CN106795514A - 泡状接头及其在核酸文库构建及测序中的应用 - Google Patents

泡状接头及其在核酸文库构建及测序中的应用 Download PDF

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Abstract

提供了一种泡状接头和利用该接头构建的单链环状文库，所述文库可用于RNA测序及其它依赖单链环状文库的测序平台，具有测序通量高、准确度高和操作简便的优点。

Description

泡状接头及其在核酸文库构建及测序中的应用 技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种泡状接头和利用该接头构建核酸文库及测序方法。
背景技术
第二代测序技术,又称新一代测序技术,是相应于以Sanger测序法为代表的第一代测序技术而得名。第二代测序中以Roche/454焦磷酸测序、Illumina/Solexa聚合酶合成测序和ABI/SOLiD连接酶测序为代表，它们的共同特点是具有很高的测序通量。而与这些主流测序平台相比，Complete Genomics(简称CG)测序平台的通量最高，每次运行可产生9.9TB的数据量，且每小时的产量可以达到50Gb，是目前主流测序平台的10-25倍。在单倍体读长方面，主流测序平台中只有illumina公司的测序仪可以实现8-10kb的单倍体读长，而CG测序仪则可以达到大于99kb。此外，CG测序仪的准确度可以高达99.999％，优于目前其他商业化的测序仪。由此可见，相较于主流测序平台，CG测序平台有着其特有的优势。
在构建核酸测序文库过程中，一般都需要引入已知序列的接头才可进行测序。而目前报道的核酸测序文库的接头连接方法，常常出现连接效率不高，副产物多的情况。此外，由于CG测序平台采用单链环状文库进行测序，因此主流测序平台通常构建的双链线性文库并不适用于CG测序仪。对于核酸测序中单链环状文库的构建方法，目前还没有相关文献报道过。
基于以上情形，本领域迫切需要开发连接效率和精准度高的接头。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于高效地制备核酸测序的单链环状文库的泡状接头。
本发明的另一目的是提供所述泡状接头用于单链环状文库的构建和测序方法。
在本发明的第一方面，提供了一种用于构建核酸文库的寡核苷酸泡状接头，所述接头具有位于两端的互补碱基序列区，以及位于所述互补碱基区之间的泡状非匹配碱基序列区；
所述泡状非匹配碱基序列区具有非匹配的第一链泡状序列区和第二链泡状序列区，并且所述第一链泡状序列区的长度大于所述第二链泡状序列区的长度；
所述互补碱基序列区包括5’双链配对区和3’双链配对区，并且所述3’双链配对区的末端为粘性末端，所述5’双链配对区的末端碱基经过磷酸化修饰。
在另一优选例中，所述的3’双链配对区的粘性末端具有突出的单碱基。
在另一优选例中，所述突出的单碱基为T。
在另一优选例中，所述第一链泡状序列区的一部分或全部是作为测序引物结合区。
在另一优选例中，所述的测序引物结合区包括任选的上游互补碱基序列区的部分序列、第一链泡状序列区的部分或全部序列和任选的下游互补碱基序列区的部分序列。
在另一优选例中，所述泡状接头的长度至少为20nt，较佳地为25-50nt、更佳地为30-45nt。
在另一优选例中，第一链泡状序列区比第二链泡状序列区的长度长至少5-30nt。
在另一优选例中，所述的5’双链配对区的末端为平末端或粘性末端。
在另一优选例中，所述的粘性末端具有非匹配的1-3个碱基。
在另一优选例中，所述的泡状接头为具有正义链和反义链的双链结构，并且具有式I所示的从5'至3'的结构：
Y0-Y1-Y2  (I)
式中，
Y0为5’双链配对区，长度为10-15nt，较佳地为11nt；
Y1为双链非配对区，其中所述非配对区中的正义链的长度比反义链的长度大5-30nt；
Y2为3’双链配对区。
在另一优选例中，所述的泡状接头序列为：
5’-GTCCTAAGACCNGATCGGGCTTCGACTGGAGACTCCGACTT-3’(SEQ ID NO.:1)
5’-/phos/AGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGACAT-3’(SEQ ID NO.:2)
在本发明的第二方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中含有容器以及位 于所述容器中的权利要求1中所述的用于构建文库的寡核苷酸泡状接头；
特异性结合于所述寡核苷酸泡状接头的第一链泡状序列区的第一引物；
特异性结合于所述寡核苷酸泡状接头的第二链泡状序列区的第二引物；和使用说明书。
在另一优选例中，所述的第一引物作为测序引物。
在另一优选例中，所述的接头位于一容器中。
在本发明的第三方面，提供了一种构建单链环状文库的方法，包括步骤：
(a)对双链DNA片段进行末端修复，从而获得平末端的DNA片段；
(b)对上一步骤的所述平末端的DNA片段的3'端添加碱基A，得到3'端加A的DNA片段；
(c)对上一步骤的所述3'端加A的DNA片段，用如权利要求1中所述的寡核苷酸泡状接头进行连接反应，从而获得两端添加泡状接头的DNA片段；
(d)将上一步骤中得到的所述两端加泡状接头的纯化DNA片段作为模板，用针对所述接头序列的特异性引物对进行PCR扩增，从而获得DNA扩增产物，其中所述引物对中的一条引物标记有生物素；
(e)对上一步骤中得到的所述DNA扩增产物，用包被有亲和素的珠子通过“亲和素-生物素”的结合进行分离，从而获得单链DNA；
(f)对上一步骤中得到的所述单链DNA，在单链环化分子的存在下，进行单链环化反应，从而获得含环化产物的混合物,即为单链环状文库。
在另一优选例中，步骤(c)中，所述的两端添加泡状接头的DNA片段具有式III所示的结构：
K1-K2-K3  (III)
式中
K1为正向的权利要求1所述的泡状接头；
K2为任意的DNA序列(待测序片段的序列)；
K3为反向的权利要求1所述的泡状接头。
在另一优选例中，K2的长度为约150bp－250bp。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤：
