JP2017532028A - 単離されたオリゴヌクレオチドおよび核酸の配列決定におけるその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
第1の態様では、本開示は複数の実施形態において、単離されたオリゴヌクレオチドを提供する。本開示の1つの実施形態においては、単離されたオリゴヌクレオチドは第1のストランドおよび第2のストランドを含有する。ここでは、第1のストランドの5’末端にある第1の末端ヌクレオチドがリン酸基を有しており、第1のストランドの3’末端にある第2の末端ヌクレオチドはジデオキシヌクレオチドであり、そして第2のストランドの5’末端にある第3の末端ヌクレオチドはリン酸基を有しておらず、第2のストランドの3’末端にある第4の末端ヌクレオチドはジデオキシヌクレオチドである。ここでは、第1のストランドの長さは第2のストランドの長さより長く、第1のストランドと第2のストランドとの間で二本鎖構造が形成される。上記オリゴヌクレオチドは、ジデオキシヌクレオチドが原因で第1および第2のストランドの3’末端で、またはリン酸基を持たない第2のストランドの5’末端で、他の核酸断片と繋がれることは不可能であり、これにより、オリゴヌクレオチドが互いに繋がることが回避される。したがって、このようなキットをライブラリーの構築のためのアダプターとして使用することができ、それによってライブラリーの構築の間に、異なるアダプターを核酸断片に対して2つの末端それぞれに連結することができる。これは、アダプターが互いに繋がることを避けるだけではなく、連結効率もまた改善し、その上、ライブラリーの構築のための経済的および時間的コストも下げる。
第3の態様では、本開示は複数の実施形態において、アダプター(第1のアダプターおよび第2のアダプターを含む)を二本鎖DNA断片に対して2つの末端(各々がリン酸基を持たない対合した平滑末端を含む)それぞれに付加するための方法を提供する。図4を参照すると、1つの実施形態では、上記方法は以下の工程S100からS400を含む。
第1のアダプターおよび第2のアダプターが二本鎖DNA断片に対して2つの末端それぞれに連結されて、第1の連結された生成物が得られる。ここでは、第1のアダプターは第2のアダプターとは異なり、第1のアダプターおよび第2のアダプターは各々が上記の単離されたオリゴヌクレオチドである。
第1のアダプターの第2のストランドは第1の一本鎖DNAによって置き換えられ、第2のアダプターの第2のストランドは第2の一本鎖DNAによって置き換えられる。ここでは、第1の一本鎖DNAは第1のアダプターの第1のストランドと特異的に対合して第1の二本鎖構造を形成することができ、第2の一本鎖DNAは第2のアダプターの第1のストランドと特異的に対合して第2の二本鎖構造を形成することができる。
第1の一本鎖DNAおよび第2の一本鎖DNAが二本鎖DNA断片に対して2つの末端それぞれに繋がれて、第2の連結された生成物が得られる。
第2の連結された生成物が第1のプライマーおよび第2のプライマーを用いて増幅されて、増幅された生成物が得られる。ここでは、増幅された生成物は、2つの末端それぞれに第1および第2のアダプターが連結されたDNA断片であり、第1のプライマーは、第1の一本鎖DNAおよび第2の一本鎖DNAの一方と同じ配列を含み、第2のプライマーは、第1の一本鎖DNAおよび第2の一本鎖DNAの他方と同じ配列を含み、第1の一本鎖DNAおよび第2の一本鎖DNAの他方と比較して5’末端にさらなるビオチンを含む。
1.ゲノム核酸を断片化して断片を得る工程;
2.標的断片を脱リン酸化して標的断片の5’末端をブロックし、その結果、断片が互いに連結することを防ぐ工程;
3.標的断片のそれぞれの末端を末端修復して、対合した平滑末端(図1に示されるように2で表される)を生じさせる工程;
4.アダプターA(図1に示されるように3で表される)およびアダプターB(図1に示されるように4で表される)を標的断片に対して2つの末端それぞれに連結させる工程(ここでは、アダプターAおよびアダプターBはそれぞれ、長いストランド(第1のストランド)および短いストランド(第2のストランド)からなるポリヌクレオチドである。5’末端にリン酸基を有しているので、長いストランドを末端修復した断片に連結することができる。一方、短いストランドは相補的な塩基の対合により長いストランドと対合するが、しかし、短いストランドの両方の末端がブロッキング配列であることの理由から、短いストランドは末端修復された断片には連結されないであろう);
