CN112779260B - 黄素单核苷酸的核酸适配体、其筛选方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明揭示了一种黄素单核苷酸的核酸适配体、其筛选方法及应用。所述核酸适配体具有SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。本发明还提供了所述核酸适配体的筛选方法，可以通过SELEX法筛选获得。本发明还提供了一种黄素单核苷酸的分离纯化方法。本发明提供的黄素单核苷酸的核酸适配体能够特异性的识别黄素单核苷酸，而不与另外两种黄素化合物(VB2和FAD)作用，因而其可以应用于黄素单核苷酸的分离纯化。

Description

黄素单核苷酸的核酸适配体、其筛选方法及应用
技术领域
本发明涉及一种核酸适配体，具体涉及一种黄素单核苷酸(FMN)的核酸适配体、其筛选方法及其应用，例如在FMN分离纯化中的应用等，属于生物技术领域。
背景技术
小分子结构类似物的区分非常困难，核酸适配体的出现使其成为可能。适配体是从随机序列库中筛选得到的一种人工合成的ssDNA或RNA分子，它可以折叠成特定的三维形状从而高亲和力和特异性的识别其靶标。如果适配体的选择性足够好，它甚至可以区分靶分子及其结构类似物，即使它们只有一个官能团/原子的差异或是结构对映体。此外，与其它天然或人工的识别分子相比适配体具有独特的优势，如易于合成和进行了官能团或标记物的修饰、成本低、化学稳定性高等。由于这些优点，适配体已成为生物传感器、生物技术和生物医学等领域的通用工具，例如，适配体可以作为识别元件设计传感器，可适用于几乎所有类型靶标的检测，包括金属离子、有机小分子、毒素、蛋白质、肿瘤生物标志物、病毒、循环肿瘤细胞等。适配体是通过一种称为配体系统进化的指数富集(SELEX)技术筛选得到的。目前，已报道了类型靶标的适配体，包括小分子、生物大分子、病毒和细胞等。然而，目前筛选得到的小分子靶标的适配体仍然不足，尤其是能够区分靶标分子与其结构类似物的适配体非常少。这主要是由小分子靶标简单的化学结构和需要固定靶标分子的传统SELEX技术之间的落差造成的。
黄素类化合物主要包括核黄素(riboflavin，简称VB2)，黄素单核苷酸(flavinmononucl eotide，简称FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide，简称FAD)，在许多代谢途径中发挥重要的氧化还原作用，例如，FMN和FAD与黄素蛋白结合后作为辅助因子，在许多生物反应中传递一个或两个电子。许多微生物和植物可以自行合成黄素，但高等动物只能从食物中摄取黄素，缺乏黄素会导致脱发、皮肤炎症、视力减退等疾病。作为一种水溶性维生素，FMN常被用作临床药物、食品及饲料添加剂等。另外，在微生物发电、污水处理、土壤修复和净化过程中，提高FMN的浓度可以有效地加快产电细菌的催化速度。然而，目前黄素单核苷酸的商业产品价格高昂、纯度低，严重制约了其在生物医学、食品、环境工程等领域的广泛应用。目前，FMN的工业化生产主要是通过其前体VB2的磷酸化来实现的，这一化学过程会产生各种副产物，而VB2是主要的副产物。而FMN的提纯工艺复杂、成本昂贵，使得VB2到FMN的价格上涨了大约1000倍，成为生产高纯度FMN的技术瓶颈。因此，发展FMN的特异性核酸适配体，能够将FMN与其它黄素(VB2和FAD)区分开，将有助于开发高效、廉价的FMN纯化方法。
目前已报道的FMN的核酸适配体是一个含35碱基的RNA序列，以及其缩短后的14个碱基的序列，但这两种RNA适配体与FMN和其它两种黄素(FAD和VB2)具有相似的亲和力。由于特异性差、成本高、易降解等缺点，限制了它们在许多实际领域的应用。目前还没有关于FMN的ssDNA适配体的报道，所以有必要开发一种特异性更高的FMN的ssDNA适体来区分FMN及其结构类似物。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种黄素单核苷酸的核酸适配体、其筛选方法及其应用，以克服现有技术中的不足。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种黄素单核苷酸的核酸适配体，它具有SEQ ID No.1或SEQID No.2所示的核苷酸序列。
本发明实施例还提供了前述黄素单核苷酸的核酸适配体于制备能够特异性识别和/或纯化黄素单核苷酸的产品中的应用。