(g)对上一步骤中含环化产物的混合物，用特异性切割线性DNA的核酸酶进行消化处理，从而获得未环化的DNA片段被消化的混合物，其中所述混合物中含有未消化的环化产物；和
(h)将上一步骤中所述未环化的DNA片段被消化的混合物进行纯化，从而获得单链环状文库。
在另一优选例中，步骤(a)中的所述双链DNA片段是通过如下步骤制备的：
(a0)对mRNA样本进行片段化处理，从而获得片段化的mRNA；
(a1)对所述片段化的mRNA进行反转录，从而获得cDNA扩增产物，作为双链DNA片段；
在另一优选例中，步骤(a)中的所述双链DNA片段是通过将DNA样本进行片段化处理后获得；
在另一优选例中，步骤(e)中，所述亲和素为链霉亲和素。
在另一优选例中，步骤(d)中，所述的引物对包括：
正向引物：
5-/phos/AGACAAGCTCNNNNNNNNNNGATCGGGCTTCGACTGGAGAC(SEQ ID NO.:3)和
反向引物：5-/bio/TCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACT(SEQ ID NO.:4)。
其中，5-/phos/表示5’末端核苷酸经过磷酸化修饰，NNNNNNNNNN表示标签序列，N为A、T、C或G。5-/bio/表示5’末端核苷酸经过生物素标记。
在另一优选例中，步骤(f)中，所述的单链环化分子的序列为TCGAGCTTGTCTTCCTAAGACCGC(SEQ ID NO.:5)。
在另一优选例中，步骤(l)中，所述的核酸酶为外切酶。
在另一优选例中，步骤(l)中，所述的核酸酶为特异性切割单链和双链线性DNA的外切酶。
在另一优选例中，所述的外切酶包括Exo I和Exo III的混合酶。
在本发明的第四方面，提供了一种用于测序的文库,所述的文库是用如本发明的第三方面所述的构建方法制备的。
本发明的第五方面，提供了一种如本发明的第四方面所述的测序文库的用途，该用途用作高通量测序平台的文库。
在另一优选例中，所述的高通量测序平台为需要单链环状文库的测序平台。
在另一优选例中，所述的高通量测序平台为Complete Genomics测序平台。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了核酸文库构建方法流程图。
图2泡状接头结构图。
图3显示了核酸文库构建中用Agilent 2100检测纯化PCR产物浓度的结果。
图4显示了文库用6％的TBE变性胶检测电泳图。泳道1和2是单链环状文库，泳道3是low range ssRNA ladder。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究和大量筛选，首次开发了一种用于高效制备高质量的、可用于核酸测序文库构建的泡状接头。实验结果证明，用本发明所述的泡状接头构建的核酸测序文库与通过其它核酸测序文库构建技术所得的测序数据相比，其文库质量和相关性非常高，可用于CG测序平台，所得到的数据真实度高、可信度佳，且对信息分析没有影响。在此基础上完成了本发明。
CG测序平台
CG测序平台采用了高密度DNA纳米芯片技术，在芯片上嵌入DNA纳米球，然后用复合探针-锚定分子连接(Combinatorial probe anchor ligation,cPAL)技术来读取碱基序列。
文库构建后可获得单链环状DNA分子，通过滚环复制，可形成一个包含200多个拷贝的DNA纳米球(DNB)，然后采用高密度DNA纳米芯片技术，将DNA纳米球加到芯片上的网状小孔内，每个小孔只能容纳一个DNA纳米球(当一个DNB结合到芯片上的小孔后，会排斥其他DNB的结合)，DNA纳米芯片的占用量超过90％，每一个制备好的芯片可容纳1800亿个碱基用于成像。
cPAL技术利用四种不同颜色标记的探针去读取接头附近的碱基，每次最多读取10个连续碱基且每次测序是相互独立的，即测序结果不受前一个碱基测序结果的影响，因此不会发生错误累积的现象，测序结果精准性高，碱基错误率可低至十万分之一。在测序时，加入锚定分子与接头互补配对，然后DNA连接酶将四种不同 颜色标记的探针结合到模板的相应碱基上，通过对荧光基团的成像来判断碱基类型。cPAL技术的另一个优势是采用了非连续、非连锁联合探针锚定连接技术来读取碱基可大大减少探针和酶的浓度；与边合成边测序不同，cPAL每个cycle(循环)可一次性读取数个碱基，这样消耗的测序试剂和成像时间都大大减少。与目前流行的第二代测序技术相比，此建库和测序方法能在消耗更少试剂的前提下获得更多的数据。
构建文库的方法
取总RNA样品，用DNase I进行消化，RNA clean磁珠纯化消化后RNA；使用Oligo(dT)25磁珠分离和纯化总RNA中的mRNA；将mRNA进行片段化反应，得到片段化的mRNA；片段化mRNA反转录合成cDNA，对cDNA作末端修复，形成平末端的DNA片段，平末端DNA片段加A碱基，得到3＇端加上一个“A”碱基的DNA片段；所得3＇端加A的DNA片段与泡状接头连接，得到两端加接头的DNA片段，使用磁珠纯化两端加接头的DNA片段；采用聚合酶链式反应(PCR)扩增所得两端加接头的DNA片段，其中PCR一条引物带有生物素标记；通过链霉亲和素磁珠分离PCR产物，得到PCR单链；通过桥式寡核苷酸和T4连接酶将PCR单链环化，酶切消化没有环化的片段，得到单链环状文库。
单链环状文库
在本发明中，还提供了用本发明上述文库构建方法所制备的适用于测序的单链环状文库。
在本发明的优选例中，本发明人通过最佳建库条件的摸索，最佳条件所得结果与其他技术所得结果的比较，充分验证该本发明方法的稳定性和可重复性，并充分验证本发明方法的真实可靠性。此外，选用不同样品，进行多次实验后，证明利用本发明的单链环状文库所获得的测序数据真实可信。
本发明主要优点在于：
(1)首次发明了可用于核酸文库构建的泡状接头。
(2)本发明的泡状接头在核酸文库构建中连接效率高、后续PCR效率高和后续步骤少。
(2)本发明的核酸文库也可用于需要单链环状文库的测序平台。
(3)本发明提供的方法具有测序通量高，准确度高和操作简便。
(4)本发明提供的方法具有稳定性，可重复性和可靠性高的特点。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
材料和方法
