CN111575275A - 泰乐菌素适配体和替米考星适配体的毛细管电泳筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物分离技术领域，具体涉及一种用于泰乐菌素适配体和替米考星适配体筛选的毛细管电泳方法。对泰乐菌素和替米考星与随机单链寡核苷酸文库混合孵育后的溶液分别进行毛细管电泳分离，利用单链寡核苷酸分别与泰乐菌素和替米考星结合所形成的两种复合物与游离单链寡核苷酸之间的淌度差异可使两种复合物分别与游离单链寡核苷酸分离。在电泳开始后的0‑5min之间可以分别有效收集与泰乐菌素和替米考星结合的单链寡核苷酸。将其分别作为次级文库再次筛选，经过仅2轮筛选即可分别得到对泰乐菌素和替米考星具有高亲和力的两种适配体。
Description
技术领域
本发明涉及生物分离技术领域，具体涉及一种用于泰乐菌素适配体和替米考星适配体筛选的毛细管电泳方法。
背景技术
适配体是单链短脱氧核糖核酸(ssDNA)序列或核糖核酸(RNA)序列，碱基互补配对形成的高级结构能够使其高特异性识别并高亲和性结合特定的靶物质，这种特性使适配体在食品安全检测领域展现了广阔的应用前景。
适配体属于寡核苷酸，碱基组成顺序的随机性使得这类物质数量极其庞大，对于长度为20-220nt的寡核苷酸序列来说，其数量可高达1015个。从如此众多的随机组成序列中将一个或数个对某特定靶标具有高特异性和高亲和性的序列选出是一件十分费时的工作。
传统的适配体筛选方法是指数富集配体系统进化(SELEX)方法，包括使用磁珠、琼脂糖、微孔板等固体载体的方法。这类方法通常将靶标固定在固体载体上，令由大量随机序列构成的初始文库与其孵育一定时间，将结合到载体上的序列洗脱后进行PCR扩增和纯化，得到次级文库；重复这些步骤，直到获得适配体。一般需要经过十几轮的反复筛选才能得到对靶标亲和性足够高的适配体，是一项十分耗时费力的工作。
毛细管电泳方法是在液相中完成靶标与随机序列文库结合的，免除了将靶标固定于固体载体的步骤，以及由此导致靶标构象的可能改变而引起的识别性改变的问题，同时也避免了核酸与载体的非特异性结合导致可能筛选出非特异性序列的问题。毛细管电泳方法分离靶标结合核酸与游离核酸利用的是两者间电泳淌度的差异，在分离并收集到靶标与核酸结合的复合物后，出现了两种后续处理的路径：一种与SELEX相同，进行PCR扩增、纯化后用于下一轮筛选，直至获得适配体；另一种是将上一轮收集复合物中的ssDNA作为次级文库直接进入下一轮筛选，直至最后一轮才对收集得到的ssDNA进行PCR扩增和纯化，然后进行测序。目前这类方法都是在蛋白质大分子靶标的适配体筛选中取得成功，其原因是大分子靶与核酸结合的复合物与游离核酸的淌度差异大，易于分离。对于小分子靶标来说，与核酸结合后的复合物与游离核酸的淌度差异极小，复合物的收集时间点极难确定，尚无用于小分子靶标适配体筛选的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可用于小分子物质泰乐菌素和替米考星适配体筛选的毛细管电泳方法，为高效筛选小分子物质的适配体提供一条可行途径。
具体步骤如下：
1、泰乐菌素适配体和替米考星适配体的毛细管电泳筛选方法，其特征在于：所述的适配体筛选按如下步骤进行：
(1)将45μL浓度100μmol/L经变性处理后的随机ssDNA文库与5μL浓度10g/L的泰乐菌素室温混合孵育30min，或与5μL浓度10g/L的替米考星室温混合孵育30min，形成由泰乐菌素-ssDNA复合物、游离ssDNA和游离泰乐菌素组成的混合物溶液，或形成由替米考星-ssDNA复合物、游离ssDNA和游离替米考星组成的混合物溶液。
