CN108613862A - 一种基于毛细管电泳的双靶同步核酸适配体筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于毛细管电泳的双靶同步核酸适配体筛选方法，属于蛋白质核酸分离分析技术领域。所述方法采用两个靶分子与随机脱氧寡核苷酸文库共同孵育，可以实现两种靶分子在孵育时竞争结合ssDNA形成各自的复合物，并发挥毛细管电泳的高效分离特性，一步分离获得两种ssDNA‑靶分子复合物，省去传统筛选方法所需的额外的负筛步骤，提升筛选效率；经毛细管电泳检测，筛选到的核酸适配体分别与两种靶分子具有高亲和力与特异性结合。

Description

一种基于毛细管电泳的双靶同步核酸适配体筛选方法
技术领域
本发明涉及一种基于毛细管电泳的双靶同步核酸适配体筛选方法，具体地说，涉及一种利用毛细管区带电泳技术同步筛选两种靶分子的高亲和力、特异性核酸适配体的方法，属于蛋白质核酸分离分析技术领域。
背景技术
单链寡核苷酸(single-stranded DNA,ssDNA)或RNA可通过形成发卡、茎环以及G-四链体等二级/三级结构与蛋白质靶分子的空间结构匹配，形成高亲和性和特异性结合。随机脱氧寡核苷酸文库(Random ssDNA library)是一类含有1013～1015种不同碱基的单链DNA分子(ssDNA)混合物，其中可能含有一种或数种能与靶分子具有高特异性，高亲和性结合的ssDNA，即核酸适配体(Aptamer)。核酸适配体可通过指数富集配体系统进化(SELEX)技术，从随机寡核苷酸文库中筛选获得，其特性是靶分子分布广、亲和力高、特异性强、易制备及修饰，无免疫原性等。由于在生物，医药以及分子识别和检测方面有重要的应用价值，目前已经发展出多种核酸适配体的筛选方法，如磁珠法分离法、微流控芯片法、膜分离法、亲和色谱法、微粒展示法及毛细管电泳法等。
毛细管电泳(CE)具有高效、快速以及实验成本低等优点，是新型的微量分离分析技术，用于核酸适配体筛选中分离靶分子—ssDNA复合物与游离ssDNA。在筛选过程中，未结合靶分子的游离ssDNA与结合了靶分子的核酸复合物因在毛细管电泳中具有不同的迁移速率而彼此分离。CE在蛋白质的核酸适配体筛选中有广泛的应用；CE用于SELEX筛选核酸适配体即为CE-SELEX。CE-SELEX可使核酸适配体筛选周期缩短至传统SELEX技术的三分之一，大大提升了筛选效率。
传统的筛选技术，包括CE-SELEX技术，为提升筛选的特异性，需要选择反筛靶标，增加额外的反筛步骤或设计反筛模块，使筛选过程复杂、耗时，样品耗费大。现有发明名称为“毛细管电泳两次在线反应分离复合物和反向筛选的方法”的中国专利申请，将反筛蛋白与靶标蛋白分先后进样至毛细管中，中间由一段电泳缓冲溶液分隔开，再将迁移速率快于反筛蛋白与靶标蛋白的ssDNA进样至毛细管中，ssDNA先与反筛蛋白相互作用完成反筛步骤，再与靶标蛋白相互作用形成复合物，完成一轮筛选。该方法中，反筛蛋白与靶标蛋白没有在同一环境内竞争结合ssDNA，蛋白质的迁移速度需小于ssDNA。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于毛细管电泳的双靶同步核酸适配体筛选方法，所述方法可用于靶分子核酸适配体的高效筛选。
为实现本发明的目的，提供以下技术方案。
一种基于毛细管电泳的双靶同步核酸适配体筛选方法，所述方法步骤如下：
(1)将随机寡聚脱氧核苷酸文库溶液与两种靶分子溶液混合后共同孵育，在孵育体系中，两种靶分子互为反筛靶，竞争结合随机寡聚脱氧核苷酸文库中的ssDNA，形成各自的ssDNA-靶分子复合物，孵育后得到混合物中含有未与两种靶分子结合的游离ssDNA和与两种靶分子结合后的两种ssDNA-靶分子复合物；
