形分布的细微变化的能力来测定可重复性和精确度。

使用重组人类HNS的共同制造小批(小批A)，评估相对峰面积和迁移时间的试验间和日间重复性。三重复试验的试验间重复性如图8所示。因为不管通过时间，有必要比较不同批次的糖形群体，所以计算来自为期四个月的7个三重复独立测量操作的相对和绝对迁移时间(图9)，并显示在表4中。

表4.相对和绝对迁移时间

MT(迁移时间)；RMT(相对迁移时间)

虽然绝对迁移时间(t_m)均小于或等于1％，但是优选相对迁移时间(RMT)(t_m/t_EOF)作为报告的参数。由于峰宽度窄，并且迁移时间相差只有约10sec，因此RMT更好的保证正确的峰识别。RMT在0.3-0.5％的范围内。相对峰面积(峰面积百分比)的精确度示于表3中。相对面积的相对标准偏差(RSD)对于同工型3-12为0.6％至2.8％，对于同工型1和2为4.0％至5％，以及对于同工型13和14为7.4％至23.2％。数据表明同工型1-2和13-14的较高的RSD百分比可能是由于其较低的相对面积。还通过绘制14个HNS同工型中的每一个的总峰面积％对数据进行评价，对于日间比较数据，还进行计算并显示在表5中。图9显示在四个月时间内，总峰面积或14个同工型中的每一个几乎没有变化。总之，这些数据有力地表明，按照上述方法和条件使用CZE，可以用来以精确的和可再现的方式准确地表征HNS糖形。

表5.相对峰面积(％)的精确度

^a根据n＝7分析来计算RSD。在4个月的时间内，每个分析都在不同的日子进行。大多数分析使用新鲜的缓冲液制剂，并在3种不同的毛细管中进行。

实施例4.用于鉴定制造变化的HNS的CZE表征

还进行研究以评估用于使用CZE来进行定量HNS表征的方法，如在人类重组HNS制造期间鉴定糖形和非均质的天然电荷结构。定量、可再现的表征数据的产生可用于监测/优化生产方法，以及根据FDA指导方针来规范商业产品的生产。

小批间变化的表征

对于本实施例，研究上述的CZE方法用于表征HNS，以评估其用于定量分析和表征同一制造过程的不同小批之间重组HNS的天然电荷异质性的可能性。

纯化的重组HNS酶使用相同的下游制造过程在两个独立的制造操作中产生。在装备有光电二极管阵列检测器和来自AgilentTechnologies(Wilmington，DE，USA)的ChemStation软件的Agilent^TM7100仪器上进行毛细管区带电泳。裸露熔融石英毛细管柱(104cmx50μmid，L＝104cm)用1.0NNaOH冲洗1小时，用水冲洗5分钟，并且然后用平衡至pH8.0的25mMTris缓冲液冲洗10分钟。通过在50mbar压力下加压注射2sec将样品引入毛细管的阳极末端。电压为+30kV，产生约8μA的电流。毛细管温度为30℃。检测波长为200nm且带通为8nm。不使用参考波长。以<0.006min(0.062sec响应时间)(40Hz)峰宽收集数据。注射之间，毛细管用水冲洗0.5min，用0.1NNaOH冲洗3min，并且用水冲洗0.5min。

图10A示出每个制造小批的覆盖电泳图(小批1和小批2)。数据表明，虽然相同数量的天然电荷同工型峰存在于这两个制造小批中，但是峰分布或“制造足迹”中存在细微差异。通过计算每个制造小批的相对峰面积(表示为总面积百分比)进一步描绘这些差异(图10B)。比较小批1和小批2的相对峰面积数据以表征参考小批189(图7)，并显示在表6中。

表6.不同HNS小批的相对峰面积(％)的比较

参考小批(HNS制造小批189)、小批1和2(使用相同下游纯化产生的人类重组HNS的两个不同制造小批)