5.一本鎖核酸C(図1に示されるように5で表される)および一本鎖核酸D(図1に示されるように7で表される)を付加する工程(ここでは、一本鎖核酸Cはタグ配列(図1に示されるように6で表される)を有しており、一本鎖核酸Cの残りの部分はアダプターAの長いストランドと対合させられる。一方、一本鎖核酸DはアダプターBの長いストランドと対合させられる。アニーリングプロセスの後、弱い様式で結合しているそれぞれのアダプターの短いストランドが除去される。そして、一本鎖核酸CおよびDがアダプターのそれぞれの長いストランドと相補的に対合させられ、その結果、一本鎖核酸CおよびDは、伸長および連結の後に標的断片に連結される);
6.(鋳型としての)工程4で得た生じた生成物を、プライマーとして一本鎖核酸CおよびDを用いてポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、それによりタグ配列を持つ生成物を富化させる工程;
7.工程5で得た生じた生成物を、オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせ(具体的には、プローブとハイブリダイズさせることを含む)、ハイブリダイズした生成物を溶離させ、そして、ハイブリダイズした生成物を富化させ、その間に核酸ストランドの一方の中にビオチン修飾を導入することにより、捕捉する工程;
8.その長さに基づくハイブリダイゼーションによる捕捉後に二本鎖核酸をスクリーニングする工程(随意);
9.核酸の二本鎖のうちの一方にのみ存在するビオチンによって、スクリーニングした二本鎖核酸を2つの一本鎖核酸断片に分離する工程;
10.一本鎖核酸断片を環化し、環化されていない一本鎖核酸断片を取り除く工程。
図1を参照すると、本開示の1つの実施形態においては、ライブラリーは以下の工程にしたがって構築される:
1.ゲノム核酸を断片化して断片を得る工程;
2.標的断片を脱リン酸化して標的断片の5’末端をブロックし、その結果、断片が互いに連結することを防ぐ工程;
3.標的断片のそれぞれの末端を末端修復して、対合した平滑末端(図1に示されるように2で表される)を生じさせる工程;
4.アダプターA(図1に示されるように3で表される)およびアダプターB(図1に示されるように4で表される)を標的断片に対して2つの末端それぞれに連結させる工程(ここでは、アダプターAおよびアダプターBはそれぞれ、長いストランド(第1のストランド)および短いストランド(第2のストランド)からなるポリヌクレオチドである。5’末端にリン酸基を有しているので、長いストランドを末端修復した断片に連結することができる。一方、短いストランドは、相補的な塩基の対合により長い鎖と対合するが、しかし、短いストランドは、ブロックされた末端が原因で末端修復された断片に対して連結されない);
5.一本鎖核酸C(図1に示されるように5で表される)および一本鎖核酸D(図1に示されるように7で表される)を付加する工程(ここでは、一本鎖核酸Cはタグ配列(図1に示されるように6で表される)を有しており、一本鎖核酸Cの残りの部分はアダプターAの長いストランドと対合させられる。一方、一本鎖核酸DはアダプターBの長いストランドと対合させられる。アニーリングプロセス後、弱い様式で結合しているそれぞれのアダプターの短いストランドが除去される。そして、一本鎖核酸CおよびDがアダプターのそれぞれの長いストランドと相補的に対合させられ、その結果、一本鎖核酸CおよびDは、伸長および連結の後に標的断片に連結される);
6.(鋳型としての)工程4で得た生じた生成物を、プライマーとして一本鎖核酸CおよびDを用いてポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、それによりタグ配列を持つ生成物を富化させる工程;
7.工程5で得た生じた生成物をオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせ(具体的には、プローブとハイブリダイズさせることを含む)、ハイブリダイズした生成物を溶離させ、そして、ハイブリダイズした生成物を富化させ、その間に核酸ストランドの一方の中にビオチン修飾を導入することにより、捕捉する工程;
8.その長さに基づくハイブリダイゼーションによる捕捉後に二本鎖核酸をスクリーニングする工程(随意);
9.核酸の二本鎖のうちの一方にのみ存在するビオチンによって、スクリーニングした二本鎖核酸を2つの一本鎖核酸断片に分離する工程;
10.一本鎖核酸断片を環化し、環化されていない一本鎖核酸断片を取り除く工程。
1.ゲノムDNAの断片化
ゲノムDNAは、物理的な超音波処理および酵素消化(これらはいずれも、市販されている十分に確立されている手順である)のようないくつかの方法で断片化することができる。本実施例では、物理的な超音波処理を断片化に使用した。