本发明实施例还提供了一种用于分离纯化黄素单核苷酸的捕获试剂，所述捕获试剂包含前述黄素单核苷酸的核酸适配体、固相载体以及所述黄素单核苷酸的核酸适配体的互补序列。
本发明实施例还提供了一种试剂盒，其包括前述黄素单核苷酸的核酸适配体或者用于分离纯化黄素单核苷酸的捕获试剂。
本发明实施例还提供了一种黄素单核苷酸的分离纯化方法，其包括：
提供前述黄素单核苷酸的核酸适配体，或者用于分离纯化黄素单核苷酸的捕获试剂；以及使包含核黄素、黄素单核苷酸和黄素腺嘌呤二核苷酸的混合核素分子样品与所述的黄素单核苷酸的核酸适配体，或者用于分离纯化黄素单核苷酸的捕获试剂接触，从而使所述黄素单核苷酸的核酸适配体与黄素单核苷酸特异性结合而实现黄素单核苷酸与其他核素分子的分离，对进而实现黄素单核苷酸的纯化。
本发明实施例还提供了一种核酸适配体的筛选方法，其包括：
1)将单链DNA文库和第一连接物标记的捕获链杂交，并将形成的杂交文库与第二连接物标记的载体孵育，使所述杂交文库固定到所述载体上，所述第一连接物和第二连接物能够特异性结合；
2)用SELEX缓冲液将游离的核酸序列和与捕获链结合能力差的核酸序列从所述载体上洗脱；
3)之后以黄素单核苷酸溶液将与黄素单核苷酸特异性作用的富集库洗脱；
4)收集所述富集库并进行PCR扩增，并制备单链DNA获得筛选文库；
5)以所述筛选文库作为单链DNA文库，重复进行步骤1)～步骤4)的操作，若干轮之后富集库得到成功富集，在进行步骤3)之前，利用核黄素和黄素腺嘌呤二核苷酸进行负筛选，除去黄素单核苷酸的非特异性结合序列，重复进行步骤1)～步骤4)的操作，直至获得所述黄素单核苷酸的核酸适配体。
与现有技术相比，本发明以上实施例所提供的技术方案的优点至少包括：
1)本发明提供的黄素单核苷酸(FMN)的DNA适配体，基于所述FMN核酸适配体与FMN的特异性结合，能够区分FMN与其它两种核素分子(VB2和FAD)；
2)本发明基于所述FMN的核酸适配体的高特异性还设计了一种纯化分离FMN的方法，其操作简单、方便，为高纯度FMN的获得提供了一种新的方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图进行简单的介绍，显而易见地，下面描述的附图仅仅作为本文发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。
图1是本发明一典型实施方式中利用改良的亲和柱SELEX方法筛选FMN适配体的示意图；
图2a和图2b是本发明实施例1中利用琼脂糖凝胶电泳监测筛选进程的实验结果图；
图3a-图3c分别是本发明实施例2中序列分析和鉴定的实验结果图；
图4a-图4f是本发明实施例3中所获适配体的亲和常数的表征结果，其中图4a和图4b分别是FMN-1S和FMN-6S的离解常数(Kd)曲线图，图4c和图4d分别是在固定适配体FMN-1S和FMN-6S浓度(1μM)的情况下，FMN荧光强度和浓度之间的线性关系图，图4e是两个候选适配体(FMN-1和FMN-6)及其裁短适配体(FMN-1S和FMN-6S)的详细序列示意图，图4f是FMN-1S和FMN-6S的预测二级结构示意图；
图5a-图5d是本发明实施例4中所获适配体的特异性的表征结果，其中图5a是在SELEX缓冲液中，不同黄素(VB2、FMN和FAD)分别与所获适配体(FMN-1S和FMN-6S)孵育后的荧光变化的柱状图，图5b是在无H3PO4和不同浓度(1、10、100和1000μM)的H3PO4存在时，FMN与所获适配体孵育后的荧光变化的柱状图，图5c是在不加和加入不同浓度(0、1、10、100和1000μM)的腺苷、腺苷酸、ADP和ATP时，FMN与FMN-1S孵育后的荧光变化柱状图，图5d是在不加和加入不同浓度(0、1、10、100和1000μM)的腺苷、腺苷酸、ADP和ATP时，FMN与FMN-6S孵育后的荧光变化柱状图；
图6是本发明实施例5中FMN分离纯化测试的实验结果柱状图。
具体实施方式
如前所述，鉴于现有技术存在的诸多缺陷，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出了本发明的技术方案，如下将予以更为具体的说明。
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本说明书使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本发明实施例的一个方面提供的一种黄素单核苷酸(FMN)的核酸适配体具有SEQID No.1所示的核苷酸序列或SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