下列实施例中试剂来源为：5×第一链缓冲液(First strand buffer)含有：80-400mM氯化钠，10-80mM氯化镁，200mM-300mM Tris-HCl、磷酸盐，pH值为8.0-8.5，溶剂为水。标准品universal human reference RNA(购自安捷伦)，该RNA是10种人细胞株的混合物(乳腺细胞、肝癌细胞、宫颈细胞、胚胎细胞、恶性胶质瘤细胞、黑色素瘤细胞、脂肪肉瘤细胞、淋巴瘤细胞、白血病T淋巴细胞、骨髓B淋巴细胞)。
纯化DNA片段均采用市售的Ampure XP磁珠。
本发明实施例中所用的实验材料如无特殊说明均可从市售渠道获得。
实施例1
使用泡状核苷酸接头构建RNA文库
具体实验步骤(见图1中所示流程步骤)：
具体实验步骤：
1、纯化mRNA
1)取标准品universal human reference RNA(安捷伦)(3ug)至一个RNase-free的管中，用DEPC水稀释至50μl。混匀，65℃变性5分钟以打开二级结构，然后立即将样品置于冰上。
2)吸取15μl Dynalbeads Oligo(dT)25磁珠于1.5ml的non-stick-EP管中，用100μl结合缓冲液(binding buffer)将磁珠洗两次，将磁珠重新悬浮于50μl binding buffer，将第一步中制得的总RNA加入管中，室温放置5min。
3)将non-stick-EP管置于MPC(磁分离器)上2min，去除上清，再用200μl washing buffer清洗磁珠两次。取一新的不粘的EP管，加入50μl的binding buffer。
4)向含磁珠的EP管(即3non-stick-EP管)中加入50μl 10mM Tris-HCl，80℃加热2min将mRNA从磁珠上洗脱下来，迅速将EP管转至MPC上，转移mRNA至3)中新的EP管，将混合溶液在65℃变性5min，打开二级结构，然后立即将样品置于冰上。另外，立即将200μl洗涤液(washing buffer)加入到含有磁珠管中，将磁珠洗两次。
5)将100μl mRNA样品加入洗过两次的磁珠中，室温放置5min，将EP管置于MPC上2min，小心吸除上清，再用200μl washing buffer清洗磁珠两次。
6)向含磁珠的EP管中加入17μl 10mM Tris-HCl，80℃加热2min，从而将mRNA从磁珠上洗脱下来。迅速地将EP管转至MPC上，转移mRNA洗脱液至一新的200μl PCR管中,大约能回收16μl mRNA。
2、打断mRNA及合成一链
向上一步中的洗脱液中加入3μL 5×第一链缓冲液(First strand buffer)，94℃，10min，立即置于冰上。加入随机引物1μl，65℃5min打开单链二级结构，置于冰上。配置反应混合液,包括100mM DTT(2μl)、25mM dNTP混合液(0.4μl)、RNase抑制剂(0.5μl)将混合物加入含RNA的管中，混匀后室温放置2min，然后加入1μl SuperscriptⅡ(200U/μl)混匀，补水至总体系25μl。在PCR仪上按照以下程序进行反应：
3、合成二链
向一链反应体系中补水至82.8μl，依次加入10μl 5×第二链缓冲液(Second Strand Buffer)、1.2μl 25mM dNTP混合液，混匀，冰上放置5min，再加入1μl RNaseH、5μl DNA Pol I，混匀，将反应管置于16℃反应2.5小时。
反应完成后，用Ampure XP磁珠纯化二链产物，溶于50μl EB缓冲液。
4、末端修复
上述步骤得到50μl DNA，向反应体系中依次加入27.4μl水、10μl 10X末端修复缓冲液(End Repair Buffer)、1.6μl 25mM dNTP混合液、5μl T4DNA聚合酶、1μl Klenow DNA聚合酶、5μl T4PNK，总反应体系为100μl，将反应管置于20℃反应30min。
反应完成后，用Ampure XP磁珠纯化末端修复产物，溶于32μl EB buffer。
5、加A,加接头
上述步骤得到32μl DNA，向反应体系中依次加入5μl碱基A突出端缓冲液(A-Tailing Buffer)、10μl 1mM dATP、3μl Klenow exo(去除3'to 5'外切酶活性)，总反应体系为50μl，将反应管置于37℃反应30min。
反应完成后，用Ampure XP磁珠纯化加A产物，溶于23μl EB缓冲液。
上述步骤得到23μl加A产物，向反应体系中依次加入25μl 2X快速T4DNA连接酶缓冲液(Rapid T4DNA Ligase Buffer)、1μl泡状接头(结构如图2所示)混合物(泡状接头的使用量50umol，接头序列为：
5’-GTCCTAAGACCNGATCGGGCTTCGACTGGAGACTCCGACTT-3’(SEQ ID NO.:1)
5’-/phos/AGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGACAT-3’(SEQ ID NO.:2))、1μl T4DNA Ligase，总反应体系为50μl，将反应管置于室温反应15min。
反应完成后，用Ampure XP磁珠纯化连接产物，溶于10μl EB buffer。
6.PCR扩增及纯化
上述步骤得到30μl连接产物，向反应体系中依次加入10μl 5X Phusion缓冲液、1μl PCR Primer F
5-/phos/AGACAAGCTCNNNNNNNNNNGATCGGGCTTCGACTGGAGAC(SEQ ID NO.：3)、
1μl PCR Primer R
(5-/bio/TCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACT)(SEQ ID No.：4)、
0.5μl 25mM dNTP混合物、0.5μl Phusion DNA聚合酶、7μl水，总反应体系50μl。在PCR仪上按照以下程序进行反应：
a.30sec,98℃
b.15个循环：
10sec，98℃
30sec，65℃
30sec，72℃
c.5min，72℃
d.保温  4℃
反应完成后，用Ampure XP磁珠纯化PCR产物，溶于32μl EB缓冲液。使用Agilent 2100检测纯化产物浓度，结果见图3。
7.单链分离
7.1链霉亲和素磁珠洗涤方法如下：