(2)将混合物进行毛细管区带电泳，在电泳过程，游离ssDNA与两种ssDNA-靶分子复合物在毛细管中的迁移速率均不同，先后依次通过毛细管末端的检测窗口，可检测和分离得到两种ssDNA-靶分子复合物的峰，并直接收集两种ssDNA-靶分子复合物；
(3)设计用于PCR扩增复合物中ssDNA序列的上游引物和下游引物，经高通量测序及验证后得到分别与两种靶分子特异性结合的ssDNA序列，即核酸适配体。
步骤(1)中：
两种靶分子为蛋白质；
优选两种靶分子摩尔浓度比为1:1
可通过将随机脱氧寡核苷酸文库溶于纯水中制成随机脱氧寡核苷酸文库储备液，将随机脱氧寡核苷酸文库储备液稀释后得到随机脱氧寡核苷酸文库溶液；可将两种靶分子分别溶于纯水中制成两种靶分子溶液。
步骤(2)中：
所述检测窗口为毛细管电泳-激光诱导荧光检测；
所述毛细管的出口端为负极，入口端为正极；
优选所述混合物在毛细管区带电泳时所使用的毛细管为熔融石英毛细管，总长度为50.2cm，有效长度为40cm，内径为75μm；采用Beckman P/ACE MDQ毛细管电泳仪进行所述电泳；电泳缓冲液采用硼酸硼砂溶液，通过50mM的硼砂溶液与20mM的硼酸溶液按体积比为3:2混合得到硼酸硼砂溶液，pH值为8.7；进样条件为：蛋白质进样：0.5psi，5s；分析条件为：分析温度为25℃，分析电压为20kV；毛细管在线反应时采用激光诱导荧光(CE-LIF)检测，检测条件为：激发波长488nm，发射波长520nm。
有益效果
1.本发明提供了一种基于毛细管电泳的双靶同步核酸适配体筛选方法，所述方法采用两个靶分子与随机脱氧寡核苷酸文库共同孵育，可以实现两种靶分子在孵育时竞争结合ssDNA形成各自的复合物，并发挥毛细管电泳的高效性，一步分离获得两种ssDNA-靶分子复合物；
2.本发明提供了一种基于毛细管电泳的双靶同步核酸适配体筛选方法，两个靶分子互为负筛靶，同步进行亲和力筛选与特异性筛选，省去传统筛选方法所需的额外的负筛步骤，提升筛选效率；
3.本发明提供了一种基于毛细管电泳的双靶同步核酸适配体筛选方法，所述方法经1次筛选，仅需1～2天即可完成两种靶分子的核酸适配体筛选；经毛细管电泳检测，筛选到的核酸适配体分别与两种靶分子具有高亲和力与特异性结合。
附图说明
图1为实施例1中靶分子饱和铁转铁蛋白(H-TF)，血小板衍生因子BB(PDGF-BB)与ssDNA的ssDNA-靶分子复合物分离结果。
图2为实施例2中ssDNA-H-TF复合物与ssDNA-PDGF-BB复合物收集与PCR扩增产物凝胶电泳结果。
具体实施方式
为了充分说明本发明的特性以及实施本发明的方式，下面给出实施例。
以下实施例1～3中，荧光标记的随机脱氧寡核苷酸文库(ssDNA40N)为：5'-FAM-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-(N40)-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3'；
40碱基H-TF核酸适配体(AptH1，AptH2)序列依次分别为：5'-FAM-CGAGTAAGCAAAGCACGTTGCTATTTACAGAGATGTCAAG-3'，5'-FAM-GAATAATCGGCGGCCACTATCGCTTCGTTGCCATCGCTTA-3'；
40碱基PDGF-BB核酸适配体(Aptp1，Aptp2)序列依次分别为：
5'-FAM-GCCACATTAGTCTCACCACTACCTGCGTACCTACCGCCGC-3'；
5'-FAM-TTGATGGCAGGTATTGCTAGGTCTACATGGAACTTGTTAA-3'。
饱和铁转帖蛋白(H-Thr)购自Sigma-Aldrich公司；
