CN102636547A - 一种基于毛细管区带电泳的寡核苷酸文库分级和评价方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于毛细管区带电泳的寡核苷酸文库分级和评价方法，属于生物分离分析领域。所述方法包括以下步骤：步骤一、将寡核苷酸文库进行毛细管区带电泳，在寡核苷酸文库电泳峰宽时间范围内，按迁移时间分段收集得到次级库；步骤二、将各次级库分别与同种靶分子混合，进行毛细管区带电泳，比较各次级库与靶分子相互作用的强弱，得到与靶分子结合能力最强的次级库。所述分级和评价方法能实现复杂组成的寡核苷酸文库的分级分离，可获得与靶分子结合能力最强的次级库，以该结合能力最强的次级库作为后续CE-SELEX技术的筛选文库，缩小筛选范围，缩短了适配体筛选周期。

Description

一种基于毛细管区带电泳的寡核苷酸文库分级和评价方法

技术领域

本发明涉及一种基于毛细管区带电泳的寡核苷酸文库分级和评价方法，属于生物分离分析领域。

背景技术

寡核苷酸文库是一类含有10¹³-10¹⁵种不同碱基的DNA分子混合物，其中可能含有一种或数种与靶分子具有高特异性，高亲和性结合的DNA分子。核酸适配体(Aptamer)是指通过指数富集配体系统进化(SELEX)技术，从随机寡核苷酸文库中筛选得到的具有高亲和性和特异性的寡核苷酸序列配体。

核酸适配体亲和力高、特异性强、易制备及修饰、其靶分子分布广。目前，SELEX技术筛选核酸适配体的方法主要包括自动化SELEX、消减SELEX、毛细管电泳(CE)-SELEX、加尾SELEX、无引物基因组SELEX、切换SELEX等。

目前，毛细管电泳使分析检测方法从微升水平提升到纳升水平，已成为重要的分离分析技术，在生物、医药以及化工等领域具有广阔的应用前景。基于毛细管电泳分离分析方法的CE-SELEX技术因其快速、高效等特点，使适配体筛选周期缩短至传统SELEX技术的三分之一，大大加快了适配体筛选速度，受到适配体研究学者的青睐。

但是，传统的CE-SELEX技术是将初始的寡核苷酸文库直接与靶分子混合，得到与靶分子结合的DNA序列，再将这部分序列进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，得到的产物为第二轮筛选的文库，然后重复进行。由于寡核苷酸文库容量庞大，使适配体筛选工作量大、耗时长(需要3～4天)，并要进行反复筛选(4～6轮)。因此需要提供一种寡核苷酸文库分级和评价方法，将文库进行分级分离后，找出与靶分子结合能力最强的次级库，再进行CE-SELEX技术，以减少筛选过程的时间和操作步骤。

发明内容

针对传统的CE-SELEX技术工作量大、耗时长，需要进行反复筛选的问题，本发明的目的在于提供一种基于毛细管区带电泳的寡核苷酸文库分级和评价方法，将寡核苷酸文库进行分级分离，并通过毛细管区带电泳在不同迁移时间段收集的次级库与同种靶分子的相互作用，找出与靶分子结合能力最强的次级库，再进行CE-SELEX技术，以减少筛选过程的时间和操作步骤。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种基于毛细管区带电泳的寡核苷酸文库分级和评价方法，步骤如下：

步骤一、将寡核苷酸文库进行毛细管区带电泳，在寡核苷酸文库电泳峰宽时间范围内，按迁移时间分段收集得到次级库；

步骤二、将各次级库分别与同种靶分子混合，进行毛细管区带电泳，比较各次级库与靶分子相互作用的强弱，得到与靶分子结合能力最强的次级库；

其中，毛细管区带电泳所用运行缓冲溶液为毛细管区带电泳领域中通常所使用的pH＞7.0的缓冲溶液。

其中，优选步骤一中，将寡核苷酸文库溶于运行缓冲溶液中制成储备液后，进行毛细管区带电泳，检测得到寡核苷酸文库电泳峰；再将所述储备液进行毛细管区带电泳，在寡核苷酸文库电泳峰宽时间范围内，按迁移时间进行分段收集，分段收集的样品为次级库；

