CN114032243B - 特异性结合环丙沙星的核酸适配体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种特异性结合环丙沙星的核酸适配体及其用途。所述特异性结合环丙沙星的核酸适配体具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO：1的全长序列60％以上相同并且能够特异性结合环丙沙星的序列，或者，由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列衍生的能够特异性结合环丙沙星的核苷酸序列。本发明还公开了一类核酸适配体的缀合物和核酸适配体的衍生物。本发明所提供的核酸适配体、其缀合物及其衍生物能够特异性结合环丙沙星，该核酸适配体具有高度特异性，且具有分子量小、化学性质稳定、易于保存和标记等优点，可以用于环丙沙星的检测。

Description

特异性结合环丙沙星的核酸适配体及其用途
技术领域
本发明涉及一种核酸适配体，具体涉及一种可用于特异性结合环丙沙星(Ciprofloxacin)的核酸适配体及其用途，属于生物技术领域。
背景技术
环丙沙星别名环丙氟哌酸、适普灵等，外文名：Ciprofloxacin、CPFX、CIPROBAY等。是人工合成的第三代喹诺酮类抗菌药物，是一种新型广谱抗菌药，杀菌力强而迅速。对包括绿脓杆菌、肠道细菌及金黄色葡萄球菌在内的革兰阳性和阴性菌均有杀菌作用。临床多用其盐酸盐，用于呼吸道感染、泌尿道感染、肠道感染、胆道各系统感染、腹腔内感染、妇科疾病感染、骨关节感染及全身严重感染的治疗。
抗生素对细菌感染性疾病的治疗至关重要，但是当过分使用，释放到环境中时，它们可能会影响整个生态系统的平衡并导致耐药菌的产生，从而对人类健康产生重大影响。近年来，由于抗生素的不规范使用，尤其是在动物护理领域的使用不当和预防性使用，抗生素耐药菌的产生和相应的污染已成为全球范围的一个严重问题。环丙沙星属于抗生素的一种，也存在这一问题。目前环丙沙星的检测方法主要是依赖气相色谱-质谱法，液相色谱-串联质谱法，高效液相色谱等方法，色谱法检测灵敏度较高，检测结果准确，但是需要昂贵的仪器设备，对检测材料的要求很高，需要提纯处理，并且耗时，需要专业的技术人员，无法实现快速便捷的检测。因此，越来越需要开发用于快速评估抗生素及其残留物的稳定、简便、灵敏和低成本的方法。而生物传感器的成本低，专一性好，准确性高，只对特定的底物起反应，因此一般不需要进行样品的预处理，干扰少，分析速度快，操作简单，容易实现自动化分析，因此可以很好的避免现有检测手段的缺陷。其中，基于核酸适配体的生物传感器(apta-sensors)因其良好的选择性，特异性和灵敏度而备受关注。
核酸适配体(aptamer)是指通过指数富集的配基系统进化技术(SELEX)筛选分离得到的DNA或者RNA分子，它可以与靶标如蛋白质、金属离子、小分子、多肽甚至整个细胞高亲和力和特异性的结合，因此在生化分析，环境监测，基础医学，新药合成等方面展示广阔的前景。核酸适配体与抗体相比分子量小，稳定性更好，易改造修饰，无免疫原性，制作周期短，可以通过人工合成，免去了动物免疫、饲养、蛋白提取和纯化等一系列流程，因此核酸适配体是一种非常理想的分子探针。
基于SELEX的方法，筛选出结合特定小分子的核酸适配体，并将该核酸适配体用于小分子的检测，目前也被广泛研究。针对于环丙沙星的核酸适配体目前报道的还很少，因此，本领域对针对环丙沙星有高结合亲和力的核酸适配体存在需求。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种具有高度特异性、分子量小、化学性质稳定、易于保存和标记的能够结合环丙沙星的核酸适配体及其衍生物，还相应提供所述核酸适配体的用途。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种特异性结合环丙沙星的核酸适配体，它具有如SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO：1的全长序列60％以上相同并且能够特异性结合环丙沙星的序列，或者，由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列衍生的能够特异性结合环丙沙星的核苷酸序列。
进一步地，所述核酸适配体包含能够与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
进一步地，所述核酸适配体包含由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列转录且能特异性结合环丙沙星的RNA序列。