每个样品取30ul链霉亲和素磁珠：加入3-5倍体积的1X磁珠结合缓冲液，混匀后置于磁力架上静止吸附，调整不粘管的方向，使得beads在1X磁珠结合缓冲液中前后游动，弃上清液后，重复上述操作一次，取出不黏管加入1倍体积(30ul)1X磁珠结合缓冲液悬浮，混匀后室温静置。
7.2.步骤6得到的PCR纯化产物，加水补齐到60ul，再加入20ul 4X磁珠结合缓冲液混匀，然后转移到上步骤含有30ul 1X磁珠结合缓冲液溶解的磁珠的不粘管中混匀，此110ul混合物室温下结合15-20min，中间轻轻弹匀一次。
7.3.将上述不粘管磁力架放置3-5min，弃去上清液，用1ml的1X磁珠洗涤缓冲液洗涤2次，方法同链霉亲和素磁珠的洗涤方法
7.4.向上述磁珠中加入78ul 0.1M NaOH，吹打混匀后放置10min，再置于磁力架上3-5min，取上清74.5ul到新的1.5ml EP管中。
7.5.向上述1.5ml EP管中加入37.5ul 0.3M MOPS，混匀备用。
7.6.此步骤产物可以冻存于-20℃。
8、单链环化
8.1提前5分钟左右准备引物反应混合液，配制如下：
ON1587(TCGAGCTTGTCTTCCTAAGACCGC)(SEQ ID No.：5)
水        43ul
20uM ON1587     20ul
总量   63ul
8.2将上述混合液震荡充分混匀，离心后，向上一步得到的112ul的样品(样本起始量n为关键步骤，一般控制在100ng≤n≤800ng)中加入63ul的引物反应混合液；
8.3提前5分钟准备连接酶反应混合液，配制如下：
8.4将连接酶反应混合液震荡充分混匀，离心后，向已经加入引物反应混合液的EP管中加入连接酶反应混合液175ul，震荡10s混匀，离心。
8.5置于孵育箱中37℃孵育1.5h。
8.6反应完成后，取出10ul样品，待6％变性胶电泳检测，剩余的约350ul体积，进入下一步酶反应。
9.酶切消化
9.1提前5分钟左右准备酶切消化反应液，配制如下：
9.2将上述混合液震荡充分混匀，离心后，向上一步得到的350ul的样品中分别加入20ul的酶切消化反应液；
9.3震荡10s混匀离心，置于孵育箱中37℃孵育30min。
9.4酶切30min完成后，向样品中加入15.4ul 500mM EDTA终止酶反应。
9.5上述样品用1.3X PEG32磁珠/tween20(也可以用Ampure XP磁珠纯化)纯化，方法如下：
将上步骤样品转移到1.5ml不粘管中，加入500ul的PEG32磁珠，室温结合15min，期间吹打混匀一次；
9.6不粘管置于磁力架3-5min后弃去上清，用700ul 75％乙醇洗涤两次，洗涤时将不粘管前后方向反转，使得磁珠在乙醇中游动，每次洗涤游动2-3次；
9.7室温下晾干后用40ul 1X TE回溶，溶解时间共计15min，中间混匀一次；
9.8上清转移到新的1.5ml EP管中，将最终得到产物用QubitTM ssDNA Assay Kit定量。
9.9取5ul样品至PCR管中与5ul 2x RNA loading buffer混匀，同时取2ul low Range RNA ladder到PCR管，将样品与ladder置于PCR仪中95℃变性2min，迅速转移至冰上冷却2min，再进行6％的TBE变性胶检测，结果见图4。
9.10浓度标准化
按照单链分子定量测定的浓度调整DNB(DNA nanoball，DNA纳米球)制备使用的样本起始量，统一调整为7.5fmol/ul。
实施例2比较使用泡状接头与其他类型接头在文库构建中的PCR效率
具体实验步骤：
采用与实例1中相同步骤，其中一种接头用泡状接头，对照接头用匹配接头。完成步骤6中PCR扩增及纯化，然后检测纯化后PCR产物的量。
PCR模板浓度和回收浓度测量用Qubit dsDNA Assay Kit。
实验结果见表1
接头名称 匹配接头 泡状接头
PCR模板量(ng) 10 10
回收产物浓度(ng/ul) 5.66 53
回收产物总量(ng) 226.4 2120
PCR效率 1.366 1.709
备注：PCR效率＝(PCR总产量/模板起始量)×(1/循环数)
从上述结果可以看出，泡状接头PCR效率明显比匹配接头高。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (8)

  1. 一种用于构建核酸文库的寡核苷酸泡状接头，其特征在于，所述接头具有位于两端的互补碱基序列区，以及位于所述互补碱基区之间的泡状非匹配碱基序列区；
    所述泡状非匹配碱基序列区具有非匹配的第一链泡状序列区和第二链泡状序列区，并且所述第一链泡状序列区的长度大于所述第二链泡状序列区的长度；
    所述互补碱基序列区包括5’双链配对区和3’双链配对区，并且所述3’双链配对区的末端为粘性末端，所述5’双链配对区的末端碱基经过磷酸化修饰。
  2. 如权利要求1所述的泡状接头，其特征在于，所述泡状接头为具有正义链和反义链的双链结构，并且具有式I所示的从5'至3'的结构：
    Y0-Y1-Y2   (I)
    式中，
    Y0为5’双链配对区，长度为10-15nt，较佳地为11nt；
    Y1为双链非配对区，其中所述非配对区中的正义链的长度比反义链的长度大5-30nt；
    Y2为3’双链配对区。
  3. 一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有容器以及位于所述容器中的权利要求1中所述的用于构建文库的寡核苷酸泡状接头；
    特异性结合于所述寡核苷酸泡状接头的第一链泡状序列区的第一引物；
    特异性结合于所述寡核苷酸泡状接头的第二链泡状序列区的第二引物；和
    使用说明书。
  4. 一种构建单链环状文库的方法，其特征在于，包括步骤：
    (a)对双链DNA片段进行末端修复，从而获得平末端的DNA片段；
    (b)对上一步骤的所述平末端的DNA片段的3'端添加碱基A，得到3'端加A的DNA片段；
    (c)对上一步骤的所述3'端加A的DNA片段，用如权利要求1中所述的寡核苷酸泡状接头进行连接反应，从而获得两端添加泡状接头的DNA片段；
    (d)将上一步骤中得到的所述两端加泡状接头的纯化DNA片段作为模板，用针对所述接头序列的特异性引物对进行PCR扩增，从而获得DNA扩增产物，其中所述引物对中的一条引物标记有生物素；
