CN105861488B - 毛细管电泳两次在线反应分离复合物和反向筛选的方法 - Google Patents

毛细管电泳两次在线反应分离复合物和反向筛选的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种毛细管电泳两次在线反应分离复合物和反向筛选的方法，属于生物分离分析技术领域。所述方法为：对反应物进行毛细管区带电泳，进样：第一反应物、第一段电泳缓冲液、第二反应物、第二段电泳缓冲液和第三反应物，两次在线反应混和形成复合物后，经过检测窗口检测；第一、二反应物移速率慢，第三反应物迁移速率快，反应物为蛋白质和ssDNA；分离复合物时，第一、二反应物同为蛋白质或ssDNA，第三反应物为与第一、二反应物不同物质；反向筛选时，ssDNA先与反筛蛋白质作用，再与靶标蛋白质作用，得到与靶标蛋白质特异性更强的ssDNA。所述方法通过一次电泳实现两次筛选，可根据靶标蛋白质不同实现在线反筛。

Description

毛细管电泳两次在线反应分离复合物和反向筛选的方法
技术领域
本发明涉及一种毛细管电泳两次在线反应分离复合物和反向筛选的方法，属于生物分离分析技术领域。
背景技术
单链寡核苷酸(single-stranded DNA,ssDNA)或RNA具有特定二级结构，可以与蛋白质分子形成高亲和性和特异性的复合物。寡核苷酸文库是一类含有1013～1015种不同碱基的ssDNA混合物，其中可能含有一种或数种能与蛋白质分子(靶分子)具有高特异性，高亲和性结合的ssDNA，即核酸适配体(Aptamer)。核酸适配体是通过指数富集配体系统进化(SELEX)技术，从随机寡核苷酸文库中筛选得到的，具有与靶分子高亲和性和高特异性的寡核苷酸序列配体，其特性是亲和力高、特异性强、易制备及修饰，并且靶分子分布广。由于在生物、医药以及分子识别和检测方面有重要的应用价值，目前已经发展出多种核酸适配体的筛选方法，如亲和色谱、膜过滤、磁珠分离及毛细管电泳等。
毛细管电泳(CE)具有高效、快速以及实验成本低等优点，是新型的微量分离分析技术，在蛋白质的核酸适配体筛选中有广泛的应用。
CE用于SELEX筛选核酸适配体即为CE-SELEX。虽然CE-SELEX技术可使核酸适配体筛选周期缩短至传统SELEX技术的三分之一，大大加快了筛选效率；但是现有技术中传统的CE-SELEX技术，需将初始的寡核苷酸文库与靶分子混合孵育，因此样品消耗大、操作复杂且耗时，并且在需要进行反筛时，传统CE-SELEX技术中的筛选与反筛不能同时进行，这样会增加筛选轮数，使操作复杂、耗时且样品耗费大。
发明内容
针对传统CE-SELEX技术筛选核酸适配体时，靶分子用量大、反应条件优化过程繁琐以及反筛步骤耗时费力的不足，本发明的目的在于提供一种基于毛细管两次在线反应分离复合物和反向筛选的方法，可用于靶分子与核酸适配体的高效筛选。
本发明中，所述毛细管电泳两次在线反应是一种动态毛细管电泳技术，所述在线反应和反向筛选为本领域常用术语，在线反应是指在毛细管电泳时毛细管中的反应；反向筛选是指当核酸适配体可以与多个作为靶标的蛋白质分子结合，但只需要与其中一个靶标特异性结合的核酸适配体时，筛选时先将核酸适配体与其他靶标反应，排除与其他靶标结合的核酸适配体，剩余的核酸适配体再与所需靶标反应的方法。
为实现本发明的目的，采用技术方案如下。
一种基于毛细管两次在线反应分离复合物和反向筛选的方法，所述方法步骤如下：
对反应物进行毛细管区带电泳，进样顺序先后依次为：第一反应物、第一段电泳缓冲液、第二反应物、第二段电泳缓冲液和第三反应物，使第三反应物和第二反应物、第三反应物和第一反应物在一次电泳过程的毛细管中实现两次在线反应混和形成ssDNA与蛋白质的复合物后，依次通过毛细管末端的检测窗口，分离收集电泳产物；