(2)将两种混合物溶液分别注入毛细管柱进行分离，均收集电泳开始后0-5min之间从毛细管中流出的溶液。此过程各重复10次，各自合并10次过程收集的电泳流出溶液分别作为次级文库，至此两种适配体筛选的第1轮结束。
(3)各取45μL变性处理后的两种次级文库分别对应与5μL浓度10g/L的泰乐菌素和替米考星室温混合孵育30min，重复步骤(2)，完成第2轮筛选。
(4)分别对第2轮筛选后获得的两种收集溶液进行对称PCR，并对PCR扩增产物分别进行凝胶电泳纯化，纯化后产物分别进行高通量测序。
(5)从各自的测序结果中将出现频率由高至低排列在前7位的序列分别选出作为适配体候选物进行合成，同时合成其各自的互补序列。
(6)分别对合成的各适配体候选物测定解离常数，从中各自选出解离常数最小的适配体候选物，即为最后确定的泰乐菌素适配体和替米考星适配体。
所述随机ssDNA文库是指由两端各22个核苷酸构成的固定引物序列和中间40个核苷酸构成的随机序列组成的寡核苷酸库，即5'-TAG GGA ATT CGT CGA CGG ATC C-N40-CTGCAG GTC GAC GCA TGC GCC G-3'；所述步骤(1)和步骤(3)中的变性处理是指先将文库95℃加热10min，再立即冰浴10min。
所述分离按如下电泳条件进行：熔融石英毛细管，长度60cm，有效长度50cm，内径100μm；运行缓冲液为80mmol/L的硼酸盐缓冲液，pH 9.24；分离电压+20kV；温度25℃；进样压力0.1379MPa，进样时间10s；检测波长190nm。
所述对称PCR按如下扩增条件进行：
(1)向PCR管中加入2μL浓度5μmol/L的上游引物5'-TAG GGA ATT CGT CGA CGGAT、2μL浓度5μmol/L的下游引物CGG CGC ATG CGT CGA CCT G-3'、2μL第2轮收集的溶液和25μL Mix，用去离子水定容至50μL。
(2)PCR期间的预变性温度95℃，持续时间5min；变性温度95℃，持续时间30s；退火温度60℃，持续时间30s；延伸温度72℃，持续时间30s；循环35次；继续延伸温度72℃，持续时间5min。
所述凝胶电泳纯化按如下条件进行：
(1)向琼脂糖凝胶中引入PCR扩增产物100-200μL，分离电压为80V，分离时间为60min。
(2)切84bp处条带，用胶回收试剂盒进行回收。
所述测定解离常数，并从中各自选出解离常数最小的适配体候选物，按如下步骤进行：
(1)取200μL 5g/L的羧基化磁珠混悬液于0.5mL离心管中，用水洗涤3次，并将其分散于200μL水中。加入10g/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和5g/L的N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)各10μL，将离心管放置于垂直混悬仪上室温混悬20min，用水洗去磁珠上过量的EDC和NHS。在磁珠中加入20μL变性后的10μmol/L泰乐菌素适配体候选物互补序列的磷酸盐缓冲溶液(PBS)，室温下振荡反应3h；或在磁珠中加入25μL变性后的10μmol/L替米考星适配体候选物互补序列的PBS，室温下振荡反应3.5h。从反应液中磁分离磁珠，用PBS清洗三次。向磁珠中加入200μL 0.5mol/L pH 8.0的乙醇胺室温反应6h，然后用去离子水洗涤，并将其分散于400μL PBS中，即为泰乐菌素适配体候选物互补序列-磁珠复合物或替米考星适配体候选物互补序列-磁珠复合物，对每一泰乐菌素适配体候选物互补序列或替米考星适配体互补序列重复上述对应步骤。