在一些优选实施方案中，所述黄素单核苷酸的核酸适配体具有SEQ ID No.1所示的序列，具体序列内容为TCGGGACGACCGAAGGGAGTCCGACTCTGGGAAACGACAAGTCCCGA。
进一步地，所述SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的具体序列内容为CGGGACGACGGGAGGCGCACATCATGTACACCGAGTGCCGTCCCG。
在一些优选的技术方案中，所述核酸适配体的一端选为进行生物素基团修饰。
本发明实施例的另一个方面提供的一种核酸适配体的筛选方法包括：
1)将单链DNA文库和第一连接物标记的捕获链杂交，并将形成的杂交文库与第二连接物标记的载体孵育，使所述杂交文库固定到所述载体上，所述第一连接物和第二连接物能够特异性结合；
2)以SELEX缓冲液将游离的核酸序列和与捕获链结合能力差的核酸序列从所述载体上洗脱；
3)之后以黄素单核苷酸溶液将与黄素单核苷酸特异性作用的富集库洗脱；
4)收集所述富集库并进行PCR扩增，制备单链DNA获得筛选文库；
5)以所述筛选文库作为单链DNA文库，重复进行步骤1)～步骤4)的操作，直至获得前述的黄素单核苷酸的核酸适配体。
在一些实施方案中，所述筛选方法包括：在进行步骤3)之前，利用核黄素和黄素腺嘌呤二核苷酸进行负筛选，除去黄素单核苷酸的非特异性结合序列。
进一步地，所述单链DNA文库具有SEQ ID No.4所示序列，其中的N为随机碱基。
进一步地，所述第一连接物和第二连接物选自生物素及链霉亲和素。
进一步地，所述载体包括琼脂糖树脂。
本发明采用改进的捕获SELEX方法，分离出FMN的ssDNA适配体，所获适配体能够将FMN与其具有类似结构的类似物区分开来。用FMN进行正筛选，并引入VB2和FAD进行负筛选，经过14轮筛选，成功地获得了两个短的45mer和47mer的适配体，它们都表现出低微摩尔级别的解离常数(Kd)和较高的特异性。
在一些实施方案中，所述FMN核酸适配体的筛选方法包括：利用生物素标记的互补短链(捕获序列)将ssDNA随机库间接的固定在链霉亲和素修饰的琼脂糖树脂上，利用FMN洗脱适配体序列进行正筛选，并利用VB2和FAD进行负筛选，除去非特异性结合序列，以增加适配体的特异性。
本发明首先通过改良的亲和柱筛选方法分离出与所述FMN作用的适配体序列。
请参阅图1所示，利用改良的亲和柱SELEX方法筛选FMN适配体的方法包括以下步骤：
(1)将200μL链霉亲和素修饰的琼脂糖树脂加入到空柱中，静置沉降，然后用400μLSELEX缓冲液洗3次；
(2)将1nmol ssDNA随机库和生物素标记的捕获序列按1∶2摩尔比杂交，在95℃水浴中加热5min，然后自然冷却至室温。将上述杂交后的ssDNA库与琼脂糖柱孵育10min(重复3次)，从而固定到亲和柱上；
(3)先用SELEX缓冲液洗脱游离的以及结合能力差的序列(3次)，再用200μM FMN溶液洗脱3次，每次孵育约10min，进行正筛选以洗脱与FMN结合的序列，再用SELEX缓冲液洗脱2次；
(4)将SELEX缓冲液和FMN洗脱的样品分别作为模板进行PCR扩增，进行琼脂糖凝胶电泳，根据各条带亮度的比对，监测筛选库的富集情况；
(5)将FMN洗脱的样品混合到一起并作为模板进行PCR扩增，制备ssDNA作为下一轮的筛选文库，进行反复筛选直到得到富集效果很好的ssDNA文库；
(6)验证ssDNA文库得到富集之后，在正筛选之前引入负筛选，具体来说：依次用SELEX缓冲液洗2次，再用200μM VB2和200μM FAD混合溶液洗脱2次，进行负筛选以洗脱与VB2和FAD结合的序列，然后再进行上述正筛选步骤；
(7)ssDNA文库富集成功之后，进行克隆和测序，并进行序列分析，选取可能的适配体序列，优化序列并鉴定后，获得FMN的适配体。
其中，所述ssDNA库两端为固定的引物序列，中间含30随机碱基，例如，较为优选的，所述ssDNA库的具体序列如SEQ ID No.4所示，即：
5’-GGAGGCTCTCGGGACGAC-N30-GTCGTCCCGATG-3’，其中N为随机碱基。
其中，所述生物素标记的捕获链具有SEQ ID No.5所示序列，具体序列为：5’-GTCGTCCCGAGAGCCATA-biotin-3’，其与ssDNA库的5’端有15互补碱基。因而，通过生物素和链霉亲和素的亲和作用可以将杂交后的ssDNA库固定在琼脂糖树脂上。