所述第一反应物和第二反应物为在毛细管中迁移速率慢的反应物，第三反应物为在毛细管中迁移速率快的反应物，所述反应物根据本领域毛细管区带电泳的要求制成样品溶液后进样。
当毛细管电泳两次在线反应分离复合物时，第一反应物和第二反应物同为蛋白质或同为ssDNA，当第一反应物和第二反应物同为蛋白质时，第三反应物为ssDNA，当第一反应物和第二反应物同为时ssDNA时，第三反应物为蛋白质，电泳过程中，第一反应物、第二反应物、第三反应物以及在线反应形成的复合物根据其荷质比大小，依次通过毛细管末端的检测窗口，可检测和分离得到两种复合物的峰。
当毛细管电泳两次在线反应用于反向筛选时，由于要求在电泳过程中，ssDNA先与反筛蛋白质作用，消耗掉与反筛蛋白质作用的ssDNA，剩余的ssDNA再与靶标蛋白质作用，与靶标蛋白质作用的ssDNA缺少了与反筛蛋白质相互作用的那一部分，最终得到与靶标蛋白质特异性更强的ssDNA，因此可通过第一反应物、第二反应物和第三反应物在毛细管中迁移速率的快慢实现，即第一反应物和第二反应物同为蛋白质，且第一反应物为靶标蛋白质，第二反应物为反筛蛋白质，第三反应物为ssDNA；由于反筛蛋白质和靶标蛋白质都属于在毛细管中迁移速率慢的反应物，当仅通过毛细管中迁移速率的速度无法保证ssDNA先与反筛蛋白质作用，出现ssDNA先与靶标蛋白质作用的情况时，可采用调节第一段电泳缓冲液和/或第二段电泳缓冲液的进样时间，使ssDNA先与反筛蛋白质作用，剩余的ssDNA再与靶标蛋白质作用。
其中，所述毛细管中迁移速率可通过分别对所述反应物进行毛细管区带电泳，根据所述反应物的出峰时间确定，先出峰的所述反应物迁移速率快。
所述反应物可通过以下方法制成样品溶液进样：将蛋白质溶于纯水中制成原始蛋白质储备液，将ssDNA溶于纯水中制备成原始ssDNA储备液；将原始蛋白质储备液稀释后得到蛋白质样品溶液，将原始ssDNA储备液稀释后得到ssDNA样品溶液。
优选确定反应物在毛细管中的迁移速率时的毛细管区带电泳使用涂层毛细管，可抑制蛋白质在管壁的吸附，可采用总长度48.5cm，有效长度40cm，内径75μm的毛细管；可使用Agilent 7100毛细管电泳仪进行所述电泳；电泳缓冲液可为硼酸硼砂溶液，可通过将50mM的硼砂溶液与20mM的硼酸溶液按体积比为3:2混合得到硼酸硼砂溶液，pH值为8.7；进样条件可为：50mbar下，进样3s～25s，分析条件可为：分析温度25℃，分析电压-15kV；可使用UV 195nm进行检测。
优选所述反应物在毛细管区带电泳时所使用的毛细管为涂层毛细管，可抑制蛋白质在管壁的吸附，可采用总长度为50.2cm，有效长度为40cm，内径为75μm的涂层毛细管；可采用Beckman P/ACE MDQ毛细管电泳仪进行所述电泳；第一、二段电泳缓冲液与确定所述反应物在毛细管中迁移速率时的毛细管区带电泳使用的电泳缓冲液相同，可采用硼酸硼砂溶液，可通过50mM的硼砂溶液与20mM的硼酸溶液按体积比为3:2混合得到硼酸硼砂溶液，pH值为8.7；进样条件可为：蛋白质进样：0.5psi，10s；ssDNA进样：0.5psi，10s；，第一段电泳缓冲液进样时间为：50s～150s；分析条件可为：分析温度为25℃，分析电压为-15kV；检测窗口采用毛细管电泳-激光诱导荧光(CE-LIF)检测，条件为：激发波长488nm，发射波长520nm。
当毛细管电泳两次在线反应分离复合物时，优选所述反应物在毛细管中迁移速率为ssDNA＞蛋白质；优选通过调节第一段电泳缓冲液和/或第二段电泳缓冲液的进样时间，提高两种复合物的分离度。
有益效果