断片化したゲノムDNAは、磁性ビーズによる精製またはゲル回収によって選択することができる。本実施例では、磁性ビーズによる精製を選択に使用した。
第1の反応溶液を以下のように処方した。
第2の反応溶液を、均質になるように以下のように処方した。
本実施例では、使用したアダプターは、以下のようなそれぞれの配列を有する。配列が左から右に5’末端から3’末端へと記載され、「//」は、その中の基が末端ヌクレオチドについての修飾基であること、またはその中の末端ヌクレオチドが修飾されていることを意味し、「phos」はリン酸化を示し、「dd」はジデオキシを示し、そして「bio」はビオチンを示すことに留意されなければならない。
アダプターA:
長いストランド:/Phos/GGCTCCGTCGAAGCCCGACG/ddC/
短いストランド:GCTTCGACGGAGC/ddC/
アダプターB:
長いストランド:/phos/ACGTCGGGGCCAAGCGGTCGT/ddC/
短いストランド:TTGGCCCCGGCT/−ddT/。
一本鎖核酸C:
/phos/AGACAAGCTCxxxxxxxxxxGATCGGGCTTCGACGGAG(中間部に位置している「x」は交換可能なヌクレオチドからなるタグ配列を意味する)
一本鎖核酸D:/bio/TCCTAAGACCGCTTGGCCCCGA。
第7の反応溶液を、均質になるように以下のように処方した。
第8の反応溶液を、以下のように処方した。
先の工程8で得た生じた磁性ビーズ−DNA複合体を0.1Mの水酸化ナトリウムに対して暴露して、ビオチンを含まない、したがってストレプトアビジンでコーティングされた磁性ビーズと結合しない一本鎖核酸断片を単離し、続いて、中和のために酸性緩衝液を添加した。中和後、全量は112μlであった。
第12の反応溶液を以下のように処方した。ここでは、一本鎖核酸Eは、繋ぐための先の工程9で得た一本鎖核酸断片の2つの末端に相補的な配列を有する。
第14の反応溶液を以下のように処方した。
本開示の実施形態にしたがうと、単離されたオリゴヌクレオチドをライブラリーの構築のためのアダプターとして効率よく使用することができる。その上、本明細書中で提供される方法は異なるアダプターを核酸断片に対して2つの末端それぞれに同時に連結させることができ、これはアダプターが互いに互いに繋がることを回避し、これによって連結効率を改善し、ライブラリーの構築のための経済的および時間的コストを下げる。
Claims (71)
- 第1のストランドおよび第2のストランドを含有している単離されたオリゴヌクレオチドであって、ここでは、
第1のストランドの5’末端にある第1の末端ヌクレオチドがリン酸基を有しており、第1のストランドの3’末端にある第2の末端ヌクレオチドがジデオキシヌクレオチドであり;そして
第2のストランドの5’末端にある第3の末端ヌクレオチドはリン酸基を有しておらず、第2のストランドの3’末端にある第4の末端ヌクレオチドがジデオキシヌクレオチドであり、
ここでは、第1のストランドの長さが第2のストランドの長さより長く、第1のストランドと第2のストランドとの間で二本鎖構造が形成される、
単離されたオリゴヌクレオチド。 - 第2のストランドと第1のストランドとの間で適合していないヌクレオチドの数が3を超えない、請求項1に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
- 第1のストランドの3’末端に位置する第1の突出;および
随意に、第2のストランドの5’末端に位置する第2の突出
を含有している、請求項1に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。 - 第1の突出の長さが第2の突出の長さより長い、請求項3に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
- 第1の突出の長さが約6ヌクレオチドから約12ヌクレオチドである、請求項4に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
- 第2の突出の長さが0ヌクレオチドから4ヌクレオチドである、請求項4に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
- 第1および第2のストランドがいずれもDNAである、請求項1に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
- 第1のストランドの長さが約20ヌクレオチドから約25ヌクレオチドである、請求項1に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
