JP6679576B2 - 小胞性リンカー、ならびに核酸ライブラリ構築およびシーケンシングにおけるその使用 - Google Patents

小胞性リンカー、ならびに核酸ライブラリ構築およびシーケンシングにおけるその使用 Download PDF

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Description

本開示はバイオテクノロジー分野に関し、特に、小胞性アダプター、核酸ライブラリ構築方法、および核酸ライブラリシーケンシング方法に関する。
第二世代シーケンシング技術は、次世代シーケンシング技術としても知られ、サンガーシーケンシング法に代表される第一世代シーケンシング技術と対応させて称される。第二世代シーケンシング技術の代表的なものとしては、Ｒｏｃｈｅ／４５４パイロシーケンシング、Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａポリメラーゼ合成シーケンシング、およびＡＢＩ／ＳＯＬｉＤリガーゼシーケンシングが挙げられ、これらはいずれも、シーケンシングスループットが高いことを特徴とする。こうした主流のシーケンシングプラットフォームと比較してＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ＣＧ）シーケンシングプラットフォームは、スループットが最も高く、１回あたり９．９ＴＢものデータを出力でき、１時間あたりでは５０Ｇｂに達する場合もある。このデータ出力量は、上記主流のシーケンシングプラットフォームによるデータ出力量の１０〜２５倍である。単相リード長に関していえば、上記主流のシーケンシングプラットフォームの中ではＩｌｌｕｍｉｎａシーケンサーのみが単相リード長８〜１０ｋｂを達成できるのに対し、ＣＧシーケンサーのリード長は９９ｋｂを超える場合がある。また、ＣＧシーケンサーは精度が９９．９９９％に達する場合もあり、この精度は他の市販のシーケンサーよりも優れている。このように、ＣＧシーケンシングプラットフォームは、上記主流のシーケンシングプラットフォームにはない利点を有している。
核酸シーケンシングライブラリを構築する過程では、通例、配列が既知のシーケンシング用アダプターを導入する必要がある。ただ、報告によれば、ライブラリ構築においてアダプターをライゲーションする際のライゲーション効率は十分でなく、また多くの副生成物が低レベルで生成する。さらに、ＣＧシーケンシングプラットフォームではシーケンシングに環状一本鎖ライブラリを使用するため、上記主流のシーケンシングプラットフォームで構築される直鎖状二重鎖ライブラリはＣＧシーケンサーには適さない。現在のところ、核酸シーケンシング用の環状一本鎖ライブラリを構築する方法について報告している文献はない。
上記状況に鑑みて、本分野では、高ライゲーション効率および高精度を有するアダプターの開発が緊急に必要とされている。
本開示の目的は、実施形態において、高効率核酸シーケンシング用の環状一本鎖ライブラリを構築するための小胞性アダプターを提供することである。
本開示の別の目的は、実施形態において、上記環状一本鎖ライブラリを構築する方法および上記環状一本鎖ライブラリをシーケンシングする方法を提供することである。
本開示の第１の態様の実施形態において、核酸ライブラリを構築するためのオリゴヌクレオチド小胞性アダプターが提供され、上記オリゴヌクレオチド小胞性アダプターは、
リン酸化末端塩基を含む５’対形成二本鎖領域を、上記オリゴヌクレオチド小胞性アダプターの第１末端において、
粘着末端を含む３’対形成二本鎖領域を、上記オリゴヌクレオチド小胞性アダプターの第２末端において、かつ
小胞性対非形成領域を、上記５’対形成二本鎖領域と上記３’対形成二本鎖領域の間において
有し、
上記小胞性対非形成領域は第１の鎖および第２の鎖を含み、上記第１の鎖および上記第２の鎖は互いに相補的でなく、上記第１の鎖の方が上記第２の鎖より長い。
本開示の一実施形態において、上記３’対形成二本鎖領域の上記粘着末端はテール状塩基１個を有する。
本開示の一実施形態において、上記テール状塩基１個はチミン（Ｔ）である。
本開示の一実施形態において、上記小胞性対非形成領域の上記第１の鎖の一部または全部がシーケンシング用プライマーとの対形成領域として使用される。
本開示の一実施形態において、上記シーケンシング用プライマーとの対形成領域は、
上記５’対形成二本鎖領域の第１の鎖の少なくとも一部でありかつ上記小胞性対非形成領域の上記第１の鎖の上流に位置する第１の部分を、任意に含み、
上記小胞性対非形成領域の上記第１の鎖の一部または全部である第２の部分を含み、かつ、
上記３’対形成二本鎖領域の第１の鎖の少なくとも一部でありかつ上記小胞性対非形成領域の上記第１の鎖の下流に位置する第３の部分を、任意に含む。
本開示の一実施形態において、上記オリゴヌクレオチド小胞性アダプターの長さが少なくとも２０ｎｔ、好ましくは２５〜５０ｎｔ、より好ましくは３０〜４５ｎｔである。
本開示の一実施形態において、上記小胞性対非形成領域の上記第１の鎖は上記小胞性対非形成領域の上記第２の鎖より少なくとも５〜３０ｎｔ長い。
本開示の一実施形態において、上記５’対形成二本鎖領域は平滑末端または粘着末端を有する。