1.本发明提供了一种基于毛细管电泳两次在线反应分离复合物和反向筛选的方法，所述方法通过一次毛细管区带电泳就可以完成筛选和反向筛选，对反应物需求量很少，该方法尤其适用于来源困难，价格昂贵的靶标反应物；在所述电泳过程中，由于三种所述反应物是在毛细管中在线反应，省去孵育步骤，避免繁琐操作；
2.本发明提供了一种基于毛细管电泳两次在线反应分离复合物和反向筛选的方法，所述方法可实现对复合物进行分离，电泳时中间进样电泳缓冲液可避免三种所述反应物提前混合，确保所述反应物在电泳分离开始后进行在线反应，在电泳过程中，在毛细管中迁移速率快的反应物会“穿越”在毛细管中迁移速率慢的反应物，并在“穿越”过程中伴随复合物的形成和解离过程；由于所述方法是将所述反应物在毛细管内进行在线反应，因此对所述反应物的需求量很少，且所有三种所述反应物都在线参与反应，还可以通过调节电泳缓冲液的进样时间，提高两个复合物的分离度；
3.本发明提供了一种基于毛细管电泳两次在线反应分离复合物和反向筛选的方法，所述方法可实现在线反向筛选，在电泳过程中，ssDNA会先与反筛蛋白作用，消耗掉与反筛蛋白作用的ssDNA，剩余的ssDNA再与靶蛋白作用，与靶蛋白作用的ssDNA缺少与反筛蛋白相互作用的那一部分，最终得到与靶蛋白特异性更强的ssDNA。
附图说明
图1为实施例1中毛细管电泳反应结果。
图2为实施例2中毛细管电泳反应结果。
图3为实施例3中毛细管电泳反应结果。
图4为实施例4中毛细管电泳反应结果。
具体实施方式
为了充分说明本发明的特性以及实施本发明的方式，下面给出实施例。
以下实施例1～4中，荧光标记29碱基H-Thr适配体(以下简称Apt29-FAM)序列：5'-FAM-AGT CCG TGG TAG GGC AGG TTG GGG TGA CT-3'，购自生工生物工程(上海)有限公司；人凝血酶(H-Thr)购自Enzo Life Science公司；Apt29-FAM互补序列：5'-FAM-AGT CAC CCCAAC CTG CCC TAC CAC GGA CT-3'；牛凝血酶(B-Thr)购自Sigma公司。
原始Apt29-FAM储备液制备：将购买的晶体状Apt29-FAM，经3000转/分离心5min，加入纯水配制成1.0×10-4mol/L的原始Apt29-FAM储备液，在94℃水浴5min后冰上冷却，-20℃保存。
原始Apt29-FAM互补序列储备液制备：将购买的晶体状Apt29-FAM互补序列，经3000转/分离心5min，加入纯水配制成1.0×10-4mol/L的原始Apt29-FAM互补序列储备液，在94℃水浴5min后冰上冷却，-20℃保存。
原始H-Thr储备液制备：将购买的晶体状H-Thr，经3000转/分离心5min，加入纯水配制成1.0×10-4mol/L的原始H-Thr储备液。
原始B-Thr储备液制备：将购买的晶体状B-Thr，经3000转/分离心5min，加入纯水配制成1.0×10-4mol/L的原始B-Thr储备液。
毛细管区带电泳所使用的毛细管为涂层毛细管，涂层毛细管购自河北邯郸开发区奥泰克生物科技有限公司。毛细管电泳采用Beckman P/ACE MDQ毛细管电泳仪，在毛细管出口端配备LIF检测器进行毛细管电泳-激光诱导荧光(CE-LIF)，检测器检测条件为：激发波长488nm，发射波长520nm；所用涂层毛细管外包硅胶层，总长度为50.2cm，有效长度为40cm，内径为75μm；第一段电泳缓冲液和第二段电泳缓冲液为pH8.7的硼酸硼砂溶液，通过将50mM的硼砂溶液与20mM的硼酸溶液按体积比为3:2混合得到。
实施例1
(1)将原始Apt29-FAM储备液用纯水稀释得到1.0×10-6mol/L的Apt29-FAM样品溶液；将原始H-Thr储备液用纯水稀释得到1.0×10-6mol/L的H-Thr样品溶液。