- 第2のストランドの長さが約10ヌクレオチドから約15ヌクレオチドである、請求項1に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
- 第1のストランドが5’GGCTCCGTCGAAGCCCGACGC3’の配列を有しており、そして
第2のストランドが5’CTTCGACGGAGCC3’の配列を有している;
または
第1のストランドが5’ACGTCGGGGCCAAGCGGTCGTC3’の配列を有しており、そして
第2のストランドが5’TTGGCCCCGGCTT3’の配列を有している、
請求項1に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。 - それぞれが請求項1〜10のいずれか一項に記載の単離されたオリゴヌクレオチドである、第1のアダプターおよび第2のアダプター、
を含有しており、
ここでは、第1のアダプターは第2のアダプターとは異なる、
キット。 - 第1のアダプターの第1のストランドと対合して第1の二本鎖構造を形成することができる第1の一本鎖DNA;および
第2のアダプターの第1のストランドと対合して第2の二本鎖構造を形成することができる第2の一本鎖DNA
をさらに含有している、請求項11に記載のキット。 - 第1の二本鎖構造の長さが、第1のアダプターの第1のストランドと第1のアダプターの第2のストランドとを用いて形成された第3の二本鎖構造の長さより長く;そして
第2の二本鎖構造の長さが、第2のアダプターの第1のストランドと第2のアダプターの第2のストランドとを用いて形成された第4の二本鎖構造の長さより長い、
請求項12に記載のキット。 - 第1の一本鎖DNAおよび第2の一本鎖DNAの一方と同じである第1のプライマー;ならびに
第1の一本鎖DNAおよび第2の一本鎖DNAの他方と比較して5’末端にさらなるビオチンを有している第2のプライマー
をさらに含有している、請求項12に記載のキット。 - 第1のアダプターの第1のストランドが5’GGCTCCGTCGAAGCCCGACGC3’の配列を有しており;
第1のアダプターの第2のストランドが5’CTTCGACGGAGCC3’の配列を有しており;
第2のアダプターの第1のストランドが5’ACGTCGGGGCCAAGCGGTCGTC3’の配列を有しており;
第2のアダプターの第2のストランドが5’TTGGCCCCGGCTT3’の配列を有しており;
第1の一本鎖DNAが5’AGACAAGCTC(N)mGATCGGGCTTCGACGGAG3’の配列を有しており、ここでは、(N)mはmヌクレオチドの長さであるタグ配列を表し、mは4から10までの範囲の整数であり、そしてNは、アデニン(A)、チミン(T)、グアニン(G)、またはシトシン(C)を表し;そして
第2の一本鎖DNAが5’TCCTAAGACCGCTTGGCCCCG3’の配列を有している、
請求項14に記載のキット。 - 第1のアダプターおよび第2のアダプターを含むアダプターを、二本鎖DNA断片に対して、リン酸基を持たない対合した平滑末端を各々が含む2つの末端それぞれに付加するための方法であって:
第1のアダプターおよび第2のアダプターを、二本鎖DNA断片に対して2つの末端それぞれに連結して、第1の連結された生成物を得る工程であって、
ここでは、第1のアダプターは第2のアダプターとは異なり;そして
第1のアダプターおよび第2のアダプターそれぞれが請求項1〜10のいずれか一項に記載の単離されたオリゴヌクレオチドである、工程;
第1のアダプターの第2のストランドを第1の一本鎖DNAにより置き換え、第2のアダプターの第2のストランドを第2の一本鎖DNAにより置き換える工程であって、
ここでは、第1の一本鎖DNAは第1のアダプターの第1のストランドと特異的に対合して第1の二本鎖構造を形成することができ、第2の一本鎖DNAは第2のアダプターの第1のストランドと特異的に対合して第2の二本鎖構造を形成することができる、工程;
第1の一本鎖DNAおよび第2の一本鎖DNAを二本鎖DNA断片に対して2つの末端それぞれに繋いで、第2の連結された生成物を得る工程、ならびに
第2の連結された生成物を第1のプライマーおよび第2のプライマーを用いて増幅して、増幅された生成物を得る工程であって、ここでは
増幅された生成物は、2つの末端それぞれに第1および第2のアダプターが連結されたDNA断片であり、
第1のプライマーは、第1の一本鎖DNAおよび第2の一本鎖DNAの一方と同じ配列を含み、そして
第2のプライマーは、第1の一本鎖DNAおよび第2の一本鎖DNAの他方と同じ配列を含み、そして第1の一本鎖DNAおよび第2の一本鎖DNAの他方と比較して5’末端にさらなるビオチンを含む、工程、
を含む、方法。 - 第1のアダプターおよび第2のアダプターが、1つの工程で、二本鎖DNA断片に対して2つの末端それぞれに連結される、請求項16に記載の方法。