本发明通过以上方法筛选出的优化的FMN的核酸适配体，其具有SEQ ID No.1所示的序列或SEQ ID No.2所示的序列。所述FMN的核酸适配体可以高效特异的识别靶分子FMN，而不与另外两种核素分子(VB2和FAD)发生作用，所述核酸适配体与FMN作用后可以使FMN的荧光发生显著降低，而与VB2或FAD作用后，荧光基本没有变化，可以区分FMN及其结构类似物(另外两种黄素分子VB2和FAD)，为FMN的分离纯化提供了一种新的高效方法。
其中，筛选得到的FMN适配体的全长序列，具体为：
FMN-1(SEQ ID No.6所示的序列)：
5’GGAGGCTCTCGGGACGACCGAAGGGAGTCCGACTCTGGGAAACGACAAGTCCCGATGCTGCAATCGTAAGAAT-3’。
FMN-6(SEQ ID No.7所示的序列)：
5’-GGAGGCTCTCGGGACGACGGGAGGCGCACATCATGTACACCGAGTGCCGTCCCGATGCTGCAATCGTAAGAAT-3’。
进一步地，本发明根据M-fold模拟的二级结构对候选适配体的全长序列进行裁短，得到裁短的适配体序列，如图4e和图4f所示，具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列或SEQID No.2所示的核苷酸序列，具体为：
FMN-1S(SEQ ID No.1所示的序列)：
5’-TCGGGACGACCGAAGGGAGTCCGACTCTGGGAAACGACAAGTCCCGA-3’。
FMN-6S(SEQ ID No.2所示的序列)：
5’-CGGGACGACGGGAGGCGCACATCATGTACACCGAGTGCCGTCCCG-3’。
本发明实施例的另一个方面提供了前述任一种黄素单核苷酸的核酸适配体于制备能够特异性识别和/或纯化黄素单核苷酸的产品中的应用。
例如，本发明实施例的另一个方面提供的一种用于分离纯化黄素单核苷酸的捕获试剂，所述捕获试剂包含前述任一种的黄素单核苷酸的核酸适配体以及所述黄素单核苷酸的核酸适配体的互补序列。
进一步地，所述捕获试剂还包括固相载体，所述黄素单核苷酸的核酸适配体被连接在固相载体上。
本发明实施例的另一个方面提供一种用于黄素单核苷酸分离纯化的亲和试剂，所述亲和试剂包含所述的黄素单核苷酸是核酸适配体、固相介质(即固相载体)、所述核酸适配体的互补序列，所述互补序列具有SEQ ID No.3所示的序列，具体序列内容为TCGGGACTTGTCGTTTCCCAGAGTCGGACTCCCTTCGGTCGTCCCGA。
进一步地，所述捕获试剂包含前述任一种的黄素单核苷酸的核酸适配体、固相载体以及所述黄素单核苷酸的核酸适配体的互补序列。
进一步地，所述黄素单核苷酸的核酸适配体经由生物素基团修饰的一端与固相载体相连接。
本发明实施例的另一个方面提供一种试剂盒，其包括前述任一种的黄素单核苷酸的核酸适配体或者所述的用于分离纯化黄素单核苷酸的捕获试剂。
本发明实施例的另一个方面提供的一种黄素单核苷酸的分离纯化方法包括：
提供前述黄素单核苷酸的核酸适配体，或者用于分离纯化黄素单核苷酸的捕获试剂；以及
使包含核黄素、黄素单核苷酸和黄素腺嘌呤二核苷酸的混合核素分子样品与所述的黄素单核苷酸的核酸适配体，或者用于分离纯化黄素单核苷酸的捕获试剂接触，从而使所述黄素单核苷酸的核酸适配体与黄素单核苷酸特异性结合而实现黄素单核苷酸与其他核素分子的分离，进而实现黄素单核苷酸的纯化。
在一些实施方案中，所述分离纯化方法还包括：使所述黄素单核苷酸的核酸适配体与黄素单核苷酸特异性结合而实现黄素单核苷酸与其他核素分子的分离，之后用黄素单核苷酸的核酸适配体的互补序列进行洗脱，超滤纯化，获得黄素单核苷酸。
在一些实施方案中，所述分离纯化方法具体包括：利用链霉亲和素修饰的载体将经由生物素基团修饰的黄素单核苷酸的核酸适配体修饰到载体上；将黄素单核苷酸特异性的固定在亲和柱上之后，利用黄素单核苷酸的核酸适配体的互补序列进行洗脱，从而将黄素单核苷酸释放下来。
进一步地，所述载体包括琼脂糖树脂。
在一优选的技术方案中，所述方法具体包括：利用链霉亲和素修饰的琼脂糖树脂将所述FMN的核酸适配体修饰到树脂上。
在一些实施方案中，所述FMN的纯化方法包括：使各种核素分子与前述的FMN核酸适配体接触，其中所述FMN核酸适配体的一端修饰官能团以用于连接固相载体；以及使所述FMN核酸适配体与FMN特异性结合而实现FMN与其他核素分子的分离；最后使所述FMN核酸适配体的互补链进行洗脱将FMN竞争下来，以实现FMN的纯化。