本開示の一実施形態において、上記５’対形成二本鎖領域の上記粘着末端は非相補的塩基を１〜３個含む。
本開示の一実施形態において、上記オリゴヌクレオチド小胞性アダプターは、センス鎖
およびアンチセンス鎖を含み、５’末端→３’末端の方向に式Ｉの構造を有する：
Ｙ０−Ｙ１−Ｙ２（Ｉ）
式中、
Ｙ０は上記５’対形成二本鎖領域を表し、その長さは１０〜１５ｎｔ、好ましくは１１
ｎｔであり、
Ｙ１は小胞性対非形成領域を表し、前記小胞性対非形成領域のセンス鎖は、前記小胞性対非形成領域のアンチセンス鎖より５〜３０ｎｔ長く、
Ｙ２は上記３’対形成二本鎖領域を表す。
本開示の一実施形態において、上記オリゴヌクレオチド小胞性アダプターは以下の配列を有する：
５’−ＧＴＣＣＴＡＡＧＡＣＣＮＧＡＴＣＧＧＧＣＴＴＣＧＡＣＴＧＧＡＧＡＣＴＣＣＧＡＣＴＴ−３’（配列番号１）
５’−／ｐｈｏｓ／ＡＧＴＣＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧＣＧＧＴＣＴＴＡＧＧＡＣＡＴ−３’（配列番号２）。
本開示の第２の態様の実施形態において、キットが提供される。上記キットは、
容器、
上記容器の中に入った、請求項１におけるライブラリ構築用のオリゴヌクレオチド小胞
性アダプター、
上記オリゴヌクレオチド小胞性アダプターの上記小胞性対非形成領域の上記第１の鎖の相補鎖と特異的に対形成する第１のプライマー、
上記ライブラリを構築するためのＰＣＲ増幅を始めるように、上記オリゴヌクレオチド小胞性アダプターの上記小胞性対非形成領域の上記第２の鎖と特異的に対形成する第２のプライマー、ここで、上記第１のプライマーが、上記第２のプライマーの存在下で得られた第１の増幅産物に特異的に結合する能力を有し、および
説明書
を含む。
本開示の一実施形態において、上記オリゴヌクレオチド小胞性アダプターは容器に入っている。
本開示の第３の態様の実施形態において、環状一本鎖ライブラリを構築する方法が提供される。上記方法は、
（ａ）二本鎖ＤＮＡ断片をエンドリペアして、平滑末端を有する二本鎖ＤＮＡ断片を取得し、
（ｂ）（ａ）で得た平滑末端を有する二本鎖ＤＮＡ断片の３’末端にアデニン（Ａ）塩基を付加して、３’末端にＡ塩基を有する二本鎖ＤＮＡ断片を取得し、
（ｃ）（ｂ）で得た３’末端にＡ塩基を有する二本鎖ＤＮＡ断片の各末端にオリゴヌクレオチド小胞性アダプターをライゲーションさせて、各末端に上記オリゴヌクレオチド小胞性アダプターがライゲーションされた二本鎖ＤＮＡ断片を取得し、
（ｄ）（ｃ）で得た各末端に上記オリゴヌクレオチド小胞性アダプターがライゲーションされた二本鎖ＤＮＡ断片を鋳型として、上記オリゴヌクレオチド小胞性アダプターの配列を特異的に標的とするプライマー対と共に、ＰＣＲ増幅に供して、ＤＮＡ増幅産物を取得し、上記プライマー対の１つはビオチン標識されたものであり、
（ｅ）（ｄ）で得たＤＮＡ増幅産物から、アビジン被覆ビーズを使用し「アビジン−ビオチン」結合により、一本鎖ＤＮＡを単離し、
（ｆ）（ｅ）で得た一本鎖ＤＮＡを環状一本鎖分子の存在下において環化に供して、環状産物を含有する混合物である環状一本鎖ライブラリを取得する
工程を有する。
本開示の一実施形態において、（ｃ）で得た各末端に上記オリゴヌクレオチド小胞性アダプターがライゲーションされた二本鎖ＤＮＡ断片は式ＩＩＩの構造を有する：
Ｋ１−Ｋ２−Ｋ３（ＩＩＩ）
式中、
Ｋ１は上記オリゴヌクレオチド小胞性アダプター１つを表し、
Ｋ２は任意のＤＮＡ配列（シーケンシングする断片の配列）を表し、
Ｋ３は上記別のオリゴヌクレオチド小胞性アダプターを表し、
Ｋ１およびＫ３はＫ２の２つの末端のそれぞれにおいてＫ２に結合している。
本開示の一実施形態において、Ｋ２の長さは約１５０ｂｐ〜約２５０ｂｐである。
本開示の一実施形態において、上記方法は、
（ｇ）（ｆ）で得た混合物に含まれる非環化一本鎖ＤＮＡを、直鎖ＤＮＡを特異的に消化するヌクレアーゼを用いて消化して、前生成物（ｐｒｅ−ｐｒｏｄｕｃｔ）を取得し、
（ｈ）（ｇ）で得た前生成物を精製して環状一本鎖ライブラリを取得する
工程をさらに有する。
本開示の一実施形態において、（ａ）の二本鎖ＤＮＡ断片の調製は、
（ａ０）ｍＲＮＡサンプルを断片化して断片化ｍＲＮＡを取得し、
（ａ１）上記断片化ｍＲＮＡを逆転写に供して、ｃＤＮＡ増幅産物を上記二本鎖ＤＮＡ断片として取得する
ことによって実施される。
本開示の一実施形態において、（ａ）の二本鎖ＤＮＡ断片はＤＮＡサンプルを断片化することによって得られる。
本開示の一実施形態において、（ｅ）のアビジンはストレプトアビジンである。
本開示の一実施形態において、（ｄ）のプライマー対は、
順方向プライマー５−／ｐｈｏｓ／ＡＧＡＣＡＡＧＣＴＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＡＴＣＧＧＧＣＴＴＣＧＡＣＴＧＧＡＧＡＣ（配列番号３）および
逆方向プライマー５−／ｂｉｏ／ＴＣＣＴＡＡＧＡＣＣＧＣＴＴＧＧＣＣＴＣＣＧＡＣＴ（配列番号４）
を含み、
５−／ｐｈｏｓ／は、５’末端ヌクレオチドがリン酸化により変性されていることを示し、
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮはタグ配列を表し、Ｎはアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、またはグアニン（Ｇ）を表し、