    (e)对上一步骤中得到的所述DNA扩增产物，用包被有亲和素的珠子通过 “亲和素-生物素”的结合进行分离，从而获得单链DNA；
    (f)对上一步骤中得到的所述单链DNA，在单链环化分子的存在下，进行单链环化反应，从而获得含环化产物的混合物,即为单链环状文库。
  5. 一种用于测序的文库,其特征在于，所述的文库是用如权利要求4所述的构建方法制备的。
  6. 如权利要求5所述的测序文库的用途，其特征在于，用作高通量测序平台的文库。
  7. 如权利要求5所述的测序文库的用途，其特征在于，所述的高通量测序平台为需要单链环状文库的测序平台
  8. 如权利要求5所述的测序文库的用途，其特征在于，所述的高通量测序平台为Complete Genomics测序平台。
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CN201480081852.6A Active CN107075731B (zh) 2014-09-12 2014-10-14 一种核酸单链环状文库的构建方法和试剂
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CN201480081852.6A Active CN107075731B (zh) 2014-09-12 2014-10-14 一种核酸单链环状文库的构建方法和试剂

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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111139533A (zh) * 2019-09-27 2020-05-12 上海英基生物科技有限公司 稳定性增加的测序文库接头
CN116042767A (zh) * 2021-10-28 2023-05-02 深圳华大生命科学研究院 测序文库的构建方法及试剂盒

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3561072A1 (en) 2012-12-10 2019-10-30 Resolution Bioscience, Inc. Methods for targeted genomic analysis
US9328382B2 (en) 2013-03-15 2016-05-03 Complete Genomics, Inc. Multiple tagging of individual long DNA fragments
CN109971826B (zh) * 2014-01-31 2022-12-30 斯威夫特生物科学股份有限公司 用于加工dna底物的改进方法
US10208338B2 (en) 2014-03-03 2019-02-19 Swift Biosciences, Inc. Enhanced adaptor ligation
CN106715713B (zh) * 2014-09-12 2020-11-03 深圳华大智造科技有限公司 试剂盒及其在核酸测序中的用途
US20180080092A1 (en) * 2014-10-14 2018-03-22 Bgi Shenzhen Co., Limited One-stop treatment method for breaking nucleic acid by means of transposase, and reagent
US10221448B2 (en) 2015-03-06 2019-03-05 Pillar Biosciences Inc. Selective amplification of overlapping amplicons
ES2856598T3 (es) 2015-11-11 2021-09-27 Resolution Bioscience Inc Construcción de alta eficiencia de bibliotecas de ADN
US11299780B2 (en) 2016-07-15 2022-04-12 The Regents Of The University Of California Methods of producing nucleic acid libraries
WO2018015365A1 (en) * 2016-07-18 2018-01-25 Roche Sequencing Solutions, Inc. Asymmetric templates and asymmetric method of nucleic acid sequencing
AU2017312953A1 (en) 2016-08-16 2019-01-24 The Regents Of The University Of California Method for finding low abundance sequences by hybridization (flash)
RU2019108294A (ru) 2016-08-25 2020-09-25 Резолюшн Байосайенс, Инк. Способы обнаружения изменений количества геномных копий в образцах днк
WO2018049049A1 (en) * 2016-09-07 2018-03-15 Baylor College Of Medicine Clinical application of cell free dna technologies to non-invasive prenatal diagnosis and other liquid biopsies
WO2018090373A1 (zh) * 2016-11-21 2018-05-24 深圳华大智造科技有限公司 一种dna末端修复与加a的方法
JP6847499B2 (ja) * 2016-12-20 2021-03-24 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 環状コンセンサスシークエンシングのための一本鎖環状ｄｎａライブラリー