本发明实施例还提供了一类核酸适配体的缀合物，所述核酸适配体的缀合物是经过在前述特异性结合环丙沙星的核酸适配体的核苷酸序列上连接选定物质而获得的，所述核酸适配体的缀合物具有能够特异性结合环丙沙星的功能，所述选定物质包括荧光标记物、放射性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、酶标记物中的至少任意一种。
本发明实施例还提供了一类核酸适配体的衍生物，所述核酸适配体的衍生物是由前述特异性结合环丙沙星的核酸适配体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架序列，或者是由前述特异性结合环丙沙星的核酸适配体改造成的肽核酸，所述核酸适配体的衍生物具有能够特异性结合环丙沙星的功能。
本发明实施例还提供了所述特异性结合环丙沙星的核酸适配体、核酸适配体的缀合物或核酸适配体的衍生物在制备能够检测环丙沙星的产品中的用途。
相应的，本发明实施例还提供了一种能够检测环丙沙星的产品，其包含前述的特异性结合环丙沙星的核酸适配体、核酸适配体的缀合物或核酸适配体的衍生物。
与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：
本发明所提供的核酸适配体、其缀合物及其衍生物能够特异性结合环丙沙星，该核酸适配体具有高度特异性，且具有分子量小、化学性质稳定、易于保存和标记等优点，可以用于环丙沙星的检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1中筛选环丙沙星核酸适配体的实验方法示意图；
图2是本发明实施例1中筛选过程中流式分选收集微珠时设置的流式的参数图，其中A对应的左图为对照微珠根据FSC信号和SSC信号圈出单个微珠群(黑色框)，右图为对照微珠的单个微珠群使用仪器的荧光通道采集到的荧光信号；B对应的左图为样品微珠根据FSC信号和SSC信号圈出单个微珠群(黑色框)，右图为样品微珠的单个微珠群使用仪器的荧光通道采集到的荧光信号；
图3A和图3B分别是对照序列、本发明实施例2中圆二色谱检测筛选得到的核酸适配体CFX-8与环丙沙星相互作用的亲和力数据结果图；
图4是本发明实施例3中等温滴定微量热方法检测筛选得到的核酸适配体CFX-8与环丙沙星相互作用的亲和力数据结果图；
图5是基于氧化石墨烯以及本发明实施例1筛选得到的核酸适配体CFX-8用于环丙沙星的检测结果图。
具体实施方式
鉴于现有技术中的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，其主要是使用SELEX技术，筛选得到了特异性结合环丙沙星的单链DNA核酸适配体。具体的，本案发明人合成了一个随机单链DNA文库和相应的引物，用来筛选具有高度特异性、化学性质稳定、易于保存和标记的能够结合环丙沙星的核酸适配体，由此筛选得到了特异性结合环丙沙星的核酸适配体并检测了该核酸适配体与环丙沙星的结合能力以及开发了基于该核酸适配体的环丙沙星检测方法。
作为本发明的一个方面，本发明提供了一种特异性结合环丙沙星的核酸适配体，它具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO：1的全长序列60％以上相同并且能够特异性结合环丙沙星的序列，或者，由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列衍生的能够特异性结合环丙沙星的核苷酸序列。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。
进一步地，所述核酸适配体包含能够与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列在严格条件下杂交的核苷酸序列。
进一步地，所述核酸适配体包含由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列转录且能特异性结合环丙沙星的RNA序列。
作为一些优选技术方案，所述核酸适配体包含以下或由以下组成：
(1)如下所示的核苷酸序列：SEQ ID NO.1(以下亦可称为“CFX-8”)：
5’-TGCTGGATGTTCTGACTAAAGCGACATGTTGTGCTGTTCTTTGGCCTGACACATCCAGC-3’
或者，(2)与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有高同源性(至少60％同源性)并且能够特异性结合环丙沙星的核苷酸序列，例如可将SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列删除或增加部分核苷酸；
或者，由(1)或(2)的核苷酸序列转录且特异性结合环丙沙星的RNA序列。
作为一些优选技术方案，所述核酸适配体的核苷酸序列上的至少选定位置是经过修饰的，且修饰的核酸适配体能够特异性结合环丙沙星，所述修饰的方式包括磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧、同位素化等中的至少任意一种，但不限于此。