通过使用IEF-SDSPAGE和CZE检查独立的HNS小批的电荷同工型检测水平的差异来测试使用CZE进行HNS表征的分析能力。对于所述实验，测试四个不同的HNS制造小批，每个小批是使用相同的下游纯化方法来制造的。在装备有光电二极管阵列检测器和来自AgilentTechnologies(Wilmington，DE，USA)的ChemStation软件的Agilent^TM7100仪器上进行毛细管区带电泳。裸露熔融石英毛细管柱(104cmx50μmid，L＝104cm)用1.0NNaOH冲洗1小时，用水冲洗5分钟，并且然后用平衡至pH8.0的25mMTris缓冲液冲洗10分钟。通过在50mbar压力下加压注射2sec将样品引入毛细管的阳极末端。电压为+30kV，产生约8μA的电流。毛细管温度为30℃。检测波长为200nm且带通为8nm。不使用参考波长。以<0.006min(0.062sec响应时间)(40Hz)峰宽收集数据。注射之间，毛细管用水冲洗0.5min，用0.1NNaOH冲洗3min，并且用水冲洗0.5min。使用本领域技术人员已知的标准分子生物学技术进行IEF-SDSPAGE。

图11示出与表征过的HNS制造参考标准(RS)相比较的每个制造小批的覆盖电泳图(小批1、2、3和4)。数据表明，虽然相同数量的天然电荷同工型峰存在于这两个制造小批中，但是峰分布或“制造足迹”方面存在差异。通过计算每个制造小批的相对峰面积(表示为总面积百分比)进一步定量确定这些差异并且在表7中示出。

表7.不同HNS小批的相对峰面积(％)的比较

HNSRS(HNS制造小批189)、小批1、2、3和4(使用相同下游纯化产生的人类重组HNS的四个不同制造小批)

使用标准IEF-SDSPAGE未观察到使用CZE显示的HNS天然电荷分布的差异，标准IEF-SDSPAGE测定的解析度较差并且具有主观性(数据未显示)。总之，这些数据表明在HNS表征中使用CZE允许制造小批之间的差异精确量化。因此，这强烈表明，鉴于在表征HNS电荷同工型时CZE的峰分离和解析度特性，所述方法能够辨别非均质HNS群体中的在其它的分析方法中可能不会容易地辨别出的细微差异。

在制造阶段过程中的HNS表征

还检测同一制造过程的不同阶段过程中测定HNS天然电荷同工型的变化的能力。纯化的重组HNS酶在两个独立的制造操作中产生。在下游纯化开始前和在制造过程完成时收集样品。在装备有光电二极管阵列检测器和来自AgilentTechnologies(Wilmington，DE，USA)的ChemStation软件的Agilent^TM7100仪器上进行毛细管区带电泳。裸露熔融石英毛细管柱(104cmx50μmid，L＝104cm)用1.0NNaOH冲洗1小时，用水冲洗5分钟，并且然后用平衡至pH8.0的25mMTris缓冲液冲洗10分钟。通过在50mbar压力下加压注射2sec将样品引入毛细管的阳极末端。电压为+30kV，产生约8μA的电流。毛细管温度为30℃。检测波长为200nm且带通为8nm。不使用参考波长。以<0.006min(0.062sec响应时间)(40Hz)峰宽收集数据。注射之间，毛细管用水冲洗0.5min，用0.1NNaOH冲洗3min，并且用水冲洗0.5min。

图12A和B示出在下游纯化之前(A)及之后(B)的制造小批的覆盖电泳图(小批1和小批2)。数据表明制造过程的不同阶段过程中的HNS的天然电荷分布的差异。这表明CZE可以用于监测制造期间和最终产品中的HNS异质性的变化。这还表明，CZE作为功能性读数，其可用于优化和改进制造步骤以控制成品的HNS电荷分布。

由不同制造过程产生的HNS的表征

还检测与不同制造过程相关联的电荷分布的差异。对于本实验，使用两种不同的下游制造过程来生产纯化的重组HNS酶，其中使用替代缓冲组合物。在装备有光电二极管阵列检测器和来自AgilentTechnologies(Wilmington，DE，USA)的ChemStation软件的Agilent^TM7100仪器上进行毛细管区带电泳。裸露熔融石英毛细管柱(104cmx50μmid，L＝104cm)用1.0NNaOH冲洗1小时，用水冲洗5分钟，并且然后用平衡至pH8.0的25mMTris缓冲液冲洗10分钟。通过在50mbar压力下加压注射2sec将样品引入毛细管的阳极末端。电压为+30kV，产生约8μA的电流。毛细管温度为30℃。检测波长为200nm且带通为8nm。不使用参考波长。以<0.006min(0.062sec响应时间)(40Hz)峰宽收集数据。注射之间，毛细管用水冲洗0.5min，用0.1NNaOH冲洗3min，并且用水冲洗0.5min。