(2)将浓度为50、100、200、400、800、1000nmol/L的各变性处理后适配体候选物与上述400μL对应的适配体候选物互补序列-磁珠复合物室温孵育2h；磁分离后用结合缓冲液将磁珠冲洗3次，将其再混悬于100μL PBS中；向该混悬液中加入10μL浓度1mg/L的对应靶标泰乐菌素或替米考星，反应15min后磁分离，以1mg/L的对应靶标泰乐菌素或替米考星为空白，测定上清液中ssDNA的浓度。对测定值按方程y＝Bmax×x/(Kd+x)进行非线性拟合，其中y为测得值，x为适配体候选物各溶液配制浓度，Kd为解离常数。
步骤(1)和(2)中的变性处理同样指先将文库95℃加热10min，再立即冰浴10min。
有益效果
现有包括泰乐菌素和替米考星在内的小分子靶物质适配体的筛选都是基于SELEX的筛选方法，需要经过10余轮筛选才能得到适配体，需要数星期时间。毛细管电泳筛选方法在液相中直接完成靶标-ssDNA复合物与游离ssDNA的分离，避免了固定靶标于固体载体的步骤及其对筛选的不利影响，适配体仅经2-4轮筛选即可获得，约1周时间，但目前仅用于大分子靶标适配体的筛选。本发明通过将毛细管电泳开始后的0-5min选为泰乐菌素-ssDNA复合物或替米考星-ssDNA复合物的收集时间窗口，通过仅2轮毛细管电泳筛选，约3天时间就成功得到了泰乐菌素和替米考星的适配体，为小分子靶标适配体的快速筛选提供了捷径，为开发基于适配体的动物性食品中泰乐菌素和替米考星多残留检测的高灵敏方法奠定了稳固基础。和大分子靶标-ssDNA复合物有较为明确的收集时间点不同，小分子靶标-ssDNA复合物极难找到这样的时间点，需要在某个时间段进行收集，这个收集时间段的确定是整个筛选过程得以顺利完成的关键。复合物移动速度和方向与靶标种类有关，也决定着收集时间段的选择，需要经过大量实验方能确定，本发明两种适配体筛选中的收集时间段就是经过大量实验以后才得以确定的。
附图说明
图1为泰乐菌素适配体候选物的非线性拟合曲线
图2为替米考星适配体候选物的非线性拟合曲线
具体实施方式
实施例1
对随机ssDNA文库5'-TAG GGA ATT CGT CGA CGG ATC C-N40-CTG CAG GTC GACGCA TGC GCC G-3'于95℃加热10min，再立即冰浴10min。将5μL浓度10g/L的泰乐菌素与45μL浓度100μmol/L的处理后随机文库室温混合孵育30min，将混合物溶液注入毛细管柱进行分离，电泳条件如下：熔融石英毛细管，长度60cm，有效长度50cm，内径100μm；运行缓冲液为80mmol/L的硼酸盐缓冲液，pH 9.24；分离电压+20kV；温度25℃；进样压力0.1379MPa，进样时间10s；检测波长190nm。收集电泳开始后0-5min之间从毛细管中流出的溶液。此过程重复10次，合并10次过程中收集到的电泳流出溶液作为次级文库，第1轮筛选结束。
对次级文库于95℃加热10min，再立即冰浴10min。将5μL浓度10g/L的泰乐菌素与45μL处理后的次级文库室温混合孵育30min，重复以上分离过程，完成第2轮筛选。
对第2轮筛选后获得的收集溶液按如下条件进行对称PCR：向PCR管中加入2μL浓度5μmol/L的上游引物5'-TAG GGA ATT CGT CGA CGG AT、2μL浓度5μmol/L的下游引物CGGCGC ATG CGT CGA CCT G-3'、2μL第2轮收集溶液和25μL Mix，用去离子水定容至50μL。对其95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s；循环35次；72℃继续延伸5min。
向琼脂糖凝胶中引入200μL的PCR扩增产物，在80V分离电压下电泳分离60min。将凝胶上84bp处条带切下，用胶回收试剂盒进行回收，纯化后产物进行高通量测序。
从测序结果中选出测序出现频率位于前7位的序列作为适配体候选物，如表1所示。合成表1各序列，同时合成它们的互补序列。
表1