另外，本领域技术人员应该理解，作为对上述技术方案的改进，可对上述核酸适配体的核苷酸序列上的某一位置进行修饰，例如，磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧或连接同位素化等，条件是这样修饰后得到的核酸适配体序列具有合乎需要的性质，例如，可以具有与修饰前的母体核酸适配体序列相等或更高的结合环丙沙星的亲和力，或虽然亲和力没有明显提升但是具有更高的稳定性。
作为一些优选技术方案，所述核酸适配体的核苷酸序列上连接有荧光标记物(如FAM)、放射性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、酶标记物等中的至少任意一种，但不限于此。
作为本发明的另一个方面，还提供了核酸适配体的缀合物。所述核酸适配体的缀合物是经过在所述特异性结合环丙沙星的核酸适配体的核苷酸序列上连接选定物质而获得的，所述核酸适配体的缀合物具有能够特异性结合环丙沙星的功能。本领域技术人员应该理解，作为对上述技术方案的改进，可在上述核酸适配体的核苷酸序列上连接荧光物质(如FAM)、放射性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料或酶标记等，条件是这样修饰后得到的核酸适配体序列具有合乎需要的性质。
换言之，以上不论是经部分取代或经过修饰后的核酸适配体序列，都具有原核酸适配体基本相同或类似的分子结构、理化性质和功能，都可应用于与环丙沙星的结合。
此外，作为一个总的技术构思，本发明还提供核酸适配体的衍生物，所述衍生物是由前述所有技术方案中所述核酸适配体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架，或者是前述所有技术方案中所述核酸适配体改造成的相应肽核酸。条件是所述衍生物都具有与原核酸适配体基本相同或类似的分子结构、理化性质和功能，且都具有能够特异性结合环丙沙星的功能。
本发明所使用的术语“硫代磷酸酯骨架”具有本领域普通技术人员一般理解的含义，其是指RNA和DNA核酸适配体的磷酸二酯骨架的非桥键氧原子可以被一个或两个硫原子取代，分别产生具有硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键的硫代磷酸酯骨架。已知这样的硫代磷酸酯骨架具有增加的对其靶标的结合亲和力，以及对核酸酶降解的增强的抗性。
本发明所使用的术语“肽核酸”具有本领域普通技术人员一般理解的含义，其是指一种人工合成DNA分子类似物，用N-2-(氨乙基)-甘氨酸(N-(2-aminoethyl)-glycine)单位代替糖-磷酸酯骨架作为重复结构单元，合成了以肽键连接的寡核苷酸模拟物，称为肽核酸。由于肽核酸(PNA)没有如DNA或RNA上的磷酸基团，因此PNA与DNA之间缺乏电性相斥的现象，使两者之间的结合强度大于DNA与DNA之间的结合强度。
在另一个方面，本发明还提供前述任一种所述的特异性结合环丙沙星的核酸适配体或上述核酸适配体的缀合物或上述的核酸适配体的衍生物在制备能够检测环丙沙星的产品中的用途。
进一步地，所述产品至少具有能够特异性结合环丙沙星的功能。
相应的，本发明的另一个方面还提供一种能够检测环丙沙星的产品，其包含前述的任一种特异性结合环丙沙星的核酸适配体、核酸适配体的缀合物或核酸适配体的衍生物。
综上所述，本发明所提供的核酸适配体具有高度特异性，且具有分子量小、化学性质稳定、易于保存和标记等优点，可以用于环丙沙星的检测。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面参照具体的实施例及附图进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，以下的实施例便于更好的理解本发明，本发明并不限于这些具体的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为常规生化试剂，可通过商业途径购买得到。
实施例1特异性结合环丙沙星的ssDNA核酸适配体的筛选
1、合成以下序列所示的随机单链DNA文库和引物：
随机单链DNA文库：
SEQ ID NO：2：
5’-GTTCGTGGTGTGCTGGATGTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTGACACATCCAGCAGCACGA-3’
其中，36个“N”表示36个任意的核苷酸碱基连接而成的序列。该文库由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
引物信息如表1，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