５−／ｂｉｏ／は、５’末端ヌクレオチドがビオチン標識されていること示す。
本開示の一実施形態において、（ｆ）における環状一本鎖分子は以下の配列を有する：ＴＣＧＡＧＣＴＴＧＴＣＴＴＣＣＴＡＡＧＡＣＣＧＣ（配列番号５）。
本開示の一実施形態において、（ｇ）で使用されるヌクレアーゼはエキソヌクレアーゼである。
本開示の一実施形態において、（ｇ）で使用されるヌクレアーゼは、直鎖状一本鎖ＤＮＡを特異的に消化する第１のエキソヌクレアーゼおよび直鎖状二本鎖ＤＮＡを特異的に消化する第２のエキソヌクレアーゼを含む。

本開示の一実施形態において、上記ヌクレアーゼはＥｘｏ ＩおよびＥｘｏ ＩＩＩからなる酵素混合物を含む。
本開示の第４の態様の実施形態において、シーケンシングライブラリが提供される。上記シーケンシングライブラリは、本開示の第３の態様の実施形態の方法で構築される。
本開示の第５の態様の実施形態において、ハイスループット・シーケンシング・プラットフォーム用のライブラリとしての本開示の第４の態様の実施形態のシーケンシングライブラリの使用が提供される。
本開示の一実施形態において、上記ハイスループット・シーケンシング・プラットフォームは環状一本鎖ライブラリを要するシーケンシングプラットフォームである。
本開示の一実施形態において、上記ハイスループット・シーケンシング・プラットフォームはＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓシーケンシングプラットフォームである。
本開示の範囲内において、上記および下記（例えば例示中）に記載される個々の技術的特徴は、互いに組み合わせて新たなまたは好ましい技術的解決方法としてもよいことを理解されたい。この組み合わせについては本明細書中に詳述しない。
図１は、本開示の実施形態の核酸ライブラリ構築方法を示すフローチャートである。 図２は、本開示の実施形態の小胞性アダプターの構造を示す図である。 図３は、核酸ライブラリ構築においてＡｇｉｌｅｎｔ ２１００で検出した精製ＰＣＲ産物の濃度の結果を示す図である。 図４は、６％ＴＢＥ変性ゲルを用いて検出されたライブラリの電気泳動図である。レーン１および２はそれぞれ環状一本鎖ライブラリを、レーン３はｌｏｗ ｒａｎｇｅ ｓｓＲＮＡ ｌａｄｄｅｒを示す。
本発明者らは、広く詳細に研究し、大規模なスクリーニングを実施した。その結果、初めて、良質の核酸シーケンシングライブラリを効率よく構築できる小胞性アダプターを開発することに成功した。実験結果から、他の核酸シーケンシングライブラリ構築技術で得られるシーケンシングデータと比較して、本開示の小胞性アダプターを用いて構築された核酸シーケンシングライブラリは、良質で相関性が高く、そのためＣＧシーケンシングプラットフォームにおいて使用でき、結果的に、確実で信頼性の高いデータを得ることができ情報分析への悪影響もないことがわかる。これにより、本発明を完成するに至った。
ＣＧシーケンシングプラットフォーム
ＣＧシーケンシングプラットフォームにおいて、高密度ＤＮＡナノチップ技術によりＤＮＡナノボールをチップ中に包埋し、コンビナトリアル・プローブ・アンカー・ライゲーション（ｃＰＡＬ）法により配列中の塩基を読み取る。
ライブラリの構築後、環状一本鎖ＤＮＡが得られた。ローリングサークル増幅（ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）により、２００コピーを超える環状一本鎖ＤＮＡを含むＤＮＡナノボール（ＤＮＢ）を形成し、次いで高密度ＤＮＡナノチップ技術により、このＤＮＡナノボールをチップの孔の中に包埋した。１つの孔に包埋できるＤＮＡナノボールは１つである（１つのＤＮＡナノボールが包埋されたチップの孔の中には他のＤＮＡナノボールが入ることはできない）。ＤＮＡナノチップ占有率は９０％超であり、調製したＤＮＡナノチップ１つにつき塩基１８００億個をイメージングに供することができる。
ｃＰＡＬ法で用いるプローブは異なる４色で標識されており、アダプターに隣接する塩基を、１回につき最大で１０塩基連続して読み取ることができる。シーケンシングは１回ごとに独立して実施される。すなわち、前に実施したシーケンシングの結果が次のシーケンシングの結果に影響を及ぼすことはない。そのため、エラーが蓄積されることがなく、低い塩基エラー率（１／１０００００）で高い精度のシーケンシング結果を得ることができる。シーケンシング過程において、アダプターとの相補対にアンカー分子を付加し、次いでＤＮＡリガーゼにより、異なる４色で標識されたプローブを対応する鋳型塩基と対にする。蛍光基のイメージングによって、塩基の種類を決定する。ｃＰＡＬ法には他にも利点がある。塩基の読み取りで実施するコンビナトリアル・プローブ・アンカー・ライゲーション（ｃＰＡＬ）法が非連続的かつ非連鎖的であるため、プローブおよび酵素の濃度は非常に低くてもよいという点である。合成によるシーケンシングとは異なり、ｃＰＡＬでは、１サイクルで一度に数個の塩基を読み取ることができるため、シーケンシング試薬の使用量およびイメージングに要する時間の両方を大幅に低減できる。現在一般的に用いられている次世代シーケンシング技術と比較して、本開示の実施形態のライブラリ構築方法およびライブラリシーケンシング方法は、より少ない試薬使用量でより多くのデータを取得できる。