进一步地，所述FMN的分离纯化方法包括：使各种黄素溶液与所述的FMN核酸适配体接触，通过FMN核酸适配体与FMN的特异性结合而将FMN固定在固相介质上，而VB2和FAD不与FMN核酸适配体作用而被洗脱。利用FMN核酸适配体的互补序列，洗脱固定在亲和柱上的FMN，实现FMN的纯化。
在本发明的一个具体实施方案中，所述FMN的纯化方法具体包括：对所述FMN核酸适配体的一端进行官能团修饰以用于连接固相载体，例如生物素修饰；利用链霉亲和素修饰的琼脂糖树脂将所述生物素修饰的FMN适配体序列修饰到树脂上；将FMN特异性的固定在亲和柱上之后，采取手段将FMN释放下来，例如利用适配体的互补链洗脱。
其中，作为本发明的一更为优选的实施案例之一，本发明利用所述FMN适配体进行FMN的分离纯化试验，具体包括以下步骤：
(1)将200μL链霉亲和素修饰的琼脂糖树脂加入到空柱中，静置沉降，然后用400μLSELEX缓冲液洗3次；
(2)利用生物素与链霉亲和素的相互作用，将FMN的核酸适配体固定到链霉亲和素修饰的琼脂糖树脂上。具体来说，将250μL 10μM生物素修饰的FMN适配体(FMN-1S)在95℃水浴中加热5min，快速冷却至室温，然后与琼脂糖柱孵育10min(重复3次)，从而固定到亲和柱上，之后用400μL SELEX缓冲液洗3次；
(3)利用FMN的核酸适配体与FMN的特异性识别作用将FMN选择性的固定到亲和柱上。具体来说，将200μL 10μM的各黄素溶液(FMN、VB2或FAD)与适配体亲和柱孵育20min(重复3次)，然后用400μL SELEX缓冲液洗3次，那么只有FMN固定在适配体亲和柱上；
(4)利用FMN的核酸适配体的互补链将FMN竞争洗脱下来。具体来说，将250μL 10μM的互补链溶液与上述柱子孵育10min(重复3次)，洗脱结合的黄素。将洗脱液用超滤管离心过滤并保留滤液，以除去游离的DNA；
(5)用荧光光谱法定量各黄素的回收量，并根据525nm处的荧光强度计算回收率。
其中，所述生物素修饰的FMN的核酸适配体序列为：
BIO-FMN1S：5’-biotin-TCGGGACGACCGAAGGGAGTCCGACTCTGGGAAACGACAAGTCCCGA-3’。
所述FMN的核酸适配体的互补链的序列为：
C-FMN1S(SEQ ID No.3所示的序列)：
5’-TCGGGACTTGTCGTTTCCCAGAGTCGGACTCCCTTCGGTCGTCCCGA-3’。
本发明以上实施例利用SELEX法筛选出黄素单核苷酸的核酸适配体，并基于所述FMN核酸适配体与FMN的特异性结合，能够区分FMN与其它两种核素分子(VB2和FAD)，并且，本发明基于所述FMN核酸适配体的高特异性还设计了一种纯化分离FMN的方法，其操作简单、方便，为高纯度FMN的获得提供了一种新的方法。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及若干较佳实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明。以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中所用试剂和原料均市售可得，而其中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。又及，除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、筛选方法、纯化方法均采用本技术领域常规的生物化学、分子生物学、分析化学及相关领域的常规技术。
实施例1
本实施例采用凝胶电泳法监测筛选进程，具体步骤如下：
在每一轮的筛选过程中，利用FMN洗脱ssDNA的相对量来监测SELEX的进程。将SELEX缓冲液、FMN以及VB2和FAD混合溶液等洗脱的样品分别作为模板进行PCR扩增，然后进行4％琼脂糖凝胶电泳成像。结果如图2a所示，经过12轮正筛选后，FMN洗脱样品的条带(12F1、12F2和12F3)明显亮于SELEX缓冲液洗脱样品的条带(12S1、12S2、12S3和12S4)，表明FMN结合序列得到成功富集。然后在正筛选前引入FAD和VB2混合溶液的洗涤步骤，也即负筛选以去除非特异性结合序列。如图2b所示，经两轮负筛选后，FMN洗脱样品的条带(14F1、14F2和14F3)明显亮于SELEX缓冲液洗脱条带(14S1、14S2、14S3和14S4)以及FAD和VB2混合液洗脱样品的条带(14N1和14N2)，表明ssDNA库的成功富集，可以进行克隆测序。