电泳时，将储备液转移至毛细管区带电泳进样瓶中，采用压力进样，使储备液进入毛细管一端；然后加电压进行电泳，使储备液在毛细管内移动，检测得到寡核苷酸文库电泳峰；

优选步骤二中，将各次级库分别与同一种类且浓度相同的靶分子混合，冰上孵育后进行毛细管区带电泳，检测得到各次级库与靶分子混合后的毛细管区带电泳谱图；在毛细管区带电泳谱图中，复合物峰为各次级库中的DNA与靶分子结合产生的峰，游离DNA峰为没有与靶分子结合的各次级库中DNA产生的峰；利用面积归一化法，得到复合物的校正峰面积和游离DNA的校正峰面积，进一步计算复合物校正峰面积/(复合物校正峰面积+游离DNA校正峰面积)的百分比，简称为复合物校正峰面积百分比，比较不同次级库与同种靶分子相互作用的强弱，得到与靶分子结合能力最强的次级库。

其中，所用靶分子的浓度通过生物分析领域常规技术手段进行选择。

优选在步骤一中，将次级库收集在稀释10倍的运行缓冲液中。

优选在步骤一中，储备液中的寡核苷酸文库浓度为20μM。

优选在步骤一中，靶分子为牛凝血酶时，运行缓冲溶液为硼酸根离子浓度为80mM，pH＝8.0的硼酸-硼砂缓冲溶液。

优选在步骤二中，冰上孵育时间为0.5～2h。

在步骤一和步骤二的毛细管区带电泳中，所用毛细管的管长和管径根据靶分子自身性质选择；优选靶分子为牛凝血酶时，所述毛细管为石英熔融毛细管，外包硅胶层，毛细管内径75μm，总长度50.2cm，检测窗口边长为0.2cm，窗口距离出样端10cm。

优选进行毛细管区带电泳时的温度为15℃。

优选毛细管区带电泳采用加压进样，进样压力为0.5psi，进样时间为5s，电泳电压为10kV，采用正向电压。

优选对毛细管区带电泳结果采用激光诱导荧光进行检测，其中激发波长488nm，发射波长520nm。

优选在步骤一完成后，对收集到的次级库进行验证，验证方法为，将分段收集得到的各次级库分别通过毛细管区带电泳，检测各次级库的出峰时间；

如果出峰时间与分段收集时该次级库在寡核苷酸文库电泳峰中的出峰时间相同，收集成功，接步骤二；

如果出峰时间与分段收集时该次级库在寡核苷酸文库电泳峰中的出峰时间不同，收集失败，重复步骤一。

有益效果

1.在寡核苷酸文库中，各DNA分子所含碱基序列不同，故DNA分子中的A、T、G、C四种碱基含量不同，在不同pH条件下可导致各DNA分子间的荷质比差异；在毛细管区带电泳模式下，荷质比差异导致DNA分子迁移速率的差异，从而表现为迁移时间的差异；在寡核苷酸文库电泳峰宽时间范围内，根据迁移时间对寡核苷酸文库进行分段收集，得到数个次级库，再将各次级库分别与同种靶分子混合，将得到的混合物进行毛细管区带电泳分析，得到与靶分子结合能力最强的次级库，进一步进行CE-SELEX技术得到核酸适配体；所述分级和评价方法能实现复杂组成的寡核苷酸文库的分级分离，可获得与靶分子结合能力最强的的次级库，缩小了CE-SELEX技术的筛选范围，缩短适配体筛选周期；

2.本发明所述分级和评价方法，通过计算靶分子与寡核苷酸结合得到的复合物校正峰面积百分比，评价不同次级库与同种靶分子作用的强弱，数据处理方法简单、直观。

附图说明

图1为实施例中的在寡核苷酸文库电泳峰宽时间范围内按迁移时间分段示意图。

图2为实施例中1号库通过激光诱导荧光检测器检测到的毛细管区带电泳谱图。

图3为实施例中收集得到的三个次级库分别与牛凝血酶相互作用的复合物校正峰面积百分比。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明方法做进一步详细说明。