表1引物及其序列
其中，引物名称中的S1代表正向引物，引物名称中A2代表反向引物，序列中的19个A表示由19个腺苷酸(A)组成的polyA尾，“Spacer 18”表示18原子的六乙二醇间臂。在上述A2-ployA引物中所用的“Spacer 18”结构式如下式所示。
引物分别用DPBS缓冲液(氯化钙0.1g/L，氯化钾0.2g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，六水氯化镁0.1g/L，氯化钠8g/L，十二水磷酸氢二钠2.8915g/L；PH7.4)配制成100μM的贮存液，于-20℃保存备用。
2、磁珠法固定文库筛选环丙沙星核酸适配体
采用磁珠固定互补引物，捕获文库，然后用小分子竞争结合将文库洗脱的方法，共计筛选4轮，筛选流程见图1。具体筛选方法如下：
2.1文库溶解：取出上海生工合成的文库干粉用12000rpm离心5min。加入280μLDPBS缓冲液，将文库稀释成5μM，涡旋混匀，然后12000rpm离心2min。
2.2文库与捕获引物匹配：将溶解好的捕获引物：S1-CS-biotin吸取28μL加入到刚才溶解的文库中，使S1-CS-biotin引物终浓度为约10μM，涡旋30秒充分混匀捕获引物和文库。将文库与捕获引物的混合液分装到PCR管中，使用PCR仪设置如下程序，95℃孵育10min，缓慢降温到60℃，降温速率0.1℃/s；然后在60℃维持1min；然后缓慢降温至25℃，降温速率为0.1℃/s。将该变复性好的文库与互补引物混合液，取2μL用紫外(A260)测定浓度为C1。
2.3磁珠清洗：吸取1mL链霉亲和素磁珠(SA-磁珠，ThermoFisher，DynabeadsTMMyOneTM Streptavidin C1；货号65001)，使用DPBS清洗磁珠4次，每次体积为400μL，磁力架进行分离清洗。
2.4将步骤2.2得到的变复性完成后的文库与互补引物混合液加入步骤2.3的磁珠中，混匀，室温旋转仪上孵育45min，利用磁力架进行分离，回收上清，取2μL上清测定紫外(A260)浓度得到数值C2。根据测定的浓度，可以粗略计算出文库偶联到磁珠上的大概的效率。文库固定效率≈(C1-C2)/C1，第一轮筛选文库固定效率大于80％，之后每一轮文库固定效率大于70％，继续筛选。
2.5清洗：上一步中得到的磁珠进行清洗，每次往磁珠中加入400μL漂洗缓冲液重悬磁珠，然后磁力架吸附磁珠，弃上清。重复清洗操作4遍。(从第二轮筛选开始每一步清洗的缓冲液体积减少到200μL)。紧接着对磁珠进行一次长时间清洗，即加入400μL漂洗缓冲液将磁珠悬浮后，置于摇床孵育30min，然后强磁铁吸附磁珠，去上清。(从第二轮筛选开始此步漂洗缓冲液也只使用200μL)。
2.6洗脱：将盐酸环丙沙星(索莱宝，货号：C9371)用DPBS溶解成1mM母液，DPBS将其稀释到100μM备用。将200μL的浓度为100μM的环丙沙星加到步骤2.5得到的SA-磁珠中，摇床孵育45min。利用磁力架分离后，取上清并标记为Elution。
3.PCR扩增以及次级文库制备
3.1扩增双链：以Elution中的核酸分子为模板，PCR进行扩增，将所有的Elution加入2mL的PCR预混液中充分混匀，扩增条件如下：95℃预变性2min；然后95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共25个循环；最后4℃保存。PCRmix的配方见表2，Pfu酶和dNTP混合液购自上海生工。
表2 PCR预混液配方
试剂 总体积1000μL
ddH2O 866μL
10×pfu酶缓冲液 100μL
dNTP混合液(10mM) 20μL
正向引物S1-FAM(100μM) 5μL
反向引物A2-polyA(100μM) 5μL
Pfu酶 4μL(20U)
3.2扩增产物用正丁醇浓缩：将所有的PCR产物收集到15mL离心管中，加入正丁醇至14毫升，在旋涡混合器上震荡以充分混匀；使用台式离心机，9000rpm(转/分钟)室温离心3min；移弃上相(正丁醇)，回收最下层澄清的液体，即浓缩的PCR产物。
3.3制备单链：在获得的浓缩的PCR产物中按体积比1∶1加入TBE/尿素变性缓冲液，煮沸10min使DNA变性，将所有的样品进行尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，400V电压下电泳至溴酚蓝到达胶底部，使FAM标记的链与加长的反义链分开。7M尿素变性聚丙烯酰胺凝胶配方如表3。
表3变性聚丙烯酰胺凝胶配方
成分 用量
尿素 3.78g
40％聚丙烯酰胺 1.8mL
5×TBE 1.8mL
ddH2O 2.25mL
10％APS 60μL
四甲基乙二胺(TEMED) 15μL