在Beckman P/ACE MDQ毛细管电泳仪中进行基于毛细管电泳两次在线反应分离复合物：分别取20μL的H-Thr样品溶液、第一段电泳缓冲液、第二段电泳缓冲液和Apt29-FAM样品溶液，电泳运行时进样先后顺序依次为：迁移速率慢的第一反应物H-Thr样品溶液、第一段电泳缓冲液、迁移速率慢的第二反应物H-Thr样品溶液、第二段电泳缓冲液和迁移速率快的第三反应物Apt29-FAM样品溶液，进样条件如下：H-Thr样品溶液：0.5psi，10s，第一段电泳缓冲液：0.5psi，50s，Apt29-FAM样品溶液：0.5psi，10s，第二段电泳缓冲液：0.5psi，10s；电泳分析时间为20min，分析电压为-15KV，分析温度为25℃，毛细管的出口端为正极，入口端为负极；在毛细管区带电泳过程中所述三种样品溶液在毛细管中进行混合形成ssDNA与蛋白质的复合物，进行毛细管电泳-激光诱导荧光检测，LIF检测器检测结果如图1所示；
(2)对比实验1：一次在线反应分离复合物：电泳运行时进样先后顺序依次为：迁移速率慢的H-Thr样品溶液、电泳缓冲液和迁移速率快的Apt29-FAM样品溶液；进样条件如下：H-Thr样品溶液：0.5psi，10s，电泳缓冲液：0.5psi，70s，Apt29-FAM样品溶液：0.5psi，10s；其余同(1)，LIF检测器检测结果如图1所示；
(3)对比实验2：在Beckman P/ACE MDQ毛细管电泳仪中进行毛细管电泳，只进样Apt29-FAM样品溶液，LIF检测器检测结果如图1所示。
图1最下方谱线为进样时只进样Apt29-FAM样品溶液的毛细管电泳结果谱线，Apt29-FAM在6.2min处产生信号峰，图1中间的谱线为Apt29-FAM与H-Thr一次在线反应分离复合物的毛细管电泳结果谱线，在6.1min处产生信号峰，和下方谱线Apt29-FAM信号峰出峰时间基本一致，所以确定6.1min信号峰为Apt29-FAM信号峰，与下方谱线对比，中间谱线中Apt29-FAM信号峰峰高降低，并在9.0min处产生了新的信号峰，是由于部分Apt29-FAM与H-Thr反应生成H-Thr和Apt29-FAM复合物，确定9.0min信号峰为H-Thr和Apt29-FAM复合物峰；图1最上方谱线的谱线为Apt29-FAM与H-Thr两次在线反应分离复合物的毛细管电泳结果谱线，在6.0min处产生信号峰，和下方谱线Apt29-FAM信号峰出峰时间基本一致，所以确定6.0min信号峰为Apt29-FAM信号峰，与下方谱线对比，上方谱线中Apt29-FAM信号峰峰高降低，与中间谱线对比，上方谱线中Apt29-FAM信号峰峰高降低，并在8.5min和9.6min处产生了新的信号峰，是由于部分Apt29-FAM在毛细管中与H-Thr反应了两次，生成两个H-Thr和Apt29-FAM复合物，C1为Apt29-FAM与H-Thr第一次在线反应产生的H-Thr和Apt29-FAM复合物峰，C2为Apt29-FAM与H-Thr第二次在线反应产生的H-Thr和Apt29-FAM复合物峰。
实施例2
(1)将原始Apt29-FAM储备液用纯水稀释得到1.0×10-8mol/L的Apt29-FAM样品溶液；将原始H-Thr储备液用纯水稀释得到1.0×10-6mol/L的H-Thr样品溶液。