- 二本鎖DNA断片が以下の工程:
DNA試料を断片化して断片化生成物を得る工程;
断片化生成物を脱リン酸化して脱リン酸化された断片化生成物を得る工程;および
脱リン酸化された断片化生成物を末端修復して二本鎖DNA断片を得る工程
により得られる、請求項16に記載の方法。 - 第1の二本鎖構造の長さが、第1のアダプターの第1のストランドと第1のアダプターの第2のストランドとを用いて形成された第3の二本鎖構造の長さより長く;そして
第2の二本鎖構造の長さが、第2のアダプターの第1のストランドと第2のアダプターの第2のストランドとを用いて形成された第4の二本鎖構造の長さより長い、
請求項16に記載の方法。 - 第1のアダプターの第1のストランドが5’GGCTCCGTCGAAGCCCGACGC3’の配列を有しており;
第1のアダプターの第2のストランドが5’CTTCGACGGAGCC3’の配列を有しており;
第2のアダプターの第1のストランドが5’ACGTCGGGGCCAAGCGGTCGTC3’の配列を有しており;
第2のアダプターの第2のストランドが5’TTGGCCCCGGCTT3’の配列を有しており;
第1の一本鎖DNAが5’AGACAAGCTC(N)mGATCGGGCTTCGACGGAG3’の配列を有しており、ここでは、(N)mはmヌクレオチドの長さであるタグ配列を表し、mは4から10までの範囲の整数であり、アデニン(A)、チミン(T)、グアニン(G)、またはシトシン(C)を表し;そして
第2の一本鎖DNAが5’TCCTAAGACCGCTTGGCCCCG3’の配列を有している、
請求項16に記載の方法。 - 第1のアダプターの第2のストランドおよび第2のアダプターの第2のストランドがそれぞれ、熱変性−アニーリングによって、第1の一本鎖DNAおよび第2の一本鎖DNAにより置き換えられる、請求項16に記載の方法。
- 熱変性が約60℃で行われる、請求項21に記載の方法。
- 第1の一本鎖DNAおよび第2の一本鎖DNAが、二本鎖DNA断片に対して2つの末端のそれぞれに、ニックトランスレーションによって繋がれる、請求項16に記載の方法。
- DNA試料がゲノムDNAまたはRNA逆転写生成物の少なくとも一部分である、請求項18に記載の方法。
- リン酸基を持たない対合した平滑末端を各々が含む2つの末端を持つ二本鎖DNA断片を配列決定するためのライブラリーを構築する方法であって:
第1のアダプターおよび第2のアダプターを、請求項16〜24のいずれか一項に記載の方法によって、二本鎖DNAに対して2つの末端それぞれに連結して、2つの末端それぞれに第1および第2のアダプターが連結されたDNA断片を得る工程;
2つの末端それぞれに第1および第2のアダプターが連結されたDNA断片を一本鎖DNA断片に分離する工程;ならびに
一本鎖DNA断片を環化して一本鎖DNAループを得る工程、
を含み、
ここでは、一本鎖DNAループが2つの末端を持つ二本鎖DNA断片を配列決定するためのライブラリーを構成する、
方法。 - 2つの末端それぞれに第1および第2のアダプターが連結されたDNA断片を一本鎖DNA断片に分離する工程が:
2つの末端それぞれに第1および第2のアダプターが連結されたDNA断片を磁性ビーズと接触させて、磁性ビーズ−DNA複合体を形成させる工程であって、ここでは、磁性ビーズがストレプトアビジンでコーティングされている、工程;ならびに
磁性ビーズ−DNA複合体をpH値が7より高い溶液に対して暴露して、一本鎖DNA断片を得る工程
をさらに含む、請求項25に記載の方法。 - pH値が7より高い溶液が水酸化ナトリウム溶液である、請求項26に記載の方法。
- 水酸化ナトリウム溶液が約0.5Mから2Mの濃度の溶液である、請求項27に記載の方法。
- 水酸化ナトリウム溶液が約1Mの濃度の溶液である、請求項28に記載の方法。
- 一本鎖DNA断片が、予めスクリーニングされた、2つの末端それぞれに第1および第2のアダプターが連結されたDNA断片から単離される、請求項25に記載の方法。
- 2つの末端それぞれに第1および第2のアダプターが連結されたDNA断片がプローブとの接触によってスクリーニングされ、ここでは、プローブは予め決定された配列に特異的である、請求項30に記載の方法。
- 予め決定された配列が少なくとも1つのエキソンを含む、請求項31に記載の方法。
- プローブがマイクロチップアレイの形態で提供される、請求項31に記載の方法。
- 一本鎖DNA断片が一本鎖核酸分子を用いて環化され、
ここでは、一本鎖核酸分子が第1の領域および第2の領域を含み、
第1の領域は、一本鎖DNA断片の5’末端および3’末端に位置する末端ヌクレオチドと対合することができ、そして