ライブラリ構築方法
ＲＮＡサンプルをＤＮａｓｅ Ｉで消化した。消化したＲＮＡを、ＲＮＡクリーン磁気ビーズ（ＲＮＡ ｃｌｅａｎ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄ）を用いて精製した。ｍＲＮＡを全ＲＮＡから単離してオリゴ（ｄＴ）２５磁気ビーズで精製し、続いて断片化することにより、断片化ｍＲＮＡを得た。この断片化ｍＲＮＡを逆転写に供することによってｃＤＮＡを合成し、次いでエンドリペアに供することにより、末端平滑化ＤＮＡ断片を作成した。得られた末端平滑化ＤＮＡ断片にＡ塩基を付加することにより、３’末端にＡ塩基１つを有するＤＮＡ断片を得た。こうして得られた３’末端にＡ塩基１つを有するＤＮＡ断片を、小胞性アダプターとライゲーションさせることにより、末端に小胞性アダプターがライゲーションされたＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片を磁気ビーズで精製し、次いでポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅させた。ＰＣＲプライマーの１種として、ビオチン標識プライマーを用いた。得られたＰＣＲ産物をストレプトアビジン被覆磁気ビーズで単離することによって、一本鎖ＰＣＲ産物を得、これを、架橋させたオリゴヌクレオチドおよびＴ４リガーゼにより環化させた。環化されていない一本鎖ＰＣＲ産物を酵素により消化して、環状一本鎖ライブラリを得た。
環状一本鎖ライブラリ
本開示はまた、実施形態において、環状一本鎖ライブラリを提供する。この環状一本鎖ライブラリはシーケンシングにおいて好適に使用され、上述した本開示のライブラリ構築方法によって構築される。
本開示の好ましい一実施形態において、本発明者らは、ライブラリ構築に最適な条件を調べ、そうした最適条件の下で得られた結果を他の技術で得られた結果と比較することによって、本開示の方法の安定性、再現性、および真の信頼性について十分に検証した。また、異なるサンプルについて数回実験を実施した結果、本開示の環状一本鎖ライブラリを用いて得られたシーケンシングデータは真に信頼性が高いということを立証した。
本開示の利点は以下の点である。
（１）核酸ライブラリ構築に用いる小胞性アダプターの発明は今回が初めてである。
（２）本開示の実施形態の小胞性アダプターを核酸ライブラリ構築に用いることにより、ライゲーション効率および続いて行うＰＣＲの効率がともに高く、実施する追跡工程は少ない。
（３）本開示の実施形態の核酸ライブラリは、環状一本鎖ライブラリを要するシーケンシングプラットフォームにおいても使用できる。
（４）本開示の実施形態で提供される方法は、シーケンシングスループットが高く、精度が高く、操作が簡便である。
（５）本開示の実施形態で提供される方法は、安定性、再現性、および信頼性が高い。
以下に、特定の実施形態により本開示を更に説明する。こうした実施形態は、本開示を単に説明するものであり、本開示の範囲を限定するものではないことを理解されたい。以下の実施形態における実験方法は、実験条件を詳細に指定していないが、従来の実験条件（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）中に記載される実験条件）または製造元が提示する実験条件に従って実施される。別途記載がない限り、百分率および部はそれぞれ重量百分率および重量部とする。
材料および方法
以下の実施形態において、試薬は以下のように調製した。５×第１の鎖のバッファーは、塩化ナトリウム８０〜４００ｍＭ、塩化マグネシウム１０〜８０ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ２００ｍＭ〜３００ｍＭ、リン酸塩、および溶媒として水を含有するものであり、ｐＨ８．０〜８．５であった。標準物質として、ユニバーサル・ヒト・レファレンスＲＮＡ（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｈｕｍａｎ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＲＮＡ）をＡｇｉｌｅｎｔ社より購入した。このＲＮＡはヒト細胞株１０種（乳房細胞、肝癌細胞、子宮頚部細胞、胚細胞、悪性神経膠腫細胞、黒色腫細胞、脂肪肉腫細胞、リンパ腫細胞、白血病Ｔ細胞、および骨髄Ｂリンパ球）の混合物である。
ＤＮＡ断片をＡｍｐｕｒｅ ＸＰ磁気ビーズで精製した。
本開示の実施形態で使用される材料はいずれも、特記しない限り、市販品である。
実施形態１
小胞性ヌクレオチドアダプターを使用するＲＮＡライブラリの構築
実施した手順の詳細を以下に示す（図１中の手順を参照）。
詳細な手順：
１．ｍＲＮＡの精製：
１）標準としたユニバーサル・ヒト・レファレンスＲＮＡ（３μｇ、Ａｇｉｌｅｎｔ）をＲＮａｓｅフリーチューブに入れ、ＤＥＰＣで５０μｌに希釈した。得られた混合物を均一に混合した後、６５℃で５分間変性させてＲＮＡ二次構造を分解し、次いで速やかに氷上に置いて、ＲＮＡサンプルを得た。