血小板衍生因子BB(PDGF-BB)购自Biolgend公司；
荧光标记的ssDNA40N与核酸适配体(AptH1，AptH2，Aptp1和Aptp2)序列，购买自生工生物工程有限公司。
熔融石英毛细管购自河北邯郸开发区奥泰克生物科技有限公司。
以下实施例3中常规PCR产物的高通量测序由生工生物工程有限公司完成。
实施例1
原始随机脱氧寡核苷酸文库(ssDNA40N)储备液制备：将购买的晶体状ssDNA40N，经3000转/分离心5min，加入纯水配制成1.0×10-4mol/L的原始ssDNA40N储备液，在94℃金属浴5min后冰上冷却，-20℃保存。
将原始ssDNA40N储备液用纯水稀释得到6.0×10-7mol/L ssDNA40N样品溶液；将原始H-TF晶体粉末用纯水配置得到1.2×10-6mol/L H-TF样品溶液；将原始PDGF-BB蛋白溶液用纯水稀释得到1.2×10-6mol/L PDGF-BB样品溶液。
分别取20μL的H-TF样品溶液，PDGF-BB样品溶液与ssDNA40N样品溶液，混合后，在37℃金属浴共同孵育10min，在孵育体系中，两种靶分子互为反筛靶，竞争结合随机寡聚脱氧核苷酸文库中的ssDNA形成各自的ssDNA-靶分子复合物，孵育后得到混合物中含有未与两种靶分子结合的游离ssDNA和与两种靶分子结合后的两种ssDNA-靶分子复合物；
在毛细管区带电泳时所使用的毛细管为熔融石英毛细管，总长度为50.2cm，有效长度为40cm，内径为75μm；将混合物在Beckman P/ACE MDQ毛细管电泳仪中进样进行所述电泳；电泳缓冲液采用硼酸硼砂溶液，通过50mM的硼砂溶液与20mM的硼酸溶液按体积比为3:2混合得到硼酸硼砂溶液，pH值为8.7；进样条件：0.5psi，5s；电泳分析条件为：时间为10min，分析电压为20kV，分析温度为25℃，毛细管的出口端为负极，入口端为正极，在电泳过程，游离ssDNA与两种ssDNA-靶分子复合物在毛细管中的迁移速率均不同，先后依次通过毛细管末端的检测窗口，可检测和分离得到两种ssDNA-靶分子复合物的峰，并直接收集两种ssDNA-靶分子复合物；毛细管在线反应时采用激光诱导荧光(CE-LIF)检测，检测条件为：激发波长488nm，发射波长520nm；LIF检测器检测结果如图1所示。
图1最下方谱线为ssDNA40N谱线，ssDNA40N在5.3min处产生信号峰；
图1中由下至上第二条为2.0×10-7mol/L ssDNA40N与4.0×10-7mol/L PDGF-BB孵育混合物的谱线，在5.3min处产生信号峰和下方谱线ssDNA40N峰出峰时间一致，所以确定5.3min信号峰为ssDNA40N信号峰，与下方谱线相比，由下至上第二条谱线中的ssDNA40N信号峰降低，并在4.2min处产生了新的信号峰，是由于部分ssDNA40N与PDGF-BB反应生成了ssDNA40N-PDGF-BB复合物，确定4.2min信号峰为ssDNA40N-PDGF-BB复合物峰；
图1中由下至上第三条为2.0×10-7mol/L ssDNA40N与4.0×10-7mol/L H-TF孵育混合物的谱线，在5.3min处产生信号峰和最下方谱线ssDNA40N峰出峰时间一致，所以确定5.3min信号峰为ssDNA40N信号峰，与最下方谱线相比，由下至上第三条谱线中的ssDNA40N信号峰降低，并在3.1min与3.5min处产生了新的信号峰，是由于部分ssDNA40N与H-TF反应生成和ssDNA40N-H-TF复合物，确定3.1min与3.5min信号峰为ssDNA40N-H-TF复合物峰；