在Beckman P/ACE MDQ毛细管电泳仪中，进行基于毛细管电泳两次在线反应分离复合物：分别取20μL的H-Thr样品溶液、第一段电泳缓冲液、第二段电泳缓冲液和Apt29-FAM样品溶液，电泳运行时进样先后顺序依次为：迁移速率慢的第一反应物H-Thr样品溶液、第一段电泳缓冲液、迁移速率慢的第二反应物H-Thr样品溶液、第二段电泳缓冲液和迁移速率快的第三反应物Apt29-FAM样品溶液；进样条件如下：固定Apt 29-FAM样品溶液，H-Thr样品溶液和第二段缓冲液进样量为0.5psi，10s，第一段电泳缓冲液进样气压：0.5psi，增加进样时间，时间梯度为：50s，99s，120s，150s；固定H-Thr样品溶液：0.5psi，10s，Apt29-FAM样品溶液：0.5psi，10s，第二段电泳缓冲液：0.5psi，10s和第一段电泳缓冲液：0.5psi不变，增加第一段电泳缓冲液进样时间，时间梯度为：50s、99s、120s和150s；电泳分析时间为20min，分析电压为-15KV，分析温度为25℃，毛细管的出口端为正极，入口端为负极；在毛细管区带电泳过程中所述三种样品溶液在毛细管中进行混合形成ssDNA与蛋白质的复合物，进行毛细管电泳-激光诱导荧光检测，LIF检测器检测结果如图2所示；
(2)对比实验1：一次在线分离复合物：电泳运行时进样先后顺序依次为：迁移速率慢的H-Thr样品溶液、电泳缓冲液和迁移速率快的Apt29-FAM样品溶液，进样条件如下：Apt29-FAM样品溶液和H-Thr样品溶液：0.5psi，10s，电泳缓冲液：0.5psi，电泳缓冲液进样时间随两次在线反应第一段电泳缓冲液进样时间的改变而改变，分别为：70s、119s、140s和170s；其余同(1)，LIF检测器检测结果如图2所示。
(3)对比实验2：在Beckman P/ACE MDQ毛细管电泳仪中进行毛细管电泳，只进样Apt29-FAM样品溶液，LIF检测器检测结果如图2所示。
图2中四个毛细管电泳图最下方谱线为进样时只进样Apt29-FAM样品溶液的毛细管电泳结果谱线，Apt29-FAM在6.2min处产生信号峰；图2中四个毛细管电泳图中间的谱线为Apt29-FAM与H-Thr一次在线反应分离复合物的毛细管电泳结果谱线，在6.1min处产生Apt29-FAM信号峰，改变电泳缓冲液的进样时间分别依次为70s、119s、140s和170s，所以分别依次对应在9.0min、8.6min、8.0min和7.4min处产生H-Thr和Apt29-FAM复合物信号峰，说明随着电泳缓冲液进样时间的增加，H-Thr和Apt29-FAM复合物出峰时间越早；图2中四个毛细管电泳图最上方的谱线为Apt29-FAM与H-Thr两次在线反应分离复合物的毛细管电泳结果谱线，增加第一段电泳缓冲液进样时间，分别依次为50s、99s、120s和150s，所以分别依次对应在9.0min、9.0min、8.4min和7.4min处产生C2信号峰，C2为Apt29-FAM与H-Thr第一次在线反应产生的H-Thr和Apt29-FAM复合物峰；分别在9.8min、10.8min、10.4min和10.2min处产生C1信号峰，C1为Apt29-FAM与H-Thr第二次在线反应产生的H-Thr和Apt29-FAM复合物峰，从图2中可以看出随着第一次缓冲液进样时间的增加C1和C2信号峰的分离度逐渐变好。
综上所述，毛细管电泳两次在线反应分离复合物可以通过改变第一段电泳缓冲液进样时间来提高两个复合物的分离度，如果第一段电泳缓冲液进样时间太短，就无法有效分离两个复合物；但是第一段电泳缓冲液进样时间也不能太长，否侧可能导致毛细管电泳过程中ssDNA还未追上迁移速率慢的蛋白质反应物，蛋白质就已经过了检测窗口，建议第一段电泳缓冲液进行时间为：50s～150s。
实施例3
(1)将原始Apt29-FAM互补序列储备液用纯水稀释得到1.0×10-6mol/L的Apt29-FAM互补序列样品溶液；将原始H-Thr储备液用纯水稀释得到1.0×10-6mol/L的H-Thr样品溶液。