２）Ｄｙｎａｌｂｅａｄｓ Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２５磁気ビーズ１５μｌを付着防止加工ＥＰチューブに入れ、結合バッファー１００μｌで２回洗浄し、次いで結合バッファー５０μｌ中に再懸濁し、１）で得たＲＮＡサンプルを添加して、最後に室温で５分間静置した。
３）この付着防止加工ＥＰチューブをＭＰＣ（磁気セパレータ）上に２分間置いて、上清を除去した。残った磁気ビーズを洗浄用バッファー２００μｌで２回洗浄した。新しい付着防止加工ＥＰチューブに結合バッファー５０μｌを入れた。
４）磁気ビーズの入った上記ＥＰチューブ（すなわち、３）の付着防止加工ＥＰチューブ）に１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ５０μｌを添加し、８０℃で２分間加熱して、溶出により磁気ビーズからｍＲＮＡを分離した。次いで、この付着防止加工ＥＰチューブをＭＰＣ上に迅速に移した。ｍＲＮＡを、３）の結合バッファーの入った新しい付着防止加工ＥＰチューブに移し、得られた混合物を６５℃で５分間変性させてｍＲＮＡの二次構造を分解し、次いで速やかに氷上に置いた。また、残った磁気ビーズの入ったチューブに洗浄用バッファー２００μｌを速やかに添加して、磁気ビーズを２回洗浄した。
５）ｍＲＮＡサンプル１００μｌに磁気ビーズを添加して２回洗浄し、次いで室温で５分間静置した。このＥＰチューブをＭＰＣ上に２分間置いて、上清を注意深く吸引し、残った磁気ビーズを洗浄用バッファー２００μｌで２回洗浄した。
６）磁気ビーズの入った上記ＥＰチューブに１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ １７μｌを添加し、次いで８０℃で２分間加熱して、溶出により磁気ビーズからｍＲＮＡを分離した。このＥＰチューブをＭＰＣ上に迅速に置いた。ｍＲＮＡを含有する溶出液を新しい２００μｌ ＰＣＲチューブに移した。再使用したｍＲＮＡは約１６μｌであった。
２．ｍＲＮＡの断片化および第１の鎖の合成
５×第１の鎖のバッファー３μＬを添加した後、前のステップで得た溶出液をまず９４℃で１０分間インキュベートし、続いて速やかに氷上に置いた。次いでランダムプライマー１μｌを添加して６５℃で５分間さらにインキュベートして二次構造を分解した後、氷上に置いた。１００ｍＭ ＤＴＴ（２μｌ）、２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合物（０．４μｌ）、およびＲＮａｓｅインヒビター（０．５μｌ）を配合した反応混合物を、ＲＮＡを入れた上記チューブに添加し、続いて均一に混合した後、室温で２分間静置した。次いでＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（２００Ｕ／μｌ）１μｌを添加し、水を添加して２５μｌとした。ＰＣＲ反応を以下の手順で実施した：
ステップ１ ２５℃ １０分間
ステップ２ ４２℃ ５０分間
ステップ３ ７０℃ １５分間
ステップ４ ４℃ 保持
３．第２の鎖の合成
上記ＰＣＲ反応の後、得られた反応系に水を添加して８２．８μｌとし、次いで５×第２の鎖のバッファー１０μｌおよび２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合物１．２μｌと順に混合して均一とした後、５分間氷上に置いた。次いで、ＲＮａｓｅＨ １μｌおよびＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉ ５μｌと混合して均一とした。こうして得られた第２の鎖を合成するための反応系を１６℃で２．５時間インキュベートした。
反応終了後、得られた二本鎖産物をＡｍｐｕｒｅ ＸＰ磁気ビーズで精製し、得られた精製二本鎖産物（ＤＮＡ）をＥＢバッファー５０μｌ中に溶解した。
４．エンドリペア
前のステップで得た二本鎖ＤＮＡを含む溶液５０μｌに、水２７．４μｌ、１０Ｘエンドリペアバッファー１０μｌ、２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合物１．６μｌ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ５μｌ、Ｋｌｅｎｏｗ ＤＮＡポリマーゼ１μｌ、およびＴ４ ＰＮＫ ５μｌを連続的に添加して、反応系１００μｌを作成し、これを２０℃で３０分間インキュベートした。
反応終了後、エンドリペア産物をＡｍｐｕｒｅ ＸＰ磁気ビーズで精製し、次いでＥＢバッファー３２μｌ中に溶解した。
５．Ａ塩基付加およびアダプターライゲーション
前のステップで得たエンドリペアＤＮＡを含む溶液３２μｌに、Ａテーリングバッファー５μｌ、１ｍＭ ｄＡＴＰ １０μｌ、およびＫｌｅｎｏｗ ｅｘｏ（３’末端→５’末端の方向に消化するエキソヌクレアーゼ活性を阻害）３μｌを連続的に添加して、反応系５０μｌを作成し、これを３７℃で３０分間インキュベートした。
反応終了後、Ａ塩基付加産物をＡｍｐｕｒｅ ＸＰ磁気ビーズで精製し、次いでＥＢバッファー２３μｌ中に溶解した。