DK3452621T3 (da) * 2017-02-21 2022-12-12 Illumina Inc Tagmentation ved brug af immobiliserede transposomer med linkere
CN111315895A (zh) * 2017-09-14 2020-06-19 豪夫迈·罗氏有限公司 用于产生环状单链dna文库的新型方法
CN109750086B (zh) * 2017-11-06 2022-08-02 深圳华大智造科技股份有限公司 单链环状文库的构建方法
WO2019140201A1 (en) 2018-01-12 2019-07-18 Claret Bioscience, Llc Methods and compositions for analyzing nucleic acid
JP7096893B2 (ja) * 2018-02-05 2022-07-06 エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 単一分子のための一本鎖環状ｄｎａ鋳型の作製
CN112639094A (zh) * 2018-05-08 2021-04-09 深圳华大智造科技股份有限公司 用于准确且经济高效的测序、单体型分型和组装的基于单管珠粒的dna共条形码化
US11629345B2 (en) 2018-06-06 2023-04-18 The Regents Of The University Of California Methods of producing nucleic acid libraries and compositions and kits for practicing same
US12049665B2 (en) 2018-06-12 2024-07-30 Accuragen Holdings Limited Methods and compositions for forming ligation products
CN109023536A (zh) * 2018-06-28 2018-12-18 河南师范大学 一种植物降解组文库构建方法
CN110734967B (zh) * 2018-07-19 2023-02-17 深圳华大智造科技股份有限公司 一种接头组合物及其应用
WO2020157684A1 (en) 2019-01-29 2020-08-06 Mgi Tech Co., Ltd. High coverage stlfr
CN112342627B (zh) * 2019-08-09 2024-07-23 深圳市真迈生物科技有限公司 一种核酸文库的制备方法及测序方法
RU2746960C1 (ru) * 2020-09-23 2021-04-22 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России) Способ создания кольцевой формы NGS библиотеки для высокопроизводительного секвенирования на платформах технологии DNBSEQ
CN113943764B (zh) * 2021-12-20 2022-03-04 中国海洋大学 一种制备双链rna的方法
WO2023240611A1 (zh) * 2022-06-17 2023-12-21 深圳华大智造科技股份有限公司 单链核酸环状文库的建库以及测序方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007087291A2 (en) * 2006-01-24 2007-08-02 Ab Advanced Genetic Analysis Corporation Asymmetrical adapters and methods of use thereof
WO2009133466A2 (en) * 2008-04-30 2009-11-05 Population Genetics Technologies Ltd. Asymmetric adapter library construction
WO2011161549A2 (en) * 2010-06-24 2011-12-29 Population Genetics Technologies Ltd. Methods and compositions for polynucleotide library production, immortalization and region of interest extraction
CN103014137A (zh) * 2011-09-22 2013-04-03 深圳华大基因科技有限公司 一种分析基因表达定量的方法
CN103667273A (zh) * 2013-12-05 2014-03-26 北京诺禾致源生物信息科技有限公司 双链接头、其应用及构建末端配对dna文库的方法

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0923650B1 (en) * 1996-06-06 2007-03-07 Solexa, Inc Sequencing by ligation of encoded adaptors
WO2001040516A2 (en) 1999-12-02 2001-06-07 Molecular Staging Inc. Generation of single-strand circular dna from linear self-annealing segments
DE602004036672C5 (de) * 2003-01-29 2012-11-29 454 Life Sciences Corporation Nukleinsäureamplifikation auf Basis von Kügelchenemulsion