其中，实施例中的毛细管电泳仪为美国Beckman公司的Beckman P/ACEMDQ毛细管电泳仪；

激光诱导荧光检测器(LIF)购自美国Beckman公司；

数据处理软件为32Karat 8.0；

寡核苷酸文库购自生工生物工程(上海)有限公司，为带有荧光标记的随机寡核苷酸文库，文库两段各有20个碱基的固定序列，中间含40个随机碱基的序列，总长80个碱基，碱基序列为5′-FAM-AGCAGCACAGAGGTCAGATG(40N)CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3′。

实施例

一种基于毛细管区带电泳的寡核苷酸文库分级和评价方法，步骤如下：

步骤一、

(1)将寡核苷酸文库溶于运行缓冲溶液中，制成寡核苷酸文库浓度为100μM的储备液1，在-20℃下保存备用；再将储备液1稀释成浓度为20μM的储备液2；

其中，毛细管区带电泳所用毛细管为石英熔融毛细管，外包硅胶层，毛细管内径75μm，总长度50.2cm，检测窗口边长为0.2cm，窗口距离出样端10cm；将毛细管依次用0.1M NaOH溶液、水和运行缓冲溶液各冲洗3min；冲洗完成后，将储备液2转移至毛细管区带电泳进样瓶中，采用压力进样，使储备液2进入毛细管一端；然后加电压进行电泳，使储备液2在毛细管内移动，并通过激光诱导荧光检测器，在激发波长488nm，发射波长520nm下检测得到如图1所示的寡核苷酸文库电泳峰；

对储备液2进行毛细管区带电泳，在所述寡核苷酸文库电泳峰宽时间范围内，按迁移时间将电泳峰分为三段收集电泳产物，得到三个次级库，并将其分别置于稀释10倍的运行缓冲液中，如图1所示，其中黑色竖直的线代表分段的时间点，分别按先后顺序标记为1、2、3号库，其中1号库对应的迁移时间段为13.4～13.9min，2号库对应的迁移时间段为13.9～14.3min，3号库对应的迁移时间段为14.3～14.8min；所述1、2、3号库为次级库；

其中，所述运行缓冲溶液为硼酸根离子浓度为80mM，pH＝8.0的硼酸-硼砂缓冲溶液；

(2)将1、2、3号库分别通过毛细管区带电泳，检测1、2、3号库的出峰时间；

如果出峰时间与分段收集时该次级库在寡核苷酸文库电泳峰中的出峰时间相同，收集成功，接步骤二；

如果出峰时间与分段收集时该次级库在寡核苷酸文库电泳峰中的出峰时间不同，收集失败，重复步骤一；

经检测，1、2、3号库的出峰时间均与该次级库在寡核苷酸文库电泳峰中的出峰时间相同，得知收集成功。

步骤二、将收集成功的各次级库分别与溶解在纯净水中、浓度为3μM的牛凝血酶混合，冰上孵育0.5h后，进行毛细管区带电泳，通过激光诱导荧光检测器，在激发波长488nm，发射波长520nm下得到毛细管区带电泳谱图；其中，图2为1号库的毛细管区带电泳谱图，复合物峰为1号库中的DNA与靶分子结合产生的峰，游离DNA峰为1号库中没有与靶分子结合的DNA产生的峰；采用数据处理软件，通过面积归一化法，得到复合物的校正峰面积和游离DNA的校正峰面积，其中校正峰面积＝峰面积/迁移时间；进一步计算复合物校正峰面积/(复合物校正峰面积+游离DNA校正峰面积)，即为1号库复合物校正峰面积百分比；采用与计算1号库复合物校正峰面积百分比相同的方法，对2、3号库的毛细管区带电泳谱图进行计算，得到2、3号库复合物校正峰面积百分比，如图3所示，可知1号库与牛凝血酶产生的复合物最多，接近15％；2号库最少，小于6％；二者产生复合物的含量相差约2.5倍，说明1号库与牛凝血酶的结合能力最强，从1号库中筛选得到牛凝血酶适配体的几率相对最大。可对1号库进行CE-SELEX技术，筛选得到牛凝血酶适配体。