在Beckman P/ACE MDQ毛细管电泳仪中，进行基于毛细管电泳两次在线反应分离复合物：分别取20μL的H-Thr样品溶液、第一段电泳缓冲液、第二段电泳缓冲液和Apt29-FAM互补序列样品溶液，电泳运行时进样先后顺序依次为：迁移速率慢的第一反应物H-Thr样品溶液、第一段电泳缓冲液、迁移速率慢的第二反应物H-Thr样品溶液、第二段电泳缓冲液和迁移速率快的第三反应物Apt29-FAM互补序列样品溶液；进样条件如下：H-Thr样品溶液、第一段电泳缓冲液、Apt29-FAM互补序列样品溶液和第二段电泳缓冲液均为：0.5psi，10s；电泳分析时间为20min，分析电压为-15KV，分析温度为25℃，毛细管的出口端为正极，入口端为负极；在毛细管区带电泳过程中所述三种样品溶液在毛细管中进行混合形成ssDNA与蛋白质的复合物，进行毛细管电泳-激光诱导荧光检测，LIF检测器检测结果如图3所示；
(2)对比实验1：一次在线反应分离复合物：电泳运行时进样先后顺序依次为：迁移速率慢的H-Thr样品溶液、电泳缓冲液和迁移速率快的Apt29-FAM互补序列样品溶液，其余同(1)，LIF检测器检测结果如图3所示；
(3)对比实验2：在Beckman P/ACE MDQ毛细管电泳仪中进行毛细管电泳，只进样Apt29-FAM互补序列样品溶液，LIF检测器检测结果如图3所示。
图3最下方谱线为进样时只进样Apt29-FAM互补序列样品溶液的毛细管电泳结果谱线，Apt29-FAM互补序列在6.4min处产生信号峰，图3中间谱线为Apt29-FAM互补序列与H-Thr一次在线反应分离复合物的毛细管电泳结果谱线，Apt29-FAM互补序列在6.6min处产生信号峰，无Apt29-FAM互补序列和H-Thr复合物的信号峰；图3上方谱线为Apt29-FAM互补序列与H-Thr两次在线反应分离复合物的毛细管电泳结果谱线，Apt29-FAM互补序列在6.6min处产生信号峰，也没有产生Apt29-FAM互补序列和H-Thr复合物的信号峰。由图3可知，Apt29-FAM互补序列与H-Thr一次在线反应和两次在线反应都没有检测到复合物的峰，但通过对Apt29-FAM互补序列峰面积积分可得：只进样Apt29-FAM互补序列样品溶液的毛细管电泳结果中为：135213479；Apt29-FAM互补序列与H-Thr一次在线反应分离复合物的毛细管电泳结果中为：132356394；Apt29-FAM与H-Thr两次在线反应分离复合物的毛细管电泳结果中为：128578631，由此可见Apt29-FAM互补序列随着穿越H-Thr次数的增加峰面积逐渐降低，猜测H-Thr和Apt29-FAM互补序列是非特异性作用，相互作用非常弱，所以在电泳运行过程中复合物已经解离，所以未检测到复合物峰。
综上所述，对于相互作用比较弱的蛋白质和ssDNA，进行毛细管电泳两次在线反应时无明显复合物生成；但在实施例1中有特异性相互作用的蛋白质和ssDNA，进行毛细管电泳两次在线反应时产生两个蛋白质和ssDNA的复合物峰，所以本发明有望用于筛选具有特异性的核酸适配体，相比已有的CE-SELEX具有优势。
实施例4
(1)将原始Apt29-FAM储备液用纯水稀释得到1.0×10-8mol/L的Apt29-FAM样品溶液；将原始H-Thr储备液用纯水稀释得到1.0×10-6mol/L的H-Thr样品溶液；将原始B-Thr储备液用纯水稀释得到1.0×10-6mol/L的B-Thr样品溶液。