切胶回收FAM标记的链：将凝胶取出放在塑料膜上，使用凝胶成像系统(美国通用电气公司，LAS4000)设置Ex(nm)：495，Em(nm)：517，检测我们需要的带有FAM标记的ssDNA；用干净的刀片将目的条带直接切下，将胶条转移至1.5mL EP管中并捣碎，加入1mL ddH2O后沸水浴10min，胶中的ssDNA会转移到溶液中，然后12000rpm离心1min，回收上清，将上清转移到15mL的离心管中。再次取1mL超纯水至碎胶中，重复煮沸离心一次，将上清全部转移至同一个15mL离心管中。向15mL离心管中，加11mL正丁醇，上下颠倒充分混匀，然后9000rpm离心3min。离心后，收集下层单链文库回收。得到的DNA单链用3.5KD的透析袋于4℃透析过夜，即得到用于下一轮筛选的次级文库。
4.多轮筛选：接下来的2～4轮筛选中，每次操作均以前一次操作中得到的次级文库为起始核酸文库，文库的固定都采用了如下的浓度和体积：文库为700nM×100μL；互补引物S1-CS-biotin为：100μM×1.4μL；SA磁珠每一轮用量为70μL。筛选到第4轮后，完成磁珠法筛选。
5.分选流式筛选第5轮
操作流程：首先将修饰了氨基的引物S1-NH2连接到羧基PS微珠(聚苯乙烯微珠，购买自Bangs Laboratories，货号PC05N)表面，再将文库用不对称PCR预混液(配方见表4)稀释到1pM，与磁珠混合均匀后通过微流控系统产生乳浊液，进行乳浊液PCR扩增，将文库扩增到微珠表面。然后从乳浊液中回收微珠，将单克隆微珠与靶标环丙沙星孵育以进行结合，去除上清，回收微珠，用流式分选收集荧光值较高的微珠20个，具体步骤如下：
5.1制备带有S1-NH2的PS微珠：取50μL PS微珠置于1.5mL的EP管中，PS微珠用100mM NaOH清洗一遍再用ddH2O清洗4遍(每次清洗后样品均用离心机5000rpm离心2min，弃掉上清)；取出一支5nmol的S1-NH2引物，加40μL的DPBS对其进行溶解，溶解后瞬离1min，取出20μL备用，再取5μL 4M的NaCl，25μL 1M的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(1M))，50μL的DMSO(二甲基亚砜)混合后放置室温孵育过夜(最后得到的总体积为100μL，NaCl为200mM，S1-NH2为25μM，DMSO为50％，EDC为250mM)；PS微珠用DPBS离心清洗4-5次，第一次清洗的时候加400μL DPBS直接离心清洗，最终微珠重悬在200μL的DPBS中备用。
5.2文库扩增至微珠上：采用乳浊液PCR扩增
使用的不对称PCR预混液配方如下：
表4不对称PCR预混液配方
试剂 体积
ddH2O 860μL
10×pfu酶缓冲液 100μL
dNTP混合液(10mM) 20μL
正向引物S1(100μM) 0.4μL
反向引物A2(100μM) 15μL
Pfu酶 4μL(20U)
方法如下：取1mL不对称PCR预混液，加入磁珠法筛选所得的第4轮文库(终浓度1nM)涡旋混匀，加入5.1步制备的微珠30μL，充分混匀。使用ePCR微液滴生成油(安徽省昂普拓迈生物科技有限责任公司，EPO-100)，用微流控系统制备油包水的乳浊液并且进行扩增，扩增条件如下：95℃预变性2min，95℃变性45秒，60℃退火45秒，72℃延伸60秒，共35个循环，4℃保存。扩增完成后，5000g离心将PS微珠离至底部，然后加入8mL正丁醇，混匀后，5000g离心8min破乳回收沉淀到底部的PS微珠，加入400μL无水乙醇清洗微珠后5000g离心3min，去上清，再使用TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH＝8.0)清洗2遍，5000g离心3min，去上清，最后使用ddH2O清洗2遍，5000g离心3min，去上清，得到的含有双链DNA的PS微珠，加入50μL ddH2O保存备用。
配制将dsDNA解成ssDNA的解链缓冲液配方如下：
无核酸酶的水 790μL
1M氢氧化钠 200μL
吐温20 10μL
将连有双链DNA的PS微珠用5000g离心3min，去上清，加入1mL解链缓冲液，室温孵育30min，将孵育结束后微珠去上清，得到连接了富集文库pool4的PS微珠，用DPBS清洗3遍，微珠重悬于30μL DPBS中备用。
5.3分选收集：使用分选流式细胞仪(美国贝克曼库尔特有限公司，moflo AstriosEQ)对微珠进行分选，分选时设置的具体参数为图2所示，A显示的是只连接了引物的微珠与环丙沙星孵育之后的流式图，其中，A对应的左图为对照微珠根据FSC信号和SSC信号圈出单个微珠群(黑色框)，右图为对照微珠的单个微珠群使用仪器的荧光通道采集到的荧光信号。B显示的是pool4-PS微珠与环丙沙星孵育之后的流式图，其中，B对应的左图为样品微珠根据FSC信号和SSC信号圈出单个微珠群(黑色框)，右图为样品微珠的单个微珠群使用仪器的荧光通道采集到的荧光信号，收集的微珠为B对应黑框内的微珠，收集微珠个数为20个，20个微珠直接收集到一个PCR管中进行扩增，获得扩增后的产物进行下一步高通量测序。