图1中最上方为2.0×10-7mol/L ssDNA40N，4.0×10-7mol/L PDGF-BB，4.0×10- 7mol/L H-TF孵育混合物的谱线，在5.3min处产生信号峰和最下方谱线ssDNA40N峰出峰时间一致，所以确定5.3min信号峰为ssDNA40N信号峰，并在3.1min，3.5min，4.2min处分别产生了新的信号峰。在4.2min处产生信号峰和由下至上第二条谱线ssDNA40N-PDGF-BB复合物峰出峰时间一致，所以确定4.2min信号峰为ssDNA40N-PDGF-BB信号峰(CP)；在3.1min，3.5min处产生信号峰和由下至上第三条谱线ssDNA40N-H-TF复合物峰出峰时间一致，所以确定3.1min，3.5min信号峰为H-TF-ssDNA40N信号峰(CH)。
综上所述，在同一孵育体系中，两种靶分子与ssDNA竞争结合，并通过毛细管区带电泳分离两种复合物峰，实现了毛细管电泳双靶同步核酸适配体筛选。
实施例2
将实施例制得的原始ssDNA40N储备液用纯水稀释得到6.0×10-7mol/L ssDNA40N样品溶液；将原始H-TF晶体粉末用纯水配置得到1.2×10-6mol/L H-TF样品溶液；将原始PDGF-BB蛋白溶液用纯水稀释得到1.2×10-6mol/L PDGF-BB样品溶液。
分别取20μL的H-TF样品溶液，PDGF-BB样品溶液与ssDNA40N样品溶液，混合后，37℃金属浴共同孵育10min；在孵育体系中，两种靶分子互为反筛靶，竞争结合随机寡聚脱氧核苷酸文库中的ssDNA形成各自的ssDNA-靶分子复合物，孵育后得到混合物中含有未与两种靶分子结合的游离ssDNA和与两种靶分子结合后的两种ssDNA-靶分子复合物；
在毛细管区带电泳时所使用的毛细管为熔融石英毛细管，总长度为50.2cm，有效长度为40cm，内径为75μm；将混合物在Beckman P/ACE MDQ毛细管电泳仪中进样进行所述电泳；电泳缓冲液采用硼酸硼砂溶液，通过50mM的硼砂溶液与20mM的硼酸溶液按体积比为3:2混合得到硼酸硼砂溶液，pH值为8.7；进样条件：0.5psi，5s；电泳分析条件为：时间为10min，分析电压为20kV，分析温度为25℃，毛细管的出口端为负极，入口端为正极，在电泳过程，游离ssDNA与两种ssDNA-靶分子复合物在毛细管中的迁移速率均不同，先后依次通过毛细管末端的检测窗口，可检测和分离得到两种ssDNA-靶分子复合物的峰，并直接收集两种ssDNA-靶分子复合物；毛细管在线反应时采用激光诱导荧光(CE-LIF)检测，检测条件为：激发波长488nm，发射波长520nm；LIF检测器检测结果如图1所示。
图2为图1中的部分放大图，其中左电泳图谱线中，分别收集1.7min～2.4min(空白)，2.8min～3.7min(ssDNA40N-H-TF复合物CH)，3.8min～4.5min(ssDNA40N-PDGF-BB复合物CP)三个区段。取上述三个区段进行常规PCR扩增，结果如图2所示。常规PCR扩增条件为：94℃，1min；94℃，30s；59℃，30s；72℃，30s；扩增28个循环，DNase/RNase-Free去离子水，2×Taq PCR Mastermix购自天根生化科技有限公司。琼脂糖凝胶电泳条件为：30ml 0.5×TBE缓冲液与0.6g琼脂糖，制备质量分数为2％琼脂糖凝胶，Bio-Rad电泳仪90V电压电泳30min；琼脂糖，GeneGreen核酸染料，6×DNA Loading Buffer，50bp DNA Ladder购自天根生化科技有限公司。
图2右为PCR扩增产物凝胶电泳结果，图2右最左侧条带为DNA marker，由下至上分别为50bp，100bp，150bp，200bp，250bp，300bp...500bp，CH与CP条带分别为ssDNA40N-H-TF复合物与ssDNA40N-PDGF-BB复合物PCR扩增产物条带，条带长度与DNA marker中的80bp位置一致，确定为目标长度的扩增产物。