第2の領域は、一本鎖DNA断片の5’末端または3’末端に位置する末端ヌクレオチドと対合することができる、
請求項25に記載の方法。 - 第1の領域が第2の領域に隣接して繋げられる、請求項34に記載の方法。
- 第1の領域が5’TCGAGCTTGTCT3’の配列を有しており;そして
第2の領域が5’TCCTAAGACCGC3’の配列を有している、
請求項35に記載の方法。 - 請求項25〜36のいずれか一項に記載の方法によって、2つの末端それぞれに異なるアダプターを持つ二本鎖DNA断片を配列決定するためのライブラリーを構築する工程;および
ライブラリーを配列決定する工程
を含む、核酸を配列決定する方法。 - ライブラリーがComplete Genomics(CG)シーケンシングプラットフォーム上で配列決定される、請求項37に記載の方法。
- 第1のアダプターおよび第2のアダプターを含むアダプターを、二本鎖DNA断片に対して、リン酸基を持たない対合した平滑末端を各々が含む2つの末端それぞれに付加するためのデバイスであって:
第1のアダプターおよび第2のアダプターを二本鎖DNA断片に対して2つの末端それぞれに連結して第1の連結された生成物が得られるように構成された第1の連結ユニットであって、
ここでは、第1のアダプターは第2のアダプターとは異なり、そして
第1のアダプターおよび第2のアダプターがそれぞれ、請求項1〜10のいずれか一項に記載の単離されたオリゴヌクレオチドである、第1の連結ユニット;
第1のアダプターの第2のストランドを第1の一本鎖DNAによって置き換え、そして第2のアダプターの第2のストランドを第2の一本鎖DNAによって置き換えるように構成された置き換えユニットであって、
ここでは、第1の一本鎖DNAは第1のアダプターの第1のストランドと特異的に対合して第1の二本鎖構造を形成することができ、そして第2の一本鎖DNAは第2のアダプターの第1のストランドと特異的に対合して第2の二本鎖構造を形成することができる、置き換えユニット;
第1の一本鎖DNAおよび第2の一本鎖DNAを二本鎖DNA断片に対して2つの末端それぞれに繋いで第2の連結された生成物が得られるように構成された第2の連結ユニット、ならびに
第2の連結された生成物を第1のプライマーおよび第2のプライマーを用いて増幅して増幅された生成物が得られるように構成された増幅ユニットであって、ここでは、
第1のプライマーは、第1の一本鎖DNAおよび第2の一本鎖DNAの一方と同じ配列を含み、そして
第2のプライマーは、第1の一本鎖DNAおよび第2の一本鎖DNAの他方と同じ配列を含み、そして第1の一本鎖DNAおよび第2の一本鎖DNAの他方と比較して5’末端にさらなるビオチンを含む、増幅ユニット、
を含有している、デバイス。 - 第1のアダプターおよび第2のアダプターが、1つの工程で、二本鎖DNA断片に対して2つの末端それぞれに連結される、請求項39に記載のデバイス。
- 以下を含有しているDNA断片を得るユニット:
DNA試料を断片化して断片化生成物が得られるように構成された断片化アセンブリ;
断片化生成物を脱リン酸化して脱リン酸化された断片化生成物が得られるように構成された脱リン酸化アセンブリ;および
脱リン酸化された断片化生成物を末端修復して二本鎖DNA断片が得られるように構成された末端修復アセンブリ
をさらに含有している、請求項39に記載のデバイス。 - 第1の二本鎖構造の長さが、第1のアダプターの第1のストランドと第1のアダプターの第2のストランドとを用いて形成された第3の二本鎖構造の長さより長く;そして
第2の二本鎖構造の長さが、第2のアダプターの第1のストランドと第2のアダプターの第2のストランドとを用いて形成された第4の二本鎖構造の長さより長い、
請求項39に記載のデバイス。 - 第1のアダプターの第1のストランドが5’GGCTCCGTCGAAGCCCGACGC3’の配列を有しており;
第1のアダプターの第2のストランドが5’CTTCGACGGAGCC3’の配列を有しており;
第2のアダプターの第1のストランドが5’ACGTCGGGGCCAAGCGGTCGTC3’の配列を有しており;
第2のアダプターの第2のストランドが5’TTGGCCCCGGCTT3’の配列を有しており;
第1の一本鎖DNAが5’AGACAAGCTC(N)mGATCGGGCTTCGACGGAG3’の配列を有しており、ここでは、(N)mはmヌクレオチドの長さであるタグ配列を表し、mは4から10までの範囲の整数であり、アデニン(A)、チミン(T)、グアニン(G)、またはシトシン(C)を表し;そして
第2の一本鎖DNAが5’TCCTAAGACCGCTTGGCCCCG3’の配列を有している、