实施例2
本实施例采用如下方法对克隆测序结果进行序列分析并选出适配体候选序列，利用荧光光谱法考察所选序列与FMN的结合能力，具体步骤如下：
(1)经克隆测序，共获得39个序列。利用clustalx1.8.3软件对获得的序列进行序列比对分析，并且为了更利于适配体序列的选择，将两端固定的引物部分去掉，只对中间含有30个随机碱基的部分进行了排列和分析。如图3a所示，其中有若干序列具有重复性，例如，序列1在随机选择的40个克隆中有6个重复。重复频率高的序列是首选的适配体候选序列，由此选择了几条适配体候选序列。此外，根据M-fold模拟的二级结构对全长序列进行了裁短，根据本案发明人以往的经验，去掉两端的部分引物，保留7个碱基对，以保持茎中部环结构(图4f)。
(2)由于黄素分子与其适配体结合后，其荧光强度会降低，因此可以采用荧光光谱法考察这些截短的适配体候选序列与FMN的结合能力。首先分别将各适配体候选序列溶于SELEX缓冲液，95℃加热5min，快速冷却至室温。然后将1μM FMN与1μM的适配体候选序列在SELEX缓冲液中于室温下孵育1h，体系的终体积为100μL。然后利用F-4600荧光光谱仪记录其在480nm-700nm范围的荧光光谱，激发光设为450nm，激发光及发射光的狭缝宽度设置为10nm。结果如图3b和图3c所示，相对于初始的ssDNA随机库，所选的5条适配体候选序列均使FMN发生更大程度的降低，表明FMN与各候选序列的结合，其中FMN-1S的荧光强度下降最明显，约为FMN的50％，其次是FMN-6S，约为FMN的65％(图3c)，表明它们与FMN的结合力更强。因此，选择FMN-1S和FMN-6S作为FMN的适配体进行进一步的分析鉴定。
实施例3
本实施例采用荧光光谱法对所获FMN的核酸适配体的亲和力进行测试，具体步骤如下：
将适配体溶于SELEX缓冲液，95℃加热5min，快速冷却至室温。然后将FMN与不同浓度的适配体在SELEX缓冲液中于室温下孵育1h，体系的终体积为100μL，FMN的终浓度为1μM，适配体的终浓度分别为0、0.1、0.2、0.5、0.75、1、2、5和10μM。然后利用F-4600荧光光谱仪记录其在480nm-700nm范围的荧光光谱，激发光设为450nm，激发光及发射光的狭缝宽度设置为10nm。将FMN在525nm处荧光强度的降低值对应适配体的浓度作图，利用OriginPro 9.0软件和公式(F0-F＝Fmax*C/(Kd+C))进行非线性弥合得到解离常数(Kd)曲线，结果如图4a-图4b所示。其中，F0代表FMN的荧光强度，F代表FMN在适配体存在时的荧光强度，C代表适配体的浓度。所述适配体FMN-1S和FMN-6S的Kd分别为0.17±0.03μM和0.93±0.12μM。图4c和图4d分别是在固定适配体FMN-1S和FMN-6S浓度(1μM)的情况下，FMN荧光强度和浓度之间的线性关系图，标准偏差来自三次独立的试验。图4e是两个候选适配体(FMN-1和FMN-6)及其裁短适配体(FMN-1S和FMN-6S)的详细序列示意图，其中下划线标注的碱基为引物部分。图4f是用M-fold(http：//mfold.rna.albany.edu/)预测的二级结构，蓝框中保留的结构为它们的截短序列，分别命名为FMN-lS和FMN-6S。
实施例4
本实施例采用荧光光谱法对所获FMN适配体的特异性进行测试，具体步骤如下：
(1)根据所获适配体(FMN-1S和FMN-6S)与各核素分子(FMN，VB2和FAD)孵育后，核素荧光强度的变化来评估这两种核酸适配体对核素的结合能力，将1μM核素与1μM ssDNA在SELEX缓冲液中室温下孵育1h后测其荧光光谱，具体方法见实施例1中所述。结果如图5a所示，与随机ssDNA库孵育后，三种核素分子的荧光几乎都没有变化，与所获的两种适配体孵育后，VB2和FAD的荧光几乎没有减弱，而FMN荧光强度大幅度减弱，降低至50％-60％，这说明了所获核酸适配体能够特异性的结合FMN，而不与另外两种核素结合。