实施例3
将实施例1制得的CH与CP PCR扩增产物分别进行高通量测序，从测序结果中分别选择两条序列，H-TF核酸适配体AptH1与AptH2，PDGF-BB核酸适配体Aptp1与Aptp2。表1A中分别为AptH1，AptH2，Aptp1，Aptp2的序列，用CE-LIF方法进行亲和力表征。AptH1，AptH2对H-TF的平衡解离常数(KD)分别为0.059μM，0.314μM，对PDGF-BB的平衡解离常数(KD)分别为5.890μM，10.560μM，H-TF核酸适配体表现出对H-TF的高亲和力与特异性。AptP1，AptP2对PDGF-BB的平衡解离常数(KD)分别为0.380μM，0.398μM，对H-TF的平衡解离常数(KD)分别为3.650μM，4.996μM，PDGF-BB核酸适配体表现出对PDGF-BB的高亲和力与特异性。
综上所述对于H-TF、PDGF-BB两个靶分子，进行毛细管电泳同步核酸适配体筛选，能够通过一轮筛选获得高亲和力、特异性的核酸适配体，所以相比已有的CE-SELEX具有优势。
表1A
表1B
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种基于毛细管电泳的双靶同步核酸适配体筛选方法，其特征在于：所述方法步骤如下：
(1)将随机寡聚脱氧核苷酸文库溶液与两种靶分子溶液混合后共同孵育，两种靶分子互为反筛靶，竞争结合随机寡聚脱氧核苷酸文库中的ssDNA，形成各自的ssDNA-靶分子复合物，孵育后得到混合物中含有游离ssDNA和两种ssDNA-靶分子复合物；
(2)将混合物进行毛细管区带电泳，在电泳过程，游离ssDNA与两种ssDNA-靶分子复合物先后依次通过毛细管末端的检测窗口，可检测和分离得到两种ssDNA-靶分子复合物的峰，并直接收集两种ssDNA-靶分子复合物；
(3)经高通量测序及验证后得到分别与两种靶分子特异性结合的ssDNA序列，即核酸适配体；
步骤(1)中：
两种靶分子为蛋白质；
步骤(2)中：
检测窗口为毛细管电泳-激光诱导荧光检测；
毛细管的出口端为负极，入口端为正极。
2.根据权利要求1所述的一种基于毛细管电泳的双靶同步核酸适配体筛选方法，其特征在于：两种靶分子摩尔浓度比为1:1。
3.根据权利要求1或2所述的一种基于毛细管电泳的双靶同步核酸适配体筛选方法，其特征在于：所述混合物在毛细管区带电泳时所使用的毛细管为熔融石英毛细管，总长度为50.2cm，有效长度为40cm，内径为75μm；采用Beckman P/ACE MDQ毛细管电泳仪进行所述电泳；电泳缓冲液采用硼酸硼砂溶液，通过50mM的硼砂溶液与20mM的硼酸溶液按体积比为3:2混合得到硼酸硼砂溶液，pH值为8.7；进样条件为：蛋白质进样：0.5psi，5s；分析条件为：分析温度为25℃，分析电压为20kV；毛细管在线反应时采用激光诱导荧光检测，检测条件为：激发波长488nm，发射波长520nm。
4.根据权利要求1或2所述的一种基于毛细管电泳的双靶同步核酸适配体筛选方法，其特征在于：通过将随机脱氧寡核苷酸文库溶于纯水中制成随机脱氧寡核苷酸文库储备液，将随机脱氧寡核苷酸文库储备液稀释后得到随机脱氧寡核苷酸文库溶液；将两种靶分子分别溶于纯水中制成两种靶分子溶液。
5.根据权利要求3所述的一种基于毛细管电泳的双靶同步核酸适配体筛选方法，其特征在于：通过将随机脱氧寡核苷酸文库溶于纯水中制成随机脱氧寡核苷酸文库储备液，将随机脱氧寡核苷酸文库储备液稀释后得到随机脱氧寡核苷酸文库溶液；将两种靶分子分别溶于纯水中制成两种靶分子溶液。
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