在Beckman P/ACE MDQ毛细管电泳仪中，进行基于毛细管电泳两次在线反应反向筛选：分别取20μL的H-Thr样品溶液、第一段电泳缓冲液、B-Thr样品溶液、第二段电泳缓冲液和Apt29-FAM样品溶液，电泳运行时进样先后顺序依次为：迁移速率慢的第一反应物H-Thr样品溶液、第一段电泳缓冲液、迁移速率慢的第二反应物B-Thr样品溶液、第二段电泳缓冲液和迁移速率快的第三反应物Apt29-FAM样品溶液；进样条件如下：H-Thr样品溶液、B-Thr样品溶液、第二段电泳缓冲液和Apt29-FAM样品溶液均为：0.5psi，10s，第一段电泳缓冲液：0.5psi，50s；电泳分析时间为20min，分析电压为-15KV，分析温度为25℃，毛细管的出口端为正极，入口端为负极；在毛细管区带电泳过程中所述三种样品溶液在毛细管中进行混合形成ssDNA与蛋白质的复合物，进行毛细管电泳-激光诱导荧光检测，LIF检测器检测结果如图4所示；
(2)对比实验1：Apt29-FAM和H-Thr一次在线反应分离复合物：电泳运行时进样先后顺序依次为：迁移速率慢的H-Thr样品溶液、电泳缓冲液和迁移速率快的Apt29-FAM样品溶液，进样条件如下：H-Thr样品溶液和Apt29-FAM样品溶液均为：0.5psi，10s，电泳缓冲液：0.5psi，70s；其余同(1)，LIF检测器检测结果如图4所示；
(3)对比实验2：Apt29-FAM和B-Thr一次在线反应分离复合物：电泳运行时进样先后顺序依次为：迁移速率慢的B-Thr样品溶液、电泳缓冲液和迁移速率快的Apt29-FAM样品溶液，进样条件如下：B-Thr样品溶液和Apt29-FAM样品溶液均为：0.5psi，10s，电泳缓冲液：0.5psi，70s；其余同(1)，LIF检测器检测结果如图4所示；
(4)对比实验3：在Beckman P/ACE MDQ毛细管电泳仪中进行毛细管电泳，只进样Apt29-FAM样品溶液，LIF检测器检测结果如图4所示。
图4最下方谱线为进样时只进样Apt29-FAM样品溶液的毛细管电泳结果谱线，Apt29-FAM在6.7min处产生信号峰，图4第二条谱线为Apt29-FAM与B-Thr一次在线反应分离复合物的毛细管电泳结果谱线，在6.6min处产生信号峰，在9.5min～11.5min产生一个展宽的包峰，为B-Thr和Apt29-FAM复合物峰，由于Apt29-FAM是H-Thr适配体，所以Apt29-FAM与B-Thr作用比Apt29-FAM与H-Thr作用弱，所以复合物峰不明显；图4第三条谱线为Apt29-FAM与H-Thr一次在线反应分离复合物的毛细管电泳结果谱线，在6.6min处产生Apt29-FAM信号峰，在11.5min产生一个新的信号峰，为H-Thr和Apt29-FAM复合物峰；图4最上方谱线是Apt29-FAM依次与B-Thr，H-Thr两次在线反应反向筛选的毛细管电泳结果谱线，在6.7min处产生Apt29-FAM信号峰，与下方三条谱线对比，上方谱线中Apt29-FAM信号峰峰面积最低，在10.5min处产生新的信号峰，峰型与下方谱线中H-Thr和Apt29-FAM复合物峰形相似，是Apt29-FAM和H-Thr复合物峰，在10.8min～13min产生一个展宽的包峰，峰型与下方谱线中B-Thr和Apt29-FAM复合物峰形相似，是Apt29-FAM和B-Thr复合物峰。
综上所述毛细管电泳两次在线反应反向筛选以两种不同的反应物为靶标，进行毛细管电泳两次在线反应时产生两种复合物峰，Apt29-FAM先与B-Thr反应，之后剩余的Apt29-FAM再与H-Thr反应，这样实现了毛细管电泳在线反向筛选，获得与靶标蛋白质H-Thr特异性更强的ssDNA。
综上所述，以上仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种毛细管电泳两次在线反应分离复合物和反向筛选的方法，其特征在于：所述方法步骤如下：