前のステップで得たＡ塩基付加産物を含む溶液２３μｌに、２ＸＲａｐｉｄ Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ ２５μｌ、小胞性アダプター（構造を図２に示す）混合物１μｌ（小胞性アダプター５０μモル含有）、およびＴ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ １μｌを連続的に添加して、反応系５０μｌを作成し、これを室温で１５分間インキュベートした。
アダプターの配列は以下であった：５’−ＧＴＣＣＴＡＡＧＡＣＣＮＧＡＴＣＧＧＧＣＴＴＣＧＡＣＴＧＧＡＧＡＣＴＣＣＧＡＣＴＴ−３’（配列番号１）
５’−／ｐｈｏｓ／ＡＧＴＣＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧＣＧＧＴＣＴＴＡＧＧＡＣＡＴ−３’（配列番号２）。
反応終了後、ライゲーション産物をＡｍｐｕｒｅ ＸＰ磁気ビーズで精製し、次いでＥＢバッファー１０μｌ中に溶解した。
６．ＰＣＲ増幅および精製
前のステップで得たアダプターライゲーション産物を含む溶液３０μｌに、５ＸＰｈｕｓｉｏｎバター１０μｌ、ＰＣＲプライマーＦ（５−／ｐｈｏｓ／ＡＧＡＣＡＡＧＣＴＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＡＴＣＧＧＧＣＴＴＣＧＡＣＴＧＧＡＧＡＣ）（配列番号３）１μｌ、ＰＣＲプライマーＲ（５−／ｂｉｏ／ＴＣＣＴＡＡＧＡＣＣＧＣＴＴＧＧＣＣＴＣＣＧＡＣＴ）（配列番号４）１μｌ、２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合物０．５μｌ、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ０．５μｌ、および水７μｌを連続的に添加して、反応系５０μｌを作成し、これを下記手順に従ってＰＲＣ装置内でインキュベートした。
ａ．３０秒、９８℃
ｂ．１５サイクル：
１０秒、９８℃
３０秒、６５℃
３０秒、７２℃
ｃ．５分、７２℃
ｄ．保持、４℃
反応終了後、ＰＣＲ増幅産物をＡｍｐｕｒｅ ＸＰ磁気ビーズで精製し、次いでＥＢバッファー３２μｌ中に溶解した。この精製ＰＣＲ産物の濃度をＡｇｉｌｅｎｔ ２１００で検出した。結果を図３に示す。
７．一本鎖産物の単離
７．１ ストレプトアビジン被覆磁気ビーズの洗浄
ストレプトアビジン被覆磁気ビーズ３０μｌ（サンプル１つにつき）を付着防止加工チューブ中で１Ｘ磁気ビーズ結合バッファー９０μｌ〜１５０μｌと混合して均一とし、これを磁気セパレータ上に置いて静置吸着させた。上記付着防止加工チューブの向きを調節して、磁気ビーズが１Ｘ磁気ビーズ結合バッファー中で前後に動けるようにし、続いて上清を捨てた。向きの調整工程をもう一度実施した後、磁気セパレータから上記付着防止加工チューブを取り出し、１Ｘ磁気ビーズ結合バッファー３０μｌを添加して室温で静置した。
７．２ 水を添加して６０μｌとした後、上記ステップ６で得た精製ＰＣＲ産物をまず４Ｘ磁気ビーズ結合バッファー２０μｌと混合して均一とした。上記ステップ７．１で得た、１Ｘ磁気ビーズ結合バッファー３０μｌ中に磁気ビーズが溶解している上記付着防止加工チューブに、上記混合物を移し、混合して均一とした。得られた混合物１１０μｌを室温で１５〜２０分間インキュベートした。インキュベーション中、上記混合物を優しく１回はじいて分布を均一にした。
７．３ 上記ステップ７．２で得た付着防止加工チューブを磁気セパレータ上に３〜５分間置き、続いて上清を捨てた。残った磁気ビーズを１Ｘ磁気ビーズ洗浄用バッファー１ｍｌで２回、上記ステップ７．１に記載する通りに洗浄した。
７．４ 上記ステップ７．３で得た磁気ビーズを０．１Ｍ ＮａＯＨ ７８μｌと共に上下に振って均一に混合し、混合物を得た。続いて１０分間静置した後、磁気セパレータ上に３〜５分間置いた。得られた上清７４．５μｌを新しい１．５ｍｌ ＥＰチューブに移した。
７．５ 上記ステップ７．４の後に、１．５ｍｌ ＥＰチューブに０．３Ｍ ＭＯＰＳ ３７．５μｌを添加し、混合して均一とすることによって、使用可能なサンプル１１２μｌを得た。
７．６ 上記サンプル１１２μｌは−２０℃で保管できる。
８．一本鎖産物の環化
８．１ 約５分前に、以下のようにプライマー反応溶液を配合した：
ＯＮ１５８７（ＴＣＧＡＧＣＴＴＧＴＣＴＴＣＣＴＡＡＧＡＣＣＧＣ）（配列番号５）
８．２ 上記ステップ８．１で得たプライマー反応溶液６３μｌを入念に振とうして混合し、遠心分離した後、上記ステップ７で得たサンプル１１２μｌに添加した（上記サンプルの初期量ｎが重要であるため、通例、１００ｎｇ≦ｎ≦８００ｎｇに制御した）。
８．３ 約５分前に、以下のようにリガーゼ反応溶液を配合した：
８．４ 上記ステップ８．３で得たリガーゼ反応溶液１７５μｌを入念に振とうして混合し、遠心分離した後、上記ステップ８．２の後にプライマー反応溶液の入ったＥＰチューブに入れた。このステップで得た混合物を１０秒間振とうして混合することにより均一とし、次いで遠心分離した。
８．５ 上記ステップ８．４で得た混合物をインキュベーターにおいて３７℃で１．５時間インキュベートした。
８．６ 反応終了後、得られたサンプル１０μｌを６％変性ゲルを用いた電気泳動検出に供し、残ったサンプル約３５０μｌを次の酵素反応に用いた。
９．酵素消化
９．１ 約５分前に、以下のように酵素消化反応溶液を配合した：