6.将得到的富集文库产物经高通量测序(北京诺禾致源科技股份有限公司)，分析后挑选排序前20以内的若干条序列由通用生物系统(安徽)有限公司合成，然后检测亲和力。
在后续检测中，确定了若干条具有很强的结合能力的序列，将它们去除部分引物区，得到了有亲和力的序列，挑选出CFX-8做下一步的应用。
实施例2：用圆二色谱检测核酸适配体CFX-8与环丙沙星的亲和力
1.将通用生物合成的核酸适配体CFX-8用DPBS溶解稀释成浓度5μM。
2.将环丙沙星用DPBS稀释到浓度为1mM，分别取30μL的浓度为1mM的环丙沙星和30μL的对照序列C9(SEQ ID NO：9)加入到120μL浓度为5μM的CFX-8中，终体积150μL。摇床孵育30min。C9的序列信息为：GTCGGTGATCACCGAAGGGGGGGCGGACACAACGGAAGGCACGGTTGGACTGAGTCGGA。
3.测定CD值。仪器型号为：JASCO Corp.，J-810；测试时的参数为：扫描的起始和终止波长分别为320nm和220nm；Data Pitch：0.5nm；扫描速度：100nm/min；Accumulatio n：2。
4.结果如图3A和图3B所示，可见与对照序列相比，CFX-8与靶标结合后CD谱发生了明显的变化，提示二者之间发生了相互作用。
实施例3：等温滴定微量热仪(ITC)检测特异性结合环丙沙星的核酸适配体和环丙沙星的亲和力
1.将通用生物合成的核酸适配体CFX-8和对照序列C9(SEQ ID NO：9)分别用DPBS稀释成20μM。
2.将环丙沙星用DPBS稀释成1mM。
3.使用仪器PEAQ-ITC进行滴定，用环丙沙星滴定核酸适配体，环丙沙星分20滴注射到浓度为20μM的核酸适配体CFX-8的样品池中，得到如图4所示的结果，CFX-8与环丙沙星之间滴定过程有热量的释放，二者有结合。
实施例4基于核酸适配体检测环丙沙星
1.将从通用生物合成的FAM标记的CFX-8用水稀释到10μM，然后使用的时候用DPBS稀释到100nM。
2.吸取氧化石墨烯(浓度为10mg/ml)，用DPBS稀释到0.1mg/ml。然后将100nM的FAM标记的CFX-8吸取400μL加入到400μL的0.1mg/mL氧化石墨烯中，放置于-20℃冷冻十分钟后，拿到室温溶解，取4份，每份体积198μL。
3.将盐酸环丙沙星用DPBS分别稀释到10μM、20μM、30μM的浓度，然后各吸取2μL分别加入到上一步的4份的氧化石墨烯和CFX-8的混合物中，将这4个样品加入96孔酶标板中，室温孵育30min。同时再单独加一个50nM的FAM标记的CFX-8作为对照。
4.使用酶标仪(TECAN，Spark)检测，检测参数为：激发波长480nm；发射波长从500nm扫描到600nm，扫描步径为1nm。从图5中可见，石墨烯可以完全淬灭FAM标记的CFX-8上的FAM荧光，加入靶标环丙沙星使FAM标记的适配体从石墨烯上脱落从而恢复荧光，且加入的靶标浓度越高，荧光值恢复的越高。
此外，本案发明人还参照前述实施例，以本说明书述及的其它原料、工艺操作、工艺条件进行了试验，并均获得了较为理想的结果。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所
<120> 特异性结合环丙沙星的核酸适配体及其用途
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
tgctggatgt tctgactaaa gcgacatgtt gtgctgttct ttggcctgac acatccagc 59
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 2
gttcgtggtg tgctggatgt tgacacatcc agcagcacga 40
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 3
gttcgtggtg tgctggatgt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 4
gttcgtggtg tgctggatgt 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 5
tcgtgctgct ggatgtgtca 20
<210> 6
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 6
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaatcgtg ctgctggatg tgtca 45