(2)FMN结构含有一个VB2基团和一个磷酸根基团，为了考察所获适配体是否能够结合磷酸根，本案发明人将H3PO4引入体系作为竞争分子。在分别加入不同浓度(0、1、10、100和1000μM)的H3PO4时，将1μM FMN与1μM适配体在100μL SELEX缓冲液中于室温下孵育1h，然后测其荧光光谱。结果如图5b所示，在引入不同浓度的磷酸根后，从1μM到1000μM，使FMN-1S和FMN-6S的荧光强度都略有增加，但变化均在8％以下，且荧光变化与H3PO4浓度之间没有正相关关系，表明磷酸根对这些适配体与FMN的结合几乎没有影响。
(3)此外，还通过引入腺嘌呤核苷酸衍生物(腺苷A、腺苷酸AMP、腺苷二磷酸ADP和三磷酸腺苷ATP)作为竞争分子，考察了所获适配体与腺嘌呤核苷酸的结合情况。在分别加入不同浓度(0、1、10、100和1000μM)的腺嘌呤核苷酸衍生物时，将1μM FMN与1μM适配体在100μL SELEX缓冲液中于室温下孵育1h，然后测其荧光光谱。标准偏差来自三次独立的试验。结果如图5c和图5d所示，在体系中引入不同浓度的竞争分子后，浓度从1μM到1000μM，使FMN-1S和FMN-6S的荧光强度产生的变化都非常小，均在12％以下，且荧光变化与竞争分子浓度之间没有正相关关系，表明腺嘌呤核苷酸衍生物对所获适配体与FMN的结合影响很小或几乎没有影响。这些结果进一步证实了FMN-1S和FMN-6S具有良好的特异性。
实施例5
本实施例采用亲和柱方法对FMN进行分离纯化测试，具体步骤如下：
为了验证所获FMN适配体在FMN分离纯化中的应用潜能，本案发明人利用亲和柱方法进行了一个方法验证试验。将优选的适配体FMN-1S一端进行生物素修饰，通过生物素-链霉亲和素作用，将适配体固定到链霉亲和素修饰的琼脂糖表面，作为适配体亲和柱。然后将相同浓度的各种核素(FMN、VB2和FAD)溶液分别与适配体亲和柱孵育，由于FMN适配体与FMN的特异性结合，FMN可以固定在亲和柱上，而VB2和FAD会被洗脱下去。最后利用适配体的互补序列将FMN竞争洗脱下来，通过超滤管离心分离除去游离的DNA，保留滤液得到纯化的FMN。用荧光光谱法定量各黄素的回收量，并根据525nm处的荧光强度计算回收率，具体步骤如前所述。图6是本实施例中FMN分离纯化测试的实验结果。将同样浓度的FMN，VB2和FAD分别利用FMN适配体亲和柱纯化后，回收到的产物的比例。结果如图6所示，FMN的回收率为55.56％，而VB2和FAD的回收率分别为0.64％和0.55％，由原浓度的1∶1∶1变为1∶0.012∶0.0099。根据结果可以推测，利用适配体亲和柱可以将纯度大约为50％的FMN纯化至纯度大于98％，说明了所获适配体在FMN纯化中的应用潜能。
本发明的各方面、实施例、特征及实例应视为在所有方面为说明性的且不打算限制本发明，本发明的范围仅由权利要求书界定。在不背离所主张的本发明的精神及范围的情况下，所属领域的技术人员将明了其它实施例、修改及使用。
在本发明案中标题及章节的使用不意味着限制本发明；每一章节可应用于本发明的任何方面、实施例或特征。
在本发明案通篇中，在将组合物描述为具有、包含或包括特定组份之处或者在将过程描述为具有、包含或包括特定过程步骤之处，预期本发明教示的组合物也基本上由所叙述组份组成或由所叙述组份组成，且本发明教示的过程也基本上由所叙述过程步骤组成或由所叙述过程步骤组组成。
除非另外具体陈述，否则术语“包含(include、includes、including)”、“具有(have、has或having)”的使用通常应理解为开放式的且不具限制性。
应理解，各步骤的次序或执行特定动作的次序并非十分重要，只要本发明教示保持可操作即可。此外，可同时进行两个或两个以上步骤或动作。
尽管已参考说明性实施例描述了本发明，但所属领域的技术人员将理解，在不背离本发明的精神及范围的情况下可做出各种其它改变、省略及/或添加且可用实质等效物替代所述实施例的元件。另外，可在不背离本发明的范围的情况下做出许多修改以使特定情形或材料适应本发明的教示。因此，本文并不打算将本发明限制于用于执行本发明的所揭示特定实施例，而是打算使本发明将包含归属于所附权利要求书的范围内的所有实施例。此外，除非具体陈述，否则术语第一、第二等的任何使用不表示任何次序或重要性，而是使用术语第一、第二等来区分一个元素与另一元素。
Figure BDA0002907559470000141
Figure BDA0002907559470000151
序列表
<110> 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所
<120> 黄素单核苷酸的核酸适配体、其筛选方法及应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