US20080318215A1 (en) 2005-12-20 2008-12-25 Ming-Sheng Lee Apparatus, methods and products for detecting genetic mutation
US8679741B2 (en) 2006-05-31 2014-03-25 Sequenom, Inc. Methods and compositions for the extraction and amplification of nucleic acid from a sample
US9328378B2 (en) * 2006-07-31 2016-05-03 Illumina Cambridge Limited Method of library preparation avoiding the formation of adaptor dimers
US7910354B2 (en) * 2006-10-27 2011-03-22 Complete Genomics, Inc. Efficient arrays of amplified polynucleotides
US20090111706A1 (en) 2006-11-09 2009-04-30 Complete Genomics, Inc. Selection of dna adaptor orientation by amplification
US8518640B2 (en) * 2007-10-29 2013-08-27 Complete Genomics, Inc. Nucleic acid sequencing and process
US7901890B2 (en) 2007-11-05 2011-03-08 Complete Genomics, Inc. Methods and oligonucleotide designs for insertion of multiple adaptors employing selective methylation
CA2707901C (en) * 2007-12-05 2015-09-15 Complete Genomics, Inc. Efficient base determination in sequencing reactions
EP2268834B1 (en) * 2008-03-17 2015-01-07 Stichting Genetwister IP Expression-linked gene discovery
AU2009229157B2 (en) * 2008-03-28 2015-01-29 Pacific Biosciences Of California, Inc. Compositions and methods for nucleic acid sequencing
CN102203273A (zh) * 2008-09-09 2011-09-28 生命技术公司 生成基因特异性的文库的方法
US8383345B2 (en) * 2008-09-12 2013-02-26 University Of Washington Sequence tag directed subassembly of short sequencing reads into long sequencing reads
EP2508529B1 (en) * 2008-10-24 2013-08-28 Epicentre Technologies Corporation Transposon end compositions and methods for modifying nucleic acids
US9080211B2 (en) * 2008-10-24 2015-07-14 Epicentre Technologies Corporation Transposon end compositions and methods for modifying nucleic acids
EP2432899A1 (en) * 2009-05-22 2012-03-28 Population Genetics Technologies LTD. Sorting asymmetrically tagged nucleic acids by selective primer extension
US9023769B2 (en) * 2009-11-30 2015-05-05 Complete Genomics, Inc. cDNA library for nucleic acid sequencing
AU2010330936B2 (en) * 2009-12-17 2014-05-22 Keygene N.V. Restriction enzyme based whole genome sequencing
EP2545183B1 (en) * 2010-03-10 2017-04-19 Ibis Biosciences, Inc. Production of single-stranded circular nucleic acid
JP5968879B2 (ja) * 2010-06-30 2016-08-10 深▲せん▼華大基因股▲ふん▼有限公司 Ｄｎａ分子タグ技術及びｄｎａ不完全断片化技術に基づいたｐｃｒシークエンシング法及びそれを用いたｈｌａ遺伝子タイピング法
CN102409049B (zh) 2010-09-21 2013-10-23 深圳华大基因科技服务有限公司 一种基于pcr的dna标签文库构建方法
CN102409045B (zh) 2010-09-21 2013-09-18 深圳华大基因科技服务有限公司 一种基于dna接头连接的标签文库构建方法及其所使用标签和标签接头
CN102534811B (zh) 2010-12-16 2013-11-20 深圳华大基因科技服务有限公司 一种dna文库及其制备方法、一种dna测序方法和装置
CN102181943B (zh) * 2011-03-02 2013-06-05 中山大学 一种配对双末端文库构建方法及用该文库进行基因组测序的方法
EP2710172B1 (en) * 2011-05-20 2017-03-29 Fluidigm Corporation Nucleic acid encoding reactions