图13A示出每个制造的HNS样品的覆盖电泳图(制造方法#1和制造方法#2)。数据表明，HNS制造过程中较小偏差会导致天然电荷分布的可观察到的差异。具体来说，制造方法1产生不同的同工型群体，在图13A中具有两个额外的负电荷峰(表示为“X”和“Y”)；并且当根据计算出的相对峰面积(表示为总面积百分比)绘制时在图13B中作为“pkx”和“pky”。通过比较每个不同的制造样品(Man.Pro.1和Man.Pro.2)的计算相对峰面积来表达这些可量化的差异，以表征参考制造小批189(图7)，并显示在表8中。

表8.由不同制造过程产生的HNS的相对峰面积(％)的比较

参考制造过程(Ref.Man.)、制造过程#1(Man.Pro.1)和制造过程#2(Man.Pro.2)

实施例5.重组HNS的聚糖分布

为确定观察到的电荷异质性的基础是否归因于糖基化，对分别使用释放唾液酸和磷酸的酶神经氨酸酶和/或磷酸酶预处理的样品进行CZE(图14)。用两种酶的组合进行处理显著减少电泳图的复杂性，其中主峰和若干次要峰都迁移接近EOF标志物，预计这是归因于负电荷的去除。

接下来，产生重组HNS的简要聚糖图。对于本实验，在0.5％SDS存在下在100℃下使HNS蛋白质变性3-4min，随后用N-糖苷酶F(prozyme，SanLeandro，CA)使聚糖酶促释放。将HNS样品在0.9％NP40存在下在37℃下与N-糖苷酶F(30mU/3μL)一起孵育4-6h，随后第二次加入N-糖苷酶F，并且再在37℃下孵育17-19h。使用装备有CarboPacPA-1保护柱的CarboPacPA-1分析柱(Dionex，Sunnyvale，CA)通过高效阴离子交换色谱连同脉冲电流检测(HPAE-PAD)来进行释放聚糖的分离。将聚糖于12mM乙酸钠/100mMNaOH中施加到管柱，随后用45min内100mMNaOH中12-300mM的乙酸钠梯度(6.4mM/min)洗脱。使用1mL/min的流速，并且管柱为环境室温。聚糖以电荷特征递增的顺序洗脱，并且分类为七个不同的峰群。对于人类重组HNS，峰群1由所有不带电荷的聚糖组成，并且峰群2、3和5分别由单唾液酸化、双唾液酸化和三唾液酸化聚糖组成。存在于峰群4和7中的碳水化合物结构分别是具有单M6P基团和双M6P基团的聚糖。峰群6由含有唾液酸和M6P两者的混合聚糖组成。在聚糖图中另外的较小峰的存在可能是由于唾液酸和/或磷酸残基的不完全去除。这些研究结果强烈表明，通过CZE所看到的天然电荷异质性的基础是由于唾液酸和M6P含量的差异。

还进行实验以评估使用不同的制造方法生产的HNS的两个不同小批，所述实验先前显示具有不同的天然电荷同工型分布(图15A)。对于本实验，进行聚糖分析以确认观察到的电荷同工型分布的差异是由于唾液酸和M6P含量的差异。对于本实验，在0.5％SDS存在下在100℃下使来自两个不同制造过程(过程#1和过程#2)的HNS蛋白质变性3-4min，随后用N-糖苷酶F(Prozyme，SanLeandro，CA)进行聚糖的酶促释放。在0.9％NP40存在下将HNS样品与N-糖苷酶F(30mU/3μL)在37℃下一起孵育4-6h，随后第二次加入N-糖苷酶F，并且再在37℃下孵育17-19h。使用装备有CarboPacPA-1保护柱的CarboPacPA-1分析柱(Dionex，Sunnyvale，CA)，通过高效阴离子交换色谱连同脉冲电流检测(HPAE-PAD)来进行释放聚糖的分离。聚糖于12mM乙酸钠/100mMNaOH中施加到管柱，随后用45分钟内100mMNaOH中12-300mM的乙酸钠梯度(6.4mM/min)洗脱。使用1mL/min的流速，并且管柱为环境室温。图15表明，在酶促消化后观察到的同工型电荷分布(图15B、C和D)对于过程1和过程2样品两者是相似的。这表明，通过CZE所看到的在初始天然电荷同工型分布中观察到的任何变化是由于唾液酸和M6P含量的差异。