tcgggacgac cgaagggagt ccgactctgg gaaacgacaa gtcccga 47
<210> 2
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 2
cgggacgacg ggaggcgcac atcatgtaca ccgagtgccg tcccg 45
<210> 3
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 3
tcgggacttg tcgtttccca gagtcggact cccttcggtc gtcccga 47
<210> 4
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 4
ggaggctctc gggacgacnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnngt cgtcccgatg 60
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 5
gtcgtcccga gagccata 18
<210> 6
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 6
ggaggctctc gggacgaccg aagggagtcc gactctggga aacgacaagt cccgatgctg 60
caatcgtaag aat 73
<210> 7
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 7
ggaggctctc gggacgacgg gaggcgcaca tcatgtacac cgagtgccgt cccgatgctg 60
caatcgtaag aat 73

Claims (10)

1.一种黄素单核苷酸的核酸适配体，其特征在于：所述核酸适配体具有SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的黄素单核苷酸的核酸适配体，其特征在于：所述核酸适配体具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；和/或，所述核酸适配体的一端经由生物素基团修饰。
3.权利要求1至2中任一项所述的黄素单核苷酸的核酸适配体于制备能够特异性识别和/或纯化黄素单核苷酸的产品中的应用。
4.一种用于分离纯化黄素单核苷酸的捕获试剂，其特征在于：所述捕获试剂包含权利要求1至2中任一项所述的黄素单核苷酸的核酸适配体、固相载体以及所述黄素单核苷酸的核酸适配体的互补序列。
5.根据权利要求4所述的捕获试剂，其特征在于：所述互补序列具有SEQ ID No.3所示的序列；和/或，所述黄素单核苷酸的核酸适配体经由生物素基团修饰的一端与固相载体相连接。
6.一种试剂盒，其特征在于包括权利要求1或2所述的黄素单核苷酸的核酸适配体或者权利要求4至5中任一项所述的用于分离纯化黄素单核苷酸的捕获试剂。
7.一种黄素单核苷酸的分离纯化方法，其特征在于包括：
提供权利要求1至2中任一项所述的黄素单核苷酸的核酸适配体，或者权利要求4至5中任一项所述的用于分离纯化黄素单核苷酸的捕获试剂；以及
使包含核黄素、黄素单核苷酸和黄素腺嘌呤二核苷酸的混合核素分子样品与所述的黄素单核苷酸的核酸适配体，或者用于分离纯化黄素单核苷酸的捕获试剂接触，从而使所述黄素单核苷酸的核酸适配体与黄素单核苷酸特异性结合而实现黄素单核苷酸与其他核素分子的分离，对进而实现黄素单核苷酸的纯化。
8.根据权利要求7所述的分离纯化方法，其特征在于还包括：使所述黄素单核苷酸的核酸适配体与黄素单核苷酸特异性结合而实现黄素单核苷酸与其他核素分子的分离，之后利用黄素单核苷酸的核酸适配体的互补序列进行洗脱，获得黄素单核苷酸。
9.根据权利要求8所述的分离纯化方法，其特征在于，所述分离纯化方法包括：利用链霉亲和素修饰的载体将经由生物素基团修饰的黄素单核苷酸的核酸适配体修饰到载体上；将黄素单核苷酸特异性的固定在亲和柱上之后，利用黄素单核苷酸的核酸适配体的互补序列进行洗脱，从而将黄素单核苷酸释放下来。
10.根据权利要求9所述的分离纯化方法，其特征在于：所述载体包括琼脂糖树脂。
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