９．２ 上記ステップ９．１で得た酵素消化反応溶液２０μｌを入念に振とうして混合し、遠心分離した後、上記ステップ８．５で得たサンプル３５０μｌに添加し、混合物を得た。
９．３ 上記ステップ９．２で得た混合物を１０秒間振とうして混合することにより均一とし、次いで遠心分離した後、インキュベーターにおいて３７℃で３０分間インキュベートした。
９．４ ３０分後、５００ｍＭ ＥＤＴＡ １５．４μｌを添加することによって酵素反応を停止させた。
９．５ 上記ステップ９．４で得たサンプルを、以下のように１．３Ｘ ＰＥＧ３２磁気ビーズ／Ｔｗｅｅｎ２０（またはＡｍｐｕｒｅ ＸＰ磁気ビーズ）で精製した。
上記ステップ９．４で得たサンプルを１．５ｍｌ付着防止加工チューブに移し、次いでＰＥＧ３２磁気ビーズ５００μｌを添加した。得られた混合物を室温で１５分間放置して結合させた。この間、上記混合物を上下に１回振って均一に混合した。
９．６ 上記ステップ９．５の後に、付着防止加工チューブを磁気セパレータ上に３〜５分間置き、その後、上清を捨てた。残った磁気ビーズを７５％エタノール７００μｌで２回洗浄した。各回において、洗浄中、上記付着防止加工チューブを逆さにして元に戻すことにより、磁気ビーズをエタノール中で２〜３回動かした。
９．７ 洗浄後の磁気ビーズを自然乾燥させ、次いで１５分間かけて１ＸＴＥ ４０μｌ中に再び溶解させた。その間、得られた混合物を１回混合して均一とした。
９．８ 上記ステップ９．８で得た混合物から上清を新しい１．５ｍｌ ＥＰチューブに移し、最終産物の定量をＱｕｂｉｔ（商標）ｓｓＤＮＡアッセイキットで実施した。
９．９ サンプル５μｌおよびｌｏｗ Ｒａｎｇｅ ＲＮＡ ｌａｄｄｅｒ ２μｌのそれぞれを別々のＰＣＲチューブ中で２ｘＲＮＡローディングバッファー５μｌと混合して均一とし、両者をＰＣＲ機内で９５℃で２分間インキュベートして変性させ、氷上に置いて５分間迅速に冷却した。得られたサンプルを６％ＴＢＥ変性ゲルを用いて検出した。その結果を図４に示す。
９．１０ 濃度の標定
ＤＮＡナノボール（ＤＮＢ）を用いて調製したサンプルの初期量を、一本鎖分子を定量検出した濃度に従って、一律７．５ｆｍｏｌ／μｌに調整した。
実施形態２
ライブラリ構築における小胞性アダプターのＰＣＲ効率と他の種類のアダプターのＰＣＲ効率との比較
実施した手順の詳細を以下に示す。
実施形態１中に記載される工程と同じ工程を実施した。その際、アダプターの１つを小胞性アダプターとし、比較用アダプターとしては対応するアダプターを使用した。上記ステップ６に記載するＰＣＲ増幅および精製を実施し、その後、精製ＰＣＲ産物の量を検出した。
ＰＣＲ鋳型の濃度および再使用濃度をＱｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡアッセイキットで測定した。
実験結果を表に示した。
上記結果から、小胞性アダプターのＰＣＲ効率が対応するアダプターのＰＣＲ効率より明らかに高い可能性があることがわかる。
本開示中に挙げた全ての文献を参考として本明細書に組み込み、各文献を参照文献として個別に列挙したものとみなす。また、当業者であれば、上述した内容に基づいて本開示に種々の変更および改変を実施することができることを理解されたい。これら均等物も、本開示に添付の特許請求の範囲に定義される範囲に含まれる。

Claims (16)

  1. 核酸ライブラリを構築するためのオリゴヌクレオチド小胞性アダプターであって、前記オリゴヌクレオチド小胞性アダプターは、
    ５’対形成二本鎖領域と、３’対形成二本鎖領域と、小胞性対非形成領域とを含み、
    ５’対形成二本鎖領域を、前記オリゴヌクレオチド小胞性アダプターの第１末端において、
    互いに相補的な第１の鎖および第２の鎖を含み、粘着末端を与えるように、３’対形成二本鎖領域における前記第１の鎖が、その３’末端にオーバーハングを含み、３’対形成二本鎖領域における前記第２の鎖が、その５’末端にリン酸化塩基を含む３’対形成二本鎖領域を、前記オリゴヌクレオチド小胞性アダプターの第２末端において、かつ
    小胞性対非形成領域を、前記５’対形成二本鎖領域と前記３’対形成二本鎖領域の間において
    有し、
    前記小胞性対非形成領域は、第１の鎖および第２の鎖を含み、前記小胞性対非形成領域における前記第１の鎖、および前記小胞性対非形成領域における前記第２の鎖は互いに相補的でなく、前記小胞性対非形成領域における前記第１の鎖の方が、前記小胞性対非形成領域における前記第２の鎖より長く、
    前記オリゴヌクレオチド小胞性アダプターの長さが２０ｎｔ〜５０ｎｔである、
    オリゴヌクレオチド小胞性アダプター。
  2. 前記オリゴヌクレオチド小胞性アダプターの長さが２５ｎｔ〜５０ｎｔである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド小胞性アダプター。
  3. 前記オリゴヌクレオチド小胞性アダプターの長さが３０ｎｔ〜４５ｎｔである、請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチド小胞性アダプター。
  4. 前記３’対形成二本鎖領域の前記粘着末端はテール状塩基１個を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド小胞性アダプター。