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 7
acatccagca caccacgaac 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 8
gttcgtggtg tgctggatgt 20
<210> 9
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 9
gtcggtgatc accgaagggg gggcggacac aacggaaggc acggttggac tgagtcgga 59

Claims (4)

1.一种特异性结合环丙沙星的核酸适配体，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一类核酸适配体的缀合物，其特征在于，所述核酸适配体的缀合物是经过在权利要求1中所述特异性结合环丙沙星的核酸适配体的核苷酸序列上连接选定物质而获得的，所述核酸适配体的缀合物具有能够特异性结合环丙沙星的功能，所述选定物质包括荧光标记物、放射性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、酶标记物中的至少任意一种。
3.权利要求1所述的特异性结合环丙沙星的核酸适配体在制备能够检测环丙沙星的产品中的用途。
4.一种能够检测环丙沙星的产品，其特征在于包含权利要求1所述的特异性结合环丙沙星的核酸适配体。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150003013A (ko) * 2013-06-28 2015-01-08 호서대학교 산학협력단 엔로플록사신 또는 시프로플록사신에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머
CN105316342A (zh) * 2015-12-10 2016-02-10 河南省农业科学院 一条可与环丙沙星特异结合的核酸适配体及其应用
CN112029771A (zh) * 2019-11-13 2020-12-04 安徽省昂普拓迈生物科技有限责任公司 一种特异性结合哌替啶的核酸适配体及其应用
CN112143732A (zh) * 2019-06-28 2020-12-29 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 特异性识别N-cadherin的ssDNA适配体、其筛选方法及应用
CN112779260A (zh) * 2021-01-20 2021-05-11 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 黄素单核苷酸的核酸适配体、其筛选方法及应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150003013A (ko) * 2013-06-28 2015-01-08 호서대학교 산학협력단 엔로플록사신 또는 시프로플록사신에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머
CN105316342A (zh) * 2015-12-10 2016-02-10 河南省农业科学院 一条可与环丙沙星特异结合的核酸适配体及其应用
CN112143732A (zh) * 2019-06-28 2020-12-29 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 特异性识别N-cadherin的ssDNA适配体、其筛选方法及应用
CN112029771A (zh) * 2019-11-13 2020-12-04 安徽省昂普拓迈生物科技有限责任公司 一种特异性结合哌替啶的核酸适配体及其应用
CN112779260A (zh) * 2021-01-20 2021-05-11 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 黄素单核苷酸的核酸适配体、其筛选方法及应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ultraselective antibiotic sensing with complementary strand DNA assisted aptamer/MoS2 field-effect transistors;Xiaoyan Chen等;《Biosensors and Bioelectronics》;第1-8页 *

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