取200μL 5g/L的羧基化磁珠混悬液于0.5mL离心管中，用水洗涤3次，并将其分散于200μL水中。加入10g/L的EDC和5g/L的NHS各10μL，将离心管放置于垂直混悬仪上室温混悬20min，用水洗去磁珠上过量的EDC和NHS。在磁珠中加入20μL变性后的10μmol/L泰乐菌素适配体候选物互补序列PBS，室温下振荡反应3h。从反应液中磁分离磁珠，用PBS清洗三次。向磁珠中加入200μL 0.5mol/L pH 8.0的乙醇胺室温反应6h，然后用去离子水洗涤，并将其分散于400μL PBS中，即为泰乐菌素适配体候选物互补序列-磁珠复合物，对每一泰乐菌素适配体候选物互补序列重复上述步骤。
将浓度为50、100、200、400、800、1000nmol/L的各变性处理后适配体候选物与上述400μL对应的适配体候选物互补序列-磁珠复合物室温孵育2h；磁分离后用结合缓冲液将磁珠冲洗3次，将其再混悬于100μL PBS中；向该混悬液中加入10μL浓度1mg/L的泰乐菌素，反应15min后磁分离，以1mg/L的泰乐菌素为空白，测定上清液中ssDNA的浓度。对测定数值按方程y＝Bmax×x/(Kd+x)进行非线性拟合，得到如表2各解离常数Kd值，其中的Ty4即为泰乐菌素最终的适配体。
表2
实施例2
对随机ssDNA文库5'-TAG GGA ATT CGT CGA CGG ATC C-N40-CTG CAG GTC GACGCA TGC GCC G-3'于95℃加热10min，再立即冰浴10min。将5μL浓度10g/L的替米考星与45μL浓度100μmol/L的处理后随机文库室温混合孵育30min，将混合物溶液注入毛细管柱进行分离，电泳条件如下：熔融石英毛细管，长度60cm，有效长度50cm，内径100μm；运行缓冲液为80mmol/L的硼酸盐缓冲液，pH 9.24；分离电压+20kV；温度25℃；进样压力0.1379MPa，进样时间10s；检测波长190nm。收集电泳开始后0-5min之间从毛细管中流出的溶液。此过程重复10次，合并10次过程中收集到的电泳流出溶液作为次级文库，第1轮筛选结束。
对次级文库于95℃加热10min，再立即冰浴10min。将5μL浓度10g/L的替米考星与45μL处理后的次级文库室温混合孵育30min，重复以上分离过程，完成第2轮筛选。
对第2轮筛选后获得的收集溶液按如下条件进行对称PCR：向PCR管中加入2μL浓度5μmol/L的上游引物5'-TAG GGA ATT CGT CGA CGG AT、2μL浓度5μmol/L的下游引物CGGCGC ATG CGT CGA CCT G-3'、2μL第2轮收集溶液和25μL Mix，用去离子水定容至50μL。对其95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s；循环35次；72℃继续延伸5min。
向琼脂糖凝胶中引入200μL的PCR扩增产物，在80V分离电压下电泳分离60min。将凝胶上84bp处条带切下，用胶回收试剂盒进行回收，纯化后产物进行高通量测序。
从测序结果中选出测序出现频率位于前7位的序列作为适配体候选物，如表3所示。合成表3各序列，同时合成它们的互补序列。
表3
取200μL 5g/L的羧基化磁珠混悬液于0.5mL离心管中，用水洗涤3次，并将其分散于200μL水中。加入10g/L的EDC和5g/L的NHS各10μL，将离心管放置于垂直混悬仪上室温混悬20min，用水洗去磁珠上过量的EDC和NHS。在磁珠中加入25μL变性后的10μmol/L替米考星适配体候选物互补序列PBS，室温下振荡反应3.5h。从反应液中磁分离磁珠，用PBS清洗三次。向磁珠中加入200μL 0.5mol/L pH 8.0的乙醇胺室温反应6h，然后用去离子水洗涤，并将其分散于400μL PBS中，即为替米考星适配体候选物互补序列-磁珠复合物，对每一替米考星适配体候选物互补序列重复上述步骤。