在步骤一和步骤二中，进行毛细管区带电泳时的温度为15℃；毛细管电泳采用加压进样，进样压力为0.5psi，进样时间为5s，电泳电压为10kV；采用正向电压。

综上所述，以上仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于毛细管区带电泳的寡核苷酸文库分级和评价方法，其特征在于：步骤如下：

步骤一、将寡核苷酸文库进行毛细管区带电泳，在寡核苷酸文库电泳峰宽时间范围内，按迁移时间分段收集得到次级库；

步骤二、将各次级库分别与同种靶分子混合，进行毛细管区带电泳，比较各次级库与靶分子相互作用的强弱，得到与靶分子结合能力最强的次级库；

其中，毛细管区带电泳所用运行缓冲溶液为毛细管区带电泳领域中所用的pH＞7.0的缓冲溶液。

2.根据权利要求1所述的一种基于毛细管区带电泳的寡核苷酸文库分级和评价方法，其特征在于：步骤一中，将寡核苷酸文库溶于运行缓冲溶液中制成储备液后，进行毛细管区带电泳，检测得到寡核苷酸文库电泳峰；再将所述储备液进行毛细管区带电泳，在寡核苷酸文库电泳峰宽时间范围内，按迁移时间进行分段收集，分段收集的样品为次级库。

3.根据权利要求1所述的一种基于毛细管区带电泳的寡核苷酸文库分级和评价方法，其特征在于：步骤二中，将各次级库分别与同一种类且浓度相同的靶分子混合，冰上孵育后进行毛细管区带电泳，检测得到各次级库与靶分子混合后的毛细管区带电泳谱图；在毛细管区带电泳谱图中，复合物峰为各次级库中的DNA与靶分子结合产生的峰，游离DNA峰为没有与靶分子结合的各次级库中DNA产生的峰；利用面积归一化法，得到复合物的校正峰面积和游离DNA的校正峰面积，进一步计算复合物校正峰面积/(复合物校正峰面积+游离DNA校正峰面积)的百分比，比较不同次级库与同种靶分子相互作用的强弱，得到与靶分子结合能力最强的次级库。

4.根据权利要求1所述的一种基于毛细管区带电泳的寡核苷酸文库分级和评价方法，其特征在于：靶分子为牛凝血酶时，运行缓冲溶液为硼酸根离子浓度为80mM，pH＝8.0的硼酸-硼砂缓冲溶液。

5.根据权利要求1所述的一种基于毛细管区带电泳的寡核苷酸文库分级和评价方法，其特征在于：靶分子为牛凝血酶时，毛细管区带电泳中所用毛细管为石英熔融毛细管，外包硅胶层，毛细管内径75μm，总长度50.2cm，检测窗口边长为0.2cm，窗口距离出样端10cm。

6.根据权利要求2所述的一种基于毛细管区带电泳的寡核苷酸文库分级和评价方法，其特征在于：储备液中的寡核苷酸文库浓度为20μM；将次级库收集在稀释10倍的运行缓冲液中。

7.根据权利要求3所述的一种基于毛细管区带电泳的寡核苷酸文库分级和评价方法，其特征在于：冰上孵育时间为0.5～2h。

8.根据权利要求1、2或3任一项所述的一种基于毛细管区带电泳的寡核苷酸文库分级和评价方法，其特征在于：进行毛细管区带电泳时的温度为15℃；毛细管区带电泳采用加压进样，进样压力为0.5psi，进样时间为5s，电泳电压为10kV，采用正向电压。

9.根据权利要求1、2或3任一项所述的一种基于毛细管区带电泳的寡核苷酸文库分级和评价方法，其特征在于：对毛细管区带电泳结果采用激光诱导荧光进行检测，其中激发波长488nm，发射波长520nm。

10.根据权利要求1或2所述的一种基于毛细管区带电泳的寡核苷酸文库分级和评价方法，其特征在于：在步骤一完成后，对收集到的次级库进行验证，验证方法为，将分段收集得到的各次级库分别通过毛细管区带电泳，检测各次级库的出峰时间；

如果出峰时间与分段收集时该次级库在寡核苷酸文库电泳峰中的出峰时间相同，收集成功，接步骤二；

如果出峰时间与分段收集时该次级库在寡核苷酸文库电泳峰中的出峰时间不同，收集失败，重复步骤一。

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