对反应物进行毛细管区带电泳，进样顺序先后依次为：第一反应物、第一段电泳缓冲液、第二反应物、第二段电泳缓冲液和第三反应物，在一次电泳过程的毛细管中实现两次在线反应混和形成ssDNA与蛋白质的复合物后，依次通过毛细管末端的检测窗口，分离收集电泳产物；
所述第一反应物和第二反应物为在毛细管中迁移速率慢的反应物，第三反应物为在毛细管中迁移速率快的反应物；
当毛细管电泳两次在线反应分离复合物时，第一反应物和第二反应物同为蛋白质，第三反应物为ssDNA；
当毛细管电泳两次在线反应反向筛选时，ssDNA先与反筛蛋白质作用，剩余的ssDNA再与靶标蛋白质作用，最终得到与靶标蛋白质特异性更强的ssDNA，第一反应物和第二反应物同为蛋白质，且第一反应物为反筛蛋白质，第二反应物为靶标蛋白质，第三反应物为ssDNA，当仅通过毛细管中迁移速率的速度无法保证ssDNA先与反筛蛋白质作用时，调节第一段电泳缓冲液和/或第二段电泳缓冲液的进样时间，使ssDNA先与反筛蛋白质作用，剩余的ssDNA再与靶标蛋白质作用。
2.根据权利要求1所述的一种毛细管电泳两次在线反应分离复合物和反向筛选的方法，其特征在于：所述毛细管中迁移速率通过分别对所述反应物进行毛细管区带电泳，根据所述反应物的出峰时间确定，先出峰的所述反应物迁移速率快。
3.根据权利要求1所述的一种毛细管电泳两次在线反应分离复合物和反向筛选的方法，其特征在于：所述反应物通过以下方法制成样品溶液进样：将蛋白质溶于纯水中制成原始蛋白质储备液，将ssDNA溶于纯水中制备成原始ssDNA储备液；将原始蛋白质储备液稀释后得到蛋白质样品溶液，将原始ssDNA储备液稀释后得到ssDNA样品溶液。
4.根据权利要求1所述的一种毛细管电泳两次在线反应分离复合物和反向筛选的方法，其特征在于：确定反应物在毛细管中的迁移速率时的毛细管区带电泳使用涂层毛细管，采用总长度48.5cm，有效长度40cm，内径75μm的毛细管；使用Agilent 7100毛细管电泳仪进行所述电泳；电泳缓冲液为硼酸硼砂溶液，通过将50mM的硼砂溶液与20mM的硼酸溶液按体积比为3:2混合得到硼酸硼砂溶液，pH值为8.7；进样条件为：50mbar下，进样3s～25s，分析条件为：分析温度25℃，分析电压-15kV；使用UV 195nm进行检测。
5.根据权利要求1所述的一种毛细管电泳两次在线反应分离复合物和反向筛选的方法，其特征在于：所述反应物在毛细管区带电泳时所使用的毛细管为涂层毛细管，采用总长度为50.2cm，有效长度为40cm，内径为75μm的涂层毛细管；采用Beckman P/ACE MDQ毛细管电泳仪进行所述电泳；第一、二段电泳缓冲液采用硼酸硼砂溶液，通过50mM的硼砂溶液与20mM的硼酸溶液按体积比为3:2混合得到硼酸硼砂溶液，pH值为8.7；进样条件为：蛋白质进样：0.5psi，10s；ssDNA进样：0.5psi，10s；第一段电泳缓冲液进样时间为：50s～150s；分析条件为：分析温度为25℃，分析电压为-15kV；检测窗口采用毛细管电泳-激光诱导荧光检测，条件为：激发波长488nm，发射波长520nm。
6.根据权利要求1所述的一种毛细管电泳两次在线反应分离复合物和反向筛选的方法，其特征在于：当毛细管电泳两次在线反应分离复合物时，所述反应物在毛细管中迁移速率为ssDNA＞蛋白质。
7.根据权利要求1或6所述的一种毛细管电泳两次在线反应分离复合物和反向筛选的方法，其特征在于：通过调节第一段电泳缓冲液和/或第二段电泳缓冲液的进样时间，提高两种复合物的分离度。
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