将浓度为50、100、200、400、800、1000nmol/L的各变性处理后适配体候选物与上述400μL对应的适配体候选物互补序列-磁珠复合物室温孵育2h；磁分离后用结合缓冲液将磁珠冲洗3次，将其再混悬于100μL PBS中；向该混悬液中加入10μL浓度1mg/L的替米考星，反应15min后磁分离，以1mg/L的替米考星为空白，测定上清液中ssDNA的浓度。对测定数值按方程y＝Bmax×x/(Kd+x)进行非线性拟合，得到如表4各解离常数Kd值，其中的Ti2即为替米考星最终的适配体。
表4
Claims (9)
1.泰乐菌素适配体和替米考星适配体的毛细管电泳筛选方法，其特征在于，对泰乐菌素和替米考星与随机单链寡核苷酸文库混合孵育后的溶液分别进行毛细管电泳分离，利用单链寡核苷酸分别与泰乐菌素和替米考星结合所形成的两种复合物与游离单链寡核苷酸之间的淌度差异可使两种复合物分别与游离单链寡核苷酸分离；在电泳开始后的0-5min之间能够分别有效收集与泰乐菌素和替米考星结合的单链寡核苷酸，将与泰乐菌素和替米考星结合的单链寡核苷酸分别作为次级文库再次采用同样方法筛选；分别对第2轮筛选后获得的两种收集溶液进行对称PCR，并对PCR扩增产物分别进行凝胶电泳纯化，纯化后产物分别进行高通量测序；从各自的测序结果中将出现频率由高至低排列在前7位的序列分别选出作为适配体候选物进行合成，同时合成其各自的互补序列；分别对合成的各适配体候选物测定解离常数，从中各自选出解离常数最小的适配体候选物，即为最后确定的泰乐菌素适配体和替米考星适配体。
2.如权利要求1所述的泰乐菌素适配体和替米考星适配体的毛细管电泳筛选方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)将45μL浓度100μmol/L经变性处理后的随机ssDNA文库与5μL浓度10g/L的泰乐菌素室温混合孵育30min，或与5μL浓度10g/L的替米考星室温混合孵育30min，形成由泰乐菌素-ssDNA复合物、游离ssDNA和游离泰乐菌素组成的混合物溶液，或形成由替米考星-ssDNA复合物、游离ssDNA和游离替米考星组成的混合物溶液；
(2)将两种混合物溶液分别注入毛细管柱进行分离，均收集电泳开始后0-5min之间从毛细管中流出的溶液；此过程各重复10次，各自合并10次过程收集的电泳流出溶液分别作为次级文库，至此两种适配体筛选的第1轮结束；
(3)各取45μL变性处理后的两种次级文库分别对应与5μL浓度10g/L的泰乐菌素和替米考星室温混合孵育30min，重复步骤(2)，完成第2轮筛选；
(4)分别对第2轮筛选后获得的两种收集溶液进行对称PCR，并对PCR扩增产物分别进行凝胶电泳纯化，纯化后产物分别进行高通量测序；
(5)从各自的测序结果中将出现频率由高至低排列在前7位的序列分别选出作为适配体候选物进行合成，同时合成其各自的互补序列；
(6)分别对合成的各适配体候选物测定解离常数，从中各自选出解离常数最小的适配体候选物，即为最后确定的泰乐菌素适配体和替米考星适配体。
3.如权利要求2所述的泰乐菌素适配体和替米考星适配体的毛细管电泳筛选方法，其特征在于，步骤(1)中，所述随机ssDNA文库是指由两端各22个核苷酸构成的固定引物序列和中间40个核苷酸构成的随机序列组成的寡核苷酸库，即5'-TAG GGA ATT CGT CGA CGGATC C-N40-CTG CAG GTC GAC GCA TGC GCC G-3'。
4.如权利要求2所述的泰乐菌素适配体和替米考星适配体的毛细管电泳筛选方法，步骤(1)和步骤(3)中，变性处理是指先将文库95℃加热10min，再立即冰浴10min。