請求項39に記載のデバイス。 - 置き換えユニットが、第1のアダプターの第2のストランドおよび第2のアダプターの第2のストランドがそれぞれ、熱変性−アニーリングによって、第1の一本鎖DNAおよび第2の一本鎖DNAにより置き換えられるように構成されている、請求項39に記載のデバイス。
- 第2の連結ユニットが、第1の一本鎖DNAおよび第2の一本鎖DNAが二本鎖DNA断片に対して2つの末端それぞれに、ニックトランスレーションによって繋がれるように構成されている、請求項39に記載のデバイス。
- DNA断片を得るユニットが:
生物学的試料からゲノムDNAを抽出するように構成されたゲノムDNA抽出アセンブリ;および/または
RNAを逆転写させて逆転写生成物が得られるように構成された逆転写アセンブリ、
をさらに含有し、
ここでは、DNA試料はゲノムDNAおよび/または逆転写生成物の少なくとも一部により形成される、
請求項41に記載のデバイス。 - リン酸基を持たない対合した平滑末端を各々が含む2つの末端を持つ二本鎖DNA断片を配列決定するためのライブラリーを構築するデバイスであって:
第1のアダプターおよび第2のアダプターを二本鎖DNAに対して2つの末端それぞれに連結して、2つの末端それぞれに第1および第2のアダプターが連結されたDNA断片が得られるように構成された、請求項39〜46のいずれかに記載のアダプターを付加するためのデバイス;
2つの末端それぞれに第1および第2のアダプターが連結されたDNA断片を一本鎖DNA断片に分離するように構成された、一本鎖DNA断片を単離するデバイス;ならびに
一本鎖DNA断片を環化して一本鎖DNAループが得られるように構成された環化デバイス、
を含み、
ここでは、一本鎖DNAループが2つの末端を持つ二本鎖DNA断片を配列決定するためのライブラリーを構成する、
デバイス。 - 一本鎖DNA断片を単離するデバイスが:
磁性ビーズを伴って提供され、そして2つの末端それぞれに第1および第2のアダプターが連結されたDNA断片を磁性ビーズと接触させて磁性ビーズ−DNA複合体を形成させるように構成された捕捉ユニットであって、ここでは、磁性ビーズがストレプトアビジンでコーティングされている、捕捉ユニット;ならびに
pH値が7より高い溶液を伴って提供され、磁性ビーズ−DNA複合体を溶液に対して暴露して一本鎖DNA断片が得られるように構成された、溶解ユニット
をさらに含有している、請求項47に記載のデバイス。 - pH値が7より高い溶液が水酸化ナトリウム溶液である、請求項48に記載のデバイス。
- 水酸化ナトリウム溶液が約0.5Mから2Mの濃度の溶液である、請求項49に記載のデバイス。
- 水酸化ナトリウム溶液が約1Mの濃度の溶液である、請求項50に記載のデバイス。
- その後に一本鎖DNA断片がそれから単離される、2つの末端それぞれに第1および第2のアダプターが連結されたDNA断片をスクリーニングするように構成されたスクリーニングデバイス
をさらに含有している、請求項47に記載のデバイス。 - スクリーニングデバイスがプローブを伴って提供され、ここでは、プローブは予め決定された配列に特異的である、請求項52に記載のデバイス。
- 予め決定された配列が少なくとも1つのエキソンを含む、請求項53に記載のデバイス。
- プローブがマイクロチップアレイの形態で提供される、請求項53に記載のデバイス。
- 環化デバイスが一本鎖核酸分子を伴って提供され、
ここでは、一本鎖核酸分子が第1の領域および第2の領域を含み、
第1の領域は、一本鎖DNA断片の5’末端および3’末端に位置する末端ヌクレオチドと対合することができ、そして
第2の領域は、一本鎖DNA断片の5’末端または3’末端に位置する末端ヌクレオチドと対合することができる、
請求項47に記載のデバイス。 - 第1の領域が第2の領域に隣接して繋げられる、請求項56に記載のデバイス。
- 第1の領域が5’TCGAGCTTGTCT3’の配列を有しており、第2の領域が5’TCCTAAGACCGC3’の配列を有している、請求項56に記載のデバイス。
- 請求項47〜58のいずれか一項に記載の2つの末端を持つ二本鎖DNA断片を配列決定するためのライブラリーを構築するデバイス;および
ライブラリーを配列決定するように構成された配列決定デバイス
を含有している、核酸を配列決定するシステム。 - 配列決定デバイスがCGシーケンシングプラットフォームである、請求項59に記載のシステム。
- ゲノムDNA試料を断片化して断片化生成物が得られるように構成された第1のユニット;
断片化生成物を脱リン酸化して脱リン酸化された断片化生成物が得られるように構成された第2のユニット;
脱リン酸化された断片化生成物を末端修復して二本鎖DNA断片が得られるように構成された第3のユニット;