Claims

1.一种分析乙酰肝素N-硫酸酯酶(HNS)蛋白质的方法，其包括通过毛细管区带电泳来表征HNS蛋白质的电荷分布。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述表征步骤包括通过毛细管区带电泳分离指示电荷变体不存在或存在的峰群的步骤。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述电荷分布包括至少14个峰群。

4.如权利要求2或3所述的方法，其中所述电荷变体与改变量的唾液酸和/或M6P基团的不存在、存在相关联。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述电荷变体与改变量的单唾液酸化、双唾液酸化、三唾液酸化聚糖、单M6P、双M6P基团及其组合的不存在、存在相关联。

6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述表征步骤包括定量地确定每个峰群的相对迁移时间和/或相对峰面积。

7.如权利要求6所述的方法，其中每个峰群的所述相对迁移时间是相对于电渗流(EOF)标志物来确定的。

8.如权利要求6或7所述的方法，其中通过与总峰面积比较的峰面积百分比来计算每个峰群的所述相对峰面积。

9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括确定所述HNS蛋白质的质量。

10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述HNS蛋白质是由哺乳动物细胞产生。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是人类细胞。

12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述HNS蛋白质是大规模生产。

13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括与参照相比，确定所述HNS蛋白质的电荷分布是否存在变化。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述参照是由不同批次生产的HNS蛋白质的电荷分布。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述方法还包括评估批次间电荷变化性的步骤。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述评估批次间电荷变化性的步骤包括比较每个由不同批次生产的HNS蛋白质的相对峰面积相对于峰群的趋势图。

17.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述毛细管区带电泳是在使得较长的迁移时间对应于增加负电荷的物质的条件下进行。

18.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中使用包含Tris的缓冲系统进行所述毛细管区带电泳。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述缓冲系统包含浓度在约20-30mM范围内的Tris。

20.如权利要求18或19所述的方法，其中所述缓冲系统包含浓度为约25mM的Tris。

21.如权利要求18-20中任一项所述的方法，其中所述缓冲系统具有在约7.8-8.2范围内的pH。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述缓冲系统具有约8的pH。

23.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中使用长度在56-112.5cm之间的范围内的毛细管进行所述毛细管区带电泳。

24.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述毛细管具有约72cm或104cm的有效长度。

25.一种制造方法，其包括根据权利要求1-24中任一项所述的方法通过毛细管区带电泳分析大规模制造的乙酰肝素N-硫酸酯酶(HNS)蛋白质的步骤。

26.如权利要求25所述的方法，其中所述制造方法包括基于所述电荷分布的分析来调节制造条件的步骤。

27.如权利要求25所述的方法，其中所述分析步骤在释放一定批量之前进行。

28.一种药物组合物，其包含基本上纯的乙酰肝素N-硫酸酯酶(HNS)蛋白质，所述基本上纯的乙酰肝素N-硫酸酯酶(HNS)蛋白质如通过毛细管区带电泳所确定表征为电荷分布包括至少14个指示所述HNS蛋白质的电荷变体的峰群。

29.如权利要求28所述的药物组合物，其中所述HNS蛋白质的所述电荷变体与改变量的唾液酸和/或M6P基团的不存在、存在相关联。

30.如权利要求29所述的药物组合物，其中所述电荷变体与改变量的单唾液酸化、双唾液酸化、三唾液酸化聚糖、单M6P、双M6P基团及其组合的不存在、存在相关联。

31.如权利要求28-30中任一项所述的药物组合物，其中所述HNS蛋白质是由哺乳动物细胞产生。

32.如权利要求31所述的药物组合物，其中所述哺乳动物细胞是人类细胞。

33.如权利要求28-32中任一项所述的药物组合物，其中所述HNS蛋白质具有与SEQIDNO:1至少70％相同的氨基酸序列

34.如权利要求28-33中任一项所述的药物组合物，其中所述HNS蛋白质具有与SEQIDNO:1相同的氨基酸序列。

35.如权利要求28-34中任一项所述的药物组合物，其中使用包含浓度在约20-30mM范围内的Tris以及pH在约7.5-8.5范围内的缓冲系统进行所述毛细管区带电泳。

36.如权利要求35所述的药物组合物，其中所述缓冲系统包含浓度为约25mM的Tris，并且具有约8.0的pH。

37.一种治疗A型圣菲力浦综合征的方法，其包括向需要治疗的受试者施用如权利要求28-36中任一项所述的药物组合物的步骤。