5.如权利要求2所述的泰乐菌素适配体和替米考星适配体的毛细管电泳筛选方法，步骤(2)中，所述分离按如下电泳条件进行：熔融石英毛细管，长度60cm，有效长度50cm，内径100μm；运行缓冲液为80mmol/L的硼酸盐缓冲液，pH 9.24；分离电压+20kV；温度25℃；进样压力0.1379MPa，进样时间10s；检测波长190nm。
6.如权利要求2所述的泰乐菌素适配体和替米考星适配体的毛细管电泳筛选方法，步骤(4)中，所述对称PCR按如下扩增条件进行：
(1)向PCR管中加入2μL浓度5μmol/L的上游引物5'-TAG GGA ATT CGT CGA CGG AT、2μL浓度5μmol/L的下游引物CGG CGC ATG CGT CGA CCT G-3'、2μL第2轮收集的溶液和25μLMix，用去离子水定容至50μL；
(2)PCR期间的预变性温度95℃，持续时间5min；变性温度95℃，持续时间30s；退火温度60℃，持续时间30s；延伸温度72℃，持续时间30s；循环35次；继续延伸温度72℃，持续时间5min。
7.如权利要求2所述的泰乐菌素适配体和替米考星适配体的毛细管电泳筛选方法，步骤(4)中，所述凝胶电泳纯化按如下条件进行：
(1)向琼脂糖凝胶中引入PCR扩增产物100-200μL，分离电压为80V，分离时间为60min；
(2)切84bp处条带，用胶回收试剂盒进行回收。
8.如权利要求2所述的泰乐菌素适配体和替米考星适配体的毛细管电泳筛选方法，步骤(6)中，所述测定解离常数，并从中各自选出解离常数最小的适配体候选物，按如下步骤进行：
(1)取200μL 5g/L的羧基化磁珠混悬液于0.5mL离心管中，用水洗涤3次，并将其分散于200μL水中；加入10g/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和5g/L的N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)各10μL，将离心管放置于垂直混悬仪上室温混悬20min，用水洗去磁珠上过量的EDC和NHS；在磁珠中加入20μL变性后的10μmol/L泰乐菌素适配体候选物互补序列的磷酸盐缓冲溶液(PBS)，室温下振荡反应3h；或在磁珠中加入25μL变性后的10μmol/L替米考星适配体候选物互补序列的PBS，室温下振荡反应3.5h；从反应液中磁分离磁珠，用PBS清洗三次；向磁珠中加入200μL 0.5mol/L pH 8.0的乙醇胺室温反应6h，然后用去离子水洗涤，并将其分散于400μL PBS中，即为泰乐菌素适配体候选物互补序列-磁珠复合物或替米考星适配体候选物互补序列-磁珠复合物，对每一泰乐菌素适配体候选物互补序列或替米考星适配体互补序列重复上述对应步骤；
(2)将浓度为50、100、200、400、800、1000nmol/L的各变性处理后适配体候选物与上述400μL对应的适配体候选物互补序列-磁珠复合物室温孵育2h；磁分离后用结合缓冲液将磁珠冲洗3次，将其再混悬于100μL PBS中；向该混悬液中加入10μL浓度1mg/L的对应靶标泰乐菌素或替米考星，反应15min后磁分离，以1mg/L的对应靶标泰乐菌素或替米考星为空白，测定上清液中ssDNA的浓度；对测定值按方程y＝Bmax×x/(Kd+x)进行非线性拟合，其中y为测得值，x为适配体候选物各溶液配制浓度，Kd为解离常数。
9.如权利要求8所述的泰乐菌素适配体和替米考星适配体的毛细管电泳筛选方法，步骤(1)和(2)中的变性处理同样指先将文库95℃加热10min，再立即冰浴10min。
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