第1のアダプターおよび第2のアダプターを二本鎖DNA断片に対して2つの末端それぞれに連結して第1の連結された生成物が得られるように構成された第4のユニットであって、
ここでは、第1のアダプターは第2のアダプターとは異なり、そして第1のアダプターおよび第2のアダプターはそれぞれ、請求項1〜10のいずれか一項に記載の単離されたオリゴヌクレオチドである、第4のユニット;
第1のアダプターの第2のストランドを第1の一本鎖DNAによって置き換え、そして第2のアダプターの第2のストランドを第2の一本鎖DNAによって置き換えるように構成された第5のユニットであって、
ここでは、第1の一本鎖DNAは第1のアダプターの第1のストランドと特異的に対合して第1の二本鎖構造を形成することができ、そして第2の一本鎖DNAは第2のアダプターの第1のストランドと特異的に対合して第2の二本鎖構造を形成することができる、第5のユニット;
第1の一本鎖DNAおよび第2の一本鎖DNAを二本鎖DNA断片に対して2つの末端それぞれに繋げて第2の連結された生成物が得られるように構成された第6のユニット;
第2の連結された生成物を第1のプライマーおよび第2のプライマーを用いて増幅して増幅された生成物が得られるように構成された第7のユニットであって、ここでは、
増幅された生成物が、2つの末端それぞれに第1および第2のアダプターが連結されたDNA断片であり、
第1のプライマーが、第1の一本鎖DNAおよび第2の一本鎖DNAの一方と同じ配列を含み、そして
第2のプライマーが、第1の一本鎖DNAおよび第2の一本鎖DNAの他方と同じ配列を含み、そして第1の一本鎖DNAおよび第2の一本鎖DNAの他方と比較して5’末端にさらなるビオチンを含む、第7のユニット;
2つの末端それぞれに第1および第2のアダプターが連結されたDNA断片から一本鎖DNA断片を単離するように構成された第8のユニット;ならびに
一本鎖DNA断片を環化して一本鎖DNAループが得られるように構成された第9のユニット、
を含有しており、
ここでは、一本鎖DNAループがゲノムDNAを配列決定するためのライブラリーを構成する、
ゲノムDNAを配列決定するためのライブラリーを構築するデバイス。 - 第1のアダプターおよび第2のアダプターが、1つの工程で、二本鎖DNA断片に対して2つの末端それぞれに連結される、請求項61に記載のデバイス。
- 生物学的試料からゲノムDNAを抽出するように構成された第10のユニット;および/または
RNAを逆転写させて逆転写生成物が得られるように構成された第11のユニット、
をさらに含有しており、
ここでは、DNA試料はゲノムDNAおよび/または逆転写生成物の少なくとも一部により形成される、
請求項61に記載のデバイス。 - 第8のユニットが:
2つの末端それぞれに第1および第2のアダプターが連結されたDNA断片を磁性ビーズと接触させて磁性ビーズ−DNA複合体が形成するようにさらに構成されており、ここでは、磁性ビーズがストレプトアビジンと連結され;そして
磁性ビーズ−DNA複合体をpH値が7より高い溶液に対して暴露して、一本鎖DNA断片が得られるようにさらに構成されている、
請求項61に記載のデバイス。 - その後に一本鎖DNA断片がそれから単離される、2つの末端それぞれに第1および第2のアダプターが連結されたDNA断片をスクリーニングするように構成された第12のユニット
をさらに含有している、請求項61に記載のデバイス。 - 2つの末端それぞれに第1および第2のアダプターが連結されたDNA断片が、プローブとの接触によってスクリーニングされ、ここでは、プローブは予め決定された配列に特異的である、請求項65に記載のデバイス。
- 予め決定された配列が少なくとも1つのエキソンを含む、請求項66に記載のデバイス。
- プローブがマイクロチップアレイの形態で提供される、請求項66に記載のデバイス。
- 第9のユニットが、一本鎖DNA断片を一本鎖核酸分子を用いて環化するようにさらに構成されており、
ここでは、一本鎖核酸分子が第1の領域および第2の領域を含み、
第1の領域は、一本鎖DNA断片の5’末端および3’末端に位置する末端ヌクレオチドと対合することができ、そして
第2の領域は、一本鎖DNA断片の5’末端または3’末端に位置する末端ヌクレオチドと対合することができる、
請求項61に記載のデバイス。 - 第1の領域が第2の領域に隣接して繋げられる、請求項69に記載のデバイス。
- 第1の領域が5’TCGAGCTTGTCT3’の配列を有しており;そして
第2の領域が5’TCCTAAGACCGC3’の配列を有している、
請求項69に記載のデバイス。
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