CN102296065B (zh) * 2011-08-04 2013-05-15 盛司潼 用于构建测序文库的系统与方法
CA2852949A1 (en) * 2011-10-19 2013-04-25 Nugen Technologies, Inc. Compositions and methods for directional nucleic acid amplification and sequencing
CN103103624B (zh) * 2011-11-15 2014-12-31 深圳华大基因科技服务有限公司 高通量测序文库的构建方法及其应用
EP2807292B1 (en) * 2012-01-26 2019-05-22 Tecan Genomics, Inc. Compositions and methods for targeted nucleic acid sequence enrichment and high efficiency library generation
NO2694769T3 (zh) * 2012-03-06 2018-03-03
ES2905448T3 (es) * 2012-05-10 2022-04-08 Massachusetts Gen Hospital Métodos para determinar una secuencia nucleotídica
CN102703426A (zh) * 2012-05-21 2012-10-03 吴江汇杰生物科技有限公司 构建核酸库的方法、试剂及试剂盒
GB2518078B (en) * 2012-06-18 2015-04-29 Nugen Technologies Inc Compositions and methods for negative selection of non-desired nucleic acid sequences
CN102703432A (zh) * 2012-07-11 2012-10-03 烟台博诺生物科技有限公司 构建核酸库的方法、试剂及试剂盒
US9644199B2 (en) 2012-10-01 2017-05-09 Agilent Technologies, Inc. Immobilized transposase complexes for DNA fragmentation and tagging
WO2014086037A1 (zh) * 2012-12-07 2014-06-12 深圳华大基因科技服务有限公司 构建核酸测序文库的方法及其应用
US9683230B2 (en) * 2013-01-09 2017-06-20 Illumina Cambridge Limited Sample preparation on a solid support
CN109971826B (zh) 2014-01-31 2022-12-30 斯威夫特生物科学股份有限公司 用于加工dna底物的改进方法
WO2016078096A1 (zh) * 2014-11-21 2016-05-26 深圳华大基因科技有限公司 使用鼓泡状接头元件构建测序文库的方法
CN107124888B (zh) 2014-11-21 2021-08-06 深圳华大智造科技股份有限公司 鼓泡状接头元件和使用其构建测序文库的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007087291A2 (en) * 2006-01-24 2007-08-02 Ab Advanced Genetic Analysis Corporation Asymmetrical adapters and methods of use thereof
WO2009133466A2 (en) * 2008-04-30 2009-11-05 Population Genetics Technologies Ltd. Asymmetric adapter library construction
WO2011161549A2 (en) * 2010-06-24 2011-12-29 Population Genetics Technologies Ltd. Methods and compositions for polynucleotide library production, immortalization and region of interest extraction
CN103014137A (zh) * 2011-09-22 2013-04-03 深圳华大基因科技有限公司 一种分析基因表达定量的方法
CN103667273A (zh) * 2013-12-05 2014-03-26 北京诺禾致源生物信息科技有限公司 双链接头、其应用及构建末端配对dna文库的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MEYER, MATTHIAS ET AL.: "Illumina Sequencing Library Preparation for Highly Multiplexed Target Capture and Sequencing", 《COLD SPRING HARBOR PROTOCOLS》 *
刘圣 等: "下一代测序数据的质量控制研究", 《军事医学》 *
罗茂 等: "玉米纹枯病抗性相关miRNA 的鉴定与功能分析", 《中国生物化学与分子生物学报》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111139533A (zh) * 2019-09-27 2020-05-12 上海英基生物科技有限公司 稳定性增加的测序文库接头
CN111139533B (zh) * 2019-09-27 2021-11-09 上海英基生物科技有限公司 稳定性增加的测序文库接头
CN116042767A (zh) * 2021-10-28 2023-05-02 深圳华大生命科学研究院 测序文库的构建方法及试剂盒

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