  5. 前記テール状塩基１個はチミン（Ｔ）である、請求項４に記載のオリゴヌクレオチド小胞性アダプター。
  6. 前記小胞性対非形成領域の前記第１の鎖は前記小胞性対非形成領域の前記第２の鎖より少なくとも５〜３０ｎｔ長い、請求項１〜５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド小胞性アダプター。
  7. 前記５’対形成二本鎖領域もまた粘着末端を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド小胞性アダプター。
  8. 前記５’対形成二本鎖領域の前記粘着末端は非相補的塩基を１〜３個含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド小胞性アダプター。
  9. センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、５’末端→３’末端の方向に式Ｉの構造を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド小胞性アダプター：
    Ｙ０−Ｙ１−Ｙ２（Ｉ）
    式中、
    Ｙ０は前記５’対形成二本鎖領域を表し、その長さは１０〜１５ｎｔであり、
    Ｙ１は小胞性対非形成領域を表し、前記小胞性対非形成領域のセンス鎖は、前記小胞性対非形成領域のアンチセンス鎖より５〜３０ｎｔ長く、
    Ｙ２は前記３’対形成二本鎖領域を表す。
  10. Ｙ０の長さが１１ｎｔである、請求項９に記載のオリゴヌクレオチド小胞性アダプター。
  11. 核酸ライブラリを構築するためのキットであって、
    容器、
    前記容器の中に入った、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のライブラリ構築用のオリゴヌクレオチド小胞性アダプター、
    前記オリゴヌクレオチド小胞性アダプターの前記小胞性対非形成領域の前記第１の鎖の相補鎖と特異的に対形成する第１のプライマー、
    前記オリゴヌクレオチド小胞性アダプターの前記小胞性対非形成領域の前記第２の鎖と特異的に対形成する第２のプライマー、および
    説明書
    を含むキット。
  12. 請求項１〜１０のいずれか一項に記載のライブラリ構築用のオリゴヌクレオチド小胞性アダプターの使用であって、
    二本鎖ＤＮＡ断片が構造を与えるために、その各末端で前記オリゴヌクレオチド小胞性アダプターとライゲーションされ、
    Ｋ１−Ｋ２−Ｋ３という構造に関して、Ｋ１およびＫ３はそれぞれ、前記３’対形成二本鎖領域の前記粘着末端を介してライゲーションされた小胞性アダプターを表し、Ｋ２は、任意のＤＮＡ配列（配列決定されるべき断片の配列）を表し、Ｋ１およびＫ３は、Ｋ２の２つの末端のそれぞれにおいてＫ２に結合している、
    オリゴヌクレオチド小胞性アダプターの使用。
  13. 請求項１１で規定されるキットが採用され、前記キットの前記第１および第２のプライマーが、前記構造Ｋ１−Ｋ２−Ｋ３を使ったＰＣＲ増幅のために採用される、請求項１２に記載のオリゴヌクレオチド小胞性アダプターの使用。
  14. 環状一本鎖ライブラリを構築する方法であって、
    （ａ）二本鎖ＤＮＡ断片をエンドリペアして、平滑末端を有する二本鎖ＤＮＡ断片を取得し、
    （ｂ）（ａ）で得た平滑末端を有する二本鎖ＤＮＡ断片の各３’末端にアデニン（Ａ）塩基を付加して、各３’末端にＡ塩基を有する二本鎖ＤＮＡ断片を取得し、
    （ｃ）（ｂ）で得た各３’末端にＡ塩基を有する二本鎖ＤＮＡ断片の各末端に、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド小胞性アダプターをライゲーションさせて、各末端に前記オリゴヌクレオチド小胞性アダプターがライゲーションされた二本鎖ＤＮＡ断片を取得し、
    （ｄ）（ｃ）で得た各末端に前記オリゴヌクレオチド小胞性アダプターがライゲーションされた二本鎖ＤＮＡ断片を鋳型として、請求項１１に規定されるプライマー対と共に、ＰＣＲ増幅に供して、ＤＮＡ増幅産物を取得し、前記プライマー対の１つはビオチン標識されたものであり、
    （ｅ）（ｄ）で得た、増幅された二本鎖ＤＮＡ産物から、アビジン被覆ビーズを使用し「アビジン−ビオチン」結合により、ビオチン標識された一本鎖ＤＮＡを単離し、環化用のビオチンマイナスの一本鎖ＤＮＡを得て、
    （ｆ）（ｅ）で得たビオチンマイナスの一本鎖ＤＮＡを環化一本鎖分子の存在下において環化に供する
    工程を有する方法。
  15. （ｇ）（ｆ）で得た非環化ＤＮＡを、直鎖ＤＮＡを特異的に消化するヌクレアーゼを用いて消化して、前生成物を取得し、
    （ｈ）（ｇ）で得た前生成物を精製して環状一本鎖ライブラリを取得する
    工程をさらに有する、請求項１４に記載の方法。
  16. （ｇ）で使用されるヌクレアーゼは直鎖状一本鎖ＤＮＡを特異的に消化する第１のエキソヌクレアーゼおよび直鎖状二本鎖ＤＮＡを特異的に消化する第２のエキソヌクレアーゼを含む、請求項１５に記載の方法。
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